СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАННИХ НАРУШЕНИЙ УГЛЕВОДНОГО ОБМЕНА У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ПАНКРЕАТИТОМ Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/573 G01N1/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к способам лабораторной диагностики ранних нарушений углеводного обмена при хроническом панкреатите.

Актуальность проблемы связана с трудностью диагностики нарушений углеводного обмена на ранних, доклинических стадиях, при заболеваниях поджелудочной железы. Лидирующее место в патологии поджелудочной железы занимает хронический панкреатит.

В 90-х годах двумя независимыми группами ученых были обнаружены нейропептиды орексина в гипоталамусе мышей (deLecea L., Kilduff T.S., Peyron С. et al., 1998; Sakurai Т., Amemiya A., Ishii M. et al., 1998). Последующие исследования показали роль орексинов в усилении аппетита и бодрствования, регулировки двигательной активности, секреции гормонов, влиянии на эмоциональные состояния и познание, а также на артериальное давление (Azeez I.A., Igado O.O., Olopade J.O.,2021].Также доказано влияние Орексинов на эндокринную функцию (воздействие нейропептидов на секрецию гормонов поджелудочной железы (deLecea L., Sutcliffe С., 2013)и модуляцию глюкозы (Tsuneki H., Wada Т., Sasaoka T., 2010), а Орексин А принимает участие в поддержании нормальной чувствительности к инсулину у пожилых пациентов, за счет регуляции передачи сигналов гипоталамического инсулина, ответственного за периферическую резистентность к инсулину повышающуюся с возрастом) и пищеварение (орексины способны усиливать моторику желудочно-кишечного тракта, а Орексин А повышать секрециюсоляной кислоты и снижать скорость опорожнения желудка и уровень лептина в плазме) (Tsuneki H., Anzawa Y., SoedaY. et al., 2008).

Известно, что поджелудочная железа сочетает в себе два крайне важных отдела по управлению питанием человека: экзокринный (выработка белкового секрета, 98% которого составляют ферменты, необходимые для расщепления питательных веществ на простые, легкоусвояемые соединения) и эндокринный (синтез гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид, инсулин и глюкагон регулируют уровень глюкозы в крови и ее транспорт в тканях). При длительном течении хронического панкреатита неизбежно развиваются нарушения углеводного обмена. Вероятность образования эндокринной недостаточности углеводного контроля при хроническом панкреатите через 10 лет достигает около 70% (Ahmed S.A., Wray С, Rilo H.L., et al. Chronicpancreatitis: recent advances and ongoing challenges. CurrProblSurg 2006; 43:127-238). Однако первые признаки нарушений углеводного обмена сложно заметить. Неадекватная потребностям организма эндокринная секреция поджелудочной железы приводит к избыточному накоплению триглицеридов (простых жиров, которые обеспечивают энергией клетки в условиях голодания или усиленной физической нагрузки), то есть росту жировых депо и ожирению, развивается гиперинсулинемия (т.е. уровень циркулирующего в крови инсулина становится выше уровня глюкозы). Появление повышенного уровня глюкозы запускает каскад процессов гликирования белков (процесс, когда изменяются свойства белков, в результате чего они не могут выполнять свою функцию), что нарушает многие процессы всего организма.

Таким образом, предполагается комплексное участие орексинов в регуляции функций пищеварительной системы и пищевого поведения. Поэтому актуальным представляется изучение уровня Орексина А у больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта, особенно при патологии поджелудочной железы, так как именно у таких пациентов наблюдается нарушение всех перечисленных функций.

Основными ферментами, синтезируемыми поджелудочной железой и принимающими участие в пищеварении, являются: амилаза, липаза, трипсин и химотрипсин. Амилаза участвует в расщеплении углеводов, поступающих с пищей, а липаза предназначена для переваривания жиров после их обработки желчью. Небольшое количество панкреатических ферментов попадает в кровоток, и их уровень повышается при затруднении оттока панкреатического сока в двенадцатиперстную кишку и при увеличении проницаемости мембран ацинусов.

Исходя из этого, появилась диагностическая необходимость определения уровня панкреатических ферментов в сыворотке крови (Саблин О.А., Гриневич В.Б., Успенский Ю.П., Ратников В. А. Функциональная диагностика в гастроэнтерологии. Санкт-Петербург. 2002; С. 53-56).

Известен способ диагностики хронического панкреатита, заключающийся в определение уровня липазы в сыворотке крови (Балабина Н.М. Хронический панкреатит: диагностика, лечение и профилактика в амбулаторных условиях: учебное пособие. Иркутск. 2016; С. 30), включающий забор крови у пациента из локтевой вены, получение плазмы крови, проведение анализа крови.

Способ определения липазы в сыворотки крови осуществляют методом ферментативного колориметрического химического анализа (Junge W, Abicht К, Goldman J etal. Оценка колориметрического жидкостного химического анализа липазы поджелудочной железы на анализаторах Hitachi в 7 клинических центрах Европы, Японии и США // Clin.Chem.Lab.Med 1999; 37).

Способ включает следующие действия: готовят 2 флакона: первый флакон-калибратор с лиофилизатом, второй - контрольный. В оба флакона вводят 3,0 млдистиллированной или деионизированной воды и растворяют содержимое взбалтыванием в течение 30 минут, затем в оба флакона добавляют 200 мкл. реагента 1 (трис 40 ммоль/л, дезоксихолат 1,8 ммоль/л, тауродезоксихолат 7,2 ммоль/л, колипаза >1 мг/л), после в контрольную пробу добавляют 2 мклдистиллированной воды, а в опытную пробу 2 мкл сыворотки, содержимое обоих флаконов перемешивают, инкубируют 3 минуты при +37°С, затем в оба флакона добавляются реагент 2 (тартратный буфер 15 ммоль/л, хлорид кальция 0,13 ммоль/л, субстрат липазы >0,7 ммоль/л), полученное содержимое тщательно перемешивают, инкубируют при +37°С в течение 2 минут, затем снимают показания поглощающей способности течение 2 минут. Анализатор автоматический рассчитывает концентрацию LIP каждой пробы после выполнения калибровки (CLSI.

