ВАРИАНТЫ КОШАЧЬИХ АНТИТЕЛ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/00 C07K16/24 C07K16/22 A61P11/00 A61P29/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет относительно предварительной заявки на патент США №63/011491, поданной 17 апреля 2020 года, содержание которой включено в данный документ посредством ссылки во всей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0002] Данное изобретение в целом относится к вариантам кошачьих антител и их применению. В частности, данное изобретение относится к мутации в константной области Fc кошачьего антитела для улучшения его периода полужизни и других характеристик.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0003] Кошачьи моноклональные антитела (мАт) IgG разрабатываются в качестве эффективных терапевтических агентов в ветеринарной медицине. Несколько лет назад были идентифицированы и охарактеризованы подклассы кошачьих IgG (Strietzel et al., 2014, Vet Immunol Immunopathol., vol. 158(3-4), pages 214-223). Однако было проделано не так много работы по продлению периода полужизни кошачьих IgG.

[0004] Посредством механизма рециркуляции неонатальный рецептор Fc (FcRn) продлевает период полужизни IgG в рН-зависимом взаимодействии с областью его кристаллизующегося фрагмента (Fc). В частности, область Fc, охватывающая границу раздела доменов СН2 и СН3, взаимодействует с FcRn на поверхности клеток, регулируя гомеостаз IgG. Данному взаимодействию способствует кислотное взаимодействие после пиноцитоза IgG, и, таким образом, IgG защищен от деградации. Подвергшийся эндоцитозу IgG затем рециркулирует обратно на поверхность клетки и высвобождается в кровоток при щелочном рН, тем самым поддерживая достаточное количество IgG в сыворотке крови для надлежащего функционирования. Соответственно, фармакокинетический профиль IgG зависит от структурных и функциональных свойств их областей Fc.

[0005] Кошачий FcRn связывают три подкласса кошачьих IgG, которые сравнивали с аналогами IgG человека. Период полужизни кошачьих IgG еще предстоит полностью изучить, поскольку без какой-либо экспериментальной поддержки нельзя ожидать или предсказать, будут ли они точно совпадать с IgG человека.

[0006] Увеличенный период полужизни IgG обеспечивает возможность менее частого введения дозы и (или) введение более низкой дозы антитела лекарственного препарата, что, в свою очередь, сокращает количество визитов к ветеринару, улучшает комплаентность пациентов и снижает зависящую от концентрации цитотоксичность / нежелательные явления.

[0007] Соответственно, существует потребность в идентификации мутаций в константных областях Fc для улучшения периода полужизни.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Данное изобретение относится к мутантным кошачьим IgG, которые обеспечивают более высокую аффинность к FcRn и более длительный период полужизни по сравнению с кошачьими IgG дикого типа. В частности, авторы данного изобретения обнаружили, что замещение аминокислотного остатка серина (Ser или S) в положении 428 или 434 другой аминокислотой удивительно и неожиданно повысило аффинность к FcRn и, таким образом, увеличило период полужизни IgG.

[0009] В одном аспекте данного изобретения представлен модифицированный IgG, содержащий: константный домен кошачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 428 или 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату. В иллюстративном варианте осуществления данного изобретения указанное замещение представляет собой замещение серина в положении 428 лейцином (S428L). В другом иллюстративном варианте осуществления данного изобретения указанное замещение представляет собой замещение серина в положении 434 гистидином (S434H). В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный константный домен кошачьего IgG содержит замещения серина как в положении 428, так и в положении 434 лейцином и гистидином, соответственно.

[00010] В другом аспекте данного изобретения представлен полипептид, содержащий: константный домен кошачьего IgG, содержащий одно или большее число аминокислотных замещений по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, при этом указанные одно или большее число замещений находятся в аминокислотных остатках 428, 434, или их комбинации.

[00011] В еще одном аспекте данного изобретения представлены антитело или молекула, содержащие: константный домен кошачьего IgG, содержащий одно или большее число аминокислотных замещений по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, при этом указанные одно или большее число замещений находятся в аминокислотных остатках 428, 434, или их комбинации.

[00012] В дополнительном аспекте данного изобретения представлен способ получения или создания антитела или молекулы, способ, включающий в себя: обеспечение наличия вектора или клетки-хозяина, содержащих константный домен кошачьего IgG, при этом указанный константный домен кошачьего IgG содержит одно или большее число аминокислотных замещений по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, при этом указанные одно или большее число замещений находятся в аминокислотных остатках 428, 434, или их комбинации.

[00013] В другом аспекте данного изобретения представлен способ увеличения периода полужизни антител в сыворотке крови кошки, способ, включающий в себя: введение указанной кошке терапевтически эффективного количества антитела, содержащего константный домен кошачьего IgG, при этом указанный константный домен кошачьего IgG содержит одно или большее число аминокислотных замещений по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, при этом указанные одно или большее число замещений находятся в аминокислотных остатках 428, 434, или их комбинации.

[00014] Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и из следующих графических материалов. Тем не менее, следует понимать, что подробное описание и конкретные примеры, указывающие на предпочтительные варианты осуществления данного изобретения, приведены только в качестве иллюстрации, поскольку различные изменения и модификации в духе и объеме данного изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники из данного подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[00015] Данный патент или заявка на патент содержит по меньшей мере одно цветное изображение. Копии данного патента или данной патентной публикации с цветным (-и) изображением (-ями) будут предоставлены уполномоченной патентной организацией после запроса и уплаты необходимых сборов.

[00016] На фиг. 1 показана доменная структура IgG. В домене СН3 произведены мутации Fc S428L и (или) N434H для увеличения периода полужизни IgG путем повышения аффинности к FcRn при рН6

[00017] На фиг. 2А показано выравнивание аминокислотных последовательностей IgG1 дикого типа (ДТ) человека, кошачьего IgG1a ДТ, кошачьего IgG1b ДТ, кошачьего IgG2 ДТ и мутантного кошачьего IgG2, имеющего мутацию в шарнире. Аминокислотные остатки пронумерованы в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату. Аминокислотные остатки СН1, шарнира, СН2 и СН3 выделены красным, фиолетовым, синим и зеленым, соответственно. На фиг. 2В показана нуклеотидная последовательность Fc кошачьего IgG1a ДТ. На фиг. 2С показана нуклеотидная последовательность Fc кошачьего IgG1a S434H. На фиг. 2D показана нуклеотидная последовательность Fc кошачьего IgG1a S428L.

[00018] На фиг. 3 показаны индивидуальные концентрации мАт1 IgG ДТ в сыворотке крови у 8 кошек- 4 самцов (G00397, G00398, G00399, G00400) и 4 самок (G00425, G00426, G00427, G00428) - после трех инъекций (п/к, п/к, в/в) дозой по 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 98 суток.

[00019] На фиг.4 показаны индивидуальные концентрации мАт1 IgG ДТ в сыворотке крови у 8 кошек- 4 самцов (G00417, G00418, G00419, G00420) и 4 самок (G00445, G00446, G00447, G0448) - после трех инъекций (п/к, п/к, в/в) дозой по 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 98 суток.

[00020] На фиг. 5 показаны индивидуальные концентрации мАт2 ДТ в сыворотке крови у 3 кошек после однократной подкожной инъекции дозы в 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 30 суток.

[00021] На фиг. 6 показаны индивидуальные концентрации мАт2 S428L в сыворотке крови у 3 кошек после однократной подкожной инъекции дозы в 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 30 суток.

[00022] На фиг. 7 показаны индивидуальные концентрации мАт3 IgG ДТ в сыворотке крови у 8 кошек - 4 самцов (G00453, G00454, G00455, G00456) и 4 самок (G00457, G00458, G00459, G00460) - после трех инъекций (п/к, п/к, в/в) дозой по 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 98 суток.

[00023] На фиг. 8 показаны индивидуальные концентрации мАт3 IgG S434H в сыворотке крови у 8 кошек - 4 самцов (G00469, G00470, G00471, G00472) и 4 самок (G00473, G00474, G00475, G0476) - после трех инъекций (п/к, п/к, в/в) дозой по 2 мг/кг, измеренные на протяжении периода в 98 суток.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[00024] SEQ ID NO.: 1 представляет собой аминокислотную последовательность константного домена мутантного IgG1a, имеющего мутацию S428L.

[00025] SEQ ID NO.: 2 представляет собой аминокислотную последовательность константного домена мутантного IgG1a, имеющего мутацию S434H.

[00026] SEQ ID NO.: 3 представляет собой аминокислотную последовательность константного домена IgG1a дикого типа.

[00027] SEQ ID NO.: 4 представляет собой нуклеотидную последовательность константного домена IgG1a дикого типа.

[00028] SEQ ID NO.: 5 представляет собой аминокислотную последовательность домена CH1 IgG1a.

[00029] SEQ ID NO.: 6 представляет собой аминокислотную последовательность шарнирного домена IgG1a.

[00030] SEQ ID NO.: 7 представляет собой аминокислотную последовательность домена СН2 IgG1a.

[00031] SEQ ID NO.: 8 представляет собой аминокислотную последовательность домена СН3 IgG1a ДТ.

[00032] SEQ ID NO.: 9 представляет собой нуклеотидную последовательность домена СН1 IgG1a.

[00033] SEQ ID NO.: 10 представляет собой нуклеотидную последовательность шарнирного домена IgG1a.

[00034] SEQ ID NO.: 11 представляет собой нуклеотидную последовательность домена СН2 IgG1a.

[00035] SEQ ID NO.: 12 представляет собой нуклеотидную последовательность домена СН3 IgG1a ДТ.

[00036] SEQ ID NO.: 13 представляет собой нуклеотидную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00037] SEQ ID NO.: 14 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00038] SEQ ID NO.: 15 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00039] SEQ ID NO.: 16 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00040] SEQ ID NO.: 17 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной области тяжелой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00041] SEQ ID NO.: 18 представляет собой нуклеотидную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00042] SEQ ID NO.: 19 представляет собой аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00043] SEQ ID NO.: 20 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00044] SEQ ID NO.: 21 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00045] SEQ ID NO.: 22 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 вариабельной области легкой цепи антитела против ИЛ-31 (ZTS-5864).

[00046] SEQ ID NO.: 23 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела против фактора роста нервов (ФРН, англ. «NGF») (ZTS768).

[00047] SEQ ID NO.: 24 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи антитела против ФРН (ZTS768).

[00048] SEQ ID NO.: 25 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи антитела против ФРН (ZTS768).

[00049] SEQ ID NO.: 26 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи антитела против ФРН (ZTS768).

[00050] SEQ ID NO.: 27 представляет собой аминокислотную последовательность легкой цепи антитела против ФРН (ZTS768).

[00051] SEQ ID NO.: 28 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 легкой цепи антитела против ФРН (ZTS768).

[00052] SEQ ID NO.: 29 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 легкой цепи антитела против ФРН (ZTS768).

[00053] SEQ ID NO.: 30 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 легкой цепи антитела против ФРН (ZTS768).

[00054] SEQ ID NO.: 31 представляет собой аминокислотную последовательность тяжелой цепи антитела против ФРН (NV02).

[00055] SEQ ID NO.: 32 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 тяжелой цепи антитела против ФРН (NV02).

[00056] SEQ ID NO.: 33 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 тяжелой цепи антитела против ФРН (NV02).

[00057] SEQ ID NO.: 34 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 тяжелой цепи антитела против ФРН (NV02).

[00058] SEQ ID NO.: 35 представляет собой аминокислотную последовательность цепи каппа антитела против ФРН (NV02).

[00059] SEQ ID NO.: 36 представляет собой аминокислотную последовательность CDR1 цепи каппа антитела против ФРН (NV02).

[00060] SEQ ID NO.: 37 представляет собой аминокислотную последовательность CDR2 цепи каппа антитела против ФРН (NV02).

[00061] SEQ ID NO.: 38 представляет собой аминокислотную последовательность CDR3 цепи каппа антитела против ФРН (NV02).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[00062] Данное изобретение можно легче понять, обратившись к следующему подробному описанию, которое является частью данного документа. Следует понимать, что данное изобретение не ограничено конкретными продуктами, способами, условиями или параметрами, описанными и (или) показанными в данном документе, и что терминология, употребляемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления данного изобретения в качестве примера и не предназначена для ограничения заявленного изобретения.

[00063] Если в данном документе не определено иное, научные и технические термины, употребляемые в связи с данной заявкой, имеют значения, которые обычно понимаются рядовыми специалистами в данной области техники. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе включают в себя множественное число, а термины во множественном числе включают в себя единственное число.

[00064] Как указано выше и по всему тексту данного документа, следующие термины и сокращения, если не указано иное, следует понимать как имеющие следующие значения.

Определения

[00065] В данном документе формы единственного числа включают в себя ссылку на множественное число, и ссылка на конкретное числовое значение включает в себя по меньшей мере указанное конкретное значение, если контекст явно не указывает на иное. Следовательно, например, ссылка на «молекулу» или «соединение» является ссылкой на одну или большее число таких молекул или соединений и их эквивалентов, известных специалистам в данной области техники, и так далее. При употреблении в контексте данного документа термин «множество» означает больше чем один. При указании диапазона, другой вариант осуществления данного изобретения включает в себя интервал от одного конкретного значения и (или) до другого конкретного значения. Подобным образом, когда значения указаны как приблизительные величины с использованием предшествующего слова «около», следует понимать, что конкретное значение образует другой вариант осуществления данного изобретения. Все диапазоны являются включающими и могут комбинироваться.

[00066] В описании и формуле данного изобретения нумерация аминокислотных остатков в тяжелой цепи иммуноглобулина соответствует индексу ЕС, как по Кабату - как в работе Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991). «Индекс EC, как по Кабату» относится к нумерации остатков в антителе IgG и отражен в данном документе на фиг. 2А.

[00067] Термин «выделенная», когда он употребляется по отношению к нуклеиновой кислоте, представляет собой нуклеиновую кислоту, которая идентифицирована и отделена по меньшей мере от одной загрязняющей нуклеиновой кислоты, с которой она обычно ассоциирована в своем природном источнике. Выделенная нуклеиновая кислота пребывает в форме или в окружении, которые отличны от тех, в которых она встречается в природе. Следовательно, молекулы выделенной нуклеиновой кислоты отличаются от молекулы нуклеиновой кислоты, существующей в естественных клетках. Молекула выделенной нуклеиновой кислоты включает в себя молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетках, которые обычно экспрессируют закодированный в них полипептид, когда, например, указанная молекула нуклеиновой кислоты находится в плазмиде или в хромосомном расположении, отличном от расположения в естественных клетках. Выделенная нуклеиновая кислота может присутствовать в одноцепочечной или двухцепочечной форме. Когда молекула выделенной нуклеиновой кислоты предназначена для использования в экспрессии белка, соответствующий олигонуклеотид или полинуклеотид будет содержать, как минимум, смысловую или кодирующую цепь, но может содержать как смысловую, так и антисмысловую цепи (т.е. может быть двухцепочечным).

[00068] Молекула нуклеиновой кислоты является «функционально связанной» или «функционально ассоциированной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другой молекулой нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если он влияет на транскрипцию данной последовательности; или сайт связывания рибосомы функционально связан с кодирующей последовательностью нуклеиновой кислоты, если он расположен так, чтобы облегчить ее трансляцию. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая вариант области Fc, функционально связана с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей гетерологичный белок (т.е. белок или его функциональный фрагмент, которые если существуют в природе, то не содержат область Fc), если она расположена так, что экспрессируемый слитый белок содержит указанные гетерологичный белок или его функциональный фрагмент, примыкающие либо в положении 5', либо в положении 3' к указанному вариантному полипептиду области Fc; указанный гетерологичный белок может непосредственно примыкать к указанному вариантному полипептиду области Fc или может быть отделен от него линкерной последовательностью любых длины и состава. Подобным образом, молекула полипептида (употребляется в данном документе как синоним термина «белок») является «функционально связанной» или «функционально ассоциированной», когда она находится в функциональной взаимосвязи с другим полипептидом.

[00069] При употреблении в контексте данного документа термин «функциональный фрагмент», употребляемый по отношению к полипептиду или белку (например, вариантной области Fc или моноклональному антителу), относится к фрагментам такого белка, которые сохраняют по меньшей мере одну функцию указанного полноразмерного полипептида. Размер фрагментов может варьировать от шести аминокислот до всей аминокислотной последовательности полноразмерного полипептида минус одна аминокислота. Функциональный фрагмент полипептида вариантной области Fc согласно данному изобретению сохраняет по меньшей мере одно «аминокислотное замещение», как определено в данном документе. Функциональный фрагмент полипептида вариантной области Fc сохраняет по меньшей мере одну известную в данной области техники функцию, связанную с областью Fc (например, АЗКЦ, КЗЦ, связывание с рецептором Fc, связывание с C1q, подавление рецепторов клеточной поверхности или может, например, увеличивать период полужизни in vivo или in vitro полипептида, с которым он функционально ассоциирован).

[00070] Термин «очищенный» или «очистка» относится к существенному удалению из образца по меньшей мере одного загрязняющего вещества. Например, антигенспецифическое антитело может быть очищено путем полного или существенного удаления (по меньшей мере 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% или больше, предпочтительно по меньшей мере 96%, 97%, 98% или 99%) по меньшей мере одного загрязняющего белка, не являющегося иммуноглобулином; оно также может быть очищено путем удаления белка иммуноглобулина, который не связывается с тем же антигеном. Удаление белков, не являющихся иммуноглобулинами, и (или) удаление иммуноглобулинов, которые не связывают конкретный антиген, приводит к повышению процентного содержания антигенспецифических иммуноглобулинов в данном образце. В другом примере полипептид (например, иммуноглобулин), экспрессируемый в бактериальных клетках-хозяевах, очищают путем полного или существенного удаления белков клеток-хозяев; следовательно, процентное содержание указанного полипептида в данном образце повышается.

[00071] Термин «нативный» при употреблении по отношению к полипептиду (например, к области Fc), употребляется в данном документе, чтобы указать, что данный полипептид имеет аминокислотную последовательность, состоящую из аминокислотной последовательности полипептида, обычно встречающегося в природе, или его встречающегося в природе полиморфизма. Нативный полипептид (например, нативная область Fc) может быть получен рекомбинантным способом или может быть выделен из природного источника.

[00072] Термин «вектор экспрессии» при употреблении в контексте данного документа относятся к рекомбинантной молекуле ДНК, содержащей желаемую кодирующую последовательность и соответствующие последовательности нуклеиновых кислот, необходимые для экспрессии данной функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине.

[00073] При употреблении в контексте данного документа термин «клетка-хозяин» относится к любой эукариотической или прокариотической клетке (например, бактериальные клетки, такие как Е. coli, клетки СНО, клетки дрожжей, клетки млекопитающих, клетки птиц, клетки амфибий, клетки растений, клетки рыб и клетки насекомых), независимо от того, находятся ли они in vitro, in situ или in vivo.

[00074] При употреблении в контексте данного документа термин «область Fc» относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. «Область Fc» может представлять собой нативную последовательность области Fc или вариантную область Fc. Хотя общепринятые границы области Fc тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, область Fc тяжелой цепи кошачьего IgG обычно определяется как простирающаяся, например, от аминокислотного остатка в положении 231 до его карбоксильного конца. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения варианты содержат только части области Fc и могут включать в себя или не включать в себя карбоксильный конец. Область Fc иммуноглобулина, как правило, содержит два константных домена СН2 и СН3. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения представлены варианты, имеющие один или большее число константных доменов. В других вариантах осуществления данного изобретения представлены варианты без таких константных доменов (или только с частями таких константных доменов).

[00075] «Домен СН2» области Fc кошачьего IgG, как правило, простирается, например, примерно от аминокислоты 231 до примерно аминокислоты 340 (см. фиг. 2А). Домен СН2 уникален тем, что он не связан тесно с другим доменом. Две N-связанные разветвленные углеводные цепи расположены между двумя доменами СН2 интактной нативной молекулы IgG.

[00076] «Домен СН3» области Fc кошачьего IgG, как правило, представляет собой участок остатков, находящийся в С-концевом положении относительно домена СН2 в области Fc, простирающейся, например, примерно от аминокислотного остатка 341 до примерно аминокислотного остатка 447 (см. фиг. 2А).

[00077] «Функциональная область Fc» обладает «эффекторной функцией» нативной последовательности области Fc. По меньшей мере одна эффекторная функция полипептида, содержащего вариант области Fc согласно данному изобретению, может быть усилена или снижена по сравнению с полипептидом, содержащим нативную область Fc или родительскую область данного варианта Fc. Примеры эффекторных функций включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: связывание C1q; комплемент-зависимую цитотоксичность (КЗЦ, англ. «CDC»); связывание рецептора Fc; антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АЗКЦ, англ. «ADCC»); фагоцитоз; снижение экспрессии рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора ВКР, англ. «BCR») и т.д. Такие эффекторные функции могут требовать того, чтобы область Fc была функционально связана со связывающим доменом (например, вариабельным доменом антитела), и их можно оценить с использованием различных анализов (например, анализ связывания Fc, анализы АЗКЦ, анализы КЗЦ, деплеция целевых клеток из образцов цельной или фракционированной крови и т.д.).

[00078] «Нативная последовательность области Fc» или «область Fc дикого типа» относятся к аминокислотной последовательности, которая идентична аминокислотной последовательности области Fc, обычно встречающейся в природе. Иллюстративные нативные последовательности кошачьих областей Fc показаны на фиг. 2А и включают в себя, например, нативную последовательность области Fc кошачьего IgG1a.

[00079] «Вариант области Fc» содержит аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности области Fc (или ее фрагмента) по меньшей мере одним «аминокислотным замещением», как определено в данном документе. В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения указанный вариант области Fc имеет по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с нативной последовательностью области Fc или по сравнению с областью Fc родительского полипептида, предпочтительно - 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотных замещений в нативной последовательности области Fc или в области Fc родительского полипептида. В альтернативном варианте осуществления данного изобретения вариант области Fc может быть сгенерирован в соответствии с описанными в данном документе способами, и указанный вариант области Fc может быть слит с гетерологичный полипептидом по выбору, таким как вариабельный домен антитела или полипептид, не являющийся антителом, например, связывающий домен рецептора или лиганда.

[00080] При употреблении в контексте данного документа термин «производное» в контексте полипептидов относится к полипептиду, который содержит аминокислотную последовательность, которая была изменена введением замещения аминокислотного остатка. Термин «производное» при употреблении в контексте данного документа также относится к полипептиду, который был модифицирован путем ковалентного присоединения к данному полипептиду молекулы любого типа. Например, но не в порядке ограничения, антитело может быть модифицировано, например, путем гликозилирования, ацетилирования, пэгилирования, фосфорилирования, амидирования, дериватизации известными защитными / блокирующими группами, протеолитического расщепления, связывания с клеточным лигандом или другим белком и т.д. Производный полипептид может быть получен путем химических модификаций с использованием методик, известных специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и т.д. Кроме того, производный полипептид обладает функцией, которая сходна или идентична функции полипептида, из которого он был получен. Следует понимать, что полипептид, содержащий вариант области Fc согласно данному изобретению, может представлять собой производное, как определено в данном документе, предпочтительно дериватизация происходит внутри области Fc.

[00081] «По существу кошачьего происхождения» при употреблении в контексте данного документа в отношении полипептида (например, области Fc или моноклонального антитела), означает, что данный полипептид имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, более предпочтительно по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, или еще более предпочтительно - по меньшей мере на 95%, 95%, 97%, 98% или на 99% гомологична нативному кошачьему аминополипептиду.

[00082] Термины «рецептор Fc» и «FcR» употребляются для описания рецептора, который связывается с участком Fc (например, с участком Fc антитела). Предпочтительный FcR представляет собой FcR с природной последовательностью. Более того, предпочтительный FcR представляет собой тот, который связывает антитело IgG (гамма-рецептор) и включает в себя рецепторы подклассов Fc гамма RI, Fc гамма RII, Fc гамма RIII, включая аллельные варианты и формы данных рецепторов после альтернативного сплайсинга. Другой предпочтительный FcR включает в себя неонатальный рецептор - FcRn, который отвечает за перенос материнских IgG к плоду (Guyer et al., J. hnmunol. 117: 587 (1976); и Kim et al., J. Immunol. 24: 249 (1994)). В данном документе термин «FcR» охватывает и другие FcR, включительно с теми, которые будут идентифицированы в будущем.

[00083] Фраза «антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность», или «АЗКЦ», относится к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки (например, неспецифические), которые экспрессируют рецепторы FcR (например, клетки естественные киллеры («NK-клетки»), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на целевой клетке и впоследствии вызывают лизис данных целевых клеток. Первичные клетки, опосредующие АЗКЦ, - NK-клетки, экспрессируют только Fc гамма RIII, тогда как моноциты экспрессируют Fc гамма RI, Fc гамма RII и Fc гамма RIII.

[00084] При употреблении в контексте данного документа фраза «эффекторные клетки» относится к лейкоцитам (предпочтительно кошачьим), которые экспрессируют один или большее число рецепторов FcR и выполняют эффекторные функции. Предпочтительно, данные клетки экспрессируют по меньшей мере Fc гамма RIII и выполняют эффекторную функцию АЗКЦ. Примеры лейкоцитов, которые опосредуют АЗКЦ, включают в себя моноклональные клетки периферической крови (МКПК, англ. «РВМС»), NK-клетки, моноциты, цитотоксические Т-клетки и нейтрофилы. Эффекторные клетки могут быть выделены из нативного источника (например, из крови или из МКПК).

[00085] Вариант полипептида с «измененной» аффинностью связывания с FcRn представляет собой полипептид, который имеет либо повышенную (т.е. увеличенную, большую или более высокую), либо сниженную (т.е. уменьшенную, меньшую или более низкую) аффинность связывания с FcRn по сравнению с родительским полипептидом данного варианта или с полипептидом, содержащим нативную область Fc, при измерении при рН 6,0. Вариант полипептида, который проявляет повышенное связывание или повышенную аффинность связывания с FcRn, связывает FcRn с более высокой аффинностью, чем родительский полипептид. Вариант полипептида, который проявляет сниженное связывание или сниженную аффинность связывания с FcRn, связывает FcRn с более низкой аффинностью, чем его родительский полипептид. Такие варианты, которые демонстрируют сниженное связывание с FcRn, могут обладать незначительным или вообще не иметь заметного связывания с FcRn, например, 0-20% связывания с FcRn, по сравнению с родительским полипептидом. Вариант полипептида, который связывает FcRn с «повышенной аффинностью» по сравнению с его родительским полипептидом, представляет собой тот, который связывает FcRn с более высокой аффинностью связывания, чем родительский полипептид, когда количества указанного варианта полипептида и указанного родительского полипептида в анализе связывания по существу одинаковы, и все другие условия идентичны. Например, вариант полипептида с повышенной аффинностью связывания с FcRn может демонстрировать от около 1,10-кратного до около 100-кратного (более типично от около 1,2-кратного до около 50-кратного) повышения аффинности связывания с FcRn по сравнению с родительским полипептидом, при этом аффинность связывания с FcRn определяют, например, в анализе способом твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА, англ. «ELISA») или другим способом, доступным рядовому специалисту в данной области техники.

[00086] При употреблении в контексте данного документа термин «аминокислотное замещение» относится к замене по меньшей мере одного существующего аминокислотного остатка в данной аминокислотной последовательности другим, отличным от него «замещающим» аминокислотным остатком. Замещающий остаток или остатки могут быть «встречающимися в природе замещающими аминокислотными остатками» (т.е. кодируемыми генетическим кодом) и выбранными из: аланина (Ala); аргинина (Arg); аспарагина (Asn); аспарагиновой кислоты (Asp); цистеина (Cys); глутамина (Gln); глутаминовой кислоты (Glu); глицина (Gly); гистидина (His); изолейцина (Ile); лейцина (Leu); лизина (Lys); метионина (Met); фенилаланина (Phe); пролина (Pro); серина (Ser); треонина (Thr); триптофана (Trp); тирозина (Tyr); и валина (Val). Замещение одним или большим числом не встречающихся в природе аминокислотных остатков также охватывается определением аминокислотного замещения, указанным в данном документе. «Не встречающийся в природе аминокислотный остаток» относится к остатку, отличному от перечисленных выше встречающихся в природе аминокислотных остатков, который способен ковалентно связывать соседний (-е) аминокислотный (-е) остаток (остатки) в полипептидной цепи. Примеры не встречающихся в природе аминокислотных остатков включают в себя норлейцин, орнитин, норвалин, гомосерин и другие аналоги аминокислотных остатков, такие как те, которые описаны в работе Ellman et al. Meth. Enzym. 202: 301-336 (1991).

[00087] Термин «сигнал анализа» относится к выходному сигналу любого способа выявления белок-белковых взаимодействий, включительно с, но не ограничиваясь ими, измерениями абсорбции в колориметрических анализах, интенсивности флуоресценции или распадов в минуту. Форматы анализа могут включать в себя ТИФА, сортировку клеток с активированной флуоресценцией (FACS) или другие способы. Изменение «сигнала анализа» может отражать изменение жизнеспособности клеток и (или) изменение кинетического показателя скорости обратной реакции, кинетического показателя скорости прямой реакции или обоих показателей. «Более высокий сигнал анализа» относится к измеренному выходному числу, которое больше, чем другое число (например, вариант может иметь более высокое (большее) измеренное число в анализе ТИФА по сравнению с родительским полипептидом). «Более низкий» сигнал анализа относится к измеренному выходному числу, которое меньше, чем другое число (например, вариант может иметь более низкое (меньшее) измеренное число в анализе ТИФА по сравнению с родительским полипептидом).

[00088] Термин «аффинность связывания» относится к константе равновесной диссоциации (выраженной в единицах концентрации), связанной с каждым взаимодействием связывания рецептора Fc с Fc. Аффинность связывания напрямую связана с кинетической константой скорости обратной реакции (как правило, указывается в единицах обратного времени, например, секунды^-1), деленной на кинетическую константу скорости прямой реакции (как правило, указывается в единицах концентрации на единицу времени, например, моль/секунда). В общем, невозможно однозначно утверждать, вызваны ли изменения констант равновесной диссоциации различиями в скоростях прямой реакции, обратной реакции или и тем, и другим, если каждый из данных параметров не определен экспериментально (например, с помощью измерений по технологии BIACORE или SAPIDYNE).

[00089] При употреблении в контексте данного документа термин «шарнирная область» относится к участку из аминокислот, например, в кошачьем IgG1a (например, участок, простирающийся от положения 216 до положения 230 кошачьего IgG1a). Шарнирные области других изотипов IgG могут быть выровнены с последовательностью IgG путем размещения первого и последнего остатков цистеина, образующих дисульфидные связи между тяжелыми цепями (S-S), в одних и тех же положениях.

[00090] «Clq» представляет собой полипептид, который включает в себя сайт связывания для области Fc иммуноглобулина. C1q вместе с двумя сериновыми протеазами, C1r и C1s, образует комплекс С1 - первый компонент пути КЗЦ.

[00091] При употреблении в контексте данного документа термин «антитело», употребляемый взаимозаменяемо с термином «иммуноглобулин», или «Ig», употребляется в наиболее широком смысле и конкретно охватывает моноклональные антитела (включительно с полноразмерными моноклональными антителами), поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность или функциональную активность. Одноцепочечные антитела и химерные, кошачьи или фелинизированные антитела, а также химерные или CDR-привитые одноцепочечные антитела и тому подобное, содержащие части, полученные из разных видов, также охватываются данным изобретением и термином «антитело». Различные части таких антител могут быть соединены вместе химическим путем с помощью обычных методик, синтетическим путем или могут быть получены в виде непрерывного белка с использованием способов генной инженерии. Например, нуклеиновые кислоты, кодирующие химерную или фелинизированную цепь, могут быть экспрессированы для получения непрерывного белка. См., например, патент США №4816567; патент США №4816397; WO 86/01533; патент США №5225539; и патенты США №5585089 и №5698762. См. также работу Newman, R. et al. BioTechnology, 10: 1455-1460, 1993, касательно приматизированного антитела и Ladner et al., патент США №4946778 и Bird, R. Е. et al., Science, 242: 423-426, 1988, касательно одноцепочечных антител. Следует понимать, что все формы антител, содержащих область Fc (или ее часть), охватываются в данном документе термином «антитело». Кроме того, антитело может быть помечено выявляемой меткой, иммобилизовано на твердой фазе и (или) конъюгировано с гетерологичный соединением (например, ферментом или токсином) в соответствии со способами, известными в данной области техники.

[00092] При употреблении в контексте данного документа термин «фрагмент антитела» относится к части интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают в себя, но не ограничиваются ими, линейные антитела; молекулы одноцепочечных антител; пептиды Fc или Fc', Fab и фрагменты Fab, и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител. Фрагменты антитела предпочтительно сохраняют по меньшей мере часть шарнира и, необязательно, область СН1 тяжелой цепи IgG. В других предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения фрагменты антитела содержат по меньшей мере часть области СН2 или всю область СН2.

[00093] При употреблении в контексте данного документа термин «функциональный фрагмент», когда он употребляется в отношении моноклонального антитела, предназначен для обозначения части моноклонального антитела, которая все еще сохраняет функциональную активность. Функциональная активность может представлять собой, например, антигенсвязывающую активность или специфичность, рецепторсвязывающую активность или специфичность, эффекторную функциональную активность и тому подобное. Функциональные фрагменты моноклонального антитела включают в себя, например, индивидуальные тяжелые или легкие цепи и их фрагменты, такие как VL, VH и Fd; моновалентные фрагменты, такие как Fv, Fab и Fab'; бивалентные фрагменты, такие как F(ab')2; одноцепочечный Fv (scFv); и фрагменты Fc. Данные термины описаны, например, в работах Harlowe and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989); Molec. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers, R.A. (ed.), New York: VCH Publisher, Inc.); Huston et al., Cell Biophysics, 22: 189-224 (1993); Pluckthun and Skerra, Meth. Enzymol., 178: 497-515 (1989); и в работе Day, Е. D., Advanced Immunochemistry, Second Ed., Wiley-Liss, Inc., New York, N.Y. (1990). Термин «функциональный фрагмент» предназначен как включающий в себя, например, фрагменты, полученные протеазным расщеплением или восстановлением моноклонального антитела и способами рекомбинантной ДНК, известными специалистам в данной области техники.

[00094] При употреблении в контексте данного документа термин «фрагмент» относится к полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность из по меньшей мере 5, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 90, 100 или больше смежных аминокислотных остатков из аминокислотной последовательности другого полипептида. В предпочтительном варианте осуществления данного изобретения фрагмент полипептида сохраняет по меньшей мере одну функцию полноразмерного полипептида.

[00095] При употреблении в контексте данного документа термин «химерное антитело» включает в себя моновалентные, бивалентные или поливалентные иммуноглобулины. Моновалентное химерное антитело представляет собой димер, образованный химерной тяжелой цепью, связанной посредством дисульфидных мостиков с химерной легкой цепью. Бивалентное химерное антитело представляет собой тетрамер, образованный двумя димерами тяжелая цепь - легкая цепь, связанными посредством по меньшей мере одного дисульфидного мостика. Химерная тяжелая цепь антитела для применения у кошек содержит антигенсвязывающую область, полученную из тяжелой цепи некошачьего антитела, которая связана с по меньшей мере частью константной области кошачьей тяжелой цепи, такой как СН1 или СН2. Химерная легкая цепь антитела для применения у кошек содержит антигенсвязывающую область, полученную из легкой цепи некошачьего антитела, связанную с по меньшей мере частью константной области кошачьей легкой цепи (CL). Антитела, фрагменты или производные, имеющие химерные тяжелые цепи и легкие цепи с одинаковой или различной специфичностью связывания вариабельной области, можно также получить путем соответствующего объединения индивидуальных полипептидных цепей в соответствии с известными стадиями способа. При таком подходе организмы-хозяева, экспрессирующие химерные тяжелые цепи, культивируют отдельно от организмов-хозяев, экспрессирующих химерные легкие цепи, и цепи иммуноглобулина отдельно выделяют и затем объединяют.В качестве альтернативы, указанные организмы-хозяева могут быть совместно культивированы, и цепям дают возможность спонтанно ассоциироваться в культуральной среде с последующим извлечением собранного иммуноглобулина или фрагмента, либо как тяжелая, так и легкая цепи могут быть экспрессированы в одной и той же клетке-хозяине. Способы получения химерных антител хорошо известны в данной области техники (см., например, патент США№6284471; №5807715; №4816567; и №4816397).

[00096] При употреблении в контексте данного документа «фелинизированные» формы некошачьих (например, мышиных) антител (т.е. фелинизированные антитела) представляют собой антитела, которые содержат минимальную последовательность, полученную из некошачьего иммуноглобулина, или не содержат такую последовательность. По большей части фелинизированные антитела представляют собой кошачьи иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из гипервариабельной области реципиента замещены остатками из гипервариабельной области вида, отличного от кошки (антитело-донор), такого как мышь, крыса, кролик или примат, отличный от человека, имеющими желаемые специфичность, аффинность и объем связывания. В некоторых случаях остатки каркасного участка (FR) кошачьего иммуноглобулина замещены соответствующими остатками из вида, отличного от кошки. Кроме того, фелинизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Такие модификации, как правило, выполняют для дальнейшего улучшения характеристик антитела. Как правило, фелинизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные петли (области CDR) соответствуют таковым из иммуноглобулина из вида, отличного от кошки, и все или по существу все остатки FR представляют собой таковые из последовательности кошачьего иммуноглобулина. Фелинизированное антитело может также содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), как правило - часть константной области кошачьего иммуноглобулина.

[00097] При употреблении в контексте данного документа термин «иммуноадгезин» обозначает антителоподобные молекулы, которые объединяют домен связывания гетерологичного белка «адгезина» (например, рецептора, лиганда или фермента) с константным доменом иммуноглобулина. По своей структуре иммуноадгезины содержат слияние аминокислотной последовательности адгезина с желаемой специфичностью связывания, которая отличается от сайта распознавания и связывания антигена (антигенсвязывающего сайта) антитела (т.е. является «гетерологичной»), с последовательностью константного домена иммуноглобулина.

[00098] При употреблении в контексте данного документа термин «лигандсвязывающий домен» относится к любому нативному рецептору или любой его области или производному, сохраняющим по меньшей мере качественную лигандсвязывающую способность соответствующего нативного рецептора. В определенных вариантах осуществления данного изобретения указанный рецептор получен из полипептида клеточной поверхности, имеющего внеклеточный домен, который гомологичен представителю суперсемейства иммуноглобулинов. Другие рецепторы, которые не являются представителями суперсемейства иммуноглобулинов, но, тем не менее, конкретно охватываются данным определением, представляют собой рецепторы цитокинов, и, в частности, рецепторы с активностью тирозинкиназы (рецепторные тирозинкиназы), представителей суперсемейств рецепторов гемопоэтина и фактора роста нервов, и молекулы клеточной адгезии (например, Е-, L- и Р-селектины).

[00099] При употреблении в контексте данного документа термин «рецепторсвязывающий домен» относится к любому нативному лиганду рецептора, включительно, например, с молекулами клеточной адгезии, или любой области или производному указанного нативного лиганда, сохраняющим по меньшей мере качественную рецепторсвязывающую способность соответствующего нативного лиганда.

[000100] При употреблении в контексте данного документа термин «выделенный» полипептид представляет собой полипептид, который был идентифицирован и отделен от и (или) выделен из компонента его естественной среды. Загрязняющие компоненты его естественной среды представляют собой материалы, которые будут мешать диагностическому или терапевтическому применению данного полипептида и могут включать в себя ферменты, гормоны и другие белковые или небелковые растворенные вещества. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения выделенный полипептид очищают (1) до содержания полипептидов, составляющего больше чем 95% по массе, как определено методом Лоури, и предпочтительно больше чем 99% по массе, (2) до степени, достаточной для получения по меньшей мере 15 остатков N-концевой или внутренней аминокислотной последовательности с использованием секвенатора с вращающейся чашкой, или (3) до однородности с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (ДСН-ПААГ, англ. «SDS-PAGE») в восстанавливающих или невосстанавливающих условиях с использованием окрашивания синим кумасси или серебром. Выделенный полипептид включает в себя полипептид in situ в рекомбинантных клетках, поскольку по меньшей мере один компонент естественной среды такого полипептида не будет присутствовать. Как правило, однако, выделенный полипептид получают посредством по меньшей мере одной стадии очистки.

[000101] При употреблении в контексте данного документа термины «нарушение» и «заболевание» употребляются взаимозаменяемо для обозначения любого состояния, которое улучшилось бы от лечения вариантом полипептида (полипептидом, содержащим вариант области Fc согласно данному изобретению), включая хронические и острые нарушения или заболевания (например, патологические состояния, которые предрасполагают пациента к конкретному нарушению).

[000102] При употреблении в контексте данного документа термин «рецептор» относится к полипептиду, способному связывать по меньшей мере один лиганд. Предпочтительный рецептор представляет собой рецептор поверхности клетки или растворимый рецептор, имеющий внеклеточный лигандсвязывающий домен и, необязательно, другие домены (например, трансмембранный домен, внутриклеточный домен и (или) мембранный якорь). Рецептор, подлежащий оценке в анализе, описанном в данном документе, может представлять собой интактный рецептор или его фрагмент, или его производное (например, слитый белок, содержащий связывающий домен рецептора, слитый с одним или большим числом гетерологичных полипептидов). Более того, рецептор, подлежащий оценке на предмет его связывающих свойств, может присутствовать в клетке или быть выделен и необязательно нанесен на планшет для анализа или на какую-либо другую твердую фазу, или может непосредственно быть помечен и использован в качестве зонда.

Кошачий IgG дикого типа

[000103] Кошачьи IgG хорошо известны в данной области техники и полностью описаны, например, в работе Strietzel et al., 2014, Vet Immunol Immunopathol., vol. 158 (3-4), pages 214-223. В одном варианте осуществления данного изобретения кошачий IgG представляет собой IgG1_a. В другом варианте осуществления данного изобретения кошачий IgG представляет собой IgG1_b. В еще одном варианте осуществления данного изобретения кошачий IgG представляет собой IgG2. В конкретном варианте осуществления данного изобретения кошачий IgG представляет собой IgG1_a.

[000104] Аминокислотные и нуклеотидные последовательности IgG1_a, IgG1_b и IgG2 также хорошо известны в данной области техники.

[000105] В одном примере IgG согласно данному изобретению содержит константный домен, например, домены CH1, СН2 или СН3, или их комбинацию. В другом примере константный домен согласно данному изобретению содержит область Fc, включающую в себя, например, домены СН2 или СН3, или их комбинацию.

[000106] В конкретном примере указанный константный домен дикого типа содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO.: 3. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный константный домен дикого типа IgG представляет собой гомолог, вариант, изомер или функциональный фрагмент последовательности SEQ ID NO.: 3, но без какой-либо мутации в положении 428 или 434. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления данного изобретения.

[000107] Константные домены IgG также включают в себя полипептиды с аминокислотными последовательностями, по существу сходными с аминокислотной последовательностью указанных тяжелой и (или) легкой цепей. По существу та же аминокислотная последовательность определена в данном документе как последовательность, которая по меньшей мере на 70%, на 75%, на 80%, на 85%, на 90%, на 95% или на 99% идентична сравниваемой аминокислотной последовательности, как определено способом поиска FASTA в соответствии с работой Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988).

[000108] Данное изобретение также включает в себя молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют IgG или их фрагменты, описанные в данном документе. В одном варианте осуществления данного изобретения указанные нуклеиновые кислоты могут кодировать тяжелую цепь антитела, содержащую, например, области CH1, СН2, СН3 или их комбинацию. В другом варианте осуществления данного изобретения указанные нуклеиновые кислоты могут кодировать тяжелую цепь антитела, содержащую, например, любую из областей VH или ее часть, или любую из областей CDR VH, включительно с любыми их вариантами. Данное изобретение также включает в себя молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют легкую цепь антитела, содержащую, например, любую из областей CL или ее часть, любую из областей VL или ее часть, или любую из областей CDR VL, включительно с любыми их вариантами. В определенных вариантах осуществления данного изобретения указанная нуклеиновая кислота кодирует как тяжелую, так и легкую цепи, или их части.

[000109] Аминокислотная последовательность константного домена дикого типа, указанная в SEQ ID NO.: 3, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 4.

Модифицированные кошачьи IgG

[000110] Авторы данного изобретения обнаружили, что замещение аминокислотного остатка серина (Ser или S) в положении 428 или 434 другой аминокислотой удивительно и неожиданно повысило аффинность к FcRn и увеличило период полужизни IgG. Термины «положение 428» или «положение 434» при употреблении в контексте данного документа относятся к положению, пронумерованному в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату (Kabat et at, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)).

[000111] Соответственно, в одном варианте осуществления данного изобретения представлен модифицированный IgG, содержащий: константный домен кошачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 428, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату. Серии в положении 428 может быть замещен любой другой аминокислотой. Например, серии в положении 428 может быть замещен лейцином (т.е. S428L), аспарагином (т.е. S428N), аланином (т.е. S428A), фенилаланином (т.е. S428F), глицином (т.е. S428G), изолейцином (т.е. S428I), лизином (т.е. S428K), гистидином (т.е. S428H), метионином (т.е. S428M), глутамином (т.е. S428Q), аргинином (т.е. S428R), треонином (т.е. S428T), валином (т.е. S428V), триптофаном (т.е. S428W), тирозином (т.е. S428Y), цистеином (т.е., S428C), аспарагиновой кислотой (т.е. S428D), глутаминовой кислотой (т.е. S428E) или пролином (т.е. S428P). В конкретном варианте осуществления данного изобретения указанное замещение представляет собой замещение лейцином (например, S428L).

[000112] В конкретном примере мутантный константный домен согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO.: 1. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный мутантный константный домен IgG представляет собой гомолог, вариант, изомер или функциональный фрагмент последовательности SEQ ID NO.: 1, но с мутацией в положении 428. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления данного изобретения.

[000113] Аминокислотная последовательность мутантного константного домена, указанная в SEQ ID NO.: 1, кодируется соответствующей ей мутантной последовательностью нуклеиновой кислоты, например, мутантной формой последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO.: 4.

[000114] В другом варианте осуществления данного изобретения представлен модифицированный IgG, содержащий: константный домен кошачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату. Серии в положении 434 может быть замещен любой другой аминокислотой. Например, серии в положении 434 может быть замещен гистидином (т.е. S434H), аспарагином (т.е. S434N), аланином (т.е. S434A), фенилаланином (т.е. S434F), глицином (т.е. S434G), изолейцином (т.е. S434I), лизином (т.е. S434K), лейцином (т.е. S434L), метионином (т.е. S434M), глутамином (т.е. S434Q), аргинином (т.е. S434R), треонином (т.е. S434T), валином (т.е. S434V), триптофаном (т.е. S434W), тирозином (т.е. S434Y), цистеином (т.е., S434C), аспарагиновой кислотой (т.е. S434D), глутаминовой кислотой (т.е. S434E) или пролином (т.е. S434P). В конкретном варианте осуществления данного изобретения указанное замещение представляет собой замещение гистидином (например, S434H).

[000115] В конкретном примере мутантный константный домен согласно данному изобретению содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO.: 2. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный мутантный константный домен IgG представляет собой гомолог, вариант, изомер или функциональный фрагмент последовательности SEQ ID NO.: 2, но с мутацией в положении 434. Каждая возможность представляет собой отдельный вариант осуществления данного изобретения.

[000116] Аминокислотная последовательность мутантного константного домена, указанная в SEQ ID NO.: 2, кодируется соответствующей ей мутантной последовательностью нуклеиновой кислоты, например, мутантной формой последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO.: 4.

[000117] В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный константный домен кошачьего IgG содержит замещения серина как в положении 428, так и в положении 434 лейцином и гистидином, соответственно.

[000118] Модифицированный IgG согласно данному изобретению обеспечивает период полужизни, варьирующий от около 8 суток до около 26 суток. В одном варианте осуществления данного изобретения модифицированный IgG согласно данному изобретению обеспечивает период полужизни, составляющий около 10, 12, 15, 17, 20, 23 или 26 суток. В конкретном варианте осуществления данного изобретения модифицированный IgG согласно данному изобретению обеспечивает период полужизни, составляющий больше чем 10 суток.

Способы получения молекул антител, представленных в данном изобретении

[000119] Способы получения молекул антител хорошо известны в данной области техники и полностью описаны в патентах США №8394925; №8088376; №8546543; №10336818; и №9803023, и в заявке на патент США №20060067930, которые включены в данный документ посредством ссылки во всей полноте. Могут применяться любые подходящие способ, процесс или технология, известные специалисту в данной области техники. Молекулу антитела, имеющую вариант области Fc согласно данному изобретению, можно получить в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанный вариант области Fc может быть слит с гетерологичным полипептидом по выбору, таким как вариабельный домен антитела или связывающий домен рецептора или лиганда.

[000120] С появлением способов молекулярной биологии и рекомбинантных технологий специалист в данной области техники может получить антитело и антителоподобные молекулы рекомбинантными средствами и, таким образом, генерировать последовательности генов, которые кодируют специфические аминокислотные последовательности, обнаруживаемые в полипептидной структуре антител. Такие антитела можно получать либо путем клонирования последовательностей генов, кодирующих полипептидные цепи указанных антител, либо путем прямого синтеза указанных полипептидных цепей со сборкой синтезированных цепей с образованием активных тетрамерных (H2L2) структур, обладающих аффинностью к специфическим эпитопам и антигенным детерминантам. Это позволило получить готовые антитела, имеющие последовательности, характерные для нейтрализующих антител из разных видов и источников.

[000121] Независимо от источника антител или способов их рекомбинантного получения, или способов их синтеза, in vitro или in vivo, с использованием трансгенных животных, больших клеточных культур лабораторного или коммерческого размера, с использованием трансгенных растений или путем прямого химического синтеза, в котором не используются живые организмы ни на одной стадии процесса, все антитела имеют сходную общую 3-мерную структуру. Данную структуру часто обозначают как H2L2, что относится к тому факту, что антитела обычно содержат две легкие (L) аминокислотные цепи и 2 тяжелые (Н) аминокислотные цепи. Обе цепи имеют участки, способные взаимодействовать со структурно комплементарной антигенной мишенью. Области, взаимодействующие с указанной мишенью, называются «вариабельными» областями, или «V»-областями, и характеризуются отличиями в аминокислотной последовательности от антител с различной антигенной специфичностью. Вариабельные участки цепи Н и цепи L содержат аминокислотные последовательности, способные специфически связываться с антигенными мишенями.

[000122] При употреблении в контексте данного документа термин «антигенсвязывающая область» относится к той части молекулы антитела, которая содержит аминокислотные остатки, которые взаимодействуют с антигеном и придают антителу его специфичность и аффинность к данному антигену. Антигенсвязывающая область антитела включает в себя «каркасные» аминокислотные остатки, необходимые для поддержания надлежащей конформации антигенсвязывающих остатков. Внутри вариабельных областей цепей Н и L, которые обеспечивают антигенсвязывающие области, находятся последовательности меньшего размера, получившие название «гипервариабельных» вследствие их крайней вариабельности между антителами различной специфичности. Такие гипервариабельные области также упоминаются как «области, определяющие комплементарность», или области «CDR». С областями CDR связана основная специфичность антитела к конкретной антигенной детерминантной структуре.

[000123] CDR представляют собой несмежные участки аминокислот в вариабельных областях, но, независимо от вида, было обнаружено, что позиционные местоположения этих критических аминокислотных последовательностей в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей имеют сходные местоположения в аминокислотных последовательностях вариабельных цепей. Вариабельные тяжелые и легкие цепи всех антител имеют по три области CDR, каждая из которых не смежна с другими. У всех видов млекопитающих пептиды антител содержат константные (т.е. высококонсервативные) и вариабельные области, и внутри последних содержатся CDR и так называемые «каркасные области», состоящие из аминокислотных последовательностей внутри вариабельной области тяжелой или легкой цепей, но за пределами CDR.

[000124] В данном изобретении дополнительно представлен вектор, включающий в себя по меньшей мере одну из нуклеиновых кислот, описанных выше. Поскольку генетический код является вырожденным, для кодирования конкретной аминокислоты может использоваться больше чем один кодон. Используя генетический код, можно идентифицировать одну или большее число различных нуклеотидных последовательностей, каждая из которых была бы способна кодировать данную аминокислоту. Вероятность того, что конкретный олигонуклеотид фактически будет составлять действительную кодирующую последовательность, можно оценить путем рассмотрения аномальных отношений спаривания оснований и частоты, с которой конкретный кодон действительно используется (для кодирования конкретной аминокислоты) в эукариотических или прокариотических клетках, экспрессирующих антитело или его часть. Такие «правила использования кодонов» описаны в работе Lathe, et al., 183 J. Molec. Biol. 1-12 (1985). Применяя «правила использования кодонов» согласно Lathe, можно идентифицировать единственную нуклеотидную последовательность или набор нуклеотидных последовательностей, которые содержат теоретическую «наиболее вероятную» нуклеотидную последовательность, способную кодировать последовательности кошачьих IgG. Также предполагается, что области, кодирующие антитела для применения в данном изобретении, также можно получить путем изменения существующих генов антител с использованием стандартных методик молекулярной биологии, которые приводят к вариантам антител и пептидов, описанных в данном документе. Такие варианты включают в себя, но не ограничиваются ими, делеции, добавления и замещения в аминокислотной последовательности антител или пептидов.

[000125] Например, одним из классов замещений являются консервативные аминокислотные замещения. Такие замещения представляют собой замещения, которые заменяют данную аминокислоту в пептиде кошачьего антитела другой аминокислотой со сходными характеристиками. Как правило, консервативными замещениями считаются замещения одна на другую между алифатическими аминокислотами Ala, Val, Leu и Ike; замещение гидроксильных остатков Ser и Thr, замещение кислотных остатков Asp и Glu, замещение между амидными остатками Asn и Gln, замещение основных остатков Lys и Arg, замещения между ароматическими остатками Phe, Tyr, и тому подобное. Указания относительно того, какие изменения аминокислот, вероятно, будут фенотипически незаметными, содержатся в работе Bowie et al., 247 Science 1306-10 (1990).

[000126] Варианты кошачьих антител и пептидов могут быть полностью функциональными или у них может отсутствовать одна или большее число из функций. Полностью функциональные варианты, как правило, содержат только консервативные вариации или вариации в некритических остатках, или в некритических областях. Функциональные варианты могут также содержать замещение аналогичных аминокислот, что не приводит к изменению или приводит к незначительному изменению функции. В качестве альтернативы, такие замены могут в некоторой степени положительно или отрицательно влиять на функцию. Нефункциональные варианты, как правило, содержат одну или большее число неконсервативных аминокислотных замещений, делеций, вставок, инверсий или усечений, или замещение, вставку, инверсию или делецию в критическом остатке или в критической области.

[000127] Аминокислоты, которые критически необходимы для функционирования, можно идентифицированы способами, известными в данной области техники, такими как сайт-направленный мутагенез или аланин-сканирующий мутагенез Cunningham et at., 244 Science 1081-85 (1989). Последняя процедура вводит единичные мутации аланина в каждом остатке в молекуле. Полученные мутантные молекулы затем тестируют на биологическую активность, такую как связывание с эпитопом или активность АЗКЦ in vitro. Сайты, которые являются критическими для связывания лиганда с рецептором, также можно определить с помощью структурного анализа, такого как кристаллография, ядерный магнитный резонанс или фотоаффинное мечение Smith et al., 224 J. Mol. Biol. 899-904 (1992); de Vos et al., 255 Science 306-12 (1992).

[000128] Более того, полипептиды часто содержат аминокислоты, отличные от двадцати «встречающихся в природе» аминокислот.Кроме того, многие аминокислоты, включительно с концевыми аминокислотами, могут быть модифицированы либо естественными процессами, такими как процессинг или другие посттрансляционные модификации, либо методиками химической модификации, которые хорошо известны в данной области техники. Известные модификации включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение гемового фрагмента, ковалентное присоединение нуклеотида или нуклеотидного производного, ковалентное присоединение липида или липидного производного, ковалентное присоединение фосфотидилинозитола, перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных перекрестных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование гликозилфосфатидилинозитолового (ГФИ, англ. «GPI») якоря, гидроксилирование, иодирование, метилирование, миристилирование, окисление, протеолитический процессинг, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, добавление аминокислот, опосредованное транспортной РНК, к белкам, например, аргинилирование, и убиквитинирование. Такие модификации хорошо известны специалистам в данной области техники и были очень подробно описаны в научной литературе. Несколько особенно распространенных модификаций, например, гликозилирование, присоединение липида, сульфатирование, гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты, гидроксилирование и АДФ-рибозилирование, описаны в большинстве фундаментальных работ, таких как «Proteins Structure and Molecular Properties)) (2nd ed., Т.E. Creighton, W.H. Freeman & Co., N.Y., 1993). На данную тему доступно множество подробных обзоров, например, работы Wold, Posttranslational Covalent Modification of proteins, 1-12 (Johnson, ed., Academic Press, N.Y., 1983); Seifter et al. 182 Meth. Enzymol. 626-46 (1990); и Rattan et al. 663 Arm. NY Acad. Sci. 48-62 (1992).

[000129] В другом аспекте данного изобретения представлены производные антител. «Производное» антитела содержит дополнительные химические фрагменты, которые обычно не входят в состав белка. Ковалентные модификации белка включены в объем данного изобретения. Такие модификации могут быть введены в молекулу путем приведения целевых аминокислотных остатков данного антитела в реакцию с органическим дериватизирующим агентом, который способен вступать в реакцию с выбранными боковыми цепями или концевыми остатками. Например, дериватизация бифункциональными агентами, хорошо известными в данной области техники, пригодна для сшивания антитела или фрагмента с нерастворимой в воде несущей матрицей или с другими макромолекулярными носителями.

[000130] Производные также включают в себя радиоактивно меченные моноклональные антитела. Например, меченные радиоактивным йодом (251,1311), углеродом (4С), серой (35S), индием, тритием (Н³) или подобным; конъюгаты моноклональных антител с биотином или авидином, с ферментами, такими как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-D-галактозидаза, глюкозооксидаза, глюкоамилаза, ангидраза карбоновой кислоты, ацетилхолинэстераза, лизоцим, малатдегидрогеназа или глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа; а также конъюгаты моноклональных антител с биолюминесцентными агентами (такими как люцифераза), хемолюминесцентными агентами (такими как сложные эфиры акридина) или флуоресцентными агентами (такими как фикобилипротеины).

[000131] Другое производное бифункционального антитела согласно данному изобретению представляет собой биспецифическое антитело, полученное путем объединения частей двух отдельных антител, которые распознают две разные антигенные группы. Этого можно достичь с помощью методик перекрестного сшивания или рекомбинации. В качестве дополнения, фрагменты могут быть добавлены к антителу или его части для увеличения периода полужизни in vivo (например, путем увеличения времени выведения из кровотока). Такие методики включают в себя, например, добавление фрагментов ПЭГ (также называемое «пэгилированием»), и хорошо известны в данной области техники. См. публикацию заявки на патент США №20030031671.

[000132] В некоторых вариантах осуществления данного изобретения нуклеиновые кислоты, кодирующие указанное антитело, вводят непосредственно в клетку-хозяина, и указанную клетку инкубируют в условиях, достаточных для индуцирования экспрессии указанного кодируемого антитела. После того, как указанные нуклеиновые кислоты ввели в клетку, указанную клетку обычно инкубируют, как правило - при температуре 37°С, иногда с отбором, в течение периода времени, составляющего около 1-24 часов, чтобы обеспечить экспрессию указанного антитела. В одном варианте осуществления данного изобретения указанное антитело секретируется в надосадочную жидкость среды, в которой растет указанная клетка. Традиционно моноклональные антитела получали в виде нативных молекул в мышиных гибридомных линиях. В дополнение к указанной технологии данное изобретение обеспечивает экспрессию антител по рекомбинантной ДНК. Это позволяет получать антитела, а также спектр производных антител и слитых белков у выбранного вида организма-хозяина.

[000133] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая по меньшей мере одно антитело, часть или полипептид согласно данному изобретению, может быть рекомбинирована с векторной ДНК в соответствии с традиционными методиками, включительно с тупыми или липкими концами для лигирования, расщеплением рестрикционным ферментом для получения подходящих концов, заполнением когезионных концов по мере необходимости, обработкой щелочной фосфатазой для избегания нежелательного соединения и лигированием соответствующими лигазами. Методики таких манипуляций, описанные, например, в работах Maniatis et al., MOLECULAR CLONING, LAB. MANUAL, (Cold Spring Harbor Lab. Press, NY, 1982 and 1989); и Ausubel et al. 1993, как указано выше, можно применять для конструирования последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют молекулу антитела или ее антигенсвязывающую область.

[000134] Молекула нуклеиновой кислоты, такая как ДНК, считается «способной экспрессировать» полипептид, если она содержит нуклеотидные последовательности, которые содержат информацию о регулировании транскрипции и трансляции, и такие последовательности «функционально связаны» с нуклеотидными последовательностями, которые кодируют указанный полипептид. Функциональная связь представляет собой связь, при которой регуляторные последовательности ДНК и последовательность ДНК, которую требуется экспрессировать, соединены таким образом, чтобы обеспечить экспрессию генов в виде пептидов или частей антител в извлекаемых количествах. Точная природа регуляторных областей, необходимых для экспрессии генов, может варьировать от организма к организму, как хорошо известно в аналогичной области техники. См., например, работы Sambrook et al., 2001, как указано выше; Ausubel et al., 1993, как указано выше.

[000135] Соответственно, данное изобретение охватывает собой экспрессию антитела или пептида либо в прокариотических, либо в эукариотических клетках. Подходящие организмы-хозяева включают в себя бактериальные или эукариотические организмы-хозяева, включительно с клетками бактерий, дрожжей, насекомых, грибов, птиц и млекопитающих либо in vivo, либо in situ, или клетки-хозяева, происходящие от млекопитающих, насекомых, птиц или дрожжей. Указанная клетка или ткань млекопитающего может происходить от человека, примата, хомяка, кролика, грызуна, коровы, свиньи, овцы, лошади, козы, собаки или кошки. Также можно использовать любую другую подходящую клетку млекопитающего, известную в данной области техники.

[000136] В одном варианте осуществления данного изобретения нуклеотидная последовательность согласно данному изобретению будет включена в плазмиду или вирусный вектор, способные к автономной репликации в реципиенте-хозяине. Для этой цели можно применять любой из широкого спектра векторов. См., например, работу Ausubel et al., 1993, как указано выше. Факторы, имеющие значение при выборе конкретной плазмиды или вирусного вектора, включают в себя: легкость, с которой клетки-реципиенты, содержащие данный вектор, могут быть распознаны и отобраны из тех клеток-реципиентов, которые не содержат данный вектор; число копий данного вектора, которые желательны у конкретного организма-хозяина; и желательна ли возможность «перемещать» вектор между клетками-хозяевами разных видов.

[000137] Примеры прокариотических векторов, известных в данной области техники, включают в себя плазмиды, например те, которые способны к репликации в Е. coli (такие как, например, pBR322, CoIE1, pSC101, pACYC 184,.pi.vX). Такие плазмиды описаны, например, в работах Maniatis et aI, 1989, как указано выше; Ausubel et al, 1993, как указано выше. Плазмиды Bacillus включают в себя рС194, рС221, рТ127 и т.д. Такие плазмиды описаны в работе Gryczan, THE MOLEC. BIO. OF THE BACILLI 307-329 (Academic Press, NY, 1982). Подходящие плазмиды Streptomyces включают в себя p1J101 (Kendall et al., 169 J. Bacteriol. 4177-83 (1987), и бактериофаги Streptomyces, такие как phLC31 (Chater et al., SIXTH INTL SYMPOSIUM ON ACTINOMYCETALES BIO. 45-54 (Akademiai Kaido, Budapest, Hungary 1986). Обзор плазмид Pseudomonas см. в работах John et al., 8 Rev. Infect. Dis. 693-704 (1986); lzaki, 33 Jpn. J. Bacteriol. 729-42 (1978); и в работе Ausubel et al., 1993, как указано выше.

[000138] В качестве альтернативы, элементы экспрессии генов, пригодные для экспрессии кДНК, кодирующих антитела или пептиды, включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: (а) промоторы вирусной транскрипции и их энхансерные элементы, такие как ранний промотор SV40 (Okayama et aI., 3 Mol. Cell. Biol. 280 (1983), LTR вируса саркомы Рауса (Gorman et al, 79 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 6777 (1982), и LTR вируса мышиного лейкоза Молони (Grosschedl et aI., 41 Cell 885 (1985); (b) области сплайсинга и сайты полиаденилирования, такие как те, которые получены из поздней области SV40 (Okayarea et al., 1983), и (с) сайты полиаденилирования, такие как в SV40 (Okayama et al., 1983).

