СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

Изобретение относится к медицинской биохимии, в частности может быть использовано при массовых обследованиях населения на стойкую гипергликемию, например на скрытый сахарный диабет.

Для диагностики сахарного диабета и оценки его терапевтической компенсации используют анализы на содержание гликированного гемоглобина в крови.

Известен способ определения гликированного гемоглобина, включающий забор крови, гемолиз эритроцитов, хроматографическое разделение гемоглобиновой фракции и колориметрические измерения. В качестве реактивов для хроматографического определения рекомендованы первичные амины и соединения гидразина.

Известен способ определения гликированного гемоглобина с помощью моноклональных антител, которые благодаря их специфическому связыванию с НвА_1с используются для радиоиммуноанализа или анализа с помощью связанного с ферментом иммуносорбента.

Наиболее близким к предлагаемому и достигаемому результату является способ определения гликированного гемоглобина в крови, включающий забор крови, отделение эритроцитов, их гемолиз, нанесение гемолизата на колонку с сорбентом, модифицированным м-аминофенилборной кислотой, элюирование сорбированного гликированного гемоглобина и его спектрофотометрическое определение, при этом в качестве сорбента используют полиакриламидный полимер или агарозполиакриламидный сополимер с привитыми группами следующего строения
-O-CH₂--CH₂-O-(CH₂)₄-O-CH₂--CH₂-NH
Однако этот метод невозможно использовать при скоростных анализах, в частности в варианте хроматографии высокого давления из-за уменьшения объема сорбента при повышении давления, изменения объема сорбента при изменении состава элюэнта и его микробиологической неустойчивости.

Цель изобретения разработка способа определения гликированного гемоглобина в крови, который можно было бы использовать при массовых анализах в варианте хроматографии высокого давления с высокой скоростью и воспроизводимостью.

Способ определения гликированного гемоглобина в крови, включающий забор крови, отделение эритроцитов, их гемолиз, нанесение гемолизата на колонку с сорбентом, элюирование гликированного гемоглобина с последующим измерением оптической плотности и расчетом, при этом в качестве сорбента используют кремнезем, содержащий привитые группы м-аминофенилборной кислоты со следующей структурной формулой:
-O-Si-(CH₂)₃-O-CH₂--CH₂-NH
Сущность способа заключается в том, что при использовании данного сорбента, отличающегося высокой степенью прививки модифицирующих аффинных гидрофильных групп, обеспечивается эффективное экранирование поверхности исходной матрицы кремнезема, что повышает его емкость и разделительную способность по отношению к гликированному гемоглобину. Выбор соответствующей матрицы и модификатора обеспечивает возможность многократного использования одной хроматографической колонки при высоких скоростях анализа, в том числе и в варианте хроматографии высокого давления.

Предлагаемый для анализа сорбент можно получить последовательной обработкой кремнезема вначале γ-глицидооксипропилтриалкоксиланом, затем м-аминофенилборной кислотой и промывкой буферным раствором и водой. Емкость сорбента составляет 80-110 мкмоль на 1 г сорбента.

П р и м е р получения сорбента. Исходный кремнезем КСК-2 (130 , 250 м²/г), размер частиц 100-160 мкм. К 10 г исходного кремнезема добавляют 100 мл 5%-ного раствора γ -глицидооксипропилтриэтоксисилана в 0,01 М Na-ацетатном буфере при рН 5,4 и нагревают на водяной бане в течение 3 ч. Продукт промывают водой, ацетоном, водой и буфером 0,5М NaHCO₃, 0,5M NaCl, pH 8,0 по 50 мл каждым.

1 г модифицированного кремнезема обрабатывают раствором, содержащим 0,15 г м-аминофенилборной кислоты в 5 мл 0,1М NaHCO₃+0,5M NaCl (рН 8,0) при комнатной температуре в течение 20 ч в атмосфере азота при легком механическом встряхивании. После этого сорбент отмывают тем же буферным раствором, затем 0,5М NaHCO₃, водой и оставляют на 12 ч с 5 мл 1М раствора моноэтаноламина (рН 9,0). Затем сорбент отмывают водой, помещают в колонку (0,3 х 3,6 см) и уравновешивают буфером с рН 8,5 (0,25М ацетат аммония, 0,05 М MgCl₂).

Получен сорбент на основе SiO₂ формулы:
-O-Si-(CH₂)₃-O-CH₂--CH₂-NH содержащий 80 мкмоль привитых групп на 1 г сорбента далее в тексте предлагаемый сорбент называют "борфенилдиасорб").

Анализы проводят следующим образом.

Образцы крови отбирают в пробирки, содержащие ЭДТА. После отделения плазмы и лейкоцитов центрифугированием при 3000 об/мин в течение 5 мин 100 мкл плотноупакованных эритроцитов гемолизуют с 2 мл воды в течение 15 мин при 37^оС.