Оценка характеристик точности методов количественного измерения (USA, 2008)

Нормальным значением считается результат от 0-190 МЕ/л, более высокие значения отражают наличие патологии поджелудочной железы: острого или обострения тяжелых форм хронического панкреатита, травм или онкологии поджелудочной железы (Ишманов М.Ю., Сертаков А.В., Соловьев A.M. и др. 250 показателей здоровья. Справочник. Из-во "Научная книга", 2013).

К недостаткам данного способа относятся:

- недостаточная чувствительность способа для выявления обострения хронического панкреатита (так как липаза повышается при некрозе поджелудочной железы, метод наиболее чувствителен при остром панкреатите);

- недостаточная чувствительность способа для ранних стадий хронического панкреатита (пиковых значений при обострении хронического панкреатита концентрация липазы в крови достигает к 3-4 суткам) (Ивашкин В.Т., Маев И.В., Шифрин О.С., Шептулин А.А., Охлобыстин А.В., Кучерявый Ю.А. Рекомендации Российской гастроэнтерологической ассоциации по диагностике и лечению хронического панкреатита (проект) // Российский журнал гастроэнтерологии гепатологии, колопроктологии. 2013; 1: 66-87);

- данный метод исследования не чувствителен к нарушению экзокринной функции поджелудочной железы при хроническом панкреатите.

Еще в 1975 году был описан фермент - панкреатическая эластаза. Он вырабатывается поджелудочной железой и не метаболизируется в кишечнике, поэтому его активность в кале отражает экзокринную функцию органа (Маев И.В., Кучерявый Ю.А., Москалева А.Б. Хронический панкреатит: мифы и реалии // Фарматека. 2010; 12: С. 24-31).

Известен способ определения фекальной эластазы-1 иммуноферментным методом (патент № 2273030), включающий определение концентрации фекальной панкреатической эластазы-1 иммуноферментным методом, при этом дополнительно определяют массу сухого вещества кала. Рассчитывают концентрацию фекальной панкреатической эластазы-1 в 1 грамме сухого вещества кала по формуле:

Cd - концентрация эластазы- 1 в 1 грамме сухого вещества кала;

Са - концентрация эластазы - 1 в 1 грамме кала, полученного с помощью иммуноферментного анализа;

M1 - любая масса кала, используемая для определения сухого вещества кала;

Md1 - масса сухого вещества кала, содержащаяся в Ml.

При этом нормальными значениями концентрации фекальной эластазы-1 считают от 1000 до 2500 мкг на 1 г сухого вещества кала.

К недостаткам данного способа относится то, что он не отражает раннихизменений углеводного обмена у пациентов с хроническим панкреатитом.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ определения уровня гликированного гемоглобина (HbAlc) в сыворотке крови (Ильин А.В., Арбузова М.И, Князева А.П. Гликированный гемоглобин как ключевой параметр при мониторинге больных сахарным диабетом. Оптимальная организация исследований // Сахарный диабет. Диагностика, контроль и лечение. 2008. №2, С. 60).

Способ включает следующие действия: во флакон с контрольным образцом добавляют 0,3 мл дистиллированной воды и отставляют на 10 минут при комнатной температуре. Затем контрольный образец, не встряхивая, перемешивают до полного растворения лиофилизата, после этого 0,02 мл контрольного образца гликированного гемоглобина разводят с 0,2 мл гемолитика и перемешивают.

Достают микроколонки из холодильника, снимают вначале верхнюю крышку, затем нижний колпачок и удаляют жидкость. Дают возможность микроколонкам прогреться до комнатной температуры 22-25°С. Для каждого анализируемого образца крови (А и Б) маркируют по 2 пробирки. Устанавливают пробирки А в штатив в ряд 1, соответствующие пробирки Б - в соседние гнезда ряда 2.

В соответствующие микроколонки на верхний фильтр вносят по 0,1 мл гемолизата исследуемых образцов крови. После впитывания гемолизатов в фильтр вносят по 0,1 мг буферного раствора и ждут его проникновения в сорбент, затем вносят в микроколонки по 2,0 мл буферного раствора и дают стечь жидкости. Микроколонки из ряда 1 перемещают в пробирки Б ряд 2 и вносят в каждую из них по 2,0 мл раствора уксусной кислоты. Дают жидкости стечь. Вынимают микроколонки из пробирок и переносят в другой штатив. В пробирки А добавляют по 4 мл дистиллированной или деионизированной воды и перемешивают (фракция А). Также тщательно перемешать пробирки Б (фракция Б). Измеряют оптическую плотность растворов из пробирок А и Б при длине волны 414 нм (или в пределах 405-420 нм, или синий фильтр), используя в качестве образца сравнения дистиллированную воду. Содержание гликированного гемоглобина рассчитывают по формуле:

где:

ОП (Б) - оптическая плотность фракции Б;

ОП (А) - оптическая плотность фракции А;

2,07 - пересчетный коэффициент оптической плотности фракции А (соотношение объема фракции А, равной 6.2 мл, и фракции Б, равной 3,0 мл);

100 - пересчетный коэффициент для вычисления процентного содержания.

