ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/00 

Изобретение относится к области определения суммарной активности антиоксидантов в объектах искусственного и природного происхождения пищевой, косметической, фармацевтической промышленности и медицины. Изобретение может быть использовано для определения суммарной антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья, продуктов питания, лекарственных препаратов, биологических объектов, что в свою очередь позволяет определить наиболее эффективные препараты и их дозировки, обладающие антиоксидантными свойствами, и рекомендовать их к использованию в лечебных и профилактических целях.

В данной области известны различные способы определения суммарной активности антиоксидантов.

Наиболее известен способ построения кинетических кривых свободно-радикального окисления какого-либо модельного вещества, например, сульфит-иона, для определения суммарной антиоксидантной активности в различных объектах. Кинетика окисления сульфит-иона контролируется в данном способе по выделению кислорода. Степень торможения реакции окисления сульфит-иона определяется по отношению наклонов кинетических кривых выделения кислорода до и после добавления антиоксидантов. Антиоксидантная активность образцов определяется по кривым зависимости изменения концентрации кислорода в реакционной смеси от количества добавленного образца (В.В. Хасанов, К.А. Дычко, Г.Л. Рыжова. Кинетический метод свободно-радикального окисления сульфит-иона для определения антиоксидантов в биообъектах.//Химико-фармацевтический журнал, 2001, 12, с. 36, 37).

Недостатком способа является то, что антиоксидантные свойства контролируются по суммарной скорости выделения кислорода, которая изменяется при добавлении антиоксидантов в небольшой степени, что ограничивает чувствительность способа. Кроме того, в качестве модельной реакции взято окисление сульфит-иона, что не совсем корректно для моделирования окислительных процессов, происходящих в биологических объектах, для которых присутствие сульфит-иона не характерно.

Известен электрохимический способ определения суммарной антиоксидантной способности объектов искусственного и природного происхождения, который заключается в кулонометрическом титровании общего количества антиоксидантов в объектах электрогенерированным бромом. По результатам титрования рассчитывают величину бромной антиоксидантной способности, мерой которой служит количество электричества в кулонах, отнесенных к 100 г (100 мл) образца (И. Ф. Абдуллин, Е. Н. Турова, Г.К. Будников. Кулонометрическая оценка антиоксидантной способности экстрактов чая электрогенерированным бромом.//Журнал аналитической химии, 2001, т.56, 6, с. 627-629).

Недостатком метода является то, что данный способ позволяет исследовать лишь водорастворимые формы антиоксидантов и те их них, которые реагируют с бромом. Кроме того, для исследований требуется не менее 100 г (100 мл) исследуемого образца.

Известен способ циклической вольтамперометрии для оценки суммарной антиоксидантной активности образцов, который заключается в съемке циклических вольтамперограмм аскорбиновой кислоты. Изменение величины площади под анодным пиком окисления аскорбиновой кислоты в присутствии антиоксидантов служило основной величиной для определения суммарной антиоксидантной способности образцов (S. Chevion, M.A. Roberts, M. Chevion. The use of cyclic voltammetry for the evaluation of antioxidant capacity. //Free radical biology and medicine, 2000, v.28, N 6, p. 860-870) - прототип.

Недостатком способа является небольшая точность и воспроизводимость метода, т.к. аскорбиновая кислота сама окисляется со временем в растворе. Кроме того, данный способ предполагает использование высокоэффективной жидкостной хроматографии в сочетании с электрохимическим детектированием, что усложняет метод, делает его дорогостоящим.

Задачей данного изобретения является разработка эффективного, экспрессного, универсального способа определения суммарной антиоксидантной активности образцов как в водной, так и в неводной средах.

В предложенном способе в качестве модельной реакции используется процесс электровосстановления кислорода, идущий по механизму, аналогичному восстановлению кислорода в клетках организма, тканях растений, и являющийся основным окислительным процессом во всех объектах искусственного и природного происхождения. В данном способе рассматривается одноэлектронное восстановление кислорода с образованием активных кислородных радикалов: О₂ ^.-, НО₂ ^.. Антиоксиданты, имеющие восстановительную природу, реагируют с кислородом и его активными радикалами на поверхности рабочего электрода, что визуально отражается в уменьшении катодного тока одноэлектронного восстановления кислорода на ртутно-пленочном электроде в области потенциалов от 0 до -0,6 В относительно хлорид-серебряного электрода сравнения (Ag, AgCl/Сl^-). Степень уменьшения тока электровосстановления кислорода относительно концентрации антиоксидантов в растворе служит коэффициентом суммарной антиоксидантной активности образцов (K):

где ΔI - изменение значений тока электровосстановления кислорода в присутствии антиоксидантов в растворе, I^o - начальное значение тока электровосстановления кислорода в отсутствие антиоксидантов в растворе, ΔC - соответствующее изменение концентрации антиоксидантов в растворе, V - общий объем раствора.

