СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/569 G01N33/533 

Изобретение относится к области медицины, а именно микробиологии и иммунологии, и может быть использовано в практическом здравоохранении для выявления антител к сальмонеллам групп А, В, С, D, E у взрослых и детей.

В прикладной иммунологии, практической и научной, и бактериологической работе тестирование антител к сальмонеллам групп А, В, С, D, Е проводят в РА, РНГА.

Биргер М.О. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования - М.: Медицина, 1982, -462 с.

Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических методов исследования. - М.: Медицина, 1988, - 440 с.

Покровский В. И., Килессо В.А., Ющук Н.Д. Сальмонеллезы. - Ташкент: Медицина, 1989, - 344 с.

Известен способ-прототип выявления антител к сальмонеллам, полученных по способу, защищенному патентом 2175558 от 27.11.2000 г., заключающийся в применении в иммунофлуоресцентной реакции микроагг-лютиинации (ИФРМА) флуоресцирующих комплексных и моногрупповых диагностикумов, содержащих в наполнителе нормальную кроличью сыворотку.

По способу-прототипу стандартизованная и отконтролированная взвесь флуоресцирующих комплексных и моногрупповых сальмонеллезных диагностикумов содержит нормальную кроличью сыворотку до конечной концентрации 0,1%.

Недостатком применения способа-прототипа являются неспецифические реакции в ИФРМА с сыворотками больных, содержащих антитела к гетерогенным возбудителям кишечной группы, что обусловлено наличием перекрестно-реагирующих детерминант у сальмонелл и кишечной группы микроорганизмов. Это делает невозможным достоверное определение антител в начальных разведениях сыворотки крови при их невысоких титрах (см. таблицу).

Изобретение направлено на решение задач: повышения чувствительности и специфичности способа; выявления специфических антител в низких разведениях сыворотки, начиная с цельного; сокращении расходов диагностикумов.

Указанные задачи достигаются за счет использования ИФРМА, отличающейся тем, что постановку реакции проводят с флуоресцирующими комплексным и моногрупповыми диагностикумами, в состав которых вместо нормальной кроличьей сыворотки введены Fab-фрагменты иммуноглобулинов к гетерологичным микроорганизмам кишечной группы. Последние взаимодействуют с перекрестно-реагирующими детерминантами диагностикума и блокируют их, обеспечивая взаимодействие в реакции только специфических детерминант диагностикума с соответствующими антителами к сальмонеллам с образованием агглютинатов. Полученные комплексы антител и флуоресцирующих комплексного и моногрупповых сальмонеллезных диагностикумов исследуют в люминесцентном микроскопе и при наличии агглютинатов, содержащих 25 и более флуоресцирующих сальмонелл, диагностируют сальмонеллез. Реакцию ИФРМА ставят в объеме не менее 2 мкл, начиная с цельного разведения сыворотки крови.

Способ осуществляют следующим образом. Для постановки используют лиофилизированные флуоресцирующие комплексный и моногрупповые сальмонеллезные диагностикумы, содержащие в наполнителе 0,1% Fab-фрагментов иммуноглобулинов к гетерологичным микроорганизмам кишечной группы, полученные из агглютинирующих эшерихиозных ОК сывороток.

Постановку ИФРМА с сухими диагностикумами осуществляют следующим образом: на предметные стекла (разграфленные на 8 квадратов), помещенные в открытую влажную камеру, наносят по 2 мкл последовательных разведении исследуемых сывороток от цельного до 1:640, Затем к каждой капле разведений сыворотки добавляют по 2 мкл флуоресцирующего сальмонеллезного диагностикума группы А, капли перемешивают и камеру закрывают Затем камеру с предметными стеклами помещают в термостат (t=37^oС), где выдерживают в течение 60 мин. После этого камеру открывают, капли на стеклах высушивают и препараты просматривают в поле зрения люминесцентного микроскопа. Аналогичную постановку осуществляют с флуоресцирующими сальмонеллезными диагностикумами других групп В, С, D, Е и комплексным.

При наличии в сыворотке специфических (к сальмонеллам гомологичного вида) антител наблюдают образование агглютинатов, содержащих флуресцирующие сальмонеллы.

Оценку результатов проводят по количеству сальмонелл в агглютинате и наличию отдельно расположенных сальмолнелл.

Учет результатов проводят по альтернативной шкале оценки при условии просмотра 8-10 полей зрения:
+ поля зрения заполнены агглютинатами крупной и средней величины (25 и более сальмонелл в одном агглютинате) и единичными отдельно расположенными сальмонеллами;
- поля зрения заполнены мелкими агглютинатами (менее 25 сальмонелл в одном агглютинате) и большим количеством отдельно расположенных сальмонелл или сальмонеллы во всех полях зрения располагаются отдельно.

