СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ПОРАЖЕНИЙ ЭПИТЕЛИЯ ЖЕЛУДКА И ПРИМЕНЕНИЕ ДИСАХАРИДОВ ДЛЯ ЭТОЙ ЦЕЛИ Российский патент 1998 года по МПК G01N33/66 

Изобретение относится к способу выявления поражений эпителия желудка, и более конкретно к способу выявления язв и повреждений желудка с помощью неинвазивных, нерадиоактивных и нерентгеновских методик или процедур. Предложенный способ пригоден для выявления и диагностики повреждений эпителия желудка независимо от причины таких повреждений. Этот способ отличается тем преимуществом, что специфичен для участка, где поврежден эпителий желудка.

Язвы желудка представляют серьезную угрозу здоровью, так как во многих случаях язвы бессимптомны. Так как язва желудка может развиваться и существовать без видимых симптомов, повреждения, которые язвы наносят желудку, и связанные с ними кровотечения могут быть опасными для здоровья. И эта опасность может быть фатальной.

Весьма желательно разработать неинвазивный и точный способ выявления и диагностики наличия язв желудка. Весьма желательно определить и точно измерить ненормальную слизистую оболочку в желудке, как например, поражение эпителиальных клеток желудка. Такой способ можно использовать для диагностики и определения различных расстройств, которые вызывают повреждения эпителиальных клеток желудка. Примерами расстройств являются язвы желудка, рак, доброкачественные нарушения и т.п. Язвы желудка могут также возникать из-за применения нестероидных противовоспалительных лекарственных препаратов (НСПВЛ), которые как класс, были указаны управлением по контролю за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, как представляющие серьезную опасность из-за возможности возникновения язвы желудка. Это управление потребовало указывать предостережение на этикетках НСПВЛ для пациентов о риске возникновения язвы желудка при постоянном приеме НСПВЛ.

В настоящее время существует ряд способов, позволяющих диагностировать язву желудка. Используемые в настоящее время способы, отличающиеся наибольшей надежностью, предполагают эндоскопию желудка пациента. В этой процедуре эндоскоп вводят через эзофагус в желудок пациента. Эта процедура некомфортна и не всегда обеспечивает визуальное наблюдение внутренних стенок желудка. При этой процедуре требуется легкая анестезия пациента.

Недостатки этой процедуры включают дискомфорт, необходимость анестезии, и результат зависит от опыта врача при проведении эндоскопии для того, чтобы обеспечить полный обзор желудка для определения поражений и распознавания поражений. Сама по себе процедура не может проводиться в кабинете врача, но обычно ее проводят в клинике или больнице.

Другой известной процедурой является использование бариевого раствора, вводимого пациенту, с последующей рентгеноскопией.

Недостатком этой процедуры является использование рентгеновских лучей и специалиста-профессионала для оценки полученных рентгеновских снимков.

Другие известные способы включают использование детектирующего агента, который имеет радиометку, и который отличается сродством к поражению в желудке. Вводя детектирующий агент, а затем определяя местонахождение радиоизотопа, можно обнаружить язву.

Недостатком такого способа является применение радиоизотопов. Хранение, использование и введение радиоизотопов требует лицензирования и может представлять проблемы для окружающей среды. Кроме того, эту процедуру нельзя проводить в кабинете врача.

Весьма желательно использовать способ обнаружения и диагностики наличия язвы желудка и других поражений неинвазивным способом, причем этот способ можно легко применять на практике (например, в лаборатории) для определения наличия повреждения эпителиальных клеток желудка. Такие процедуры пригодились бы для ранней диагностики, что позволило бы проводить лечения серьезных случаев на ранних стадиях заболевания. Такую процедуру можно легко осуществить для пациента из группы риска или предрасположенного такому заболеванию, диагностируя его и проводя лечение фармацевтическими средствами.

Изобретение относится к неинвазивному способу определения повреждения эпителия желудка у пациента. В этом способе используют дисахарид, который можно орально ввести пациенту и который не транспортируется через клеточные мембраны, и который преобразуется в тонкой кишке в соответствующие моносахариды, причем этот дисахарид не разрушается нигде далее в организме. Примеры дисахаридов включают сахарозу, мальтозу и лактозу.

