СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КИСЛОЙ ФОСФАТАЗЫ ГОМОГЕНАТА ИЗ ОРГАНОВ И ТКАНЕЙ ПЧЕЛ Российский патент 2005 года по МПК G01N33/50 C12Q1/42 

Изобретение относится к области ветеринарной медицины, в частности иммунологии пчел.

Известно определение кислой фосфатазы в тканях [см. Gomori (1952 г.) Ф.Г.Дж.Хейхоу, Д.Кваглино. Гематологическая цитохимия. Лабораторные методы. Пер. с англ. Е.В.Самочатовой, под ред. проф. Н.С. Кисляк. М.: Медицина 1983, с.144-145] на гистологических срезах.

Также известен способ определения кислой фосфатазы в мазках крови и костного мозга человека (см. патент РФ №2196987, G 01 N 33/48, 2003), включающий подготовку биологического субстрата, обработку его буферно-инкубационной смесью с рН, равной 5.0, инкубацию биологического субстрата осуществляют в темноте 2 часа при температуре 37° С, промывают дистиллированной водой, высушивают, дополнительно окрашивают мазки биологического субстрата в течение 0,5-1 мин, затем промывают дистиллированной водой, сушат и по количеству окрашенных гранул в цитоплазме в биологическом субстрате определяют процент активности фермента кислой фосфотазы, микроскопируют и по степеням окрашенности определяют средний цитохимический индекс.

Недостатками данного метода является ограниченные возможности, поскольку нельзя определить активность кислой фосфатазы в тканях пчел.

Техническим решением задачи является расширение технологических возможностей в области иммунологических исследований.

Поставленная задача достигается тем, что в способе определения активности кислой фосфатазы в гомогенате из органов и тканей пчел, включающем, подготовку биологического субстрата, обработку его буферно-инкубационной смесью с рН, равной 5.0, инкубацию биологического субстрата в темноте 2 часа при температуре 37° С, промывание дистиллированной водой, высушивание, дополнительное окрашивание мазков биологического субстрата в течение 0,5-1 мин, затем промывание дистиллированной водой, высушивание и определение по количеству окрашенных гранул в цитоплазме в биологическом субстрате процента активности фермента кислой фосфотазы, микроскопирование и определение по степеням окрашенности среднего цитохимического индекса, в качестве биологического субстрата используют гомогенат из органов и тканей пчел, а для приготовления буферной смеси используют 50,70-48,50 мл 0,1 М раствора монодигидрата лимонной кислоты - цитрат натрия C₆H₈О₇·_{H2О и 49,30-51,50 мл 0,2 М двузамещенного фосфорнокислого натрия Na2HPО4, в который добавляют 24 мг ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), для обеспечения рН 4,8-5,0, при этом ядра клеток платоцитов, находящихся в гомогенате органов и тканей, докрашивают в красный цвет краской - 0,5% нейтральным красным, приготовленным на забуференном с рН 4,8-5,0 физиологическом растворе в течение 0,5-1 минуты, затем промывают дистиллированной водой, сушат и по количеству окрашенных гранул в цитоплазме платоцитов, находящихся в гомогенате из органов и тканей, в красно-коричневый, мембраны - в сине-фиолетовый, ядра которых докрашены в голубой цвет, определяют активность фермента кислой фосфатазы по среднему цитохимическому индексу.}

Новизна заявляемого способа обусловлена тем, что определение активности кислой фосфатазы в мазках, полученных из гомогената тканей и органов, имеет важное значение в диагностике иммунобиологической реактивности организма пчел в разные физиологические периоды. Снижение иммунитета влечет за собой нарушение гомеостаза организма и вытекающие из него последствия: снижение сохранности жизнеспособности взрослых пчел, работоспособности, репродуктивной способности и т.д. Кроме того, обеспечивается возможность определения активности кислой фосфатазы в гомогенате из органов и тканей у пчел наиболее быстрым и точным по сравнению с известным методом определения кислой фосфатазы в сыворотке крови у теплокровных животных как с научной, так и с экономической стороны, за счет подбора сочетания солей, обладающих буферными свойствами с получением определенного рН системы и не способных ингибировать активность определяемого фермента, кроме того, осуществляют дополнительно окраску ядер клеток в мазках из гомогената органов и тканей 0,5%-забуференным буферной смесью - лимонной кислоты, двузамещенного особ может быть экспресс методом для проведения цитохимического анализа активности кислой фосфатазы в гомогенате у пчел. Применение методики основано на взаимодействии кислой фосфатазы с α -нафтилфосфатом натрия. Фосфатаза катализирует гидролиз α -нафтилфосфата натрия с образованием α -нафтола и фосфорнокислого двузамещенного натрия. Для активации кислой фосфатазы в систему вводили буферную смесь, предложенную нами, состоящую из лимонной кислоты, которая является естественным субстратом клеточных ферментов, участвующая в основном при внутриклеточном дыхании в синтезе АТР, а фосфатазы катализируют процессы с участием АТР. В буферную смесь входит 50,70-48,50 мл 0,1 М раствора монодигидрата лимонной кислоты - цитрат натрия С₆H₈О₇·_{Н2О и 49,30-51,50 мл 0,2 М двузамещенного фосфорнокислого натрия Na2HPО4 для обеспечения рН 4,8-5,0, в который добавляют 24 мг ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), который ингибирует щелочную фосфатазу. α -Нафтол взаимодействует с красителем нейтральным прочным синим В с образованием комплексного соединения азокрасителя. Образовавшийся комплекс (азокраситель) окрашивает кислую фосфатазу, содержащуюся внутри в виде гранул в цитоплазме платоцитов.}