100 мкл полученного гемолизата наносят на микроколонку с борфенилдиасорбом, которую промывают после внесения образца 6 мл уравновешивающего буфера.

Несвязавшийся гемоглобин и промывные воды собирают в градуированную пробирку и разбавляют водой до 15 мл. Сорбированный гемоглобин элюируют 3 мл 0,2 М сорбитола в исходном буфере, элюат разбавляют до 5 мл. Измеряют оптическую плотность полученных растворов при 414 нм. Вычисляют содержание гликированного гемоглобина по следующей формуле:
Hb гликир.
П р и м е р 1. У пациента А взята кровь из вены в пробирку с ЭДТА. Кровь центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. К 0,1 мл плотноупакованных клеток добавляют 1,9 мл дистиллированной воды и выдерживают при комнатной температуре. 100 мкл гемолизата наносят на колонку (0,4 х x7 см), уравновешенную 0,25 ацетатом аммония, рН 8,5, содержащим 0,05 М MgCl₂. Колонку промывают 6 мл уравновешивающего буфера. Несвязавшуюся фракцию собирают в градуированную пробирку и разбавляют водой до 15 мл. Сорбированный гемоглобин элюируют 3 мл 0,2 М сорбитом в исходном буфере, элюат разбавляют до 5 мл дистиллированной водой. Измеряют оптическую плотность полученных растворов при длине волны 414 нм.

А₄₁₄ несвязавшейся фракции 0,620
А₄₁₄ связавшейся фракции 0,105
гликир.гемогл. (0,105 х x100)/(0,105+3х0,62) 5,34%
П р и м е р 2. Аналогичным образом проведен анализ крови пациента Б.

А₄₁₄ связ.фр. 0,115
А₄₁₄ несвяз.фр. 0,608
глик.гемогл. (0,115 х 100)/(0,115 +
+ 3 х 0,608) 5,93%
Пациент Б норма.

П р и м е р 3. Анализ крови пациента В, проведенный в соответствии с примером 1, показал:
А₄₁₄ связ. фр. 0,230
А₄₁₄ несвяз.фр. 0,570
глик.гемогл. (0,230 х 100)/(0,230 +
+ 3 х 0,57) 11,21%
Пациент В патология (сахарный диабет)
Проведено 10 повторных анализов для одного больного.

Коэффициент вариации составил 0,78%
В то же время при проведении 10 повторных анализов одного больного по известному способу коэффициент вариации составил 0,82%
П р и м е р 4. Проведено 25 анализов крови пациента Г на одной колонке, заполненной предлагаемым сорбентом.

Коэффициент вариации составил 0,96%
Таким образом, доказано, что возможно по крайней мере 25-кратное использование одной колонки.

В известном способе гарантировано 10-кратное воспроизведение результатов.

Продолжительность анализа предлагаемым способом составила 6-8 мин от стадии получения гемолизата, в известном способе это время составило 15 мин.

П р и м е р 5. Проведена серия массовых анализов крови на ВЭЖХ-хроматографе. Аналогично примеру 1анализы проведены на стальной хроматографической колонке 4 х 15 мм, заполненной предлагаемым сорбентом.

При сорбции используется буфер А: 0,25М Gly-Gly, 0,05M MgCl₂, pH 8.

При элюировании используется буфер Б: 0,25М Gly-Gly, 0,2М Сорбитол, рН 7,5.

Время анализа: 0-0,95 мин 100%А
0,95 1,55 100% Б
Скорость 1,25 мл/мин, время анализа 2 мин.

Далее колонку промывают в течение 1,6 5 мин буфером А, после чего колонка готова к следующему анализу.

Пpоведено 500 анализов.

Таким образом, способ может быть рекомендован при массовых обследованиях населения благодаря высокой эффективности используемого сорбента.

Способ используется в медицине, медицинской биохимии для определения гликированного гемоглобина в крови. Сущность изобретения: из пробы крови отделяют эритроциты, проводят их гемолиз, наносят гемолизат на колонку с сорбентом, в качестве которого используют кремнезем, содержащий привитые группы м-аминофенилборной кислоты, элюируют гликированный гемоглобин, измеряют оптическую плотность элюата, затем рассчитывают содержание измеряемого компонента.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА В КРОВИ, включающий забор крови, отделение эритроцитов, их гемолиз, нанесение гемолизата на колонку с сорбентом с привитыми группами м-аминофенилборной кислоты, элюирование гликированного гемоглобина с последующим измерением оптической плотности и расчетом, отличающийся тем, что в качестве сорбента используют кремнезем, содержащий привитые группы м-аминофенилборной кислоты со следующей структурной формулой: