СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФЕРМЕНТА ДИСАХАРИДАЗЫ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к способу определения содержания дисахаридов в образце биопсии из 12-перстной кишки, обычно при проведении гастроскопии у пациента с подозрением на наличие непереносимости дисахаридов, в частности, непереносимости лактозы. Изобретение также относится к набору для применения при диагностике указанной непереносимости. Настоящий способ может легко осуществляться как быстрый способ диагностики "у постели больного".

Предшествующий уровень техники
Непереносимость дисахаридов определяется как ограниченная способность организма переваривать дисахариды, обычно молочный сахар, т.е. лактозу, но также, например, известна непереносимость мальтозы. Непереносимость связана со снижением активности или концентрации соответствующего фермента, переваривающего дисахарид, т.е. лактазы (β-галактозидазы) в случае непереносимости лактозы, причем этот фермент вырабатывается в слизистой оболочке тонкой кишки или 12-перстной кишки. Фермент расщепляет дисахарид на более простые сахара, которые могут затем всасываться в кровоток.

Обычно, когда лактоза достигает пищеварительной системы, фермент лактаза гидролизует ее в D-глюкозу и D-галактозу. Затем печень превращает галактозу в глюкозу, которая поступает в кровоток и поднимает уровень глюкозы в крови человека. Если лактоза расщеплена не полностью, уровень глюкозы в крови не повышается, и подтверждается диагноз непереносимости лактозы. Возникающее в результате этого состояние, хотя обычно и не опасное, может причинять сильные страдания. Хотя не у всех лиц с недостаточностью лактазы есть симптомы, те, у кого они есть, расцениваются как имеющие непереносимость лактозы (см. в целом Buller, Н.А. and Grand, R.J. "Lactose Intolerance," Ann. Rev. Med., Vol.41, pp. 141-148 (1990).

К обычным симптомам относятся тошнота, мышечные судороги, отеки, метеоризм и диарея, которые начинаются приблизительно через 30 мин - 2 ч после употребления в пищу в твердом или жидком виде продуктов, содержащих лактозу. Эти симптомы вызваны тем, что не всосавшаяся лактоза в тонкой кишке связывает жидкость и ускоряет скорость прохождения в толстую кишку, где бактерии переваривают углеводы до короткоцепочечных жирных кислот, лактата, двуокиси углерода и водорода. Тяжесть симптомов варьирует в зависимости от количества лактозы, которое может переносить каждый индивидуум.

Некоторые причины непереносимости лактозы хорошо известны. Например, определенные заболевания пищеварительного тракта и повреждения тонкой кишки могут уменьшить количество вырабатываемых ферментов. В редких случаях рождаются дети, лишенные способности вырабатывать лактазу. Хотя у большинства людей недостаточность лактазы представляет собой состояние, которое развивается естественно с течением времени. После возраста приблизительно двух лет организм начинает вырабатывать меньше лактазы. Однако многие люди могут не испытывать симптомы до тех пор, пока они не станут гораздо старше.

От 30 до 50 миллионов американцев страдают непереносимостью лактозы. Определенные этнические и расовые группы характеризуются более обширным поражением, чем другие. До 75% всех американцев африканского происхождения и коренных народов Америки и до 90% американцев азиатского происхождения страдают непереносимостью лактозы. В Южной Европе и на Ближнем Востоке процентная доля составляет около 60, а среди арабов она достигает 90. Это состояние реже всего встречается среди людей-выходцев из Северной Европы, например, в Финляндии непереносимостью лактозы страдают 11% населения, но в северной Скандинавии непереносимость лактозы выявляется у 60% саамов.

Обычно непереносимость лактозы диагностируется с использованием теста на переносимость лактозы, теста выдыхаемого водорода, теста кислотности стула или определения содержания галактозы.

Тест на переносимость лактозы является наиболее широко применяемым тестом для диагностики непереносимости лактозы. У пациента после голодания берут образец крови для определения уровня глюкозы, после чего пациенту дают питье, содержащее лактозу. Новые образцы крови берут через 20, 40 и 60 мин. Тест выявляет гиполактазию, если через 1-2 ч после приема питья, содержащего лактозу, развиваются отчетливые желудочные симптомы и если уровень глюкозы в крови остается ниже 1,1 ммоль/л от исходной величины.

Тест выдыхаемого водорода измеряет количество водорода в выдыхаемом воздухе. Обычно в выдыхаемом воздухе водород не выявляется. Однако непереваренная лактоза под влиянием бактерий ободочной кишки подвергается брожению, в результате которого образуется множество газов, включая водород. Образовавшийся водород всасывается из кишечника, переносится потоком крови в легкие и выдыхается. Пациенту дают питье, содержащее лактозу, после чего через равные интервалы времени анализируют выдыхаемый воздух. Повышенная концентрация водорода в выдыхаемом воздухе свидетельствует о неадекватном переваривании лактозы. На результаты теста могут повлиять определенные пищевые продукты, лекарственные препараты и курение.