0,71+1,9 - пересчетные коэффициенты для вычисления фракции гликированного гемоглобина из общего содержания гликогемоглобина.

(Инструкция по применению набора для определения гликогемоглобина (НЬА1 с) в крови «ГЛИКОГЕМОТЕСТ»).

Показатель гликированного гемоглобинаявляется критерием наличия или отсутствия сахарного диабета, компенсации и декомпенсации заболевания и эффективности терапии. При значении гликированного гемоглобина <6,1 ммоль/л отмечают отсутствие сахарного диабета, при значении 6,1-7,5 ммоль/л судят об эффективности терапии сахарного диабета 1 типа, <7,0 ммоль/л - о компенсации сахарного диабета 1 и 2 типов, 7,1-7,5 ммоль/л - субкомпенсации сахарного диабета, более 7,5 ммоль/л - декомпенсации сахарного диабета 1 и 2 типа и неэффективности лечения сахарного диабета 1 типа (Ильин А.В., Арбузова М.И, Князева А.П. Гликированный гемоглобин как ключевой параметр при мониторинге больных сахарным диабетом. Оптимальная организация исследований // Сахарный диабет. Диагностика, контроль и лечение. 2008; № 2, С. 60).

Недостатками данного способа является то, что он отражает латентную (скрытую) форму сахарного диабета, и не отражает экзокринную функцию поджелудочной железы, а также зависим от гематологических заболеваний и демонстрирует ложные значения гликированного гемоглобина у больных анемиями, гемоглобинопатиями (Бирюкова Е.В. Роль гликированного гемоглобина в диагностике и улучшении прогноза сахарного диабета // Медицинский совет 2017; № 3, С. 48-53).

Недавно были обнаружены нейропептиды-орексины А и В, которые осуществляют свое действие в клетках за счет активации специфических орексиновых рецепторов OX1R и OX2R (Wang C, PanY., Zhang R., et al. Heterodimerization of mouse orexin type 2 receptor variants and the effects on signal transduction. Biochim Biophys Acta. 2014; 1843 (3):652-63).

Орексиновые нейроны являются небольшой группой клеток, расположенных в латеральном гипоталамусе, а их аксоны формируют сеть, которая охватывает различные структуры головного мозга, следовательно, функциональная роль орексинов разнообразна. За счет связи с аркуатным ядром гипоталамуса, через реципрокные соединения, в экспериментальных исследованиях было показано, что орексины активируют прием пищи, что опосредованно оказывает влияние на увеличение массы тела и поддержание нормального уровня гликемии, влияют на моторную активность и секрецию верхних отделов пищеварительной трубки (Шаинидзе К.З., Новикова Н.С., Корнева Е.А. Орексин-содержащие нейроны гипоталамуса при стрессе и некоторых формах патологии // Вестник Санкт-Петербургского университета 2011; 11(2), С. 182-184).

В экспериментах на животных было показано влияние обсуждаемых пептидов на всасывание глюкозы в кишечнике посредством регуляции транспортера SGLT1 (Docroc T., Voisin T., Laburthe M. Orexins Control Intestinal Glucose Transportby Distinct Neuronal, Endocrine, and Direct Epithelial Pathways. Diabetes 2007; 56 (10): 2494-2500). OX1R и OX2R ингибируют SGLT1-опосредованное поглощение глюкозы через энтероциты, что предполагает их участие в патогенезе сахарного диабета, а также в регуляции функции поджелудочной железы. Таким образом, показано комплексное участие этих пептидов регуляции функций пищеварительной системы, контроле массы тела и углеводном обмене.

Цель изобретения - создание способа выявления ранних нарушений углеводного обмена у пациентов с хроническим панкреатитом.

Поставленная цель достигается тем, что способ реализуют с помощью набора для определения Орексина А методом конкурентного иммуноферментного анализа в сыворотке крови (Фиг. 1). Реагенты и материалы набора Cloud-CloneCorp.для определения Орексина А методом конкурентного иммуноферментного анализа в сыворотке крови представлены на Фиг. 4.

Для этого восстанавливают стандартный реагент: 1 мл раствора для стандарта выдерживают 10 минут при комнатной температуре, взбалтывают, (концентрация составляет 1000 пг/мл), готовят 5 пробирок, в каждой из которых содержатся 0,6 мл (600 мкл) растворителя для стандарта, в 4 пробирки добавляют 0,3 мл раствора стандарта, перемешивают, в результате получают 5 точек разведения: 1000; 333.33; 111.11; 37.04; 12.35 пг/мл и последняя пробирка с растворителем для стандарта-0 пг/мл (Фиг. 2).

Детектирующий реагент А восстанавливают при помощи 150 мкл растворителя для реагентов, выдерживают 10 минут при комнатной температуре, перемешивают без образования пены, разводят до рабочей концентрации растворителем А (1:100).

Детектирующий реагент взбалтывают или центрифугируют перед использованием, разводят до рабочих концентраций при помощи растворителя В (1:100). 20 мл промывающего раствора разводят в 580 мл деионизированной или дистиллированной воды, чтобы получилось 600 мл промывающего раствора. Достают из набора 9 мл ТМБ раствора и 6 мл Стоп-реагента (прилагаются к набору в готовом виде).

Процедура анализа состоит из следующих действий:

1. Достают из набора 96-луночный стрипованный планшет. Определяют лунки для разведенных стандартов, для бланка (нулевой уровень) и для образцов. Готовят 5 лунок для стандарта и 1 для бланка. Добавляют по 50 мкл разведенных стандартов, образцов и бланк в соответствующие лунки. Затем незамедлительно добавляют по 50 мкл Детектирующего реагента А в каждую лунку, аккуратно встряхивают планшет. Заклеивают планшет пленкой для планшета и инкубируют в течение 1 часа при 37°С.

