СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА Российский патент 2001 года по МПК A61K39/112 G01N33/532 C12Q1/10 

Описание патента на изобретение RU2175558C1

Изобретение относится к медицине, а именно иммунологии, и может быть использовано при производстве сальмонеллезных диагностических и профилактических препаратов.

В прикладной иммунологии, практической и научной бактериологической работе одним из наиболее распространенных тестов является реакция агглютинации (РА).

Известно получение сальмонеллезных жидких инактивированных (нагреванием, ацетоном, спиртом или формалином) корпускулярных антигенов, очищенных от среды культивирования центрифугированием с последующей стандартизацией [1].

Наиболее близким к заявляемому способу является способ, заключающийся в культивировании сальмонелл на мясопептонном агаре, получении взвеси микробов в 0,9% растворе натрия хлорида после смыва с питательной среды, инактивации их формалином (группы A, B, C, D, E) или спиртом (брюшнотифозные бактерии), центрифугировании инактивированной взвеси после осаждения сальмонелл, стандартизации по оптическому стандарту и изучении специфических свойств в РА [2] . При соответствии результатов исследования регламентированным требованиям взвеси сальмонелл разливали в ампулы и герметизировали.

Однако полученные по способу-прототипу сальмонеллы содержат антигенные структуры, обуславливающие ложноположительные результаты в РА с возбудителями кишечной группы.

Кроме того, для получения диагностикума по способу-прототипу требуются значительные затраты питательных сред и биомассы сальмонелл.

Исходя из этих негативных явлений был предложен экономичный способ получения сальмонеллезного диагностикума, повышающий качество препарата, сокращающий затраты.

Изобретение направлено на решение задачи - получение комплексного сальмонеллезного диагностикума за счет повышения чистоты и специфичности препарата, обусловленных способом очистки. (Таблица 1).

Решение данной задачи заключается в дополнительной обработке взвесей сальмонелл хлороформом, конъюгацией их с флуоресцентным красителем - изотиоцианатом флуоресцеина.

Существенные признаки заявляемого способа:
ограничительные - инактивация сальмонелл, центрифугирование, стандартизация;
отличительные - инактивация сальмонелл всех групп формалином, обработка хлороформом с последующей конъюгацией с флуоресцентным красителем - изотиоцианатом флуоресцеина, многократное центрифугирование до полного отсутствия красителя в надосадочной жидкости.

Способ осуществляется следующим образом: Культуры сальмонелл серогрупп A, B, C, D, E, выращенные на МПА, смывают (каждую в отдельности) 0,9% раствором натрия хлорида, стандартизируют и соединяют в комплексную взвесь. Взвесь сальмонелл A, B, C, D, E инактивируют формалином. После этого из взвеси сальмонелл путем низкоскоростного центрифугирования осаждают агаровые частицы. Надосадочную жидкость, содержащую сальмонеллы, декантируют и подвергают высокоскоростному центрифугированию для осаждения сальмонелл. Полученный осадок ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида и обрабатывают хлороформом для удаления денатурированных белков, а также липидов. Очищенную взвесь сальмонелл центрифугируют, а осадок ресуспендируют и коньюгируют с изотиоцианатом флуоресцеина. По истечении времени конъюгации меченые сальмонеллы отмывают от непрореагировавшего-красителя, стандартизируют и оценивают в иммунофлуоресцентной реакции микроагглютинации (ИФРМА). При получении результатов, соответствующих регламентированным данным, меченые сальмонеллы лиофилизируют. Для проведения исследований с приготовленным диагностикумом на 1000 проб сывороток потребуется 1 мл культуры сальмонелл с концентрацией 20•109 в 1 мл микробной взвеси.

ПРИМЕР 1. Получение целевого продукта по заявляемому способу.

С 1,5 мл скошенного МПА получали 1,0 мл взвесь сальмонелл группы А с концентрацией 20 млрд. в 1 мл микробной взвеси (табл. 1). Полученную взвесь доводили до концентрации 5•109 сальмонелл в 1 мл микробной взвеси. Приготовленные аналогичным образом взвеси сальмонелл групп B, C, D, E объединяли по 1 мл и получали комплексную взвесь. В 8 мл взвеси сальмонелл групп A, B, C, D, E добавляли 0,04 мл формалина и выдерживали в течение 7 суток при температуре +4-10oC. Из инактивированной взвеси осаждали крупные агаровые частицы путем центрифугирования при 1500 об/мин, в течение 10 мин. Надосадочную жидкость, содержащую сальмонеллы, декантировали и центрифугировали при 10000 об/мин, в течение 30 мин с целью осаждения сальмонелл. Полученный осадок ресуспендировали в 8,0 мл 0,9% раствора натрия хлорида. К полученной взвеси добавляли хлороформ до конечной концентрации 0,5%. Смесь встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали при 1500 об/мин, в течение 10 мин для осаждения хлороформа и денатурированных белков. Надосадочную жидкость декантировали и центрифугировали при 10000 об/мин, в течение 30 мин. Осадок сальмонелл ресуспендировали в 8,0 мл забуферного физиологического раствора. В сальмонеллезную взвесь добавляли изотиоцианат флуоресцеина из расчета 2,5 мг на 1•109 микробов. Конъюгацию красителя с сальмонеллами проводили в течение 16 часов при постоянном перемешивании при температуре +4-10oC. После этого взвесь центрифугировали при 10000 об/мин, в течение 30 мин. Образовавшийся осадок ресуспендировали в 8,0 мл забуферного физиологического раствора. Процедуру отмывания путем центрифугирования повторяли до полного отсутствия красителя в надосадочной жидкости. Осадок очищенных меченых сальмонелл ресуспендировали в дистиллированной воде до концентрации 5•109 сальмонелл в 1 мл микробной взвеси и исследовали в ИФРМА на специфическую активность. (Таблица 2).

