СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ПАРАДОНТИТА У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/52 

Изобретение относится к медицине, в частности к диагностике стоматологических заболеваний.

Наиболее близким техническим решением является способ диагностики респираторных заболеваний, включающий исследование ферментной активности лимфоцитов крови и определение в гомогенате лимфоцитов биолюминесцентным методом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, лактатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы, по которым диагностируют предрасположенность лиц к респираторным заболеваниям.

Недостатком известного способа является длительность процесса диагностики до 1,5 часов
Задачей предлагаемого изобретения является сокращение времени на диагностику заболевания парадонтитом у больных сахарным диабетом и удешевление способа.

Поставленная задача достигается тем,что в способе диагностики парадонтита у больных сахарным диабетом, включающем исследование крови, новым является то, что мазок крови обрабатывают п-нитротетрозолием фиолетовым, сукцинатом и α-глицерофосфатом с образованием гранул черно-фиолетового диформазана и по их размерам, форме и интенсивности окрашивания определяют активность ферментов сукцинатдегидрогеназы и α-глицерофосфатдегидрогеназы методом компьютерной морфоденситометрии и по повышению активности α-глицерофосфатдегидрогеназы и снижению показателей активности сукцинатдегидрогеназы диагностируют заболевание парадонтитом. Морфоденситометрический анализ активности ферментов выполняется на цельной крови. Инкубационный состав среды состоит из буфера, субстратов и п-нитротетразолия фиолетового. Весь дальнейший анализ осуществляется на компьютере.

Функциональная активность лимфоцитов крови имеет важное значение при самых разных заболеваниях, особенно связанных с воспалительными процессами. Это определяется тем, что, лимфоциты в случае функциональной активации не только осуществляют цитотоксические функции, но и выделяют биологически активные вещества, влияющие на состояние других эффекторов воспаления. Набор рецепторов у лимфоцитов делает их высокочувствительными к разнообразным нарушениям гомеостаза организма.

Четкая зависимость функциональной активности лимфоцитов от их метаболизма доказана широким рядом исследований. В лимфоцитах вместе с анаэробными процессами осуществляются и аэробные (кислород-зависимые) реакции. При этом, в ходе функциональной активации повышается потребность в аденозинтрифосфорной кислоте (АТФ), которая быстро реализуется через повышение интенсивности аэробных процессов. Значительную роль в поддержании аэробного дыхания играют сукцинатдегидрогеназа (СДГ) и α-глицерофосфатдегидрогеназа (αГФДГ). СДГ является одним из регуляторных ферментов цикла трикарбоновых кислот, напрямую передающих восстановленные флавинадениндинуклеотиды на дыхательную цепь митохондрий. αГФДГ является митохондриальным компонентов α-глицерофосфатного шунта, функцией которого является перенос восстановленных кофакторов в митохондрий, что также повышает интенсивность аэробных реакций. Кроме того, доказано, что оба фермента чувствительны к гормональной и медиаторной регуляции.

Методика морфоденситометрического анализа активности ферментов в лимфоцитах крови.

Сукцинатдегидрогеназа (СДГ) катализирует дегидрирование янтарной кислоты с образованием фумаровой кислоты. СДГ выявляется во всех видах лейкоцитов и бластных элементах костного мозга. Митохондриальная α-глицерофосфатдегидрогеназа (αГФДГ) участвует в транспорте водорода из цитоплазмы в митохондрии, осуществляя "челночный механизм", координирующий в клетке процессы дыхания и гликолиз.

Цитохимическое окрашивание лимфоцитов крови для выявления активности СДГ и αГФДГ осуществляется по методу Р.П. Нарциссова (1969) с применением п-нитротетрозолия фиолетового, сукцината и α-глицерофосфата. п-Нитротетрозолий фиолетовый, восстанавливаясь в результате ферментативных реакций, образует нерастворимые черно-фиолетовые гранулы диформазана, по которым оценивается активность СДГ и αГФДГ.