2. Удаляют жидкость из лунок и промывают 350 мкл Промывающего раствора каждую лунку при помощи пипетки, оставляют на 1-2 минуты. Полностью удаляют оставшуюся жидкость из всех лунок встряхиванием на фильтровальную бумагу, повторяют процедуру 3 раза. После последней промывки удаляют остатки жидкости аспирацией или встряхиванием. Переворачивают планшет на фильтровальную бумагу.

3. Добавляют по 100 мкл рабочего раствора Детектирующего реагента Вв каждую лунку. Заклеивают пленкой для планшета лунки и инкубируютв течение 30 минут при температуре 37°С.

4. Повторяют 5 раз процесс, описанный в пункте 2.

5. Затем добавляют 90 мкл ТМБ раствора в каждую лунку, заклеивают пленкой для планшета и инкубируют 10-20 минут при температуре 37°С, избегают попадания света, жидкость должна приобрести голубой цвет.

6. Добавляют 50 мкл стоп-реагента в каждую лунку, жидкость должна стать желтой, перемешивают жидкость постукиванием по боковой части планшета.

7. Удаляют следы жидкости и отпечатки пальцев со дна планшета, немедленно помещают планшет в микропланшетный ридер с шириной полосы пропускания 10 нм или менее и оптической плотностью 0-3 O.D. или больше, проводят измерения на длине волны 450 нм±10 нм.

Микропланшетный ридер рассчитывает средние результаты оптической плотности для стандартов, контролей и образцов при анализе в дублях. Из полученных значений строят стандартную кривую на логарифмических координатах или полулогарифмических координатах. По оси Y откладывают логарифм концентрации Орексина А, а по оси X - оптическую плотность. По полученным точкам чертят кривую (Фиг. 3).

Минимальная определяемая концентрация 4,99 пг/мл. Это минимальная концентрация белка, которую набор способен отличить от нуля. Она определяется в диапазоне двух стандартных отклонений от медианы оптической плотности величины нулевого стандарта (бланка) при 20 измерениях. Затем вычисляют соответствующую концентрацию. Набор имеет высокую чувствительность и специфичность для определения Орексина А. Не обнаружено кросс-реактивности и интерференции с аналогами. (Инструкция от набора для определения Орексина А методом ИФА для человека invitro Cloude-CloneCorp.USA).

При значении Орексина А более 99,9 пг/мл судят о наличии ранних, доклинических признаков нарушения углеводного обмена у пациентов с хроническим панкреатитом и риске развития сахарного диабета.

Новизна способа заключается в том, что впервые у пациентов с хроническим панкреатитом определяют уровень Орексина А.

Заявляемый способ позволяет использовать сыворотку крови пациента, без специальной подготовки пациента для анализа, увеличивает выявляемость ранних нарушений углеводного обмена у больных хроническим панкреатитом, что может помочь в поиске новых возможностей лечения ожирения и ассоциированных с ним заболеваний (сахарного диабета, нарушения толерантности к углеводам, артериальной гипертонии и других).

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Были исследованы 90 пациентов, из них 40 больных с хроническим панкреатитом, 50 с эрозивно-язвенными заболеваниями желудка и двенадцатиперстной кишки и 10 здоровых добровольцев. Всем пациентам проведен забор крови из вены, из которой после центрифугирования в течение 20 минут при ускорении 1000 g, получена сыворотка для дальнейшего исследования.

Исследование проводилось с использованием набора CEA607Hu производителя Cloud-CloneCorp., USA.

Набор CEA607Hu для количественного определения Орексина А методом конкурентного ИФА в сыворотке, плазме крови и других биологических жидкостях человека, включает следующие реагенты и материалы:

- 96-лунный стрипованный планшет;

- стандарт;

- детектирующий реагент А;

- детектирующий реагент В;

- растворитель для реагентов;

- ТМБ субстрат (3,3',5,5'-тетраметилбензидина гидрохлорида);

- промывающий раствор (30х концентрат);

- пленка для заклейки 96-лунного планшета;

- растворитель для стандарта;

- растворитель А;

- растворитель В;

- стоп-реагент.

Также в исследовании использовались материалы, не входящие в комплект поставки, указанные производителем:

- микропланшетный ридер с фильтром 450±10 нм;

- прецизионная одноканальная или многоканальная пипетки со сменными наконечниками;

- пробирки эппендорфа для разведения образцов;

- деионизированная или дистиллированная вода;

- фильтрационная бумага для подсушивания планшета;

- ванночка для промывающего раствора;

- фосфатно-солевой буферный раствор 0,01 моль/л, рН 7.0-7.2.

Перед проведением исследования готовят реагенты:

- фосфатно-солевой буферный раствор,

- восстанавливают: стандарт (из набора CEA607Hu), детектирующий реагент А (из набора CEA607Hu), детектирующий реагент В (из набора CEA607Hu),

- разводят промывающий раствор (из набора CEA607Hu).

1. Приготовление фосфатно-солевого буферного раствора включает:

Раствор 1. В мерную колбу вместимостью 1000 мл поместить 17,8 г натрия фосфата двузамещенного 2 - водного (Na₂HPO₄⋅H₂O), растворить в 500 мл воды очищенной, довести объем раствора тем же растворителем до метки и перемешать.