[000139] Иммуноглобулиновые гены кДНК можно экспрессировать так, как описано в работе Weidle et al., 51 Gene 21 (1987), используя в качестве элементов экспрессии ранний промотор SV40 и его энхансер, энхансеры промотора цепи Н иммуноглобулина мыши, сплайсинг мРНК поздней области SV40, промежуточную последовательность S-глобина кролика, сайты полиаденилирования иммуноглобулина и S-глобина кролика, и элементы полиаденилирования SV40. Для генов иммуноглобулинов, состоящих частично из кДНК, частично из геномной ДНК (Whittle et al., 1 Protein Engin. 499 (1987)), промотор транскрипции может представлять собой цитомегало вирус человека, энхансеры транскрипции могут представлять собой цитоме галовирус и иммуноглобулин мыши / человека, а области сплайсинга мРНК и полиаденилирования могут представлять собой нативные хромосомные последовательности иммуноглобулина.

[000140] В одном варианте осуществления данного изобретения для экспрессии генов кДНК в клетках грызунов промотор транскрипции представляет собой последовательность LTR вируса, энхансеры промотора транскрипции представляют собой один или оба из энхансера тяжелой цепи иммуноглобулина мыши и энхансера LTR вируса, область сплайсинга содержит интрон размером больше чем 31 п.о., и области полиаденилирования и терминации транскрипции получены из нативной хромосомной последовательности, соответствующей синтезируемой цепи иммуноглобулина. В других вариантах осуществления данного изобретения последовательности кДНК, кодирующие другие белки, объединяют с перечисленными выше элементами экспрессии для достижения экспрессии указанных белков в клетках млекопитающих.

[000141] Каждый слитый ген может быть собран в экспрессионный вектор или вставлен в него. Клетки-реципиенты, способные экспрессировать продукт гена цепи иммуноглобулина, затем трансфицируют отдельно пептидом или геном, кодирующим цепь Н или L, или совместно трансфицируют геном цепей Н и L. Трансфицированные клетки-реципиенты культивируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию встроенных генов, и из указанной культуры извлекают экспрессированные цепи иммуноглобулина или интактные антитела, или их фрагменты.

[000142] В одном варианте осуществления данного изобретения слитые гены, кодирующие пептид или цепи Н и L, или их части, собираются в отдельные векторы экспрессии, которые затем используются для совместной трансфекции клетки-реципиента. В качестве альтернативы, слитые гены, кодирующие цепи Н и L, могут быть собраны на одном и том же векторе экспрессии. Для трансфекции векторов экспрессии и получения антитела указанная линия клеток-реципиентов может представлять собой клетки миеломы. Клетки миеломы могут синтезировать, собирать и секретировать иммуноглобулины, кодируемые генами трансфицированного иммуноглобулина, и обладают механизмом для гликозилирования указанного иммуноглобулина. Клетки миеломы можно выращивать в культуре или в брюшной полости мыши, при этом секретируемый иммуноглобулин можно получить из асцитной жидкости. Другие подходящие клетки-реципиенты включают в себя лимфоидные клетки, такие как В-лимфоциты кошачьего или некошачьего происхождения, гибридомные клетки кошачьего или некошачьего происхождения, или межвидовые гетерогибридомные клетки.

[000143] Вектор экспрессии, несущий конструкцию антитела или полипептид согласно данному изобретению, можно ввести в соответствующую клетку-хозяина любым из множества подходящих способов, включительно с такими биохимическими способами, как трансформация, трансфекция, конъюгация, слияние протопластов, осаждение с фосфатом кальция и нанесение поликатионов, таких как диэтиламиноэтил (ДЭАЭ, англ. «DEAE») декстран, и такими механическими способами, как электропорация, прямая микроинъекция и бомбардировка микрочастицами Johnston et al, 240 Science 1538 (1988).

[000144] Дрожжи могут обеспечить существенные преимущества перед бактериями в производстве цепей Н и L иммуноглобулина. Дрожжи осуществляют посттрансляционные пептидные модификации, включая гликозилирование. В настоящее время существует ряд стратегий рекомбинантной ДНК, которые используют сильные промоторные последовательности и плазмиды с большим числом копий, которые можно применять для получения желаемых белков в дрожжах. Дрожжи распознают лидирующие последовательности продуктов клонированных генов млекопитающих и секретируют пептиды, несущие лидирующие последовательности (т.е. пре-пептиды). Hitzman et al., 11th Int'l Conference on Yeast, Genetics & Molec. Biol. (Montpelier, France, 1982).

[000145] Дрожжевые системы экспрессии генов можно регулярно оценивать на предмет уровней продукции, секреции и стабильности пептидов, антител, их фрагментов и областей. Можно применять любую из ряда дрожжевых систем экспрессии генов, содержащих промоторные и терминационные элементы из активно экспрессируемых генов, кодирующих гликолитические ферменты, которые продуцируются в больших количествах при выращивании дрожжей в средах, богатых глюкозой. Известные гликолитические гены также могут обеспечить очень эффективные сигналы управления транскрипцией. Например, можно применять промоторные и терминационные сигналы гена фосфоглицераткиназы (ФГК, англ. «PGK»). Для оценки оптимальных экспрессионных плазмид для экспрессии клонированных кДНК иммуноглобулина в дрожжах можно применять ряд подходов. См. Vol.II DNA Cloning, 45-66, (Glover, ed.,) IRL Press, Oxford, UK 1985.

[000146] Бактериальные штаммы также можно применять в качестве организмов-хозяев для получения молекул антител или пептидов, описанных в данном изобретении. В связи с указанными бактериальными хозяевами используют плазмидные векторы, содержащие репликон и контрольные последовательности, которые получены из видов, совместимых с клеткой-хозяином. Указанный вектор несет сайт репликации, а также специфические гены, которые способны обеспечивать фенотипический отбор в трансформированных клетках. Можно применять ряд подходов для оценки экспрессии плазмид для получения антител, их фрагментов и областей, или цепей антител, кодируемых клонированными кДНК иммуноглобулина в бактериях (см. Работы Glover, 1985, как указано выше; Ausubel, 1993 как указано выше; Sambrook, 2001, как указано выше; Colligan et al., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1994-2001); Colligan et al., eds. Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, N.Y. (1997-2001).

[000147] Клетки-хозяева, происходящие из млекопитающих, можно выращивать in vitro или in vivo. Клетки млекопитающих обеспечивают посттрансляционные модификации молекул белка иммуноглобулина, включительно с удалением лидирующего пептида, фолдинг и сборку цепей Н и L, гликозилирование молекул антител и секрецию функционального белка антитела. Клетки млекопитающих, которые могут быть полезны в качестве организмов-хозяев для продуцирования белков антител, в дополнение к клеткам лимфоидного происхождения, описанным выше, включают в себя клетки фибробластного происхождения, такие как клетки Vero (АТСС CRL 81) или клетки СНО-K1 (АТСС CRL 61). Доступно множество векторных систем для экспрессии клонированных пептидов из генов цепей Н и L в клетках млекопитающих (см. работу Glover, 1985, как указано выше). Для получения полных антител H2L2 можно применять различные подходы. Возможна совместная экспрессия цепей Н и L в одних и тех же клетках для достижения внутриклеточной ассоциации и сцепления цепей Н и L в полные тетрамерные антитела H2L2 и (или) пептиды. Указанная совместная экспрессия может происходить при использовании либо одних и тех же, либо разных плазмид в одном и том же хозяине. Гены для обеих цепей и (или) пептидов Н и L можно поместить в одну и ту же плазмиду, которую затем трансфицируют в клетки, а затем отбирать непосредственно клетки, экспрессирующие обе указанные цепи. В качестве альтернативы, клетки можно сначала трансфицировать плазмидой, кодирующей одну цепь, например, цепь L, с последующей трансфекцией полученной клеточной линии плазмидой с цепью Н, содержащей второй маркер отбора. Клеточные линии, продуцирующие пептиды и (или) молекулы H2L2 любым из путей, можно трансфицировать плазмидами, кодирующими дополнительные копии пептидов - цепей Н, L или Н плюс L, в сочетании с дополнительными маркерами отбора для получения клеточных линий с улучшенными свойствами, такими как более высокая продукция собранных молекул антител H2L2 или повышенная стабильность трансфицированных клеточных линий.

[000148] Для долгосрочного получения рекомбинантных антител с высоким выходом можно применять стабильную экспрессию. Например, можно сконструировать клеточные линии, которые стабильно экспрессируют молекулу антитела. Вместо использования векторов экспрессии, которые содержат вирусные источники репликации, клетки-хозяева можно трансформировать кассетами экспрессии иммуноглобулина и маркера отбора. После введения чужеродной ДНК сконструированные клетки можно выращивать в течение 1-2 суток в обогащенной питательной среде, а затем перевести на селективную среду. Маркер отбора в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость к отбору и позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в хромосому и расти с образованием очагов, которые, в свою очередь, можно клонировать и размножать в клеточные линии. Такие сконструированные клеточные линии могут быть особенно полезны при скрининге и оценке соединений / компонентов, которые прямо или косвенно взаимодействуют с данной молекулой антитела.

[000149] Как только антитело согласно данному изобретению получено, его можно очистить любым способом очистки молекулы иммуноглобулина, известным в данной области техники, например, хроматографией (например, ионообменной, аффинной, в частности - с аффинностью к специфическому антигену после белка А, и хроматографией на колонке с отсечением по размеру), центрифугированием, способом дифференциальной растворимости или любой другой стандартной методикой очистки белков. Во многих вариантах осуществления данного изобретения антитела секретируются из клетки в культуральную среду и собираются из указанной культуральной среды.

[000150] В другом аспекте данного изобретения представлено антитело, содержащее: константный домен кошачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 428, 434, или их комбинации. В одном варианте осуществления данного изобретения указанное замещение представляет собой замещение серина в положении 428 лейцином (S428L). В другом варианте осуществления данного изобретения указанное замещение представляет собой замещение серина в положении 434 гистидином (S434H).

[000151] Антитело, имеющее указанное замещение, может представлять собой любое подходящее антитело, известное специалисту в данной области техники. В одном примере указанное антитело представляет собой антитело против ИЛ-31. В другом примере указанное антитело представляет собой антитело против ФРН.

[000152] Антитело против ИЛ-31 без описанного в данном документе замещения хорошо известно в данной области техники и полностью описано, например, в патентах США №10526405; №10421807; №9206253; и №8790651. Антитело против ФРН без описанного в данном документе замещения также хорошо известно в данной области техники и полностью описано, например, в патентах США №10125192; №10093725; №9951128; №9617334; и №9505829.

[000153] В одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению (т.е. антитело, имеющее замещение) снижает, ингибирует или нейтрализует ИЛ-31-опосредованные состояние зуда или аллергическое состояние. В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению снижает, ингибирует или нейтрализует активность ИЛ-31 у кошки.

[000154] Последовательности VL, VH и CDR антител против ИЛ-31 хорошо известны в данной области техники и полностью описаны, например, в патентах США №10526405; №10421807; №9206253; и №8790651. В одном примере антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению может включать в себя по меньшей мере одну из следующих последовательностей областей, определяющих комплементарность (CDR): вариабельную тяжелую (VH)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 15, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 16, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 17, вариабельную легкую (VL)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 20, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 21 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению может включать в себя по меньшей мере одну CDR, описанную в данном документе.

[000155] В одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 19. В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14.

[000156] В одном варианте осуществления данного изобретения мутантное антитело против ФРН согласно данному изобретению (т.е. антитело, имеющее замещение) снижает, ингибирует или нейтрализует активность ФРН у животного и (или) усиливает способность ингибировать связывание ФРН с Trk А и р75 для лечения ФРН-опосредованных боли или состояния.

[000157] Последовательности VL, VH и CDR антител против ФРН также хорошо известны в данной области техники и полностью описаны, например, в патентах США №10125192; №10093725; №9951128; №9617334; и №9505829. В одном примере антитело против ФРН согласно данному изобретению может включать в себя по меньшей мере одну из следующих последовательностей областей, определяющих комплементарность (CDR): вариабельную тяжелую (VH)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 24, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 25, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 26, вариабельную легкую (VL)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 28, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 29 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 30.

[000158] В другом примере антитело против ФРН согласно данному изобретению может включать в себя по меньшей мере одну из следующих последовательностей областей, определяющих комплементарность (CDR): вариабельную тяжелую (VH)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 32, VH-CDR2 согласно SEQ ID NO: 33, VH-CDR3 согласно SEQ ID NO: 34, вариабельную легкую (VL)-CDR1 согласно SEQ ID NO: 36, VL-CDR2 согласно SEQ ID NO: 37 и VL-CDR3 согласно SEQ ID NO: 38.

[000159] В одном варианте осуществления данного изобретения антитело против ФРН согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 27 или 35.

[000160] В другом варианте осуществления данного изобретения антитело против ФРН согласно данному изобретению может включать в себя вариабельную область тяжелой цепи, содержащую вариабельную область с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 23 или 31.

Фармацевтическое и ветеринарное применение

[000161] В данном изобретении также представлена фармацевтическая композиция, содержащая молекулы согласно данному изобретению и один или большее число фармацевтически приемлемых носителей. Более конкретно, в данном изобретении представлена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель и, в качестве активного ингредиента, антитело или пептид согласно данному изобретению.

