СПОСОБ ВИЗУАЛИЗАЦИИ ФОРМЕННЫХ ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ ПТИЦ НА ОДНОМ МАЗКЕ Российский патент 2004 года по МПК G01N1/30 

Способ визуализации форменных элементов крови птиц относится к ветеринарии и может быть использован при массовых исследованиях в лабораторной диагностике.

Известны различные способы определения количества форменных элементов крови по окрашенным образцам свежей крови, включающим фиксацию мазков, их окраску и микроскопирование.

Например, окраска по Романовскому-Гимзе позволяет при микроскопировании увидеть эритроциты, лейкоциты, тромбоциты. Однако время окрашивания образцов на выявление эритроцитов и лейкоцитов значительно варьирует от 20 мин до 1 часа (1), (за счет того, что при каждом приготовлении получается краситель с разным титром), а для выявления тромбоцитов длительность окрашивания увеличивается до 1,5-3 ч. Кроме того, этот способ не позволяет обнаружить ретикулоциты.

Окраска по Май-Грюнвальду проводится без предварительной фиксации (краска растворена в метиловом спирте), однако на фоне хорошо окрашенной цитоплазмы эритроцитов ядра прокрашиваются в бледно-голубой цвет, что затрудняет проведение кариометрии.

Окраска по Папенгейму сочетает окраску по Май-Грюнвальду и докрашивание по Романовскому, что увеличивает время проведения исследования, а в результате хорошо окрашивается базофильная структура ядер и специфическая зернистость лейкоцитов, что позволяет применять данный способ для окраски пунктатов костного мозга, при этом невозможно достаточно четко дифференцировать клеточные популяции в периферической крови.

Окраска азур-эозином основана на крашении красителем Романовского, приготовленном на метиловом спирте, при этом фиксация и окрашивание идут одновременно. Недостаток способа: для определения тромбоцитов следует использовать подщелоченный азур-эозин, а для определения эозинофилов - подкисленный азур-эозин, т.е. фактически проводить два исследования.

Окрашивание красителем по Лейшману предполагает использование нефиксированных мазков, так как краска готовится на фиксаторе - метиловом спирте. Этот способ экономичен - окраска мазка занимает 13 мин (первые 3 мин мазок помещают в неразбавленный краситель-фиксатор, в последующие 10 мин докраску производят в разбавленном красителе) (2). Недостаток способа - использование дистиллированной воды для приготовления разбавленного красителя и промывки мазков: несоблюдение рН среды приводит к получению некачественных мазков, что снижает достоверность результатов.

Общим недостатком вышеперечисленных способов является невозможность выявления ретикулоцитов.

В гематологии для подсчета ретикулоцитов в качестве красителей используют: бриллианткрезилблау, метиленовый синий, азур I, азур II.

Окраска мазков крови птиц метиленовым синим, азуром I не позволяет дифференцировать эритроциты и тромбоциты (вследствие одинакового прокрашивания ядер и слабого прокрашивания внутриклеточных структур цитоплазмы).

Окраска красителем бриллианткрезилблау на стекле во влажной камере не позволяет идентифицировать ретикулоциты вследствие слабого прокрашивания клеточных элементов.

За прототип визуализации форменных элементов крови нами выбран способ суправитальной окраски азуром II (способ Алексеева), рекомендованный для одновременного выявления ретикулоцитов и тромбоцитов: первые приобретают синеватый цвет с характерной для них сетчатостью, вторые - фиолетово-розовый (3). Однако окрашивание в меланжере снижает достоверность результатов вследствие механического повреждения клеток крови птицы при перемешивании. Этот способ не позволяет визуализировать клетки лимфоцитарного ряда, что требует для подсчета каждой клеточной популяции крови проведения самостоятельных исследований.

Задачей предлагаемого изобретения является создание способа визуализации форменных элементов крови, позволяющего на одном мазке произвести подсчет лейкоформулы, ретикулоцитов, тромбоцитов, а также эритроцитометрию и кариометрию, что повысит достоверность полученных результатов и сократит сроки исследования.

Для достижения названного технического результата предлагается в способ Алексеева, включающий
- перемешивание крови с красителем азур II (путем трехразового перемещения смеси из меланжера на часовое стекло и обратно в меланжер),
- проведение окрашивания в меланжере в течение 0,5 - 2 ч,
- взбалтывание смеси в меланжере в течение 2 минут,
- сушку сделанных на предметных стеклах мазков,
- фиксацию их метиловым спиртом или раствором краски Май-Грюнвальда в течение 3 минут,
- промывку дистиллированной водой,
- докрашивание по Романовскому-Гимзе в течение 30-45 минут, внести следующие изменения:
- производить окрашивание нестабилизированной крови,
- вместо азур II использовать 1% раствор красителя бриллианткрезилблау,
- перемешивать кровь с красителем (осторожно) в течение 30 с в замкнутом объеме, например в пробирке, при комнатной температуре (18-20^oС),
- окрашивать в течение 20-40 минут,
- мазки, приготовленные и подсушенные на воздухе, фиксировать в течение 3 минут в растворе-фиксаторе по Лейшману;
- докрашивать в течение 10 минут разбавленным раствором красителя по Лейшману, приготовленном на буферном растворе в соотношении 1:1, причем буфер готовится из 0,95% натрия фосфорнокислого двузамещенного и 0,907% калия фосфорнокислого однозамещенного (рН 6,8-7,2);
- вместо дистиллированной воды промывать мазок в том же буфере (для получения качественных мазков важно сохранение одного и того же значения рН среды при окраске и промывке мазка).