Раствор 2. В мерную колбу вместимостью 1000 мл поместить 156 г натрия фосфата однозамещенного 2-водного (NaH₂PO4⋅H₂O), растворить в 500 мл воды очищенной, довести объем раствора тем же растворителем до метки и перемешать.

В мерную колбу вместимостью 1000 мл внести 720 мл раствора 1, прибавить 280 мл раствора 2 и перемешать. Затем в мерную колбу вместимостью 1000 мл поместить 100 мл приготовленного 0,1 М фосфатного буферного раствора, довести объем раствора водой очищенной до метки, перемешать, прибавить 8,5 г натрия хлорида и вновь перемешать.

(Примечание *РН полученного раствора должен быть 7,2±0,02. Если показатель рН выше или ниже требуемого, его соответственно доводят 1 М раствором хлористоводородной кислоты или 1 М раствором натрия гидроксида).

2. Стандартный раствор, входящий в набор CEA607Hu представляет собой лиофилизированный раствор, содержащий моноклональные антитела, специфичные к Орексину А, конъюгированные с пероксидазой хрена, концентрация которого составляет 1000 пг/мл.

Готовый раствор из набора, в начале исследования необходимо восстановить (развести): 1 мл растворителя для стандарта выдерживают 10 минут при комнатной температуре, взбалтывают без образования пены (концентрация стандарта составляет 1000 пг/мл), готовят 5 пробирок, в каждой из которых содержатся 0,6 мл (600 мкл) растворителя для стандарта, в 4 пробирки добавляют 0.3 мл раствора стандарта, перемешивают, в результате получают 5 точек разведения: 1000; 333.33; 111.11; 37.04; 12.35 пг/мл и последняя пробирка с растворителем для стандарта-0 пг/мл, этапы разведения показаны на Фиг. 1.

(Примечание *в рекомендации производителя указано что Стандарт необходимо приготовить за 15 минут до проведения анализа).

3. Восстановление детектирующего реагента А: в готовый детектирующий реагент А из набора CEA607Hu добавить 150 мкл растворителя для реагентов, выдержать 10 минут при комнатной температуре, перемешать без образования пены, затем развести до рабочей концентрации растворителем А (1:100).

4. Восстановление детектирующего реагента В: взять готовый детектирующий реагент Виз набора CEA607Hu, взболтать вращательными движениями или центрифугировать, затем развести до рабочих концентраций при помощи растворителя В (1:100).

Примечание *в рекомендации производителя указано, что при приготовлении Стандарта и детектирующих реагентов А и В необходимо избегать образования пены при взбалтывании, а для минимизации погрешностей при пипетировании используются малые объемы и калибровочные дозаторы, важно дозировать более чем 10 мкл за один раз).

5. Разведение промывающего раствора: в 20 мл промывающего раствора из набора CEA607Hu добавить 580 мл деионизированной и дистиллированной воды, должно получиться 600 мл промывающего раствора.

(Примечание * если в промывающем растворе образовались кристаллы необходимо довести температуру раствора до комнатной температуры и аккуратно перемещать его до растворения кристаллов).

Процедура анализа

1. Необходимо определить лунки для разведенных стандартов, для бланка (нулевой уровень) и для образцов. Приготовить 5 лунок для стандартов и 1 для бланка. Затем добавить по 50 мкл разведенных стандартов, образцов и бланк в соответствующие лунки, встряхнуть планшет, заклеить его пленкой и инкубировать 1 час при 37°С.

2. Удалить жидкость из лунок и промыть их 350 мкл промывающим раствором (1х) в каждую лунку при помощи пипетки, оставить на 1-2 минуты, затем полностью удалить оставшуюся жидкость из всех лунок встряхиванием на фильтровальную бумагу, процедуру повторить 3 раза, после последней промывки удалить остатки жидкости встряхиванием или аспирацией, затем перевернуть планшет на фильтровальную бумагу.

3. Добавить по 100 мкл раствора детектирующего реагента В в каждую лунку, заклеить пленкой для планшета и инкубировать 30 минут при 37°С.

4. Повторить процесс, описанный в пункте № 2 пять раз.

5. Добавить по 90 мкл готового ТМБ субстрата из набора CEA607Hu в каждую лунку, заклеить пленкой для планшета и инкубировать 10-20 минут при температуре 37°С, избегая попадания света с целью профилактики контаминации, жидкость должна приобрести голубой цвет.

6. Добавить по 50 мкл готового Стоп-реагента из набора CEA607Hu в каждую лунку, жидкость должна стать желтой, перемешать постукиванием по боковой части планшета

7. Удалить следы жидкости и отпечатки пальцев со дна планшета и незамедлительно поместить планшет в ридер и сделать измерение на длине волны 450 нм.

Оценка результатов

Принцип исследования основан на конкурентном методе ИФА, поэтому наблюдается обратная зависимость между концентрацией Орексина А в образце и интенсивностью сигнала. В исследовании рассчитываются средние результаты оптической плотности для стандартов, контролей и образцов при анализе в дублях. Стандартная кривая строится на логарифмических координатах или полулогарифмических координатах. По оси Y откладывают логарифм концентрации Орексина А, а по оси Х - оптическую плотность. Затем чертится кривая, которая наиболее точно соответствует полученным точкам. График можно построить при помощи программного обеспечения.

Линейность набора была определена тестированием образцов с определенной концентрацией Орексина А и их серийных разведений. В таблице 1 показано процентное соотношение расчетной концентрации к ожидаемой.

Чувствительность метода

Минимальная определяема концентрация 4,99 пг/мл. Это минимальная концентрация белка, которую набор способен отличить от нуля. Она определяется в диапазоне двух стандартных отклонений от медианы оптической плотности величины нулевого стандарта при 20 измерениях. Затем вычисляется соответствующая концентрация.