Тест кислотности стула измеряет содержание молочной кислоты и других короткоцепочечных жирных кислот, вырабатываемых бактериями ободочной кишки в результате брожения непереваренной лактозы, причем содержание этих кислот можно определить в образце стула. Содержание галактозы можно определить с помощью простого теста в моче после введения лактозы, причем этот тест требует использования полуколичественного способа определения содержания галактозы.

Способы определения содержания дисахаридов ранее известны, но анализ содержания дисахаридов в образце биопсии обычно требует нескольких этапов. Прежде всего, образец необходимо гомогенизировать, после чего его инкубируют с субстратом (лактозой, мальтозой и т.д.), а затем производят химический анализ содержания желаемого моносахарида. Существующая методология сложна и связана с длительными затратами времени. Поэтому есть необходимость в одиночном, быстром и специфичном способе диагностики непереносимости дисахаридов, в частности, непереносимости лактозы.

В публикации ЕР 72450 описывается тест активности лактазы для грудных детей в связи с диагностикой муковисцедоза (MB) у грудных детей, причем, по имеющимся данным, у таких грудных детей с MB в меконии выявляется повышенная активность дисахаридазы. Соответственно, тонкую пленку мекония распределяют по тестирующему устройству, содержащему лактозу, глюкозооксидазу, средство, обладающее активностью перекисного окисления, и хромоген, и если образец имеет активность лактазы, то непосредственно под меконием образуется отчетливо видимое окрашивание в синий цвет.

Сущность изобретения
Настоящее изобретение предоставляет быстрый и легко осуществимый способ определения содержания фермента дисахаридазы в образце биопсии, взятой из 12-перстной кишки индивидуума, у которого подозревается наличие непереносимости дисахаридов, причем этот способ включает этапы:
- обеспечения контакта указанного образца биопсии без его обработки с субстратной средой, содержащей указанный дисахарид; и
- определения присутствия желаемого моносахарида в субстратной среде с использованием устройства для количественного анализа указанного моносахарида.

Еще одной задачей данного изобретения является предоставление набора для использования при осуществлении указанного выше способа, включающего:
- субстратную среду, содержащую указанный дисахарид, для обеспечения контакта с образцом биопсии, взятой из 12-перстной кишки индивидуума, у которого подозревается наличие непереносимости дисахаридов; и
- средство для определения присутствия желаемого моносахарида в субстратной среде после контакта субстратной среды с указанным образцом биопсии.

Другие сферы возможного применения настоящего изобретения будут очевидны из следующего ниже подробного описания.

Подробное описание изобретения
В соответствии с настоящим изобретением, непереносимость дисахаридов диагностируют у индивидуума с помощью выявления недостаточности или сниженной активности соответствующего фермента, переваривающего дисахарид, дисахаридазы, в образце биопсии, взятой из 12-перстной кишки индивидуума, где обычно вырабатывается соответствующий фермент.

Хотя особо упоминается лактоза в качестве дисахарида и лактаза в качестве соответствующего фермента, переваривающего дисахарид, ясно, что описание в равной степени также относится к способам диагностики состояний непереносимости других дисахаридов. Такие состояния включают непереносимость мальтозы, при которой объектом диагностики будет недостаточность фермента мальтазы, или непереносимость сахарозы, при которой диагностируемым ферментом должна быть сахаридаза.

Вкратце, способ включает выявление присутствия дисахаридазы в образце биопсии, взятой из 12-перстной кишки индивидуума, у которого подозревается наличие непереносимости дисахаридов, причем способ включает первый этап обеспечения контакта образца биопсии как такового, в интактной форме, то есть в необработанной форме, такой как не гомогенизированная и не тонко измельченная форма, с субстратной средой, содержащей указанный дисахарид. Любая дисахаридаза, присутствующая в образце, переваривает дисахарид в субстрате до моносахаридов. На следующем этапе присутствие образованного таким образом в субстратной среде желаемого моносахарида определяют с использованием устройства для количественного анализа указанного моносахарида, которое может представлять собой полоску реагента, предпочтительно полоску реагента для погружения в жидкость и считывания результата.

Когда объектом диагностики является непереносимость лактозы и этот способ, таким образом, включает выявление возможного присутствия или отсутствия в образце биопсии активности фермента лактазы, дисахарид, который предстоит использовать в субстратной среде, представляет собой лактозу. Лактоза переваривается любой лактазой, присутствующей в образце биопсии, до глюкозы и галактозы, которые известным образом можно выявить в субстратной среде.

