СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ДЕФИЦИТА ЛАКТАЗЫ Российский патент 2007 года по МПК A61K38/47 A61P1/14 

Изобретение относится к лекарственным средствам, применяемым для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями пищеварения у лиц, страдающих непереносимостью лактозы.

Известно (1), что пищеварительная система человека содержит целый набор ферментов, предназначенных для расщепления сложных компонентов пищи на простые молекулы, в виде которых они всасываются в кишечнике человека. В частности, в верхнем отделе тонкого кишечника человека синтезируется фермент лактаза, который расщепляет дисахарид лактозу, содержащийся в молоке и молочных продуктах на эквимолярные количества глюкозы и галактозы, которые легко усваиваются организмом (2).

Лактозная непереносимость (гиполактазия), обусловленная снижением выработки или отсутствием в слизистой оболочке кишечника фермента лактазы, встречается как у детей, так и у взрослых. Неспособность расщепить лактозу на глюкозу и галактозу после употребления молока или молочных продуктов проявляется тошнотой, рвотой, вздутием и болями в животе, диареей. В то же время исключение из рациона человека молока и молочных продуктов приводит к определенным нарушениям регулирующих систем организма (особенно в грудничковом возрасте) (2, 3).

Лактозная непереносимость у человека может быть преодолена несколькими путями:

- получением низколактозного или полностью безлактозного молока путем предварительного гидролиза лактозы в молоке с помощью ферментных препаратов,

- применением лекарственных препаратов, содержащих экзогенный фермент лактазу микробного происхождения.

Первый путь - получение безлактозного молока, был внедрен еще в начале 80-х годов рядом фирм ("Snam Progetti", Италия; "Gist-Brocades", Нидерланды). Недостатком этого способа является то, что он может быть использован только для обработки цельного молока и малопригоден для обработки кисломолочных продуктов (творога, сырков, йогуртов и т.д.), т.к. приводит к изменению их консистенции, внешнего вида и, в ряде случаев, вкусовых качеств.

Второй путь - это использование лекарственных препаратов, содержащих фермент лактазу микробного происхождения. Эти препараты предназначены для перорального приема людьми, у которых лактаза практически не вырабатывается или вырабатывается недостаточно в собственном кишечнике.

Выпускаемые лекарственные препараты, содержащие лактазу, можно условно поделить на две группы:

- препараты, содержащие лактазу, синтезируемую дрожжами и бактериями с оптимумом действия в нейтральной и слабощелочной зоне рН;

- препараты, содержащие лактазу, синтезируемую микроскопическими грибами с оптимумом действия в кислой зоне рН.

К первой группе относятся препараты "Lact-Aid", выпускаемый фирмой "Sugar Lo Co. Pleantvi" (USA), "Максилакт" (фирма "Gist Brocades", Нидерланды), "Лактейд" (фирма "Sugar Lo"), "Lactozym" (фирма "Novozymes"). Все эти препараты, содержащие дрожжевые лактазы, проявляют активность в довольно узком диапазоне рН (6,0-7,0) и не действует при рН ниже 6,0, что ограничивает сферу их использования (4). Эти препараты используются в основном для обработки цельного молока перед употреблением и малоэффективны в отношении лактозы кисломолочных продуктов.

Ко второй группе относятся лекарственные препараты на основе лактаз, синтезируемых микроскопическими грибами. Эти лактазы активны в кислой зоне рН (3,5-5,0) и, следовательно, эффективны для гидролиза лактозы кисломолочных продуктов и менее эффективны при гидролизе лактозы цельного молока. Так, фирмой "Fermentation Industries Kingstree" (США) получена лактаза из Aspergillus niger и выпущена в продажу в виде порошка под названием "Lactrase-N"; фирма "Шварц Фарма" производит препарат "Лактразу" в капсульной форме на основе лактазы из Aspergillus orysae (5, 6, 7).

Анализ препаратов, применяемых при непереносимости лактозы, показал, что для эффективного гидролиза лактозы молока и кисломолочных продуктов необходимо использовать, по крайней мере, два вида препаратов с оптимумом действия в различных зонах рН.

