Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации относится к методам лабораторной диагностики коксиеллеза и может быть использован в ветеринарной медицине.
Известны способы получения эритроцитарных диагностикумов, ранее используемые для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при сальмонеллезе, пастереллёзе животных, описанные в рефератах российских патентных документов за 1994-2008 гг. (M№ 2257581, 2005.07.27, 95117746, 1997.10.10).
Однако у известных способов присутствует ряд недостатков:
1. трудоемкие методы фиксации эритроцитов,
2. неэкономичные и сложные методы сенсибилизации эритроцитов сенситином,
3. проводится танизация.
Наиболее близким в техническом плане к заявляемому способу является бруцеллезный эритроцитарный диагностикум (Красиков А.П. Новые механизмы исскуственной регуляции паразито-хозяинных отношений: дис. доктора вет. наук.: 16.00.03. / А.П.Красиков. - Новосибирск - 1996. - С.97-101), который готовится по следующей схеме:
1. В качестве клеточной основы для приготовления диагностикума применяются эритроциты барана. При формалинизации эритроцитов используется свежая дефибринированная кровь барана - донора, которую разводят 1:1 буферным физиологическим раствором pH - 7,2 (0,137 M хлористый натрий и 0,001 M двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 литр дистиллированной воды).
Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П., которая заключается в более щадящем способе воздействия раствора формальдегида на эритроциты и одновременно обеспечивающая хорошую их фиксацию. Для чего к 100 мл разведенной крови раствор формальдегида добавлялся не сразу, а порциями, в возрастающих объемах, через определенный промежуток времени.
Так, к 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный раствор формальдегида порциями в возрастающих объемах, через каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого внесения смесь перемешивают на водяной бане при 70°C до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным раствором pH 7,2, путем центрифугирования при 3000 об/мин 2-5 мин и ресуспендируют в 400 мл того же буфера. Из осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% 20%-ного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты сохраняют свои сорбционные свойства в течение 5 лет.
2. Второй этап приготовления эритроцитарного диагностикума - получение антигена, который обладает способностью адсорбироваться на эритроцитах. С этой целью используется глубокодиссоциированный вакцинный штамм B.abortus 16/4. Антиген готовят по методике ВНИИБТЖ-ИЭВСиДВ. Для этого девитализированную бактериальную массу центрифугируют при 3000 об/мин в течение 20-30 минут, надосадочную жидкость сливают, а на сырую бактериальную массу воздействуют расплавленным концентрированным фенолом (ХЧ) в соотношении 1:1.
Бактериальную массу с фенолом выдерживают 30-40 мин при 80-85°C на водяной бане. Затем добавляют дистиллированную воду, нагретую до 70°C, в таком количестве, чтобы остаточная концентрация фенола в растворе составила 5%. После фильтрации смеси проводят ее диализ при комнатной температуре в целлофановых мешочках против десяти объемов дистиллированной воды в течение 48 часов. Диализат используют в качестве антигена.
3. Танизацию эритроцитов исключают из цикла приготовления эритроцитарного диагностикума в связи с низким содержанием белка в полученном антигене.
Для нагрузки формалинизированных эритроцитов бруцеллезный антиген разводят 1:10 буферным раствором с pH 6,4. Данной дозой антигена сенсибилизируют эритроциты в соотношении 2:1 (2 объема антигена, 1 объем эритроцитов). Сенсибилизация проводится на водяной бане при температуре 70°C, в течение 30 мин при перемешивании взвеси через каждые 5 мин. За 10 мин до конца сенсибилизации для закрепления сенситина на эритроцитах добавляют 1% 40%-ного раствора формальдегида. Полученный эритроцитарный диагностикум трехкратно отмывают буферным раствором с pH 7,2 с добавлением отрицательной на бруцеллез нормальной кроличьей сыворотки в соотношении 1:250 путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут и доводят тем же буфером до 3%-ной концентрации эритроцитов с добавлением 1% формальдегида с целью закрепления антигена на эритроцитах.
Цель изобретения - получение коксиеллезного эритроцитарного диагностикума для выявления антител в сыворотке крови крупного рогатого скота.
Данная цель реализуется в несколько этапов:
1. дробная формалинизация эритроцитов барана,
2. получение антигена из вакцинного штамма C.burnetii M-44 путем прогревания его на водяной бане при 70°C в течение 30 мин,
3. сенсибилизация формалинизированных эритроцитов барана, без предварительной танизации коксиеллезным антигеном, при 70°C в течение 30 мин, с последующим трехкратным отмыванием эритроцитарного диагностикума буферным раствором с pH 7,2 без добавления нормальной кроличьей сыворотки.
Описание метода:
1. Для формалинизации (фиксации) эритроцитов берут свежую дефибринированную кровь барана-донора, которую разводят буферным физиологическим раствором в соотношении 1:1, pH 7,2 (0,137 M NaCl и 0,001 M двузамещенный фосфорнокислый калий на 1 литр дистиллированной воды). Фиксацию эритроцитов проводят по методу Фили в модификации Красикова А.П.
Затем к 100 мл 50% взвеси эритроцитов барана добавляют 20%-ный раствор формальдегида, небольшими порциями в возрастающих объемах, каждые 15 минут: 6, 7, 8, 9 и 10 мл. После каждого добавления раствора формальдегида смесь перемешивают на водяной бане при 70°C до получения темно-коричневого цвета. Взвесь эритроцитов 4-кратно отмывают фосфатно-буферным солевым раствором pH 7,2, путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 5 минут, а затем ресуспензируют в 400 мл того же буфера. Из полученного осадка готовят 10% рабочую взвесь на буферном физиологическом растворе, содержащем 0,3% 20%-ного раствора формальдегида. При данном способе фиксации эритроциты в течение 5 лет сохраняют свои сорбционные свойства.