Как следует из данных, представленных в таблице, серии диагностикумов, полученные по заявленному способу, взаимодействуют со специфическими антителами сывороток крови людей, больных сальмонеллезом, моноспецифическими диагностическими сальмонеллезными сыворотками и не реагируют с гетерологичными и близкородственными антителами диагностических сывороток.

На постановку ИФРМА для скрининга 1000 сывороток потребуется 5 мл флуоресцирующего сальмонеллезного диагностикума с концентрацией 5•109 в 1 мл микробной взвеси.

Таким образом, меченый антиген сальмонелл, полученный по заявленному способу пригоден для применения в качестве диагностикума сальмонеллезного комплексного флуоресцирующего для ИФРМА.

ПРИМЕР 2. Получение целевого продукта по способу-прототипу.

Культуру сальмонелл группы A, выращенную на 45 мл мясопептонного агара, смывали 0,9% раствором натрия хлорида, стандартизировали до концентрации 20•109 сальмонелл в 1 мл. Получали 30 мл взвеси культуры сальмонелл группы A. Приготовленную взвесь инактивировали путем добавления формалина до конечной концентрации 0,5% и выдерживали 7 суток. Затем инактивированную взвесь центрифугировали при 1500 об/мин, в течение 10 мин, отделяли надосадочную жидкость и подвергали ее центрифугированию при 3000 об/мин, в течение 30 мин. Полученный осадок ресуспендировали в 250 мл 0,9% раствора натрия хлорида, стандартизировали до 2•109 сальмонелл в 1 мл микробной взвеси и исследовали в РА. (Таблица 2).

При соответствии результатов регламентированным данным препарат разливали в ампулы по 10 мл и герметизировали.

Аналогичным образом готовили другие сальмонеллезные диагностикумы серогрупп B, C, D, E. Получали по 250 мл диагностикумов групп B, C, D, E с концентрацией 2•109 в 1 мл микробной взвеси.

Как следует из данных таблицы 2, препарат взаимодействовал с сальмонеллезными сыворотками группы A и диагностической сывороткой группы A. Кроме этого, были отмечены ложно-положительные результаты с сыворотками к кишечной группе.

Использованные источники
1. Медуницин Н.В. Брюшнотифозные вакцины. Вакцинология. - М.: Триада - X. - 1999. - С. 172-173.

2. Петросян E.А., Коссова А.К., Ефимова А.А. Разработка метода получения очищенных антигенов в производственных условиях. Поливакцины. - Москва, - 1956. - Т. 8. - С. 245-276.