Ближайшим аналогом предполагаемого изобретения является патент US № 6,410,018 В1 Eisenhardt с соавт., в котором описана композиция для гидролиза лактозы, состоящая из двух лактаз микробного происхождения с оптимумами действия в кислой и нейтральной зоне рН (8). Это, по мнению авторов, позволяет наиболее полно осуществлять гидролиз лактозы при употреблении молока и молочных продуктов за счет того, что один фермент работает в кислой среде желудка, а другой в кишечнике человека при нейтральном и слабощелочном значении рН.

Недостатком заявленной композиции является сложность и многостадийность ее приготовления. В состав предложенной смеси входят два ферментных препарата, полученных из различных продуцентов по различным технологиям. Фермент, имеющий оптимум действия в нейтральной и слабощелочной зоне рН, покрывается кислотоустойчивой оболочкой, затем добавляется лактаза, действующая в кислой среде желудка, и смесь заключается в кислоторастворимую оболочку. Процесс приготовления указанной композиции продолжителен по времени и требует дополнительных материальных затрат.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание универсального средства для гидролиза лактозы, способного эффективно работать как в кислой, так и в нейтральной зоне рН.

Технический результат был достигнут получением высокоочищенного фермента лактазы, выделенного из культуральной жидкости микроскопического гриба Pen. canescens, обладающего высокой ферментативной активностью (не менее 10000 ед./г) и специфичностью действия. Очищенная лактаза (β-галактозидаза, К.Ф.3.2.1.23) имеет молекулярную массу 120-130 kD, изоэлектрическую точку pI 6,7, проявляет активность и стабильность в широком диапазоне рН (2,5-7,0) и температур (4-55°С) (фиг.1, 2). Фермент подвергается незначительному смешанному типу ингибирования продуктами гидролиза лактозы, что позволяет использовать его в процессе длительного гидролиза молочного сахара.

Указанные свойства делают фермент универсальным для работы при повышенной температуре (37°С), при комнатной температуре и температуре 4°С как в кислой, так и в нейтральной зоне рН.

Изучение специфического действия препарата лактазы было проведено на наиболее часто употребляемых человеком в пищу продуктах (молоке, кефире, твороге, йогурте). Обработку молока и молочных продуктов проводили следующими дозами фермента: 500, 1000, 2000 и 4000 ед. на 100 г продукта. Процесс вели при температуре 20°С в течение шести часов, при температуре 4°С в течение 12 часов и при 37°С в течение 2-х часов с добавлением желудочного сока, имитируя внутреннюю среду организма.

В ходе исследований была выбрана оптимальная доза фермента, обеспечивающая необходимую степень гидролиза молочного сахара (лактозы). Она составила 2000 ед. на 100 г кисломолочных продуктов и 4000 ед. на 100 г цельного молока. Эти концентрации фермента и были использованы для проведения дальнейшей работы.

При выборе дозы лактазы для предварительной обработки молока и молочных продуктов перед употреблением учитывали тот факт, что для большинства людей, страдающих гиполактазией, некоторое количество лактозы в сутки вполне приемлемо. Употребление ими в среднем 250 г молочных продуктов со степенью гидролиза лактозы 60-70% в несколько приемов не приводит к проявлению симптомов непереносимости лактозы. Гидролиз лактозы на 90% и более необходим только в случае исключительной непереносимости лактозы (7, 9).

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

В конические колбочки вместимостью 200 мл помещали по 100 г биосубстрата и добавляли фермент с суммарной лактазной активностью 2000 ед. и 4000 ед. Содержимое колбочек тщательно перемешивали и оставляли при температуре 20°С. В контрольном опыте субстрат выдерживали без добавления фермента. Для изучения сравнительного действия полученного фермента с зарубежными аналогами использовали импортный препарат Лактразу в виде капсул с той же активностью. Аналогично готовили пробы для обработки молока в холодильнике (4°С) в течение 12 часов.

Определение образующейся в ходе гидролиза глюкозы проводили по методу Kurz G., Beutler H.O. (10, 11, 12).

Результаты опытов по предварительной обработке молока и молочных продуктов, а также сравнительные данные действия препарата с действием импортного аналога Лактразы представлены в табл.1.

Как видно из табл.1, степень гидролиза лактозы в молоке ферментом с активностью 2000 ед. при температуре 20°С через 6 часов достигает значения 58%, а при использовании 4000 ед. - 65%. Такой же глубины гидролиза можно достичь при обработке молока соответствующими дозами при 4°С за 12 часов.