Микроскопирование проводить под иммерсией.

Предлагаемый метод исключает артефакты и травмируемость клеток. Значительно лучшее прокрашивание большинства клеточных структур сокращает длительность исследований за счет того, что на одном мазке одномоментно визуализируют все форменные элементы крови, что позволяет провести подсчет лейкоформулы, количества ретикулоцитов, тромбоцитов, а также эритроцитометрию и кариометрию.

Отличительными признаками заявленного способа является то, что окрашивание нестабилизированной крови производят 1% раствором бриллианткрезилблау в течение 20-40 мин при температуре 18-20^oС, причем для обеспечения сохранности клеток крови объединение и ламинарное перемешивание крови с красителем проводят в замкнутом объеме, например в пробирке, в течение 30 с при той же температуре; приготовленный и высушенный мазок фиксируют в концентрированном растворе по Лейшману в течение 3 мин; докрашивают его в разбавленном растворе по Лейшману, приготовленном на буферном растворе, в течение 10 мин, и промывают в том же буферном растворе.

Ламинарное перемешивание красителя и крови позволяет максимально сохранить клетки в недеформированном состоянии и обеспечивает прокрашивание клеточных структур не только эритроидного, но и лимфоцитарного ряда.

Суправитальная окраска позволяет сохранить и выявить внутриклеточные элементы, содержащие рибонуклеопротеиды, в то время как фиксация мазка до окрашивания приводит к их гибели.

Последующая фиксация суправитально окрашенных мазков в растворе-красителе по Лейшману обеспечивает сохранность мазка длительное время и позволяет проводить многократное его микроскопирование.

Докрашивание по Лейшману в разбавленном растворе, приготовленном на буферном растворе, и промывка тем же буферным раствором позволяют сохранять постоянным рН среды и при микроскопировании под иммерсией получить достоверную картину форменных элементов крови благодаря дифференциальному окрашиванию каждого вида клеток и внутриклеточных структур. Предлагаемый способ позволяет визуализировать одномоментно на одном мазке все форменные элементы крови, причем
- эритроциты представляют собой вытянутые эллипсоиды с резко оксифильной цитоплазмой, насыщенной гемоглобином, ядром интенсивного сине-фиолетового цвета с плотной структурой хроматина;
- ретикулоциты - вытянутые эллипсоиды с четко выделяющейся зернисто-ниточной субстанцией в виде синей сеточки на розовом (оксифильном) фоне и ядром от светло-синего до фиолетового цвета;
- базофилы - темно-фиолетовые клетки округлой формы с плохо просматривающимися ядрами из-за зернистости, которая накладывается на ядерные и цитоплазматические структуры;
- эозинофилы - клетки округлой формы с эксцентрично расположенным светло-фиолетовым ядром и светло-голубой цитоплазмой с круглой зернистостью от темно-красного до светло-розового цвета;
- псевдоэозинофилы - с бесцветной цитоплазмой и сегментированным ядром, хроматином светло-фиолетового цвета, светло-розовой зернистостью в виде веретена с острым концом;
- лимфоциты - округлой формы, с цитоплазмой голубого или серо-голубого цвета, ярко выраженной перинуклеарной зоной, ядро округлое, фиолетово-розового цвета;
- моноциты - очень крупные клетки угловато-округлой формы с протоплазмой от голубоватого до серовато-синего цвета, иногда с вакуолями, ядро различной формы, иногда эксцентрично расположенное;
- тромбоциты - мелкие клетки овальной формы с округлым ядром сине-фиолетового цвета, вокруг которого выделяется более светлая перинуклеарная зона, и цитоплазмой, окрашенной в цвета от нежно-розового до серовато-голубого.

Пример способа окрашивания пробы крови для визуализации форменных элементов.

В пробирку вносят 0,1 мл краски 1% бриллианткрезилблау, приготовленного на физиологическом растворе (рН 2,95-3), добавляют 0,1 мл крови и перемешивают в течение 30 с при температуре 18-20^oС, путем осторожного прокручивая пробирки, не допуская при этом резких движений.

Окраску производят при комнатной температуре (18-20^oС) в течение 20-40 минут. Делают мазок на предметном стекле и подсушивают его. Фиксируют в концентрированном растворе красителя-фиксатора по Лейшману в течение 3 минут. Не промывая, помещают мазок для докрашивания на 10 минут в разбавленный раствор красителя по Лейшману, приготовленный на буферном растворе (рН 6,8-7,2). После докраски промывают мазок тем же буферным раствором. Мазок подсушивают и проводят микроскопирование под иммерсией. Для буфера готовится 2 раствора:
1. 9,5 г натрия фосфорнокислого двузамещенного безводного, или 22,7 г натрия фосфорнокислого двузамещенного 12-водного, доводится до 1000 мл дистиллированной водой;
2. 9,07 г калия фосфорнокислого однозамещенного доводится до 1000 мл дистиллированной водой.