[000162] «Фармацевтически приемлемые носители» включают в себя любой эксципиент, который не токсичен для клетки или животного, подвергающегося его воздействию, в применяемых дозах и концентрациях. Фармацевтическая композиция может включать в себя один или большее число дополнительных терапевтических агентов.

[000163] «Фармацевтически приемлемое (-ый, -ая, -ые)» относится к тем соединениям, материалам, композициям и (или) дозированным формам, которые с медицинской точки зрения подходят для контакта с тканями животных без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергической реакции или других проблем, или осложнений, в соответствии с разумным соотношением польза/риск.

[000164] Фармацевтически приемлемые носители включают в себя растворители, дисперсионные среды, буферы, покрытия, антибактериальные и противогрибковые агенты, смачивающие агенты, консерванты, буферы, хелатирующие агенты, антиоксиданты, изотонические агенты и агенты, замедляющие абсорбцию.

[000165] Фармацевтически приемлемые носители включают в себя воду; физиологический раствор; фосфатно-солевой раствор; декстрозу; глицерол; спирты, такие как этанол и изопропанол; фосфат, цитрат и другие органические кислоты; аскорбиновую кислоту; полипептиды с низкой молекулярной массой (меньше чем около 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включительно с глюкозой, маннозой или декстринами; ЭДТА; противоионы, образующие соли, такие как натрий; и (или) неионные поверхностно-активные вещества, такие как ТВИН, полиэтиленгликоль (ПЭГ) и полоксамеры; изотонические агенты, такие как сахара, полиспирты, такие как маннит и сорбит, и хлорид натрия; а также их комбинации.

[000166] Фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут быть приготовлены в различных формах, включительно с, например, жидкими, полутвердыми или твердыми лекарственными формами, такими как жидкие растворы (например, растворы для инъекций и инфузий), дисперсии или суспензии, липосомы, суппозитории, таблетки, пилюли или порошки. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанные композиции составлены в форме растворов для инъекций или инфузий. Указанная композиция может быть в форме, подходящей для внутривенного, внутриартериального, внутримышечного, подкожного, парентерального, трансмукозального, перорального, местного или трансдермального введения. Указанную композицию можно составить в форме фармацевтической композиции немедленного, контролируемого, пролонгированного или замедленного высвобождения.

[000167] Композиции согласно данному изобретению можно вводить либо в качестве отдельных терапевтических агентов, либо в комбинации с другими терапевтическими агентами. Их можно вводить отдельно, но обычно их вводят с фармацевтическим носителем, выбранным на основе выбранного способа введения и стандартной фармацевтической практики. Введение антител, описанных в данном документе, можно осуществлять любым подходящим способом, включительно с парентеральной инъекцией (такой как внутрибрюшинная, подкожная или внутримышечная инъекция), пероральным путем или путем местного введения антител (обычно содержащихся в фармацевтической композиции) на поверхность дыхательных путей. Местное введение на поверхность дыхательных путей можно осуществлять путем интраназального введения (например, с помощью капельницы, тампона или ингалятора). Местное введение антител на поверхность дыхательных путей также можно осуществлять путем ингаляционного введения, например, путем создания пригодных для вдыхания частиц фармацевтического состава (включительно как с твердыми, так и с жидкими частицами), содержащих антитела в виде аэрозольной суспензии, и затем вызывая вдыхание субъектом указанных пригодных для вдыхания частиц. Способы и устройство для введения пригодных для вдыхания частиц фармацевтических составов хорошо известны, и можно применять любую традиционную методику.

[000168] В некоторых желательных вариантах осуществления данного изобретения указанные антитела вводят посредством парентеральной инъекции. Для парентерального введения антитела или молекулы можно составить в форме раствора, суспензии, эмульсии или лиофилизированного порошка в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем для парентерального введения. Например, указанный носитель может представлять собой раствор антитела или его смеси, растворенный в приемлемом носителе, таком как водный носитель, такими носителями являются вода, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы, раствор трегалозы или сахарозы, или 5% сывороточный альбумин, 0,4% физиологический раствор, 0,3% глицин и тому подобное. Также можно использовать липосомы и неводные носители, такие как фиксированные масла. Указанные растворы стерильны и, как правило, не содержат твердых частиц. Указанные композиции могут быть стерилизованы обычными, хорошо известными методиками стерилизации. Указанные композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, необходимые для приближения к физиологическим условиям, такие как регулирующие рН и буферные агенты, регулирующие токсичность агенты и тому подобное, например, ацетат натрия, хлорид натрия, хлорид калия, хлорид кальция, лактат натрия и т.д. Концентрация антител в указанных фармацевтических составах может варьировать в широких пределах, например, от меньше чем около 0,5% по массе, обычно на уровне или по меньшей мере около 1% по массе, вплоть до 15% или 20% по массе, и выбирается главным образом на основе объемов жидкости, показателей вязкости и т.д., в соответствии с конкретным выбранным путем введения. Носитель или лиофилизированный порошок могут содержать добавки, которые поддерживают изотоничность (например, хлорид натрия, маннит) и химическую стабильность (например, буферы и консерванты). Указанный фармацевтический состав стерилизуют с помощью общепринятых методик. Фактические способы приготовления композиций для парентерального введения известны или очевидны специалистам в данной области техники и описаны более подробно, например, в работе REMINGTON'S PHARMA. SCI. (15th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa., 1980).

[000169] Антитела или молекулы согласно данному изобретению могут быть лиофилизированы для хранения и восстановлены в подходящем носителе перед использованием. Было показано, что данная методика эффективна при использовании с обычными иммуноглобулинами. Можно использовать любые подходящие методики лиофилизации и восстановления. Специалистам в данной области техники будет понятно, что лиофилизация и восстановление могут приводить к различной степени потери активности антител и что уровни использования, возможно, придется корректировать для компенсации. Композиции, содержащие указанные антитела или их смесь, можно вводить для предотвращения рецидива и (или) для терапевтического лечения существующего заболевания. Подходящие фармацевтические носители описаны в наиболее позднем издании «Фармацевтических наук Ремингтона» («REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES))) стандартной цитируемой работе в данной области техники. При терапевтическом применении композиции вводят субъекту, уже страдающему заболеванием, в количестве, достаточном для излечения или, по меньшей мере, частичной остановки или облегчения указанного заболевания и его осложнений.

[000170] Эффективные дозы композиций согласно данному изобретению для лечения состояний или заболеваний, описанных в данном документе, варьируются в зависимости от множества различных факторов, включительно, например, но не ограничиваясь ими, с фармакодинамическими характеристиками конкретного агента, способом и путем его введения; целевым участком; физиологическим состоянием животного; другими вводимыми лекарственными препаратами; характером лечения - профилактическим или терапевтическим; возрастом, состоянием здоровья и массой тела реципиента; природой и степенью выраженности симптомов, характером сопутствующего лечения, частотой лечения и желаемым эффектом.

[000171] Однократное или многократное введение указанных композиций можно осуществлять с уровнями доз и схемой, выбираемыми лечащим ветеринаром. В любом случае, указанные фармацевтические композиции должны обеспечивать количество антитела (антител) согласно данному изобретению, достаточное для эффективного лечения данного субъекта. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения указанную композицию вводят один раз в два месяца, один раз в три месяца, один раз в четыре месяца, один раз в пять месяцев, один раз в шесть месяцев или один раз в семь месяцев.

[000172] Лечебные дозы можно титровать с использованием обычных способов, известных специалистам в данной области техники, для оптимизации безопасности и эффективности.

[000173] Фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут содержать «терапевтически эффективное количество». «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, эффективному для достижения желаемого терапевтического результата при необходимых дозах и в течение необходимых периодов времени. Терапевтически эффективное количество молекулы может варьировать в зависимости от таких факторов, как стадия заболевания, возраст, пол и масса тела субъекта, а также способность молекулы вызывать желаемый ответ у данного субъекта. Терапевтически эффективное количество также является таким, при использовании которого терапевтически благоприятные эффекты превосходят любые токсические или пагубные эффекты данной молекулы.

[000174] В другом аспекте данного изобретения композиции согласно данному изобретению можно применять, например, при лечении различных заболеваний и нарушений у кошек. При употреблении в контексте данного документа термины «лечить» и «лечение» относятся к терапевтическому лечению, включительно с профилактическими или предупреждающими мерами, целью которых является предотвращение или замедление (уменьшение) нежелательного физиологического изменения, связанного с заболеванием или состоянием. Благоприятные или желаемые клинические результаты включают в себя следующие, но не ограничиваются ими: облегчение симптомов, уменьшение степени заболевания или состояния, стабилизацию заболевания или состояния (т.е. когда заболевание или состояние не ухудшается), задержку или замедление прогрессирования заболевания или состояния, смягчение или облегчение заболевания, или состояния, и ремиссию (частичную или полную) заболевания или состояния, независимо от того, обнаруживаемые они или нет.К числу тех, кто нуждается в лечении, относятся те, кто уже имеют заболевание или патологическое состояние, а также те, кто склонен к заболеванию или патологическому состоянию, или те, у кого заболевание или патологическое состояние необходимо предотвратить.

[000175] Композицию, содержащую мутантную молекулу согласно данному изобретению, можно применять для лечения любого подходящего заболевания или нарушения. Например, мутантное антитело против ИЛ-31 согласно данному изобретению можно применять для лечения опосредованных ИЛ-31 состояния зуда или аллергического состояния. Примеры опосредованного ИЛ-31 состояния зуда включают в себя, например, но не ограничиваются ими, атопический дерматит, экзему, псориаз, склеродермию и зуд. Примеры опосредованного ИЛ-31 аллергического состояния включают в себя, например, но не ограничиваются ими, аллергический дерматит, летнюю экзему, крапивницу, отеки, воспалительное заболевание дыхательных путей, рецидивирующую обструкцию дыхательных путей, гиперчувствительность дыхательных путей, хроническую обструктивную болезнь легких и воспалительные процессы, возникающие в результате аутоиммунитета.

[000176] Мутантное антитело против ФРН согласно данному изобретению можно применять для лечения опосредованных ФРН боли или состояния. Примеры боли включают в себя, например, следующие, но не ограничиваясь ими: хроническую боль, воспалительную боль, боль после хирургического надреза, нейропатическую боль, боль при переломе, боль при переломе, ассоциированном с остеопорозом, постгерпетическую невралгию, боль при онкологическом заболевании, боль, возникающую в результате ожогов, боль, связанную с ранами, боль, связанную с травмой, нейропатическую боль, боль, связанную с нарушением опорно-двигательного аппарата, ревматоидный артрит, остеоартрит, анкилозирующий спондилит, серонегативные (неревматоидные) артропатии, внесуставной ревматизм, периартикулярное нарушение или периферическую нейропатию. В конкретном варианте осуществления данного изобретения указанная боль представляет собой боль при остеоартрите.

[000177] Все патенты и литературные ссылки, указанные в данном документе, настоящим включены в данный документ посредством ссылки во всей их полноте.

[000178] Следующие ниже примеры представлены в дополнение к предшествующему описанию и для лучшего понимания изобретения, описанного в данном документе. Указанные примеры не следует рассматривать как ограничение описываемого изобретения. Следует понимать, что примеры и варианты осуществления данного изобретения, описанные в данном документе, предназначены только для иллюстративных целей, и что различные их модификации или изменения будут понятны квалифицированным специалистам в данной области техники и включены в данный документ, и могут осуществляться без отклонения от объема данного изобретения.

ПРИМЕРЫ ПРИМЕР 1

Конструирование Fc-мутантов кошачьего IgG

[000179] Конструирование всех кошачьих IgG (фиг. 1) выполняли так, как описано в работе Strietzel et. al. (Strietzel et al., 2014, Vet Immunol Immunopathol., vol. 158 (3-4), pages 214-223), при этом использовали плазмиды, содержащие последовательность, кодирующую кошачьи константные области для аллели а подкласса 1 IgG (IgG1a), и последовательности VH/VL для каждого исследуемого в данном примере мАт вставляли в положении к 5' и в рамке с нуклеотидами, кодирующими указанные константные домены. Мутации производили в положениях S434 и S428 домена СН3 (фиг. 2) каждой плазмиды с использованием мутагенеза по технологии QuikChange II от Agilent и связанных с ним инструментов Agilent для разработки праймеров для мутагенеза, направленного на один сайт (https://www.agilent.com/store/primerDesignProgram.jsp).

[000180] Конструкции антител кратковременно экспрессировали либо в клетках HEK 293 с использованием стандартного протокола трансфекции липофектамином (Invitrogen Life Technologies, г. Карлсбад, штат Калифорния, США), либо в клетках СНО с использованием протоколов из набора реактивов ExpiCHO transient system (ThermoFisher Scientific). Экспрессия ExpiCHO соответствовала протоколам, изложенным ThermoFisher для совместной трансфекции плазмиды, содержащей последовательность генов, кодирующую легкую цепь IgG и тяжелую цепь IgG. Для экспрессии HEK293 совместно трансфицировали равные по весу количества плазмиды с тяжелой цепью и плазмиды с легкой цепью. Клетки выращивали в течение 7 суток, после чего собирали надосадочные жидкости для очистки от антител. Антитела подвергали скринингу на предмет связывания с сенсорами белка А с помощью количественного определения в системе Octet QKe (Pall ForteBio Corp, г. Менло-Парк, штат Калифорния, США). Конструкции, которые связывались с белком А, очищали и количественно определяли так, как описано в работе Strietzel et al. для качественной оценки белка.