2. Коксиеллезный антиген получают из вакцинного штамма C.burnetii М-44, инактивируют его путем прогревания на водяной бане при 70°C в течение 30 мин. Затем разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 1,7 млрд микробных клеток в 1 мл по бактериальному стандарту мутности (ГИСК им. Л.А.Тарасевича). В качестве рабочего используют разведение 850 млн микробных клеток в 1 мл. Полученный антигенный препарат используют для сенсибилизации формалинизированных эритроцитов.
3. Для нагрузки 3% формалинизированных эритроцитов их сенсибилизируют в соотношении 2:1 (2V антигена: 1V эритроцитов). Сенсибилизацию проводят на водяной бане при температуре 70°C в течение 30 мин, с перемешиванием взвеси каждые 5 минут. За 10 минут до конца сенсибилизации добавляют 1% 40%-ного раствора формальдегида для закрепления сенситина на эритроцитах.
Эритроциты, нагруженные антигеном трехкратно отмывают от несвязавшихся сенситинов фосфатно-буферным солевым раствором с pH 7,2 путем центрифугирования при 3000 об/мин, затем ресуспендируют в этом же растворе, доводя до первоначальной 3% концентрации и используют для постановки РНГА макрометодом в объеме 0,5 мл на полистироловых планшетах.
Испытуемые сыворотки, после освобождения от неспецифических гемагглютининов путем инактивации в течение 20 мин при 56°C, разводят в двукратной последовательности, начиная с разведения 1:10, фосфатно-буферным раствором с pH 7,2. К каждому разведению добавляют по одной капле (0,05 мл) эритроцитарного диагностикума, тщательно перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре на 1,5-2 часа. Реакция оценивается по четырехкрестной системе. Конечным титром считают последнее разведение сыворотки, дающее гемагглютинацию на три креста.
Определены специфичность и активность четырех серий (C-1-C-4) коксиеллезного эритроцитарного диагностикума (КЭД) в РНГА (табл.1, 2).
Преимущество данного эритроцитарного диагностикума в специфичности и активности в РНГА при коксиеллезе крупного рогатого скота.
Контроль на чувствительность и активность КЭД в РНГА
Для контроля чувствительности и активности полученного эритроцитарного диагностикума проводят постановку РНГА. Реакцию ставят макрометодом в объеме 0,5 мл в полистироловых планшетах с коксиеллезными сыворотками кроличьей и крупного рогатого скота, начиная с разведений 1:10 и 1:50 соответственно. В качестве разбавителя применяют фосфатный буфер с pH 7,2. В качестве контроля используют этот же буфер и заведомо отрицательные на коксиеллез сыворотки кролика и крупного рогатого скота.
С коксиеллезными антисыворотками полученный диагностикум реагирует на три креста до разведения 1:1280 с кроличьей и 1:800 с сывороткой крупного рогатого скота. С отрицательными сыворотками отмечается положительная реакция до разведений 1:20 и 1:200 соответственно. В контроле с буферным раствором четко выраженная отрицательная реакция наблюдается во всех разведениях (табл.1).
Контроль на специфичность КЭД в РНГА
Для контроля специфичности полученных серий коксиеллезного эритроцитарного диагностикума ставят РНГА с гетерологичными сыворотками. КЭД в РНГА не вызывает перекрестных реакций с бруцеллезной, пастереллезной, лептоспирозной, листериозной, сальмонеллезной и хламидиозной гетерологичными сыворотками, во всех разведениях РНГА отрицательная при четко выраженных положительных реакциях с гомологичными коксиеллезными сыворотками. Поэтому за диагностический (патологический) титр принимается разведение сыворотки 1:40 и выше для кроличьей сыворотки и 1:400 для крупного рогатого скота (табл.2).
Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) при коксиеллезе крупного рогатого скота состоит из дробной формалинизации эритроцитов барана и сенсибилизации их коксиеллезным антигеном при 70°С в течение 30 минут. Для сенсибилизации используют эритроциты, которые нагружают сенситином, полученным из вакцинного штамма C.burnetii M-44, прогретым на водяной бане при 70°С в течение 30 минут, с последующим трехкратным отмыванием эритроцитарного диагностикума буферным раствором с рН - 7,2. Изобретение обеспечивает повышение специфичности и активности диагностикума в РНГА при коксиеллезе крупного рогатого скота. 2 табл.
Способ получения эритроцитарного диагностикума для реакции непрямой гемагглютинации при коксиеллезе крупного рогатого скота, состоящий из дробной формалинизации эритроцитов барана и сенсибилизации их коксиеллезным антигеном при 70°С в течение 30 мин, причем для сенсибилизации используют эритроциты барана, которые нагружают сенситином из вакцинного штамма Coxiella burnetii M-44, прогретого на водяной бане при 70°С в течение 30 мин, с последующим трехкратным отмыванием диагностикума фосфатно-буферным солевым раствором с рН 7,2.
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ (РНГА) ПРИ САЛЬМОНЕЛЛЕЗАХ ЖИВОТНЫХ | 2003 |
|
RU2257581C2 |
| ПАСТЕРЕЛЛЕЗНЫЙ АНТИТЕЛЬНЫЙ ЭРИТРОЦИТАРНЫЙ ДИАГНОСТИКУМ И СПОСОБ ЕГО ПРИГОТОВЛЕНИЯ | 1995 |
|
RU2110801C1 |
| КАРАЛЬНИК Б.В | |||
| с соавт | |||
| Эритроцитарные белковые диагностикумы | |||
| Изд | |||
| "Наука" Казахской ССР, Алма-Ата, 1982, с.63-72. | |||