Титром сыворотки считают ее максимальное разведение, которое вызывает агглютинацию диагностикума с содержанием 25 и более флуоресцирующих сальмонелл в одном агглютинате. При наличии в исследуемой сыворотке агглютинатов указанной величины диагностируют сальмонеллез.

Постановка реакции должна сопровождаться нижеследующими контролями:
1. Заведомо положительный контроль: стандартная диагностическая сыворотка + флуоресцирующие сальмонеллезные диагностикумы, титр сыворотки должен подтвердиться.

2. 3аведомо отрицательный контроль: сыворотка, не содержащая специфических антител + флуоресцирующие сальмонеллезные диагностикумы. Агглютинаты отсутствуют.

3. Контроль диагностикумов: физиологический раствор + флуоресцирующие диагностикумы. Агглютинаты отсутствуют.

Продолжительность постановки реакции 1 ч 10 мин.

Примеры конкретного исполнения
Пример 1.

Больной Д., 11 лет, поступил в клинику в 1-й день болезни. Заболел остро. Утром появилась тошнота, недомогание, затем рвота, которая появилась за день дважды, жидкого стула не было.

При поступлении состояние средней тяжести, температура 38,5^oС. В сознании. Кожа чистая, эластичность кожи и тургор сохранены. Пульс 108 ударов в 1 мин. Язык суховат, обложен серо-белым налетом. Живот при пальпации мягкий, болезненный в области эпигастрии и подвздошной областях, урчит по ходу толстого кишечника. Печень у края реберной дуги, селезенка не пальпируется. Диурез сохранен. Стула на приеме не было, с первых суток в отделении - водянистый, желтый, без патологических примесей, затем кашицеобразный, с 6 суток оформленный. Субфибрильно температурил в течение 7 дней.

В общем анализе крови лейкоцитоз 10,3•10⁹ г/л, нейтрофилез со сдвигом влево до п/я - 29%, значительно ускоренная СОЭ - 39 мм/ч.

Общий анализ мочи без изменений.

В копроцитограмме слизь +++, непереваренные углеводы ++.

Бак. анализ кала 3-кратно отрицат.

Серологические исследования.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, обнаружены агглютинаты, содержащие 30-45 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:320 (титр1:320). Выявлены неспецифические реакции в разведении 1:80 с возбудителями кишечной группы (эшерихии).

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом с Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, зарегистрированы агглютинаты, содержащие 30-50 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:320 (титр 1:320), начиная с цельного разведения сыворотки. Неспецифические реакции с эшерихиями не наблюдались.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованиями сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е (титр 1:320).

Поставлен диагноз сальмонеллез, желудочно-кишечная форма (гастроэнтероколит) средней тяжести, острое течение. Выписан в удовлетворительном состоянии.

Пример 2
Больная М., 1 г. 8 мес, поступила в клинику на 6-й день болезни с жалобами на повышение температуры тела до 39^oС, рвота до 3 раз в сутки, жидкий стул с зеленью и слизью до 5 раз в сутки. Заболела остро с повышения температуры до 38^oС, появления жидкого стула. Лечились в течение 5 дней амбулаторно фуразолидоном, смектой, парацетамолом - без эффекта. Направлена в стационар.

Состояние при поступлении средней тяжести, вялая, аппетит снижен, кожные покровы бледные, эластичность кожи и тургор сохранены. Язык влажный, чистый. Живот мягкий безболезненный. Печень у края реберной дуги, селезенка не пальпирунтся. Диурез сохранен. Стул жидкий, желтый, с большим количеством мутной слизи в течение 4 дней в стационаре, затем кашицеобразный, а с 7суток - оформленный.

В OAK лейкоциты - 6.8•10⁹г/л, п/я - 5%, с/я - 30%, л - 54%, м - 10%, э - 1%, СОЭ - 22 мм/ч, умеренно ускорена.

В ОАМ лейкоциты 4-6 П/зр., белок - отр., бактерии +, фосфаты +++.

Бак. анализ кала 4-кратно отрицат.

Серологические анализы. В ИФРМА на 14 день болезни с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, выявлены агглютинаты, содержащие 35-50 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:1280 (титр 1:1280). Отмечены неспецифические реакции с эшерихиями в титре 1:40.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, обнаружены агглютинаты, содержащие 40-50 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:1280 (титр 1:1280). Реакции с эшерихиями отсутствуют, начиная с цельного разведения сыворотки.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованиями сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е (титр 1:1280).

Поставлен диагноз: сальмонеллез, гастроэнтероколитическая форма, средней тяжести (клинически и серологически), острое течение. Больная выписана из стационара в удовлетворительном состоянии.