ПРИМЕР 2

Анализ аффинности и активности связывания с целевой молекулой

[000181] Аффинность каждого мАт оценивали с помощью анализа по технологии Biacore и определяли IC50 с помощью подходящего клеточного анализа активности. Проводили поверхностный плазмонный резонанс на приборе Biacore Т200 (GE Healthcare, г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США) для измерения аффинностей связывания каждого антитела с его целевой молекулой. По 2,5 мкг/мл каждого целевого белка иммобилизовали путем аминного связывания с использованием реактива EDC/NHS для получения конечной плотности, составляющей ~250 ЕР (единиц резонанса, англ. «RU») в проточных ячейках 2-4 сенсорного чипа СМ5, соответственно.

[000182] Проточную ячейку 1 использовали в качестве внутреннего референса для поправки на воздействие рабочего буфера. Связывание антител измеряли при температуре 15°С с продолжительностью контакта 250 с и скоростью потока 30 мкл/мин. Период диссоциации составлял 300 с. Восстановление проводили с использованием восстановительных буферов (10 мМ глицина, рН 1,5, и 10 мМ NaOH) и скоростью потока 20 мкл/мин в течение 60 с каждый. Рабочий буфер / разбавитель (1X HBS-EP, GE Healthcare, BR-1006-69, 10Х, содержащий 100 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 30 мМ ЭДТА и 0,5% об./об. сурфактанта Р20, рН 7,4, 1:10 в отфильтрованной MQ H2O) использовали в качестве отрицательного контроля при том же формате анализа.

[000183] Данные анализировали с помощью программного обеспечения Biacore Т200 Evaluation с использованием способа двойного референса. Полученные в результате кривые встраивали в модель связывания 1:1. Не было выявлено различий в аффинностях связывания или в IC50 между IgG ДТ и мутантными IgG S434 и S428 (таблица 1).

ПРИМЕР 3 Анализ связывания FcRn in vitro

[000184] Выделяли и подготавливали кошачий FcRn, и анализировали Fc-мутанты IgG по сравнению с FcRn в соответствии с Strietzel et. al. Применяли стандартный способ ПЦР с быстрой амплификацией концов кДНК (англ. «RACE PCR») для амплификации субъединицы α кошачьего FcRn и р-микроглобулина. Субъединицу FcRn-α и β-микроглобулин совместно трансфицировали в клетки НЕК 293, и комплекс FcRn очищали методом аффинной очистки посредством аффинной хроматографии с иммобилизованным металлом (АХИМ, англ. «IMAC») с использованием С-концевой гистидиновой метки. Показатели KD измеряли с помощью Biacore 3000 или Biacore Т200 (GE Healthcare, г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США) с использованием сенсорного чипа СМ5.

[000185] FcRn иммобилизовали на поверхности сенсора с использованием стандартного способа аминной иммобилизации для достижения желаемой поверхностной плотности. HBS-EP использовали в качестве рабочего буфера для иммобилизации, а 10 мМ MES; 150 мМ NaCl; 0,005% Твин-20; 0,5 мг/мл БСА; рН 6 и р Н7,2, и ФСБ; 0,005% Твин-20; 0,5 мг/мл БСА; рН 7,4 использовали в качестве рабочих буферов для анализа и титрования. Fc-мутантные IgG пропускали над поверхностью рецепторов и определяли аффинность с помощью программного обеспечения Scrubber2 (BioLogic Software Pty, Ltd., Кэмпбелл, Австралия) или программного обеспечения Т200 Evaluation (таблица 2). Значения от пустых контрольных ячеек, содержащих только буфер, вычитали из значений для всех остальных ячеек. Проточные ячейки восстанавливали с использованием 50 мМ Трис рН 8. Прогоны проводили при температуре 15°С.

[000186] Мутации, произведенные в положениях 434 и 428, оказали заметное влияние на аффинность указанных IgG к FcRn при рН 6. Данное исследование показывает, что повышение аффинности IgG к FcRn не зависит от доменов VHVL и является универсальным для любого кошачьего IgG1a.

ПРИМЕР 4

Исследования фармакокинетики Fc-мутантов IgG у кошек

[000187] Проводили исследования фармакокинетики (ФК) с целью демонстрации эффекта мутаций S434H и S428L по продлению периода полужизни подкласса IgG1a с мАт, полученными против множества целевых молекул. Планы исследований варьировали, но по существу провели два типа исследований:

[000188] План исследования 1: мАт вводили группам из 4 самцов и 4 самок домашних короткошерстных кошек в дозе по 2 мг/кг.Первую и вторую дозы вводили подкожно с интервалом в 28 суток. Третью дозу вводили внутривенно спустя 28 суток. Образцы сыворотки крови отбирали еженедельно в течение 14 недель.

[000189] План исследования 2: мАт вводили в виде разовой дозы в 2 мг/кг подкожно или внутривенно группам из 3 или 4 домашних короткошерстных кошек. Образцы сыворотки отбирали еженедельно.

[000190] Фармакокинетические расчеты проводили с использованием некомпартментарного подхода (правило линейной трапеции для расчета AUC) с помощью Watson™. Дополнительные расчеты выполняли с помощью Excel™, включительно с поправкой AUC, учитывающей перекрытие профилей концентрация - время после 2-й и 3-й инъекций препарата. Сводные данные о концентрации во времени и фармакокинетические данные с простой статистикой (среднее значение, стандартное отклонение, коэффициент вариации) рассчитывали с использованием Excel™ или Watson™. Никакие другие статистические анализы не проводили.

[000191] Было показано, что точечная мутация S428L в кошачьем IgG1a увеличивает период полужизни трех различных кошачьих IgG у домашних короткошерстных кошек. Для мАт 1 период полужизни увеличился с 11 суток до 26 суток, а для мАт2 - с 7,9 суток до 23 суток. Было показано, что точечная мутация S434H в кошачьем IgGla увеличивает период полужизни одного мАт с 10,1 суток до 13,2 суток.

[000192] Механизм действия заключается в повышении аффинности к кошачьему FcRn при рН 6, и это было продемонстрировано на множестве кошачьих IgG, которые связывают очень разные и конкретные растворимые целевые молекулы. Следовательно, было продемонстрировано, что продление периода полужизни мутациями S428L и N434 в кошачьем IgGla не зависит от доменов VHVL.

ПРИМЕР 5 Анализ связывания FcRn

[000193] Выделяли и подготавливали кошачий FcRn, и анализировали Fc-мутанты IgG по сравнению с кошачьим FcRn в соответствии с работой Strietzel et. al., как обсуждалось выше. Применяли стандартный способ ПЦР для амплификации субъединицы а кошачьего FcRn и β-микроглобулина. Субъединицу FcRn-α и β-микроглобулин совместно трансфицировали в клетки HEK 293, и комплекс FcRn очищали методом аффинной очистки с АХИМ с использованием С-концевой гистидиновой метки. Комплекс FcRn метили биотином с помощью ферментативной реакции биотинилирования BirA. Показатели KD измеряли с помощью Biacore Т200 (GE Healthcare, г. Питтсбург, штат Пенсильвания, США) или Biacore 8K (Cytiva, г. Мальборо, штат Массачусетс, США) с использованием сенсорного чипа SA.

[000194] FcRn захватывали на поверхности указанного сенсора с использованием модифицированного метода захвата SA. 10 мМ MES; 150 мМ NaCl; 0,005% Твин-20; 0,5 мг/мл БСА; рН 6 использовали в качестве буфера для захвата, анализа и титрования. 1х HBS-P, 0,5 мг/мл БСА; рН 7,4 также использовали в качестве буфера для анализа и титрования. Fc-мутантные IgG пропускали над поверхностью рецепторов и определяли аффинность с помощью программного обеспечения Т200 Evaluation или программного обеспечения Biacore Insight Evaluation. Значения от пустых контрольных ячеек, содержащих только буфер, вычитали из значений для всех остальных ячеек. Проточные ячейки восстанавливали с использованием 50 мМ Трис рН 8 или рН 9. Прогоны проводили при температуре 15°С.

[000195] Мутации, произведенные в соответствующих положениях, оказали заметное влияние на аффинность указанных IgG к FcRn при рН 6. Связывание IgG дикого типа (ДТ) и мутантных IgG с кошачьим FcRn измеряли посредством поверхностного плазмонного резонанса (Biacore).

[000196] Заметное влияние на аффинность наблюдалось у совершенно разных и структурно различающихся антител, которые связывают разные целевые молекулы (т.е. у антител против ИЛ-31 и против ФРН), а также у разных версий антител, которые связывают одну и ту же целевую молекулу (т.е. у разных версий антител против ИЛ-31 и против ФРН) (таблицы 1-5). Следовательно, повышение аффинности IgG к FcRn не зависит от доменов VHVL или областей CDR. В дополнение к этому, заметное влияние на аффинность наблюдалось у множества подклассов IgG. В целом, данные результаты показывают, что повышение аффинности IgG к FcRn к не зависит от подкласса кошачьего IgG.

[000197] Предпочтительные варианты осуществления данного изобретения описаны в данном документе, но следует понимать, что данное изобретение не ограничивается указанными точными вариантами осуществления данного изобретения, и что специалисты в данной области техники могут вносить в него различные изменения и модификации без отступления от объема или духа данного изобретения, определенных в прилагаемой формуле данного изобретения.

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлен модифицированный IgG, обладающий свойствами повышенной аффинности связывания с неонатальным рецептором Fc (FcRn), который содержит константный домен кошачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, способ его получения и применение. При этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 428 или 434. Также раскрыты: фармацевтическая композиция и набор для увеличения периода полужизни IgG в сыворотке крови кошки, вектор экспрессии, выделенная клетка-хозяин, применение иммуноглобулина для увеличения его периода полужизни в сыворотке крови кошки и слитый белок. Изобретение позволяет увеличить период полужизни кошачьего антитела в сыворотке крови кошки. 8 н. и 9 з.п. ф-лы, 6 табл., 16 ил., 5 пр.

1. Модифицированный IgG, обладающий свойствами повышенной аффинности связывания с неонатальным рецептором Fc (FcRn), содержащий: константный домен кошачьего IgG, содержащий по меньшей мере одно аминокислотное замещение по сравнению с константным доменом кошачьего IgG дикого типа, при этом указанное замещение находится в аминокислотном остатке 428 или 434, пронумерованном в соответствии с индексом ЕС, как по Кабату.

2. Модифицированный IgG по п. 1, отличающийся тем, что указанное замещение представляет собой замещение серина в положении 428 лейцином (S428L).

3. Модифицированный IgG по п. 1, отличающийся тем, что указанное замещение представляет собой замещение серина в положении 434 гистидином (S434H).

4. Модифицированный IgG по п. 1, отличающийся тем, что указанный константный домен кошачьего IgG содержит два аминокислотных замещения, где первое замещение находится в аминокислотном остатке 428, и второе замещение находится в аминокислотном остатке 434.

5. Модифицированный IgG по п. 4, отличающийся тем, что первое замещение представляет собой замещение серина в положении 428 лейцином (S428L), и второе замещение представляет собой замещение серина в положении 434 гистидином (S434H).

6. Модифицированный IgG по п. 1, отличающийся тем, что указанный модифицированный IgG обладает более высокой аффинностью к FcRn, чем указанный IgG, содержащий константный домен кошачьего IgG дикого типа.

7. Модифицированный IgG по п. 1, отличающийся тем, что указанный модифицированный IgG представляет собой кошачий или фелинизированный IgG.

8. Модифицированный IgG по п. 1, отличающийся тем, что указанный константный домен IgG содержит константную область Fc, содержащую домены CH2 или CH3, или их комбинацию.

9. Модифицированный IgG по п. 1, отличающийся тем, что указанный константный домен IgG содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1 или 2.

10. Фармацевтическая композиция для увеличения периода полужизни IgG в сыворотке крови кошки, содержащая модифицированный IgG по любому из пп. 1-9 и фармацевтически приемлемый носитель.

11. Набор, предназначенный для увеличения периода полужизни IgG в сыворотке крови кошки, содержащий модифицированный IgG по любому из пп. 1-9 в контейнере и инструкции по применению.

12. Вектор экспрессии, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую константный домен кошачьего IgG модифицированного IgG по п. 1, где указанный домен имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 1 или 2.

13. Выделенная клетка-хозяин, содержащая вектор по п. 12, которая продуцирует модифицированный IgG, обладающий свойствами повышенной аффинности связывания с FcRn.

14. Способ производства антитела, включающий в себя обеспечение наличия клетки по п. 13 и культивирование указанной клетки.

15. Применение иммуноглобулина для увеличения его периода полужизни в сыворотке крови кошки, где указанный иммуноглобулин содержит модифицированный IgG по любому из пп. 1-9.

16. Слитый белок, обладающий свойствами повышенной аффинности связывания с FcRn, содержащий модифицированный IgG по любому из пп. 1-9, слитый с гетерологичным белком.

17. Применение по п. 15, где указанный иммуноглобулин представляет собой молекулу против интерлейкина-31 (ИЛ-31) или против фактора роста нервов (ФРН).