Для определения активности СДГ и αГФДГ применяется метод компьютерной морфоденситометрии. Этот метод основан на цифровой обработке изображений, что позволяет объективизировать исследования. Объект исследования характеризуется оптическими и геометрическими признаками. В результате исследования в качестве выходных данных получают морфоденситометрические параметры.

Для проведения измерений сначала вводится изображение, то есть осуществляется вывод исходного изображения с телевизионной камеры, соединенной с микроскопом, на монитор (фиг.1). При этом получается оцифрованное исходное изображение анализируемого препарата - массив чисел, полученный по яркости исходного изображения. Изображение представляется в ЭВМ в виде первичной матрицы распределения интенсивностей. Матрица имеет размерность 256х256 элементов (пиксель). Каждый элемент матрицы представляет собой усредненную на площади 1 пиксель величину интенсивности. При этом интенсивность каждого ее элемента лежит в пределах от 0 до 255, т.е. всего 256 градаций полутонов серого при квантовании по интенсивности от 0 - черное до 255 - белое (байт на точку).

Из введенного фрагмента препарата выделяется интересующий объект, то есть лимфоцит с черными гранулами формазана. В результате последовательного повторения этой операции составляется видеоархив препарата (фиг.2).

Затем проводятся операции, в результате которых одно изображение преобразуется в другое. Возможно преобразование полутонового изображения в оверлейное (бинарное). Оверлейное изображение имеет такую же пространственную размерность, как и само изображение - 256x256, но каждый элемент оверлея может принимать только два значения - 0 или 1 (бит на точку). Далее проводятся измерения заданных параметров. Полученные количественные данные сохраняются в файле. После этого на следующем этапе изображение подвергается процессу обработки. К наиболее важным операциям преобразования изображения относятся оцифровывание, кодирование и сжатие данных, улучшение качества и восстановление, сегментация, анализ изображений. Для улучшения качества изображения проводится цифровая фильтрация изображения (включает свыше 20-и стандартных фильтров) и редактирование изображения. Результаты некоторых операций представлены на фиг.3. На экран дисплея компьютера выводятся данные, содержащие результаты измерения данного объекта. Таким образом, ферментативная реакция оценивается количественно.

С помощью камеры Горяева произведен пересчет количественных параметров геометрических величин. Нами измерено, что при стандартно используемых характеристиках микроскопа (объектив х 100, оптовар х 2,5) 1 мм=13110 пиксель и 1 мм= 171872100 пиксель. Исходя из этого морфологические параметры представлены в метрических величинах - мкм (табл.1). Значение интегральной оптической плотности вычисляется программой "Cito", вследствие чего данный показатель не переводится в метрическую величину
Предлагаемый способ диагностики парадонтита у больных сахарным диабетом поясняется изображениями.

На фиг. 1 - введенное с телевизионной камеры изображение цитохимически прокрашенного на сукцинатдегидрогеназу лимфоцита (компьютерное изображение, увеличение микроскопа об. х 100, oп. х 2,5. Программное увеличение в 14 раз).

На фиг.2А - лимфоциты с гранулами диформазана при реакции на α-глицерофосфатдегидрогеназу; Б - лимфоциты с гранулами диформазана при определении сукцинатдегидрогеназы (компьютерное изображение, увеличение микроскопа об. х100, oп. х2,5. Программное увеличение в 8 раз).

На фиг. 3 - последовательный компьютерный анализ активности (по цитохимическому препарату) сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов крови здорового человека (компьютерное изображение, увеличение микроскопа об. х 100, oп. х 2,5. Программное увеличение в 28 раз).

На фиг.4 - лимфоцит с типичной цитохимической реакцией α-ГФДГ здорового (А) и больного (Б) (компьютерное изображение, увеличение микроскопа об. х100, oп. х2,5. Программное увеличение в 14 раз).