Предложенный способ показывает непосредственное содержание изучаемого фермента в гомогенате из органов и тканей у пчел. Определяется активность кислой фосфатазы в плагоцитах гемолимфы по четырем ступеням.

Сущность изобретения поясняется чертежами, где представлены окрашенные гранулы по степеням: фиг.1 - 0-я степень; фиг.2 - 1-я степень; фиг.3 - 2-я степень; фиг.4 - 3-я степень; фиг.5 - 4-я степень.

Подготовка мазков гомогената из органов и тканей и их фиксация

Для получения гомогената из органов и тканей (не обездвиженных эфиром пчел, чтобы активность фермента не снизилась) у пчел удаляли наружный покров глазными ножницами и пинцетом, затем удаляли кишечник. Ткани и органы, полученные от десяти пчел, помещали в ручной стеклянный гомогенизатор и добавили физиологический раствор из расчета 1:1 забуференный буферной смесью - лимонной кислоты, двузамещенного фосфорнокислого натрия и ЭДТА (рН=4,8-5,0), затем осторожным движением тефлонового пестика вверх и вниз, чтобы не вылилось содержимое, гомогенизировали в течение 1-2 минут.

Из гомогената готовили мазок. Для этого каплю гомогената наносили на край сухого обезжиренного стекла, которое удерживали между большим и средним пальцами левой руки. Впереди капли под углом 45° подводили шлифованный край покровного стекла так, чтобы образовавшийся угол между стеклами был равномерно заполнен гомогенатом. Движением правой руки от себя каплю распределяли тонким слоем по предметному стеклу. Хорошим мазком будет такой, в котором гомогенат располагается на поверхности стекла без просветов, в виде равномерной полоски, не выходящей за ее края. Мазки с гомогенатом сушат на воздухе и фиксируют в парах 40% формалина в течение 3-5 минут. Для этого на дно эксикатора наливают около 150 мл формалина, оставляют под закрытой крышкой на 30 минут для возгонки паров формалина. Затем осторожно снимают крышку и на решетку эксикатора помещают мазки и закрывают крышкой. Таким образом, фиксируются мазки.

Приготовление буферных растворов

В начале проводили калибровку иономера рН-150. В состав буферной смеси входили 50,70-48,50 мл 0,1 М раствор монодигидрат лимонной кислоты - цитрат натрия (C₈H₈O₇·_{H2O) и 49,30-51,50 мл 0,2 М двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na2HP04), в который добавляют 24 мг ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), для обеспечения рН 4,8-5,0.}

Приготовление забуференного физиологического раствора

Берут 0,9 г хлорида натрия, к которому добавляют 99,1 мл буферной смеси лимонной кислоты, двузамещенного фосфорнокислого натрия и ЭДТА (рН=4,8-5,0), хорошо перемешивают.

Приготовление 0,5% забуференного раствора метиленовой сини

Берут 0,5 г метиленовой сини 99,5 мл забуференного (буферной смесью лимонной кислоты, двузамещенного фосфорнокислого натрия и ЭДТА с рН=4,8-5,0) физиологического раствора (рН=4,8-5,0).

Приготовление инкубационной смеси

Правильное приготовление инкубационной смеси имеет немаловажное значение для дальнейшей окраски мазков. Готовить инкубационную смесь желательно в затемненной комнате. Для ее приготовления готовят раствор 1 и 2.

Приготовление раствора 1

Берут 2,0-2,5 мг α -нафтилфосфата натрия, для растворения добавляли 1,6 мл дистиллированной воды и 1,3 мл ацетона (для полного растворения α -нафтилфосфата), добавляют 1,5 мл буферной смеси небольшими порциями, перемешивая.

Приготовление раствора 2

Берут 5 мг красителя нейтрального прочного синего В и растворяют его в 5 мл буферной смеси, смешивая их постепенно (рН=5,0).

Полученные растворы смешивают и фильтруют в темноте желательно через стеклянный фильтр.

Инкубация мазков гомогената

На фиксированные формалином мазки гомогената наносится равномерным слоем инкубационная смесь, и их помещают во влажную камеру, которая готовится следующим образом: для этого берут стерильную чашку Петри, на дно которой кладут хорошо смоченную дистиллированной водой фильтровалную бумагу, и на нее помещают мазки гемогената и закрывают крышкой чашки Петри.