Способ состоит во введении пациенту дисахарида с последующим анализом наличия дисахарида либо в крови, либо в моче пациента. Если анализ показывает величину, которая превышает нормальное контрольное значение для дисахарида в крови или моче, это служит указанием на повреждение эпителия желудка.

Далее способ можно осуществить, вводя дисахарид пациенту, собирая образцы крови или мочи пациента и определяя в образцах крови или мочи наличие дисахарида. По полученным в анализе величинам дисахарида, определенным в образцах крови или мочи, может можно судить о степени повреждения эпителия желудка.

На фиг. 1 представлена диаграмма повреждений в желудке как функция внутриполостной концентрации индометацина у крыс; на фиг. 2 - график, иллюстрирующий чувствительность желудка кролика к индометацину; на фиг. 3 - график концентрации в плазме сахарозы после 60 мин желудочного инкубирования меченой сахарозы для 5-10 животных; на фиг. 4 - график, представляющий повреждения желудка у кроликов, которым за 12 ч до этого подкожно ввели 20 мг/кг индометацина; на фиг. 5 - график, иллюстрирующий повреждения желудка у кроликов, после введения пяти последовательных доз индометацина, причем эти данные представляют среднее для ±SE 42-6 животных для каждой точки; на фиг.6 - график зависимости повреждений, вызванных НСЗПВЛ от возрастания содержания сахарозы в моче после внутрижелудочного введения меченой сахарозы; на фиг. 7 - график фракционного выделения сахарозы в моче человека после экспериментального введения сахарозы по данным ВЭЖХ.

Изобретение относится к способу определения поражения эпителия желудка. Этот способ можно использовать для определения поражений в желудке, например язв, включая язвы, вызванные приемом НСПВЛ. Этот способ является специфическим для определения язв желудка.

В этом способе используют дисахарид с природным весом около 342, хорошо растворимый в воде, но такой, который не транспортируется через клеточные мембраны, т.е. этот дисахарид не характеризуется как обладающий способностью транспортироваться через клеточные мембраны. Эти дисахариды являются дисахаридами, которые не претерпевают трансформации в желудке, но которые трансформируются или каким-либо другим способом разрушаются в нижнем кишечнике на моносахариды. Дисахариды не разрушаются далее нигде в организме, что и позволяет определять их в крови или моче пациента.

Было обнаружено, что приемлемыми и предпочтительными дисахаридами являются сахароза, мальтоза и лактоза. Наиболее предпочтительным дисахаридом является сахароза. Каждый из предпочтительных дисахаридов является природным и его можно вводить животным без каких-либо побочных эффектов. Сахароза является особенно предпочтительным дисахаридом, так как легко доступна и ее легко вводить пациентам. Сахароза легко переваривается и ее можно вводить в твердой или жидкой форме при применении этого способа. Для целей изобретения дисахарид можно вводить в любой подходящей и приемлемой для орального введения форме. Специалистам понятно, что физическая форма дисахарида, вводимого пациенту в указанном способе, не является критической.

В практике настоящего способа дисахарид вводят пациенту орально, так чтобы дисахарид попал в желудок пациента. Дисахариды, пригодные для практического использования в предлагаемом способе, обычно не транспортируются через клеточные мембраны и поэтому не абсорбируются в организм из желудка. Подходящие для изобретения дисахариды обычно проходят через желудок желудочно-кишечного тракта в тонкий кишечник, где этот дисахарид разлагается на моносахаридные компоненты. Затем моносахаридные фрагменты абсорбируются.

Важной особенностью рассматриваемого способа является то, что дисахариды вообще не транспортируются через клеточные мембраны в каких-либо заметных количествах (микрограммные количества могут обнаруживаться в моче, как будет показано далее), и что эти дисахариды разрушаются после того, как покидают желудок. Именно это свойство позволяет использовать дисахариды как маркеры повреждения эпителия желудка. Дисахариды могут проникать через поврежденный эпителий в поток крови пациента, где они не должны находиться, если только нет повреждений эпителия.

