Текст описания в факсимильном виде (см. графическую часть)н
Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в медицинской практике и касается полипептида, который выводится через почки и не содержит в своей исходной форме Fc-области IgG. Исходный полипептид модифицируют так, чтобы включить спасательный рецепторсвязывающий эпитоп Fc-области IgG и посредством этого увеличить циркуляторное время полужизни. Модифицированный полипептид содержит аминокислотную последовательность Ig-домена или Ig-подобного, который не является СН2-доменом, и аминокислотную последовательность спасательного рецепторсвязывающего эпитопа Fc-области IgG, расположенную в пределах Ig-домена или Ig-подобного домена. Аминокислотная последовательность модифицированного полипептида, по меньшей мере, на 70% идентична таковой исходного полипептида. Раскрыт способ получения указанного полипептида с использованием ДНК (в конструкции вектора), кодирующей указанный полипептид. Полученный полипептид может использоваться для лечения опосредованного LFA-1 нарушения у млекопитающих, в том числе человека. Изобретение позволяет увеличить время полужизни полипептида, за счет чего повышается эффективность лечения. 8 с. и 17 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 табл.
1. Модифицированный полипептид, обладающий увеличенной продолжительностью времени полужизни in vivo и характеризующийся тем, что он получен на основе представляющего интерес полипептида, который не содержит Fc-область IgG и выводится через почки, причем аминокислотная последовательность представляющего интерес полипептида модифицирована таким образом, что она содержит а) аминокислотную последовательность Ig-домена или Ig-подобного домена, который не является СН2-доменом, и б) аминокислотную последовательность спасательного рецепторсвязывающего эпитопа Fc-области IgG, которая расположена в пределах Ig-домена или Ig-подобного домена, где аминокислотная последовательность модифицированного полипептида, по меньшей мере, на 70% идентична аминокислотной последовательности представляющего интерес полипептида и его биологическая активность сохраняется.2. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что Ig-домен или Ig-подобный домен содержит домен CH1.3. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп происходит из одной или двух петель Fc-области и расположен в Ig-домене или Ig-подобном домене.4. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп происходит из СН2-домена Fc-области, модифицированный полипептид дополнительно включает CH1-, СН3- или VH-область и указанный эпитоп расположен в CH1-, СН3- или Vн-области или в нескольких таких областях Ig-домена или Ig-подобного домена.5. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп происходит из СН2-домена Fc-области и расположен в Ig-домене или Ig-подобном домене.6. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является Fab, (Fab’)2, диантителом, Fv-фрагментом, одноцепочечным Fv-фрагментом или рецептором.7. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является антагонистом LFA-1.8. Модифицированный полипептид по п.7, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является Fab или (Fab’)2 антитела против LFA-1.9. Модифицированный полипептид по п.8, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является анти-CD18 Fab или анти-CD18(Fab’)2.10. Модифицированный полипептид по п.9, отличающийся тем, что представляющий интерес полипептид является человеческим или гуманизированным.11. Модифицированный полипептид по любому одному из пп.1-10, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп содержит последовательность PKNSSMISNTR (SEQ ID NO:3).12. Модифицированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп дополнительно содержит последовательность HQSLGTQ (SEQ ID NO:11).13. Модифицированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп дополнительно содержит последовательность HQNLSDGK (SEQ ID NO:1).14. Модифицированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп дополнительно содержит последовательность HQNISDGK (SEQ ID NO:2).15. Модифицированный полипептид по п.11, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп дополнительно содержит последовательность VISSHLGQ (SEQ ID NO:31).16. Модифицированный полипептид по п.1, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп содержит последовательности HQNLSDGK (SEQ ID NO:1), HQNISDGK (SEQ ID NO:2), HQSLGTQ (SEQ ID NO:11) или VISSHLGQ (SEQ ID NO:31) и последовательность PKNSSMISNTP (SEQ ID NO:3).17. Модифицированный полипептид по п.16, отличающийся тем, что спасательный рецепторсвязывающий эпитоп слит с представляющим интерес полипептидом.18. Молекула ДНК, кодирующая модифицированный полипептид по любому из пп.1-16.19. Реплицируемый вектор, содержащий молекулу ДНК по п.18.20. Способ получения модифицированного полипептида по любому из пп.1-17, включающий культивирование клеток, содержащих кодирующую указанный модифицированный полипептид нуклеиновую кислоту, в культуральной среде и извлечение указанного модифицированного полипептида из культуральной среды, клеток или как из культуральной среды, так и из клеток.21. Способ получения модифицированного полипептида по любому из пп.1-15, включающий изменение представляющего интерес полипептида таким образом, что он содержит спасательный рецепторсвязывающий эпитоп Fc-области IgG и имеет увеличенное время полужизни in vivo.22. Способ по п.21, отличающийся тем, что стадию изменения проводят с помощью сайт-направленного, кассетного или PCR-мутагенеза.23. Способ получения модифицированного полипептида по п.1, включающий (а) идентификацию последовательности и конформации спасательного рецепторсвязывающего эпитопа Fc-области молекулы IgG, где указанный эпитоп происходит из СН2-домена Fc-области; б) изменение последовательности указанного представляющего интерес полипептида, который выводится через почки и не содержит Fc-область IgG, с целью включения последовательности и конформации идентифицированного связывающего эпитопа; (в) проверку измененного полипептида со стадии (б) на предмет более длительного времени полужизни in vivo, чем у представляющего интерес полипептида; (г) если измененный полипептид не обладает более длительным временем полужизни in vivo, дальнейшее изменение последовательности представляющего интерес полипептида с целью дальнейшего включения последовательности и конформации идентифицированного связывающего эпитопа и проверку на предмет увеличения времени полужизни in vivo до тех пор, пока не получат более длительное время полужизни in vivo.24. Способ лечения опосредованного LFA-1 нарушения, характеризующийся тем, что млекопитающему, нуждающемуся в лечении, вводят эффективное количество модифицированного полипептида по любому из пп.1-15.25. Способ лечения опосредованного LFA-1 нарушения, характеризующийся тем, что пациенту, нуждающемуся в лечении, вводят эффективное количество модифицированного полипептида по любому из пп.1-15.