Пример расчета результатов

После проведенной процедуры анализа, 96-тилуночный микропланшет был помещен в ридер и проведены измерения на длине волны 450 нм. В результате нами были получены следующие значения Орексина А, пг/мл сыворотки крови пациентов, участвующих в исследовании (3 группы: 1-больные с хроническим панкреатитом, 2-больные с эрозивно-язвенными заболеваниями желудка и ДПК, 3-контрольная группа здоровых добровольцев), полученные данные представлены в таблице Фиг. 2. Наибольшие значения Орексина А (более 99,9 пг/мл) были характерны для пациентов с хроническим панкреатитом, с выявленными нарушения углеводного обмена по результатам глюкозы крови натощак и уровню гликированного гемоглобина. Что является либо риском развития сахарного диабета в будущем, либо уже подтверждением наличия заболевания. Полученные значения Орексина А, пг/мл. приведены на Фиг. 2.

Затем нами были рассчитаны средние значения оптической плотности для стандартов, контролей и образцов в дублях. После с помощью программного обеспечения (CurveExpert) по полученным результатам построен график, приведенный на рисунке 2, где по оси Y отложены логарифмы концентрации Орексина А, а по оси Х-оптическая плотность. ОП-независимая переменная, а концентрация-зависимая переменная, полученный график представлен на Фиг. 3.

Пример 2

Пациент А., 55 лет, обратился в ГБУЗ ККБ № 2 в гастроэнтерологический центр СКАЛ в 2021 году, с жалобами: на боли в верхних отделах живота, усиливающиеся после приема пищи, снижение аппетита, тошноту, повышенное газообразование, кашицеобразный стул 2-3 раза в сутки без патологических примесей. Из анамнеза: более 5 лет страдает хроническим панкреатитом, обострения отмечает при погрешностях в питании (употребление жирной, жареной и богатой быстрыми углеводами пищи), приеме алкоголя (16-19 баллов по результату теста AUDIT). Наследственность отягощена по Сахарному диабету и Артериальной гипертонии.

Настоящее ухудшение отмечает последние 2 недели, когда после пищевой нагрузки и употребления алкоголя рецидивировали абдоминальные боли, проявления диспепсии и диарейный синдром. Пациент принимал полиферментные препараты 25000 ед. на прием, спазмолитики, на фоне лечения отметил клиническое улучшение.

При определении содержания сывороточных ферментов поджелудочной железы (липазы и амилазы), было выявлено повышение липазы в сыворотке крови до 70,65 МЕ/л, а уровень амилазы в моче и крови у пациента были в пределах нормы. По данным концентрации панкреатической эластазы-1 в кале у пациента значение было в пределах нормы (>500 мкг/г фекалий). Содержание общего холестерина было выше референтных значений и составило 6,3 ммоль/л, а содержание липопротеидов низкой плотности превышало референтные значения и составило 3,9 ммоль/л. В копрограмместеатореи выявлено не было. Определяя уровень гликированного гемоглобина (HbAlc) и глюкозы натощак, значение HbAlc составило 6,4%, а уровень глюкозы 5,94 ммоль/л, что было в пределах нормы.

В отделении были проведены следующие исследования: антропометрическое исследование, в результате чего выявлено ожирение 1 степени (ИМТ>30 кг/м²). По Ультразвуковому исследованию органов брюшной полости были выявлены неравномерность контуров поджелудочной железы, повышение эхогенности и неоднородность структуры ткани железы. Эзофагогастродуодноскопия показала наличие недостаточности кардии и признаки гастрита. Результат эндоскопической ультрасонографии выявил гиперэхогенные очаги без тени и неравномерность главного протока поджелудочной железы.

В результате был установлен диагноз: Хронический панкреатит с сохраненной внешнесекреторной функцией, болевая форма, стадия обострения. СИБР. Ожирение 1 степени (ИМТ>30 кг/м²). Дислипидемия.

Затем мы определили уровень Орексина А-104 пг/мл (норма до 99,9 пг\мл), который свидетельствует о нарушении углеводного обмена у пациента с хроническим панкреатитом.

Пациенту дополнительно, был проведен пероральный глюкозотолерантный тест с 75 г глюкозы, в результате было выявлено нарушение толерантности к углеводам (значение глюкозы через 2 часа после приема глюкозы составил 8,0 ммоль/л), согласно данным диагностических критерий сахарного диабета и нарушений гликемии ВОЗ.

Пример 3

Для проведения сравнительного исследования, осуществлялся отбор пациентов методом случайной выборки. Исследование проводилось на базе гастроэнтерологического отделения центра СКАЛ Краевой клинической больницы № 2 в 2020 году, в него вошли 100 пациентов, из которых 40 - с хроническим панкреатитом, 50 - с эрозивно-язвенными изменениями желудка и двенадцатиперстной кишки и 10 здоровых добровольцев.

Для первой группы пациентов отбирали, учитывая наличие в анамнезе хронический панкреатит, и имеющих клинические проявления, типичные для этого заболевания, без наличия в анамнезе хирургических вмешательств на поджелудочной железе.

Для второй группы были отобраны пациенты, имеющие в анамнезе язвенную болезнь желудка или двенадцатиперстной кишки, либо впервые выявленные эрозивно-язвенные изменения слизистой желудка и двенадцатиперстной кишки при проведении эндоскопического исследования.

Критериями исключения стали: НПВП-ассоциированные повреждения желудка и двенадцатиперстной кишки, пациенты с циррозом печени, после операций на пищеводе и желудке, с воспалительными заболеваниями кишечника, опухолями органов пищеварения и других локализаций и пациенты, которые принимали участие в каких-либо клинических исследованиях в настоящее время.