На фиг.5 - лимфоцит с типичной цитохимической реакцией СДГ здорового (А) и больного (Б) (компьютерное изображение, увеличение микроскопа об.х100, oп. х2,5. Программное увеличение в 14 раз).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пациентка С. , 1949 г.р. Диагноз - сахарный диабет, в полости рта клинические проявления парадонтита, на исследование взят мазок крови на стекло из пальца, который подвергнут обработке п-нитротетрозолием фиолетовым, сукцинатом и α-глицерофосфатом с образованием гранул черно-фиолетового диформазана, по которым на компьютере проводят весь дальнейший анализ. Приводим данные активности α-ГФДГ: S - 0,88 мкм², FF - 0,72 (o.e.), OD - 15,1 (e.o.п. ), Rx - 0,65 (мкм), Rу - 0,75 (мкм), IOD - 1130,03 (пиксельхе.о.п.).

Данные активности СДГ: S - 1,92 мкм², Р - 13,85 мкм, OD - 15,01 (e.o.п.) IOD - 821,4 (пиксель х е.о.п.).

Пример 2. Пациентка Б., 1954 г.р. Клинический диагноз-норма.

Приводим показатели активности α-ГФДГ: S - 1,94 мкм², FF - 0,86 (o.e.) OD - 14,05 (e.o.п.), Rх - 1,30 (мкм), Ry - 1,31 (мкм), IOD - 1015 (пиксель х e. о. п. ). Показатели активности СДГ: S - 3,42 (мкм), Р - 19,97 (мкм), OD - 18,55 (е.о.п.), IOD - 15,50 (пиксель х е.о.п.).

Полученые данные показывают повышение активности α-ГФДГ и снижение активности СДГ больного человека относительно здорового, что подтверждает клинически поставленный диагноз парадонтит у больных сахарным диабетом. Нами было обследовано 28 человек, больных сахарным диабетом, с различными по степени тяжести клиническими проявлениями парадонтита и 44 человека, у которых клинический диагноз - норма, эти данные приводим ниже.

Исследованы изменения показателей ферментативной активности лимфоцитов крови здоровых людей и больных сахарным диабетом с клиническими проявлениями парадонтита. Обнаружено, что морфоденситометрические параметры активности α-глицерофосфатдегидрогеназы больных относительно здоровых характеризуются снижением площади, фактора формы гранул продукта реакции, усредненных расстояний между ними и более высокими оптической плотностью и интегральной оптической плотностью (табл.2, фиг.4).

Морфоденситометрические параметры активности сукцинатдегидрогеназы больных по сравнению со здоровыми характеризуют снижение как количества фермента (площадь и периметр ниже) в клетке, так и его активность (оптическая плотность меньше), вследствие чего снижено значение интегральной оптической плотности гранул продукта реакции (табл.3, фиг.5).

Использование предлагаемого метода позволяет сократить время исследования, дать более точную диагностику имеющихся воспалительных изменений в парадонте, обеспечить возможность более ранней оценки состояния слизистой оболочки полости рта. В связи с тем, что анализ делается на компьютере, то соответственно автоматически формируется база данных, облегчающих статистическую обработку. Ввиду применения меньшего количества реактивов значительно удешевляется предлагаемый способ.

Изобретение относится к медицине, в частности, к диагностике стоматологических заболеваний. Способ диагностики парадонтита у больных сахарным диабетом включает следующие стадии: мазок крови обрабатывают п-нитротетрозолием фиолетовым, сукцинатом и α-глицерофосфатом с образованием гранул черно-фиолетового диформазана и по размерам, форме и интенсивности окрашивания определяют активность ферментов сукцинатдегидрогеназы и α-глицерофосфатдегидрогеназы методом компьютерной морфоденситометрии, по повышению активности α-ГФДГ и снижению показателей активности СДГ диагностируют заболевание парадонтитом. Изобретение обеспечивает повышение точности диагностики. 5 ил., 3 табл.

Способ диагностики парадонтита у больных сахарным диабетом, включающий исследование крови, отличающийся тем, что мазок крови обрабатывают п-нитротетрозолием фиолетовым, сукцинатом и α-глицерофосфатом с образованием гранул черно-фиолетового диформазана и по размерам, форме и интенсивности окрашивания определяют активность ферментов сукцинатдегидрогеназы и α-глицерофосфатдегидрогеназы методом компьютерной морфоденситометрии, по повышению активности α-ГФДГ и снижению показателей активности СДГ диагностируют заболевание парадонтитом.