В кефире, йогурте и твороге гидролиз лактозы происходит быстрее и более глубоко по сравнению с молоком за счет того, что кисломолочные продукты имеют рН среды 4,0-4,5, близкий к оптимуму действия предлагаемого средства (4,0-4,5). За 6 часов обработки при комнатной температуре (20°С) или в течение 12 часов при 4°С степень гидролиза лактозы в кефире и йогурте достигает 85 или 89-91% в зависимости от дозы вносимого препарата. Лактоза в твороге гидролизуется на 97-100% после часа обработки при комнатной температуре (20°С) и на 100% через 12 часов при 4°С.

Из табл.1 также видно, что специфическая активность предлагаемого средства выше, чем у импортного препарата Лактраза фирмы "Шварц Фарма", как при гидролизе лактозы в молоке (на 10-15%), так и при гидролизе лактозы в кисломолочных продуктах (на 5-10%).

Пример 2.

Для изучения специфической активности препарата лактазы в условиях, имитирующих внутреннюю среду организма, в конические колбочки вместимостью 200 мл помещали по 100 г биосубстрата, вносили фермент с суммарной активностью лактазы 2000 ед. и 4000 ед. и добавляли по 10 мл натурального желудочного сока "Эквин" (10% от массы субстрата) (1). Содержимое колбочек перемешивали и помещали в термостат при температуре 37°С на 2 часа, периодически встряхивая. В контрольный опыт фермент не добавляли. В качестве сравнения использовали препарат Лактразу в тех же дозах.

Время обработки ограничили двумя часами, т.к. из литературных данных известно (13), что первые клинические симптомы лактазной недостаточности возникают уже через 1,5-2 ч после употребления молока и других молочных продуктов. Пробы отбирали через каждые 30 минут. В них определяли содержание глюкозы и рассчитывали степень гидролиза лактозы.

Данные по изучению специфической активности предлагаемого средства в условиях, имитирующих среду организма, представлены в табл.2.

В условиях, приближенных к условиям организма (37°С, в присутствии желудочного сока), скорость гидролиза лактозы увеличивалась за счет сдвига температуры в зону оптимальных значений действия фермента. В зависимости от дозы вносимого препарата лактоза молока гидролизовалась на 59% или 75% за 2 часа. За это же время степень гидролиза лактозы в кефире и йогурте достигала соответственно 87 и 91%, а в твороге уже за 1 час было прогидролизовано 94-100% лактозы.

Сравнительный анализ специфического действия предлагаемого средства и Лактразы показал, что предлагаемое средство на 5-15% эффективнее, особенно в отношении лактозы молока.

Таким образом, разработанное средство для коррекции дефицита лактазы обладает высокой специфической активностью в отношении лактозы молока и молочных продуктов, превращая молочный сахар в смесь легкоусвояемых сахаров: глюкозу и галактозу, делая тем самым молочные продукты доступными для людей, страдающих лактазной недостаточностью.

Фармакокинетические исследования, проведенные на 60 беспородных крысах-самцах, показали, что ферментативная активность лактазы в плазме крови подопытных животных не выявляется и основная масса лактазной активности (до 75%) обнаруживается в фекалиях.

Подобрать "модельное" животное для испытаний разработанного средства "in vivo" не представляется возможным, так как подобная патология у животных не выявляется. Чистые линии животных с данной патологией не выведены. Учитывая отсутствие модельных лабораторных животных, имеющих данную патологию, результаты фармакокинетики, свидетельствующие об отсутствии специфической активности лактазы в плазме крови подопытных животных, а также имеющийся опыт использования в заместительной терапии импортных препаратов на основе микробных лактаз, испытания предлагаемого лекарственного средства "in vivo" не проводились.

Доклинические токсикологические исследования предлагаемого средства проведены ООО "ТОКСОФАРМ" на экспериментальной базе лаборатории фармакологии и химиотерапии ГУ НИИНА им. Г.Ф.Гаузе РАМН в соответствии с "Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ", 2000 г. (14). Изучение острой токсичности предлагаемого средства, проведенное на здоровых беспородных крысах-самцах и мышах-самцах SHK показало, что препарат относится к малотоксичным веществам: показатель острой токсичности (ЛД₅₀) у мышей находился на уровне 3250 мг/кг; МПД (ЛД₁₀) - 1710 мг/кг; у крыс ЛД₅₀ составляла 2970 мг/кг; МПД - 1563 мг/кг. При изучении хронической токсичности на здоровых беспородных крысах-самцах было установлено, что введение препарата лактазы внутрь испытуемым животным в терапевтической, 2-кратной и 5-кратной дозах не приводило к нарушению функционального состояния организма подопытных животных и не вызывало изменений показателей периферической крови, биохимических показателей крови, морфологической структуры тканей и органов. Препарат не обладает аллергизирующими, анафилактогенными и иммунотоксическими свойствами, не влияет на основные звенья гуморального и клеточного иммунитета, не оказывает тератогенный и эмбриотоксический эффекты.