Было обнаружено, что, если в желудке имеются поражения, дисахариды, после приема находящиеся в желудке, могут проникать через отверстия в эпителии желудка и поступать в кровь. Попав в кроветок пациента, дисахариды не испытывают превращений ни в одном из органов, но очищаются и отфильтровываются из крови, после чего могут удалиться из организма пациента с мочой. А раз дисахариды находятся в крови и моче пациентов, кровь и моча представляют собой подходящую среду для отбора и последующего анализа на наличие дисахаридов.

Было обнаружено, что количество присутствующего в крови дисахарида прямо связано со степенью поражения эпителия желудка. То есть, чем обширней поражение, тем больше дисахарида поступает из желудка в кровь пациента.

Осуществить предлагаемый способ можно, просто введя орально пациенту дисахарид. Наиболее предпочтителен способ, в котором пациент вначале голодает в течение достаточного промежутка времени, например 6 - 12 ч, или 6-8 ч перед приемом дисахарида. Способ предусматривает введение определенного количества дисахарида. Желательно вводить достаточное количество дисахарида для облегчения его последующего выделения и анализа. Однако количество вводимого дисахарида не является критическим, поскольку наличие сахарозы в моче или крови пациента указывает на наличие некоторого поражения эпителия желудка. После введения дисахарида можно собрать всю мочу пациента за определенный промежуток времени. Полное количество мочи можно собрать вплоть до 24 ч. Было обнаружено, что сбор мочи достаточно проводить, начиная с первого до 2 - 5 ч после. Как здесь будет указано, полное количество мочи пациента, собранное за период до 5 ч после введения пациенту дисахарида, составляет эффективное и достаточное количество для определения наличия дисахарида в моче.

В другом варианте, можно отбирать кровь у пациента через определенный промежуток времени после приема дисахарида. Подходящим временным интервалом является интервал от 30 мин до около 2 ч после введения дисахарида, в который и следует взять у пациента кровь на анализ. Затем собранную мочу или кровь можно проанализировать на наличие сахарозы. Можно использовать любой удобный способ, т.е. можно использовать любой стандартный или общепринятый способ анализа сахарозы в крови или в моче. Предпочтительно использовать количественный анализ с тем, чтобы количество определяемого дисахарида можно было сопоставить со степенью поражения эпителия желудка. Качественный анализ дает возможность только предсказать некоторые поражения эпителия. Качественный анализ, имеющий индикаторный пороговый уровень до указания наличия дисахарида, можно проводить как быстрое диагностическое средство для определения наличия или отсутствия необходимости дальнейшего исследования пациента.

Было обнаружено, что моча у всех людей содержит измеримые количества сахарозы в интервале концентраций 0,1 - 1 мкг/мкл. Предполагается, что это соответствует пищевой сахарозе, которая обычно проникает через слизистую желудка и выделяется с мочой.

В практике описываемого способа дисахариды являются предпочтительными соединениями, так как они обладают приемлемой растворимостью в воде, безопасностью и не претерпевают трансформации ни в желудке, ни в крови, ни в моче пациента, и поэтому могут легко быть определены качественно и количественно в крови или моче.

Кроме того, дисахариды приемлемы, так как они разрушаются в пищеварительном процессе в тонкой кишке. А так как дисахариды разрушаются в пищеварительном процессе в тонком кишечнике, они не могут указывать на поражение в кишечнике, а являются специфическими по участку для определения поражений эпителия в желудке. Дисахаридные соединения вполне приемлемы, так как они являются сахарами природного происхождения, встречающимися в данной пище, и они превращаются в моносахариды в тонкой кишке. Молекулярный вес их приблизительно составляет 300, они прекрасно растворимы в воде, не проникают через клеточные мембраны и не разрушаются ни в каких других органах. Обычно эти соединения быстро разлагаются до глюкозы и других моносахаридов в проксимальной части тонкой кишки. Таким образом, если сахарозу (обычный кусковой сахар) находят либо в крови, либо в моче в нативной форме, она должна была проникнуть в тонкую кишку через стенки желудка.