Пример 3
Больной К., 7 лет, поступил в клинику на 2-й день болезни с жалобами на повышение температуры тела до 39^oС, боли в животе, рвоту, жидкий стул до 3-4 раз в сутки. Состояние при поступлении средней тяжести, температура 37,4^oС, вялый, аппетит снижен, кожа чистая, бледная, язык влажный, обложен серо-белым налетом. Живот при пальпации мягкий, болезненный по ходу толстого кишечника, печень на 2 см ниже края реберной дуги, селезенка не пальпируется. Стул на приеме и в последующие 3 суток в отделении жидкий, с зеленью и слизью.

В общем анализе крови лейкоциты 8,1•10⁹ г/л, нейтрофилез со сдвигом влево до п/я - 42%, СОЭ - 15 мм/ч.

В общем анализе мочи изменений невыявлено.

Бак. анализ кала 4-кратно отрицательный.

Серологические анализы: в ИФРМА на 7-й день болезни с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, обнаружены агглютинаты, содержащие 25 - 40 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:640 (титр 1:640). Наблюдали неспецифические реакции в разведении до 1:80 с возбудителями кишечной группы (эшерихиями).

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, наблюдали агглютинаты, содержащие 32-65 флуоресцирующие сальмонеллы в разведении 1:640 (титр 1:640). Неспецифические реакции с эшерихиями не отмечены, начиная с цельного разведения сыворотки.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованиями сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е (титр 1:640).

Поставлен диагноз: сальмонеллез,, гастроэнтероколитическая форма, средней тяжести (клинически и серологически), острое течение. Выписан из отделения на 11 сутки в удовлетворительном состоянии.

Пример 4
Больная А., 4 года, поступила в клинику с жалобами на повышение температуры до 39^oС, многократную рвоту, жидкий, водянистый стул на 2-й день болезни. Заболела остро. Состояние при поступлении средней тяжести, температура 37,9^oС. Кожные покровы бледные с мраморным рисунком, эластичность кожи и тургор сохранены. Язык сухой, обложен серо-белым налетом. Тахикардия до 120 в мин. Живот при пальпации мягкий, болезненный в левой подвздошной области, сигмовидная кишка спазмирована.

В общем анализе крови лейкоцитоз 12,6•10⁹ г/л, нейтрофилез со сдвигом влево до п/я - 40%, ускоренная СОЭ до 25 мм/ч.

В копроцитограмме слизь, непереваренные углеводы, бактерии.

Бак. анализ кала 3-кратно отриц.

Серологические анализы.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, обнаружены агглютинаты, содержащие 25-40 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1:160 (титр 1:160) Наблюдали неспецифические реакции в разведении до 1:20 с возбудителями кишечной группы (эшерихиями).

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, наблюдали агглютинаты, содержащие 30-60 флуоресцирующие сальмонеллы в разведении 1:160 (титр 1:160). Неспецифические реакции с эшерихиями не отмечены, начиная с цельного разведения сыворотки.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованиями сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е (титр 1:160).

Поставлен диагноз: сальмонеллез, гастроэнтероколитическая форма, средней тяжести (клинически и серологически), острое течение. Выписан из отделения на 11 сутки в удовлетворительном состоянии.

Пример 5
Больная Б., 1 г. 3 мес, поступила в клинику на 2-ые сутки от начала заболевания с жалобами на боли в животе, частый жидкий стул, повышение температуры до 38^oС. Заболела остро. Врачом скорой помощи госпитализирована в детское хирургическое отделение для исключения острого аппендицита из-за сильных болей в животе, где наблюдалась в течение суток.

В общем анализе крови наблюдался лейкоцитоз до 16,3•10⁹ г/л, п/я - 38%, СОЭ - 40 мм/ч.

За время наблюдения боли уменьшились, диагноз острого аппендицита был снят и девочка переведена в нашу клинику с острой кишечной инфекцией. Состояние при поступлении средней тяжести. Кожа и видимые слизистые физиологической окраски, влажные. Тургор тканей сохранен. Тахикардия до 124 в мин на фоне температуры 38^oС. В ротоглотке умеренная гиперемия дужек и миндалин. Склерит. Язык обложен серо-белым налетом. Живот мягкий, безболезненный, печень 1 см, селезенка не пальпируется. Диурез сохранен. Стул в первые сутки в стационаре до 5 раз в сутки, жидкий, зеленый, со слизью и прожилками крови, с 3 суток - кашицеобразный, с 5 суток - оформленный.

В общем анализе крови лейкоцотоз сменился лейкопенией до 5.7•10⁹ г/л, п/я - 10%, лимфоцитоз, СОЭ - 2 мм/ч.

В копроцитограмме увеличение лейкоцитов до 15-20 в п/зр., непереваренные углеводы+, бактерии+, эритроциты 10-15 в п/зр.