На основе представленной в Минздрав РФ документации было получено разрешение на проведение клинических испытаний препарата.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Гальперин С.И. Физиология человека и животных, М., 1970.

2. Валенкевич Л.Н. // Клиническая медицина, 1996, № 8.

3. Коршунов М.Ф., Даркина Е.Е. // Педиатрия, 1997, № 3.

4. Coughlin R.W., Charles M. - In: Immobilized Enzymes for Food Processing / Ed.W.Pitcher - Florida: USA, CRC Press, 1980, p.153-173; Itoh Т., Suzuki M., Adachi S/ - Agric. Biol. Chem., 1982, v.46, N4, p.899-904.

5. Green M.L. // Milk Industry, 1980, v.82, N 3, p.25-31.

6. Collins M.S., Di Palma Y.A., Pierson W.P. et al. // Gastroenterology - 1986 - vol.90 - p.1377-1378.

7. Di Palma Y.A., Collins M.S. // J. Clin. Gastroenterol. - 1989 - vol.11, № 3 - p.290-293.

8. Патент США № 6,410,018 В1 от 25 июня 2002 г.

9. Moskovitz M., Curtis C., Gavaler Y. // Am.J. Gastroenterol. - 1987 - vol.82, № 7 - р.632-635/

10. Kurz G. & Wallenfels K. Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer H.U., Hrsg.) 3.Aufl., Bd.2, S.1225-1229 and S.1324-1327, Verlag Chemie, Weinheim, and (1974) in Methods of Enzymatic Analysis (Bergmeyer, H.U., ed.) 2nd., vol.3, pp.1180-1184 and pp.1279-1282, Verlag Chemie, Weinheim, Academic Press, Inc. New York and London.

11. Beutler H.O. Methoden der enzymatischen Analyse (Bergmeyer H.U., ed.), 3rd ed., Vol.VI, pp.104-112, Verlag Chemie, Weinheim, Deerfield Beach/Florida, Basel.

12. Methods of Biochemical Analysis and Food Analysis. Instruction for the Analysis of Foodstuffs in Research, Production and Official Control. Boehringer Mannheim GmbH, 1989, p.86-88.

13. Козловский А.А. // Мед. Новости, 2001 г., № 1.

14. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Москва, 2000 г.

Изобретение относится к лекарственным средствам, применяемым для лечения и профилактики заболеваний, связанных с недостаточностью или отсутствием в организме человека фермента лактазы. Средство содержит фермент лактазу, выделенную из культуральной жидкости микроскопического гриба Penicilium canescens с активностью не менее 10000 ед./г, и обладает стабильностью в диапазоне рН от 2,5 до 7,0 и температур от 4°С до 60°С. Средство обеспечивает эффективное расщепление лактозы в молоке и молочных продуктах на смесь легкоусвояемых моносахаридов: глюкозу и галактозу, делая молочные продукты доступными для употребления людьми, страдающими лактозной непереносимостью. Фермент стабилен, что позволяет использовать его как для приема внутрь одновременно с употреблением молочных продуктов, так и для предварительной их обработки. 1 з.п. ф-лы, 2 ил., 2 табл.

1. Средство для коррекции дефицита лактазы, представляющее собой высокоочищенный фермент лактазу, отличающееся тем, что лактаза выделена из культуральной жидкости грибного продуцента Penicilium canescens, обладает активностью не менее 10000 ед./г и стабильна в широком диапазоне рН (от 2,5 до 7,0) и температур (от 4 до 60°С).2. Средство по п.1, отличающееся тем, что способно эффективно расщеплять молочный сахар на смесь легкоусвояемых моносахаридов: глюкозу и галактозу, как при пероральном применении, так и при предварительной обработке молока и молочных продуктов перед употреблением.