Сравнительное исследование пациентов

Последнее десятилетие широкое распространение во всем мире получила проблема избыточного веса. Ожирение имеет лидирующее место среди причин инвалидности и смертности не только взрослых, но и детей. В связи с тем, что в патогенезе заболевания, помимо дисбаланса между потреблением и расходом энергии, лежат нейрогуморальные механизмы (гормональные и нейротрансмиттерные нарушения в работе оси "кишечник - головной мозг") и факторы внешней среды (малоподвижный образ жизни, нарушение пищевого поведения, хронический стресс) ожирение можно считать мультидисциплинарной проблемой (Дедов И.И., Мокрышева Н.Г., Мельниченко Г.А и др. Клинические рекомендации - Ожирение 2020). Ожирение выступает либо как самостоятельное заболевание, либо как синдром при других заболеваниях. Чаще всего ожирение ассоциировано с сердечно-сосудистыми заболеваниями, сахарным диабетом 2 типа, онкологией, остеоартрозом, поэтому изучение возможности терапии и профилактики остается актуальной задачей современной медицины (Дедов И.И., Мокрышева Н.Г., Мельниченко Г.А и др. Клинические рекомендации - Ожирение 2020).

Для диагностики избыточной массы тела и ожирения, а также для оценки его степени, по-прежнему используется определение индекса массы тела (ИМТ).

В группе с хроническим панкреатитом, только у 9 больных выявлена нормальная масса тела, 13 имели избыточную массу тела, 15-ожирение I степени и 3 человека-ожирение II степени, пациентов с ожирение III степени в этой группе выявлено не было. Во второй группе, нормальную массу тела имели -25 пациентов, избыточную массу тела-12, 11 человек-ожирение I степени, 1-ожирение II степени и 1 -ожирение III степени. Пациентов с недостатком массы тела в обоих группах выявлено не было (Таблица 1).

Ссылаясь на мнение многих авторов, последнее время, увеличилась частота панкреатита на фоне гиперлипидемии, а особенно острого, за счет токсического действия свободных желчных кислот на ткань поджелудочной железы (Немцов Л.М. Патофизиологическое и клинико-диагностическое значение холецистокинина при билиарной патологии // Вестник ВГМУ, 2014, том 13 № 14 С. 12).

Пациентам были определены показатели липидограммы: общий холестерин, липопротеиды низкой плотности (ЛПНП), липопротеиды высокой плотности (ЛПВП), у пациентов с хроническим панкреатитом выявлялся более высокий уровень общего холестерина, выше референтных значений у половины пациентов, а среднее значение общего холестерина составило 5,73 ммоль/л. как и содержание ЛПНП.

Оценивая гликемический профиль у пациентов в группах, были определены: уровень глюкозы натощак и гликированный гемоглобин (HbA1c). Пациенты с хроническим панкреатитом имели более высокие показатели уровня тощаковой глюкозы венозной крови, среднее значение составило 5,79 ммоль/л, а у 5 пациентов выявлен сахарный диабет 2 типа. При анализе значения гликированного гемоглобина, мы обнаружили значимую разницу между группами, пациенты с хроническим панкреатитом имели более высокие средние значения HbA1c, нежели пациенты с эрозивно-язвенными изменениями, что свидетельствует о том, что у пациентов с хроническим панкреатитом чаще развивается нарушение толерантности к глюкозе.

Патология печени, а именно неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП) рассматривают в качестве одного из компонентов метаболического синдрома, наряду с ожирением, артериальной гипертензией, нарушением толерантности к глюкозе, гипергликемией натощак, снижением концентрации ЛПВП (Маев И.В., Андреев Д.Н., Кучерявый Ю.А, Дичева Д.Т., Кузнецова Е.И. Неалкогольная жировая болезнь печени с позиции современной медицины // Клиническая гастроэнтерология. 2020; С. 7-15).

Для оценки формы НАЖБП используется лабораторная диагностика. Выявление цитолитического синдрома свидетельствует о воспалении печени-неалкогольном стетогепатите (НАСГ), активность которого определяется по степени повышения печеночных трансаминаз (Маев И.В., Андреев Д.Н., Кучерявый Ю.А, Дичева Д.Т., Кузнецова Е.И. Неалкогольная жировая болезнь печени с позиции современной медицины // Клиническая гастроэнтерология. 2020; С. 7-15).

В результате исследования у пациентов с хроническим панкреатитом чаще выявлялась НАЖБП- у 9 человек, чем у пациентов из группы с эрозивно-язвенными изменениями желудка и ДПК-у 5 человек. НАСГ в группе с панкреатитом был обнаружен у 4 человек, во второй группе у 1 человека (Таблица 3).

Учитывая данные многочисленных исследований, вероятность развития хронического или острого панкреатита у пациентов с желчнокаменной болезнью (ЖКБ) высока, что обусловлено либо механическими причинами: холедохолитиазом или дисфункцией сфинктера Одди, вызванной микролитиазом, либо отеком и фиброзом головки поджелудочной железы на фоне обострений хронического панкреатита, послуживших причиной сдавления желчных протоков и окружающих сосудов (Бордин Д.С, Кучерявый Ю.А., Кирюкова М.А. Обновленная этиологическая классификация панкреатитов TIGAR-O (версия 2): адаптация для российской клинической практики // Альманах клинической медицины. 2020; № 48 (6) С. 349-363).