При увеличении повреждений эпителия все большая конечная концентрация дисахарида образуется в плазме пациента. Эти дисахариды и особенно сахароза представляют собой уникальный индикатор для определения повреждений эпителия желудка, так как обладают несколькими свойствами, которые делают их чрезвычайно привлекательными для определения хронических повреждений особенно у людей. Дисахариды и особенно сахарозу не следует рассматривать как вредный агент при использовании ее людьми.

Эффективность предлагаемой здесь методики проверяли как на животных, так и на людях. Этот способ оценивался на животной модели на острые НСПВЛ, вызывающие поражения желудка у крыс и кроликов.

Биологические исследования.

Острые повреждения желудка, вызванные НСПВЛ у крыс.

Модель разрабатывали для определения острых случаев поражений желудка, вызванных НСПВЛ у крыс штамма Спран-Доули. После анестезии вскрывали брюшко и вводили катетеры в желудок через пилорус и эзофагус. Содержимое желудка тщательно вымывали и промывали внутри физиологическим раствором. После этого вводили индометацин (НСПВЛ) или носитель и оставляли на 30 мин.

Затем НСПВЛ удаляют и заменяют 100 мМ HCl на 60 мин. В результате быстро и эффективно образуется обширное поверхностное повреждение желудка крыс, аналогичное острым НСПВЛ поражениям, наблюдающимся у людей. Более того, такое повреждение воспроизводимо и зависит от дозы. Отчетливый градиент повреждения желудка можно получить при концентрациях индометацина в интервале 0 - 20 мг/мл. На протяжении всей процедуры животные остаются под анестезией. На фиг. 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая результаты такого исследования, которые показывают зависимость поражений желудка от внутриполостной концентрации индометацина. Повреждение оценивают количественно как площадь поверхности желудка, пораженную макроскопически эрозией или острыми язвенными поражениями. Каждая из точек представляет среднее значение плюс-минус стандартную ошибку для 5 - 10 животных.

Было обнаружено, что та же биологическая модель применима в Новозеландским белыми кроликам, как аналогичная реакция на внутриполостные поражения индометацином, когда возрастающая концентрация индометацина в полости продуцирует картину поражения возрастающей серьезности. Полученные результаты представлены на фиг. 2. Повреждение количественно оценивают, как площадь поверхности желудка, макроскопически пораженную эрозией или острыми язвами. Каждая точка представляет среднее значение плюс-минус стандартная ошибка для 4-10 животных.

Экспериментальная модель на крысах была проведена для создания повреждения эпителия. Крысам затем вводили раствор сахарозы с радиоактивной меткой (5 мМ). Тестировали 5 - 10 животных, полученные результаты экспериментов представлены на фиг. 3. Эти результаты четко показывают, что сахароза является приемлемым индикатором язв, вызванных НСПВЛ в желудках крыс. Диагностическую методику проверяют далее в модельных опытах на кроликах с хроническими энтероязвами, вызванными НСВПЛ. Было обнаружено, что подкожные инъекции индометацина кроликам приводят к образованию поражений в желудке кроликов. По-видимому, такие поражения проявляются в двух различных формах. На фиг. 4 представлена степень поражения желудка, количественно оцениваемая как площадь поверхности, охваченная поверхностными поражениями после возрастающего количества инъекций индометацина (20 мг/кг подкожно) с двенадцатичасовыми интервалами. Всех животных умерщвляли спустя 12 ч после последней инъекции и повреждение оценивали как в указанном ранее исследовании на крысах. Наблюдаются поверхностные повреждения, однако было также отмечено, что происходит и глубокое проникновение и наблюдаются хронические антральные изъязвления, причем некоторые оказались перфорированными у животных, которым было введено шесть или более последовательных доз. Такие язвы аналогичны тем, которые наблюдаются у людей с поражениями типа НСПВЛ, и по-видимому, рубцуются после прекращения приема НСПВЛ. В качестве другого примера на моделях кроликам вводят пять доз подкожно индометацина, а затем умерщвляют в несколько временных интервалов после последней дозы. На фиг. 6 показано, что обнаруженные язвы залечиваются в зависимости от прошедшего времени. В развитие модели на животных кроликам вводят по семь доз индометацина или носителя и вскоре после последней дозы анестезируют для исследований. В желудок вводят катетеры с эзофагеального и пилорусного концов, и раствор, содержащий 5 мМ сахарозы, вводят в течение 1 ч. В методике детектирования используют ¹⁴C -сахарозу в тестовом растворе. Модель на кроликах обеспечивает отбор небольших количеств мочи, выделяющейся в процессе исследований, что дает возможность количественного анализа сахарозы при сцинтилляционной регистрации. Результаты исследований показаны на фиг. 6. Было обнаружено, что значительно более высокие концентрации сахарозы находятся в моче животных с повреждениями желудка, после введения индометацина. Количество выделяющейся мочи оказалось с одинаковым для обеих групп и поэтому полученные результаты представляют возрастание сахарозы в моче для группы, которой вводили НСПВЛ.