В колбу на 1000 мл вносится 63 мл первого раствора и 37 мл второго и доводится до 1000 мл дистиллированной водой (рН полученного раствора должно находиться в пределах 6,8-7,2).

Данные по микроскопированию представлены в таблицах 1-4.

Таким образом, на одном мазке крови, приготовленном по предлагаемому способу, можно провести целый ряд исследований, что позволит уменьшить не только время на проведение исследований, но и сократить расход красителей и реактивов. Одновременно повышается достоверность результатов за счет исключения травмирования и повреждения клеток крови. Фиксация суправитально окрашенных мазков позволяет длительно хранить и многократно исследовать их.

Список литературы
1. Антонов Б.И. и др. Лабораторные исследования в ветеринарии, Справочник, М., Агропромиздат, 1986, 199 с.

2. Болотников И.А. Гематология птиц, Л., Наука, 1980, 116 с.

3. Клинико-лабораторные методы в гематологии, под редакцией В.Г.Михайлова и Г.А.Алексеева, Ташкент, Медицина, 1986 г.

Изобретение относится к области ветеринарии. Пробу нестабилизированной крови суправитально окрашивают красителем бриллиантовым крезиловым синим в течение 20-40 мин при температуре 18-20^oС. При этом предварительное смешивание крови с красителем производят ламинарно в замкнутом объеме в течение 30 с при той же температуре. После приготовления и сушки мазков производят фиксацию в растворе-фиксаторе по Лейшману в течение 3 мин, а затем докрашивают разбавленным буферным раствором с рН 6,8-7,2, состоящим из 0,95% натрия фосфорнокислого двузамещенного и 0,907% калия фосфорнокислого однозамещенного красителя-фиксатора по Лейшману в течение 10 мин. Мазок промывают тем же буферным раствором. Предлагаемый способ позволяет на одном мазке одномоментно визуализировать эритроциты, ретикулоциты, базофилы, эозинофилы, псевдоэозинофилы, лимфоциты, моноциты и тромбоциты. 3 з.п.ф-лы, 4 табл.

1. Способ визуализации форменных элементов крови птиц (тромбоцитов, ретикулоцитов, эритроцитов), включающий перемешивание крови с основным красителем, суправитальное окрашивание, сушку сделанных на предметных стеклах мазков, фиксацию их в течение 3 мин, докрашивание и микроскопирование под иммерсией, отличающийся тем, что окрашивание нестабилизированной крови проводят красителем бриллианткрезилблау при температуре 18-20°С в течение 20-40 мин, причем перемешивание ее с красителем проводят ламинарно в замкнутом объеме в течение 30 с, после сушки мазков фиксируют их в растворе-фиксаторе по Лейшману, докрашивают в течение 10 мин разбавленным раствором красителя–фиксатора по Лейшману, промывают буферным раствором, микроскопируют.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что разбавленный раствор красителя-фиксатора по Лейшману готовят путем разведения его с буферным раствором в соответствии 1:1.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для приготовления раствора красителя–фиксатора по Лейшману и для промывания мазков используют буферный раствор с рН 6,8-7,2, состоящий из 0,95% натрия фосфорнокислого двузамещенного и 0,907% калия фосфорнокислого однозамещенного.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при микроскопировании на мазке одномоментно визуализируют эритроциты в виде вытянутых эллипсоидов с резко оксифильной цитоплазмой, насыщенной гемоглобином, ядром интенсивного сине-фиолетового цвета с плотной структурой хроматина; ретикулоциты в форме вытянутых эллипсоидов с четко выделяющейся зернисто-ниточной субстанцией в виде синей сеточки на розовом (оксифильном) фоне и ядром от светло-синего до фиолетового цвета; базофилы в виде темно-фиолетовых клеток округлой формы с плохо просматривающимися ядрами из-за зернистости, которая накладывается на ядерные и цитоплазматические структуры; эозинофилы в виде клеток округлой формы с эксцентрично расположенным светло-фиолетовым ядром и светло-голубой цитоплазмой с круглой зернистостью от темно-красного до светло-розового цвета; псевдоэозинофилы в виде клеток округлой формы с бесцветной цитоплазмой и сегментированным ядром, хроматином светло-фиолетового цвета, светло-розовой зернистостью в форме веретена с острым концом; лимфоциты в виде клеток округлой формы, с цитоплазмой голубого или серо-голубого цвета, ярко выраженной перинуклеарной зоной, ядро округлое, фиолетово-розового цвета; моноциты в виде клеток угловато-округлой формы с протоплазмой от голубоватого до серовато-синего цвета, иногда с вакуолями, ядро различной формы, иногда эксцентрично расположенное; тромбоциты в виде мелких клеток овальной формы с округлым ядром сине-фиолетового цвета, вокруг которого выделяется более светлая перинуклеарная зона, и цитоплазмой, окрашенной в цвета от нежно-розового до серовато голубого.