Похожие патенты RU2175558C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА РИККЕТСИАЛЬНОГО СИБИРИКА КОРПУСКУЛЯРНОГО 1994
  • Пантюхина А.Н.
  • Александрова Л.В.
  • Петров В.Ф.
  • Тарасевич И.В.
  • Яблонская В.А.
RU2122427C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРЕПОНЕМНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА 2002
  • Кутковой В.Б.
  • Тимашева О.А.
  • Мисенжников А.В.
RU2216743C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ САЛЬМОНЕЛЛОНОСИТЕЛЬСТВА У КУР 1998
  • Носырева Л.А.
  • Туркова Н.В.
  • Кокорев В.С.
  • Вахрушева Д.В.
  • Кирсанов Ю.А.
  • Егоров К.Е.
  • Сканчев А.И.
  • Заднишевских Н.Ю.
RU2158133C2
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БРУЦЕЛЛЕЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА 2004
  • Андреевская Нина Михайловна
  • Михайлова Вера Александровна
  • Голубинский Евгений Павлович
  • Калиновский Александр Иннокентьевич
  • Михайлов Леонид Михайлович
  • Белобородов Юрий Владимирович
  • Каретникова Эльвира Семеновна
  • Репина Людмила Петровна
  • Игнатьева Ирина Александровна
  • Юденич Сергей Валентинович
RU2269360C2
СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ХЛАМИДИЙНЫХ ИНФЕКЦИЙ У ЧЕЛОВЕКА 2002
  • Тимашева О.А.
  • Оборина Л.И.
RU2242993C2
Способ получения бруцеллезного полистирольного латексного диагностикума 2022
  • Курноскина Мария Михайловна
  • Жарникова Ирина Викторовна
  • Русанова Диана Владимировна
  • Курчева Светлана Александровна
  • Кошкидько Александра Геннадьевна
  • Даурова Алина Викторовна
  • Пономаренко Дмитрий Григорьевич
  • Жданова Елена Владимировна
  • Жарникова Татьяна Владимировна
  • Беседин Артём Викторович
RU2798124C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИКУМА ЭРИТРОЦИТАРНОГО САПНОГО ИММУНОГЛОБУЛИНОВОГО МОНОКЛОНАЛЬНОГО 2017
  • Савина Елена Владимировна
  • Новицкая Ирина Вячеславовна
  • Храпова Наталья Петровна
  • Кулаков Михаил Яковлевич
  • Топорков Андрей Владимирович
  • Викторов Дмитрий Викторович
RU2658434C1
Способ выявления эндотоксинов грамотрицательных бактерий 1982
  • Лиходед Владимир Гаврилович
  • Гремякова Татьяна Андреевна
  • Саенко Александр Семенович
SU1142122A1
СПОСОБ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ РАДИАЦИОННЫХ ПОРАЖЕНИЙ ОРГАНИЗМА 2001
  • Равилов А.З.
  • Низамов Р.Н.
  • Конюхов Г.В.
  • Титов А.С.
  • Тарасова Н.Б.
  • Мухаметшин И.Р.
  • Шарифуллина Д.Т.
  • Давкаев Р.Ш.
RU2226106C2
ШТАММ БАКТЕРИЙ STREPTOCOCCUS ZOOEPIDEMICUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ БИОПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ СТРЕПТОКОККОЗА НУТРИЙ 1994
  • Есепенок Виктор Арсеньтьевич
RU2097422C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 175 558 C1

Реферат патента 2001 года СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУХОГО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕГО САЛЬМОНЕЛЛЕЗНОГО ДИАГНОСТИКУМА

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано при производстве сальмонеллезных диагностических и профилактических препаратов. Способ заключается в том, что инактивацию сальмонелл осуществляют формалином, очищают хлороформом, центрифугируют и конъюгируют с изотиоционатом флуоресцина. Затем отмывают от непрореагировавшего красителя путем многократного центрифугирования, стандартизуют и лиофилизируют. Техническим результатом является повышение чистоты и специфичности получаемого препарата. 1 з.п. ф-лы, 2 табл.

Формула изобретения RU 2 175 558 C1

1. Способ получения сальмонеллезного диагностикума путем инактивации сальмонелл, их стандартизации и центрифугирования, отличающийся тем, что инактивацию сальмонелл всех групп осуществляют формалином, взвесь сальмонелл очищают хлороформом, очищенную взвесь центрифугируют, осадок, содержащий сальмонеллы, ресуспендируют и конъюгируют с флюоресцентным красителем из расчета 2,5 мг красителя на 1•109 микробных тел и затем отмывают от непрореагировавшего красителя путем многократного центрифугирования, стандартизуют жидкий препарат до концентрации 5•109 микроб.кл./мл, стандартизованный препарат, содержащий меченые сальмонеллы, лиофилизинуют с получением сухого флюоресцирующего сальмонеллезного диагностикума. 2. Способ получения сальмонеллезного диагностикума по п.1, отличающийся тем, что в качестве флюоресцирующего красителя используют изотиоцианат флуоресцина.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2001 года RU2175558C1

ПЕТРОСЯН Е.А
и др
Разработка метода получения очищенных антигенов в производственных условиях
Поливакцины
- М., 1956, т.8, с.245 - 276
ХАЛИТОВА В.И
и др
Диагностика сальмонеллеза у детей с использованием иммунофлуоресцентного метода
Актуальные вопросы педиатрии
- Кишинев, 1988, с.141 и 142
ВОЙТЕНКОВА Е.В
Применение иммунологических методов для диагностики сальмонеллезов
Автореф
канд
дисс
- Л., 1988
WO 8604352 A1, 31.07.1986
КОРОТЯЕВ А.И
Медицинская микробиология иммунология и вирусология
ЩИТОВОЙ ДЛЯ ВОДОЕМОВ ЗАТВОР 1922
  • Гебель В.Г.
SU2000A1

RU 2 175 558 C1

Авторы

Пантюхина А.Н.

Кротова М.Л.

Даты

2001-11-10Публикация

2000-11-27Подача