Использованную таким образом методику оценивали далее в следующих, описываемых клинических исследованиях на пациентах.

Клинические исследования на пациентах.

Для введения пациентам сахарозы разработали тестовую пищу, представляющую мягкий безалкогольный напиток, содержащий сахарозу, классический Соке (торговая марка Кока-Колы Компани) и содержащие сахарозу сладкие плитки, батончики Марс (торговая марка Mand М Марс Компани), которые содержат 105 г пищевой сахарозы. Пациентам предписывалось принимать эту пищу на завтрак после ночного голодания, а затем собирать мочу с пятичасовыми интервалами. Образцы мочи отбирали в день эндоскопии и замораживали. Пациентам проводили эндоскопию. Образцы мочи оценивали, используя высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЖХ). На фиг. 7 представлены результаты исследований как доля поглощенной сахарозы, выделенная спустя 5 ч в образцах мочи. Как видно, измеряемые количества сахарозы были найдены в исходных образцах мочи. На фиг. 7 видно, что пациентов можно разделить на категории с нормальной или ненормальной эндоскопией, и во-видимому, в последней группе фракционное выделение сахарозы больше, нежели в первой. Понятие ненормальной эндоскопии включает макроскопически заметные воспаления эзофагуса, желудка или двенадцатиперстной кишки, также как и ряд пациентов с кажущейся нормальной эндоскопией, но таких, у которых антральная биопсия выявила гастриты. Полученные результаты показывают, что сахарозный зонд предоставляет чувствительный способ определения поражений, так как молекулы показывают, что они могут проникать через участки поражений, не обязательно видимые глазом.

Для дальнейшей оценки возможности применения дисахаридов в качестве диагностических агентов для определения повреждений эпителия желудка были предприняты следующие клинические исследования.

Схема исследований.

Для двухдневного теста выбрали десять добровольцев. В первый день каждый пациент голодал в течение 8 ч, после чего получал 500 мл водного сахарозного напитка, содержащего 100 г сахарозы. В следующие 5 ч собирали всю мочу. Объем мочи регистрировали и определяли концентрацию сахарозы с помощью ВЖХ. Рассчитывали полное количество выделившейся сахарозы. На второй день каждый из добровольцев пришел в лабораторию и тест был повторен. Однако перед тем, как принять сахарозный напиток, каждый из пациентов принял 650 мг ацетилсалициловой кислоты (ASA). Через 5 мин после приема ASA (для максимального подавления продуцирования простагландинов желудка) принимали 50 мл водки. Хорошо известно, что такой прием ASA и этанола приводит к сильным поверхностным повреждениям слизистой желудка, и это аналогично экспериментам, о которых ранее сообщалось для моделей на животных. Спустя 5 мин вводили сахарозу и снова собирали в течение 5 ч мочу. В таблице приведены данные по выделению сахарозы с мочой для обоих дней. До приема ASA и спирта пациенты выделяют 121,3±19,7 мг сахарозы. После повреждения слизистой желудка эти значения возрастают до 384 ± 76,8 мг сахарозы, что составляет существенную разницу. Хотя были и отдельные вариации, повреждение желудка приводит к повышению содержания сахарозы в моче у всех пациентов. Как видно из таблицы, варианты составили от 159 до 996% возрастания выделения сахарозы после повреждения желудка. Среднее значение возрастания выделения сахарозы составляет 3,53±0,78 после повреждения желудка.