В группах, по результату Ультразвукового исследования органов брюшной полости, у 15 пациентов в первой группе был выявлен холецистолитиаз, во второй группе у 2 пациентов. Учитывая анамнез пациентов, выявлено, что 10 человек из группы с хроническим панкреатитом имели в анамнезе лапароскопическую холецистэктомию, а во второй группе - 3 пациента.

На основании полученных данных, мы пришли к выводу о том, что пациенты с хроническим панкреатитом наиболее подвержены нарушению углеводного обмена и липидного спектра, соответственно развитию сахарного диабета 2 типа, ожирению, атеросклерозу и сердечно-сосудистым заболеваниям в будущем, значимо чаще имеют неалкогольную жировую болезнь печени и ЖКБ, что может привести к осложненному течению заболевания.

Публикации последних лет показывают, что в патогенезе изменения массы тела ведущая роль принадлежит регуляторным механизмам расходования энергии, где центральное место занимает гипоталамус, так как он интегрирует информацию о питании, полученную от всех периферических органов (MessinaG., DaliaC, TafuriD.etal. Орексин-А контролирует симпатическую активность и пищевое поведение Front:. Psychol., 08 September 2014). Орексин А, являясь гипоталамическим нейропептидом участвует в регуляции пищевого поведения и нейроэндокринного гомеостаза, так же принимает участие в контроле симпатической активации артериального давления, метаболического статуса и уровня глюкозы крови (MessinaG., DaliaC, TafuriD. et al. Орексин-А контролирует симпатическую активность и пищевое поведение Front. Psychol., 08 September 2014).

В нашем исследовании, у пациентов с хроническим панкреатитом, среднее арифметическое значение уровня Орексина А было значительно выше, чем у пациентов других групп.

Причем чем наиболее высокие значения Орексина А (более 99,9 пг/мл) были у пациентов с избыточной массой тела или ожирением и с выявленными показателями нарушенного углеводного обмена.

При определении Орексина А до проведения дополнительного обследования в нашем случае глюкозотолерантного теста, который доступен не всем лечебным учреждениям и имеет определенные финансовые и временные затраты, поможет в выявлении ранних нарушений углеводного обмена, что предотвратит развитие тяжелых осложнений заболеваний поджелудочной железы.

Изобретение относится к медицине, а именно к лабораторной диагностике, гастроэнтерологии, эндокринологии, и может быть использовано для диагностики ранних нарушений углеводного обмена у пациентов с хроническим панкреатитом. Проводят забор крови из вены пациента, получение сыворотки крови, подготовку реагентов для проведения исследования, измерение оптической плотности растворов. Венозную кровь пациента центрифугируют для получения сыворотки крови в течение 20 минут при ускорении 1000 g, в качестве буферного раствора используют фосфатно-солевой раствор с концентрацией 0,01 моль/л, рН приготовленного раствора должен быть 7,18-7,22. За 15 минут до проведения анализа готовят раствор стандарта Орексина А, в результате получая 5 точек: 1000; 333.33; 111.11; 37.04; 12.35 пг/мл. Проводят исследование с помощью реагентов, на каждом этапе исследования после промывания удаляют с планшета остатки промывающего раствора, поддерживают влажность окружающего воздуха менее 60% и защищают раствор от действия солнечных лучей. При помощи микропланшетного ридера проводят измерения на длине волны 450 нм, рассчитывают средние значения оптической плотности для стандартов, контролей и образцов при анализе в дублях. С помощью полученных значений строят калибровочную кривую, по оси Y откладывают логарифм концентрации каждого стандарта Орексина А, а по оси X - оптическую плотность соответствующего стандарта. Концентрацию Орексина А в образцах определяют путем сравнения полученной оптической плотности образцов с построенной калибровочной кривой. При значении Орексина А более 99,9 пг/мл диагностируют ранние нарушения углеводного обмена у пациентов с хроническим панкреатитом. Способ обеспечивает возможность выявления ранних нарушений углеводного обмена у пациентов с хроническим панкреатитом, что предотвратит развитие тяжелых осложнений заболеваний поджелудочной железы, за счет определения концентрации Орексина А в крови пациентов. 4 ил., 5 табл., 3 пр.

Способ диагностики ранних нарушений углеводного обмена у пациентов с хроническим панкреатитом, включающий забор крови из вены пациента, получение сыворотки крови, подготовку реагентов для проведения исследования, измерение оптической плотности растворов, отличающийся тем, что венозную кровь пациента центрифугируют для получения сыворотки крови в течение 20 минут при ускорении 1000 g, в качестве буферного раствора используют фосфатно-солевой раствор с концентрацией 0,01 моль/л, рН приготовленного раствора должен быть 7,18-7,22, за 15 минут до проведения анализа готовят раствор стандарта Орексина А, в результате получая 5 точек 1000; 333.33; 111.11; 37.04; 12.35 пг/мл, проводят исследование с помощью реагентов, на каждом этапе исследования после промывания удаляют с планшета остатки промывающего раствора, поддерживают влажность окружающего воздуха менее 60% и защищают раствор от действия солнечных лучей, при помощи микропланшетного ридера проводят измерения на длине волны 450 нм, рассчитывают средние значения оптической плотности для стандартов, контролей и образцов при анализе в дублях, с помощью полученных значений строят калибровочную кривую, по оси Y откладывают логарифм концентрации каждого стандарта Орексина А, а по оси X - оптическую плотность соответствующего стандарта, концентрацию Орексина А в образцах определяют путем сравнения полученной оптической плотности образцов с построенной калибровочной кривой и при значении Орексина А более 99,9 пг/мл диагностируют ранние нарушения углеводного обмена у пациентов с хроническим панкреатитом.