Инкубацию мазков проводят в темноте 2-2,5 часа при температуре 37,5° С, промывают дистиллированной водой, высушивают, дополнительно окрашивают мазки из гомогената краской 0,5% метиленовым синим, приготовленным на забуференном с рН=4,8-5,0 физиологическом растворе в течение 0,5-1 минуты, затем промывают дистиллированной водой, сушат и по количеству окрашенных гранул в цитоплазме платоцитов в красно-коричневый, мембраны - в сине-фиолетовфый, ядра клеток докрашены в голубой цвет определяют активность фермента кислой фосфатазы по среднему цитохимическому индексу.

Микроскопия мазков

Микроскопия проводят с использованием иммерсионной системы при увеличении (90× 15).

Результаты полученных данных при микроскопии мазков.

Активность кислой фосфатазы определяют и по количеству окрашенных гранул в цитоплазме платоцитов в красно-коричневый, мембраны - в сине-фиолетовый, ядра клеток докрашены в голубой цвет, определяют активность фермента кислой фосфатазы по среднему цитохимическому индексу.

Визуально проводят оценку цитохимической реакции следующим образом:

0-я степень - окрашено только ядро в голубой цвет, цитоплазма не окрашена, контуры мембраны слабо окрашены в серо-фиолетовый цвет;

1-я степень - вся цитоплазма диффузно окрашена в красно-коричневый цвет, контуры мембраны окрашены в сине-фиолетовый цвет, ядро в голубой цвет;

2-я степень - в цитоплазме видны хорошо окрашенные гранулы в красно-коричневый цвет, окрашено более цитоплазмы, контуры мембраны интенсивно окрашены в сине-фиолетовый цвет, в голубой цвет;

3-я - всю цитоплазму занимают гранулы, окрашенные в красно-коричневый цвет, но ядро свободно 3/4 и более цитоплазмы, контуры мембраны интенсивно окрашены в сине-фиолетовый цвет, в голубой цвет;

4-я степень - гранулы занимают всю цитоплазму и наслаиваются на ядро, окрашены в красно-коричневый цвет, контуры мембраны интенсивно окрашены в сине-фиолетовый цвет, в голубой цвет.

Средний цитохимический индекс выводят по следующей формуле,

предварительно подсчитывая 100 платоцитов:

где а, б, в, г, д - количество клеток соответственно 0, 1, 2, 3, 4-ой степени. Пример расчета среднего цитохимического индекса у пчел Серо] горной кавказской породы:

При расчете данного примера не активных платоцитов, т.е. нулевых (0) было подсчитано в мазке гемолимфы в количестве 33 клеток, первой степени - 9, второй степени - 10 клеток, третьей степени - 16 клеток, четвертой степени - 32 клеток. Таким образом, средний цитохимический индекс активности кислой фосфатазы составил 2,05.

Активность кислой фосфатазы в платоцитах гемолимфы у пчел,(m+m; n=10)Породы пчелСредний цитохимический индексИтало-карпатская помесь первого поколения2,59±0,05Карпатская порода2,58±0,09Приокская2,13±0,05Серая горная кавказская2,05±0,01

Данная методика позволяет экспресс-методом определить микробицидные свойства организма пчел, в частности определение активности кислой фосфатазы в платоцитах, находящихся в гомогенате из органов и тканей. В платоцитах, находящихся в органах и тканях, содержится больше кислой фосфатазы, чем в платоцитах, находящихся в сосудах. Определение активности кислой фосфатазы в мазках гомогената из органов и тканей является одним из важных тестов диагностики иммуннитета организма пчел. Высокие показатели среднего цитохимического индекса указывают на активность фермента кислой фосфатазы в органах и тканях у пчел, по которому можно судить о состоянии иммунного статуса организма пчел.

Способ относится к области ветеринарной медицины, в частности биохимии. Способ заключается в обработке мазков буферной смесью, инкубации в темноте 2 часа, промывании дистиллированной водой, высушивании, дополнительном окрашивании 0,5% метиленовым синим, промывании, высушивании, определении активности фермента по количеству окрашенных гранул. Способ позволяет расширить технологические возможности в области иммунологических исследований. 5 ил., 1 табл.

Способ определения активности кислой фосфатазы гомогената из органов и тканей пчел, включающий подготовку мазков биологического субстрата, обработку их буферной смесью, для приготовления которой используют 50,7-48,5 мл 0,1 М раствор цитрата натрия и 49,3-51,5 мл 0,2 М двухзамещенного фосфорнокислого натрия, с добавлением 24 мг ЭДТА для достижения рН 4,8-5,0, инкубацию в темноте 2 ч при температуре 37°С, промывание дистиллированной водой, высушивание, дополнительное окрашивание мазков 0,5%-ным метиленовым синим, приготовленным на физрастворе с рН 4,8-5,0 в течение 0,5-1 мин, последующее промывание дистиллированной водой, высушивание и определение активности фермента кислой фосфатазы по количеству окрашенных гранул в цитоплазме платоцитов.