Измерение выделения с мочой сахарозы после орального приема дозы легко переносится и представляет собой неинвазивную методику для оценки повреждений желудка. Сахароза обеспечивает количественную информацию независимо от степени повреждения желудка.

Изобретение пригодно для неинвазивной диагностики повреждений эпителия желудка независимо от причины таких повреждений. Для этого пациенту вводят преобразующийся дисахарид, преимущественно сахарозу. Далее измеряют концентрацию дисахарида в пробе крови или мочи и при ее концентрации выше контрольной величины определяют повреждение желудка. Применение дисахаридов в качестве индикатора наличия или степени повреждения эпителия желудка у пациента. Способ специфичен для участка, где поврежден эпителий желудка, и прост в проведении. 4 с. и 14 з.п. ф-лы, 7 ил., 1 табл.

1. Способ определения повреждения эпителия желудка у пациента посредством определения сахаров в биологической жидкости, отличающийся тем, что пациенту вводят преобразующийся дисахарид, измеряют концентрацию дисахарида в пробе крови или мочи и при ее значении выше контрольной величины определяют повреждение эпителия желудка. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что дисахарид выбирают из сахарозы, мальтозы и лактозы. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что дисахаридом является сахароза. 4. Способ обнаружения или определения степени повреждения эпителия желудка у пациента посредством определения сахаров в биологической жидкости, отличающийся тем, что пациенту вводят преобразующийся дисахарид, измеряют концентрацию этого дисахарида в пробе крови или мочи и определяют наличие или степень повреждения эпителия желудка путем сравнения этой концентрации с контрольной величиной. 5. Способ по п.4, отличающийся тем, что дисахарид выбирают из сахарозы, мальтозы и лактозы. 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что дисахаридом является сахароза. 7. Способ по п. 4, отличающийся тем, что стадия анализа дополнительно включает сбор мочи пациента в течение определенного промежутка времени и исследование собранной мочи на присутствие дисахарида в течение этого промежутка времени. 8. Способ по п.7, отличающийся тем, что мочу собирают в течение промежутка времени от первого мочеиспускания пациента и в течение последующих 5 ч. 9. Способ по п.4, отличающийся тем, что стадии анализа выполняют на образце крови, взятой у пациента. 10. Способ определения повреждения эпителия желудка у пациента посредством определения сахаров в биологической жидкости, отличающийся тем, что перед введением определенного количества преобразующегося дисахарида пациент голодает в течение определенного промежутка времени, затем определяют концентрацию дисахарида в пробе крови или мочи и при значениях ее выше контрольной определяют повреждение эпителия желудка. 11. Способ по п.10, отличающийся тем, что дисахарид выбирают из сахарозы, мальтозы и лактозы. 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что дисахаридом является сахароза. 13. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадия анализа дополнительно включает сбор мочи пациента в течение определенного промежутка времени. 14. Способ по п.13, отличающийся тем, что мочу собирают в течение промежутка времени от первого мочеиспускания пациента и в течение последующих 5 ч. 15. Способ по п.10, отличающийся тем, что стадию анализа выполняют на образце крови, взятой у пациента, от 30 мин до 2 ч после введения дисахарида. 16. Применение дисахарида в качестве индикатора наличия или степени повреждения эпителия желудка у пациента. 17. Применение по п.16, отличающееся тем, что дисахаридом является сахароза, мальтоза и лактоза. 18. Применение по п.17, отличающееся тем, что дисахаридом является сахароза.