СОРБЕНТ НА ОСНОВЕ КРЕМНЕЗЕМА Российский патент 1995 года по МПК B01J20/10 G01N30/48 

Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и может быть использовано в химии, биохимии, медицине, в частности для хроматографического отделения гликированных белков от негликированных белков.

Известны сорбенты на основе агарозных производных аминофенилборной кислоты, используемые для выделения гликированного гемоглобина.

Известен также сорбент, содержащий полимерную матрицу, модифицированную аминофенилборной кислотой и имеющий структурную формулу
_O-CH₂--CH₂-O-(CH₂)₄-O-CH₂--CH₂-NH
В качестве недостатков указанных сорбентов следует отметить изменение объема сорбента при изменении состава элюента, сжимаемость сорбента при повышении давления, микробиологическую неустойчивость. Это делает невозможным использование такого типа сорбентов при скоростных анализах, в частности в варианте хроматографии высокого давления.

Известен также сорбент на основе кремнезема, содержащий привитые группы аминофенилборной кислоты со следующей структурной формулой
SiOi(CH₂)₃-NH-
и используемый для аффинной хроматографии сахаров.

Недостатком известного сорбента является наличие гидрофобной связки, что обуславливает неспецифическую сорбцию белков и непригодность его использования для анализа, например гликированного гемоглобина.

Задачей изобретения является создание сорбента на основе кремнезема для выделения гликированного гемоглобина, отличающегося высокой плотностью прививки модифицирующих аффинных гидрофильных групп, что обеспечивает эффективное экранирование поверхности исходного кремнезема и повышает разделительную способность и емкость сорбента по отношению к гликированному гемоглобину.

Поставленная задача решается описываемым сорбентом на основе кремнезема, содержащим привитые группы м-аминофенилборной кислоты и имеющим структурную формулу
-O-Si(CH₂)₃-O-CH₂--CH₂-NH-
Описываемый сорбент можно получить обработкой кремнезема γ-глицидооксипропилтриалкоксисиланами, затем м-аминофенилборной кислотой с последующей отмывкой буферным раствором и водой.

Для обработки рекомендуется использовать кремнезем с удельной поверхностью 50-300 м²/г, предпочтительно с удельной поверхностью 250 м²/г и средним диаметром пор 100-500 .

Емкость получаемого сорбента составляет 80-100 мкмоль м-аминофенилборной кислоты на 1 г сорбента.

П р и м е р 1. А. Получение сорбента.

Исходный кремнезем КСК-2 (130 , 250 м²/г), размер частиц 100-160 мкм. К 10 г исходного кремнезема добавляют 100 мл 5%-ного раствора γ-глицидооксипропилтриэтоксисилана в 0,01 М Na-ацетатном буфере при рН 5,4 и нагревают на водяной бане в течение 3 ч. Продукт промывают водой, ацетоном, водой и буфером 0,5 М NaHCO₃, 0,5M NaCl, рН 8, по 50 мл каждый.

1 г модифицированного кремнезема обрабатывают раствором, содержащим 0,15 г м-аминофенилборной кислоты в 5 мл 0,1 М NaHCO+0,5М NaCl (рН 8,0) при комнатной температуре в течение 20 часов в атмосфере азота при легком механическом встряхивании. После этого сорбент отмывают тем же буферным раствором, затем 0,5М NaHCO₃, водой и оставляют на 12 ч с 5 мл 1М раствора моноэтаноламина (рН=9,0). Затем сорбент отмывают водой, помещают колонку (0,3х3,6 см) и уранвовешивают буфером с рН 8,5 (0,25М ацетат аммония, 0,05М MgCl₂). Получен сорбент на основе SiO₂ формулы:
-O-Si(CH₂)₃-OCH₂--CH₂-NH-
содержащий 80 мкмоль привитых групп на 1 г сорбента.

Б. Испытания сорбента.

Полученным сорбентом заполнена хроматографическая микроколонка (1 мл сорбента). На колонке проведено количественное определение гликированного гемоглобина в крови.

Образцы крови отбирают в пробирки, содержащие ЭДТА, отделяют плазму и лейкоциты, проводят гемолиз водой. 100 мкл полученного гемолизата наносят на колонку с сорбентом уравновешенным буферным раствором рН 8,5. Колонку промывают 6 мл уравновешенного буфера, несвязавшуюся фракцию отбирают в пробирку и разбавляют водой. Связанный с сорбентом гемоглобин элюируют 3 мл 0,2 М сорбитола, элюат также разбавляют водой. Измеряют оптическую плотность полученных растворов при 414 нм и вычисляют содержание гликированного гемоглобина по формуле: Hb_глик
Проведено 25 повторных определений гликированного гемоглобина в одной колонке и установлен коэффициент вариации 0,96%
Таким образом, возможно по крайней мере 25-кратное использование колонки с сорбентом, в то время как аналогичные известные сорбенты гарантируют 10-кратное воспроизведение результатов.

П р и м е р 2. Проведен синтез сорбента аналогично описанному в примере 1, но размер частиц силикагеля составил 10 мкм.

Определено, что емкость сорбента составила 110 мкмоль активных групп на 1 г сорбента.

Испытания сорбента, полученного по примеру 2. Сорбент помещен в колонку из стали 4х15 мм.

Анализ проводят при высоких давлениях на ВЭЖХ хроматографе.

Буфер А: 0,25М Gly-Gly, 0,05М MgCl₂ рН 8.

Буфер Б: 0,25 М Gly-Gly, 0-05M MgCl₂, 0,2 М сорбитола рН 7,5.

Время анализа 2 мин, скорость 1,25 мл/мин:
0-0,95 мин 100% А
0,95-1,55 мин 100% Б
Промывка 1,6-5 мин 100% А.

Показана возможность использования сорбента не менее 500 вводов.

П р и м е р 3. проведен синтез сорбента по методике, описанной в примере 1, но с использованием силохрома С-80 (80 м²/г, 500 , pазмер частиц 100-160 мкм). Анализ показал, что получен сорбент состава:
-O-i(CH₂)₃-OCH-CH₂-NH-
содержащий 100 мкмоль активных групп на 1 г сорбента.

Испытания полученного сорбента проведены также, как в примере 2, и показаны аналогичные результаты.

Таким образом, полученный сорбент, обладая высокой емкостью и разделительной способностью позволяет проводить анализ в режиме высокоэффективной жидкостной хроматографии с проведением не менее 500 анализов на одной колонке.

Изобретение относится к сорбентам для аффинной хроматографии и позволяет, например, проводить отделение гликированного гемоглобина от негликированного. Предложен сорбент на основе кремнезема, содержащий привитые группы м-аминофенилборной кислоты в количестве 80 110 мкмоль на 1 г сорбента.

СОРБЕНТ НА ОСНОВЕ КРЕМНЕЗЕМА, содержащий привитые группы м-аминофенилборной кислоты, отличающийся тем, что он имеет структурную формулу