С другой стороны, мальтоза будет перевариваться ферментом мальтазой до двух молекул глюкозы, а сахароза переваривается сахаридазой до глюкозы и фруктозы.

Способ можно осуществить простым образом, например, используя субстратную среду, которая в том же растворе содержит субстрат для фермента, то есть лактозу, если предстоит диагностировать недостаточность фермента лактазы, фермента глюкозооксидазы (или галактозооксидазы), фермента пероксидазы, и хромогенное вещество. Можно также держать один или несколько реагентов отдельно от других реагентов до тех пор, пока не будет проводиться тест. Одной такой альтернативой является содержание хромогенного вещества и/или фермента глюкозы или галактозы в отдельном растворе, или, например, поглощенными в подходящей среде, например, гелевой матрице или бумаге, для обеспечения контакта с остающимися реагентами в момент проведения теста. Возможны также другие модификации проведения теста, и их легко может осуществить специалист в данной области.

Фермент дисахаридаза в образце биопсии, введенный в субстратную среду, переварит дисахарид в субстратной среде до глюкозы, галактозы и/или фруктозы, в зависимости от типа дисахарида. Фермент глюкозооксидаза (или галактозооксидаза) в той же среде, в которую предпочтительно добавлен буфер до величины рН приблизительно 5-7, затем окисляет глюкозу или галактозу до продуктов окисления, высвобождая перекись водорода (Н₂О₂). Фермент пероксидаза катализирует реакцию, при которой перекись водорода окисляет бесцветное хромогенное вещество с образованием окрашенной или выявляемой другим образом формы.

Реакция с окрашиванием, происходящая в субстрате, протекает быстро и может выявляться при комнатной температуре уже через несколько минут. Образец биопсии может быть маленьким, например, порядка 1 х 1 х 1 мм, взятым из 12-перстной кишки при проведении гастроскопии. Взятый образец используется как таковой без обработки, и нет необходимости перед исследованием образец гомогенизировать или измельчать другим образом. Изменение цвета можно определить или невооруженным глазом, или его можно считывать с помощью подходящего устройства, например, с помощью фотометрии, флюорометрии или рефлектометрии. Способ также обеспечивает возможность оценки уровня дисахаридазы в образце биопсии, т.е. производить полуколичественный анализ и, таким образом, оценивать тяжесть состояния непереносимости. Проведение способа в качестве теста "у постели больного" легкое и быстрое и он не требует сложного лабораторного оборудования.

Концентрация различных реагентов в субстратной среде не имеет решающего значения и может подбираться для обеспечения оптимальных условий тестирования. Реакция может проводиться в подходящем сосуде при комнатной температуре, или она может быть обеспечена в форме подходящего набора, причем набор содержит все реагенты, необходимые для проведения теста, в одной готовой к употреблению упаковке.

Очевидно, что описанное таким образом изобретение может различным образом изменяться. Такие изменения не должны рассматриваться как отклонение от сущности и объема притязаний изобретения, и предполагается, что все такие модификации, которые будут очевидны специалисту в данной области, должны быть включены в диапазон следующей формулы изобретения.

Изобретение относится к медицине, в частности к гастроскопии. Способ определения содержания дисахаридазы в образце биопсии, взятой из 12-перстной кишки, причем этот способ включает этапы обеспечения контакта указанного образца биопсии с субстратной средой, содержащей дисахарид, и определения присутствия желательного моносахарида в субстратной среде с использованием устройства для количественного анализа указанного моносахарида. Изобретение позволяет быстро и легко определить содержание фермента дисахаридазы у пациента с подозрением на наличие непереносимости дисахаридов. 4 з.п. ф-лы.

1. Способ определения содержания фермента дисахаридазы, которая способна переваривать дисахарид в моносахариды, в негомогенизированном образце биопсии, взятой из 12-перстной кишки индивидуума, которого предстоит обследовать для выявления наличия непереносимости дисахаридов, включающий обеспечение контакта указанного негомогенизированного образца биопсии с субстратной средой, содержащей указанный дисахарид, глюкозооксидазу и/или галактозооксидазу, фермент пероксидазу и хромогенное вещество, с последующим количественным анализом указанного моносахарида.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дисахаридаза, содержание которой предстоит определить в образце, представляет собой лактазу, мальтазу или сахаразу.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что дисахарид представляет собой лактозу.4. Способ по п.3, отличающийся тем, что моносахарид, содержание которого предстоит определить в субстратной среде, представляет собой глюкозу.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что количественный анализ проводят с помощью фотометрии, флюорометрии или рефлектометрии.