Бак. анализ кала 3-кратно отрицат.

Серологические исследования.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, обнаружены агглютинаты, содержащие 35-40 флуоресцирующих сальмонелл в разведении 1: 320 (титр 1:320). Наблюдали неспецифические реакции в разведении до 1:20 с возбудителями кишечной группы (эшерихиями).

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, наблюдали агглютинаты, содержащие 28-55 флуоресцирующие сальмонеллы в разведении 1:320 (титр 1:320). Неспецифические реакции с эшерихиями не отмечены, начиная с цельного разведения сыворотки.

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованиями сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е (титр 1:320).

Полученные результаты подтверждены контрольными исследованими сыворотки в РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е, в которой титр 1:320, проба с унитиолом - отрицательная.

Поставлен диагноз: сальмонеллез (клинически и серологически), энтероколитическая форма, средней тяжести, острое течение. Выписана в удовлетворительном состоянии
Пример 6
Больная А. , 2 г. 2 мес, поступила в клинику с жалобами на повышение температуры до 38^oС. До этого в течение 2-х недель лечилась амбулаторно по поводу ОРВИ симптоматическими средствами. Состояние при поступлении средней тяжести, температура 38,3^oС. Кожа бледная, чистая. Слизистые влажные. Зев гиперемирован. Из носа слизистое отделяемое. Язык чистый, влажный. Живот мягкий, безболезненный. Печень +2 см, селезенка не пальпируется. Диурез сохранен. Стула не приеме не было. В отделении утром и в 1-е сутки поступления жидкий стул, темно-коричневый с тяжами слизи и прожилками крови. Из анамнеза стало известно, что накануне заболевания кормили творогом со сметаной, купленными в магазине. В дальнейшем стул в отделении жидкий, водянистый с хлопьями мутной слизи до 7 раз в сутки в течение 2-х дней, затем кашицеобразный и оформленный.

При обследовании в OAK лейкоцитоз до 12,1•10⁹ г/л, нейтрофилез со сдвигом влево до п/я - 18%, СОЭ - 7 мм/ч. Кал на яйца глистов и простейшие отрицательный. Бак. анализ кала 3-кратно отрицательный. Кал на вирусы - ротавирусы не обнаружены.

Серологические исследования.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом, полученным по способу-прототипу, были выявлены агглютинаты, содержащие 8-10 флуоресцирующих сальмонелл, в разведении 1:20, т.е. результаты были отрицательные. Отмечены неспецифические реакции с эшерихиями в разведении 1:20.

В ИФРМА с флуоресцирующим диагностикумом и Fab-фрагментами, полученным по заявленному способу, не наблюдали агглютинатов флуоресцирующих сальмонелл, начиная с цельного разведения сыворотки.

В РНГА с комплексным эритроцитарным сальмонеллезным диагностикумом А, В, С, D, Е титр антител 1:10, при постановке РТНГА со специфическим антигеном торможения реакции не наблюдали, что свидетельствовало о неспецифических результатах, полученных в РНГА.

Поставлен диагноз: инфекционный энтероколит неустановленной этиолгии, средней тяжести, острое течение. Выписана в удовлетворительном состоянии.

Положительный эффект данной методики заключается в повышении чувствительности и специфичности по сравнению со способом-прототипом, возможности регистрировать антитела в цельной сыворотке, что важно при низкой величине титров антител, наблюдающейся у детей, а также в 2-кратном снижении экономических затрат диагностикумово

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики сальмонеллеза. Способ заключается в выявлении антител к сальмонеллам в сыворотке крови посредством иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА) с флуоресцирующими комплексными и моногрупповыми (к антигенам групп А, В, С, D, Е) сальмонеллезными диагностикумами, в состав которых введены Fab-фрагменты иммуноглобулинов к гетерологичным микроорганизмам кишечной группы. При наличии в мазках агглютинатов, содержащих 25 и более флуоресцирующих сальмонелл, диагностируют сальмонеллез. Реакцию ИФРМА ставят в объеме не менее 2 мкл, начиная с цельного разведения сыворотки крови. Преимущество изобретения заключается в повышении чувствительности и специфичности способа. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

1. Способ диагностики сальмонеллеза с помощью иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА) путем взаимодействия специфических антител сыворотки крови с флуоресцирующими комплексным и моногрупповыми сальмонеллезными диагностикумами, отличающийся тем, что в состав диагностикумов введены Fab - фрагменты иммуноглобулинов к гетерологичным микроорганизмам кишечной группы, и при наличии в мазках агглютинатов, содержащих 25 и более флуоресцирующих сальмонелл, диагностируют сальмонеллез.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что реакцию ИФРМА ставят в объеме не менее 2 мкл, начиная с цельного разведения сыворотки крови.