Использование относительного изменения тока электровосстановления кислорода позволяет значительно повысить точность и воспроизводимость метода, избежать влияния растворителя, окружающей среды и других побочных факторов на определение суммарной антиоксидантной активности образцов.

Способ отличается высокой чувствительностью, характерной для вольтамперометрических методов анализа. Для определения суммарной антиоксидантной активности требуется всего около 1 г (1 мл) исследуемого образца.

Кроме того, данный способ отличается тем, что суммарная антиоксидантная активность образцов определяется по первой волне одноэлектронного восстановления кислорода на ртутно-пленочном электроде, приготовленном способом электролиза ртути на серебряную подложку из насыщенного раствора азотнокислой закисной ртути в течение 20 с.

Данный способ одинаково эффективен как в анализе биологических объектов (плазма, сыворотка крови), так и в водных и неводных (спиртовых, апротонных) средах, экстрактах растений, продуктов питания и других объектов. Способ не требует длительной пробоподготовки. Достаточно перевести образец в растворимое состояние в водной, спиртовой или апротонной среде, поэтому способ экспрессен и не требует дорогостоящей аппаратуры. Время проведения одного определения не более 15 мин. Способ не требует добавления в раствор посторонних веществ, т.к. используется растворенный кислород в исследуемом водном или неводном растворе. Ток электровосстановления кислорода в исходном растворе соответствует его растворимости в используемом растворителе при нормальных условиях.

Данный способ позволяет построить концентрационную зависимость тока электровосстановления кислорода от количества антиоксидантов в растворе и определить, в какой области концентраций тот или иной объект обладает наилучшей антиоксидантной способностью. Кроме того, данный способ весьма удобен в исследовании стабильности исследуемых препаратов во времени.

Для определения суммарной антиоксидантной активности в данном способе используется метод катодной вольтамперометрии. В качестве прибора можно использовать полярограф или вольтамперометрический анализатор любого типа с подключенной к нему электрохимической ячейкой, состоящей из рабочего ртутно-пленочного электрода и хлорид-серебряного электрода сравнения, опущенных в раствор фонового электролита. В качестве фонового электролита для водных сред использовался 0,1М Na₂SO₄, для апротонных сред 0,1М NaClO₄, для биологических объектов 0,9% NaCl (физиологический раствор).

Перед проведением эксперимента необходимо подготовить рабочий электрод: нанести на серебряную подложку тонкий слой ртути электролизом из насыщенного раствора азотнокислой закисной ртути Hg₂(NO₃)₂ в течение 20 с.

Подготовленные к работе рабочий ртутно-пленочный электрод и хлорид-серебряный электрод сравнения опускаются в раствор фонового электролита (5 мл) и подключаются к прибору. Исследуемые образцы переводят в растворимое состояние в водной, спиртовой или апротонной среде, растворяя 1 г (1 мл) образца в 50-100 мл растворителя.

Методика эксперимента заключается в съемке вольтамперограмм первой волны катодного тока электровосстановления кислорода в области потенциалов от 0 до -0.6 В без добавления и с последующим добавлением приготовленного раствора исследуемого образца. Используется режим дифференциальной катодной вольтамперометрии, скорость развертки потенциала W=50-100 мВ/с. Устанавливают время 10-30 с - перемешивание раствора с помощью магнитной мешалки и 10-30 с - успокоение раствора перед съемкой. Рекомендуется строго контролировать время перемешивания и успокоения раствора для повышения точности определения.

По результатам эксперимента строят график зависимости относительного тока электровосстановления кислорода от концентрации образца в растворе (C•V):

где I - текущее значение тока электровосстановления кислорода в присутствии образца в растворе, I^o - ток электровосстановления кислорода в фоновом электролите в отсутствие образца в растворе (начальное значение), С - концентрация образца в растворе (г/мл), V - общий объем исследуемого раствора (мл). По данному графику выбирается линейный участок кривой (в области малых концентраций), тангенс угла наклона которого служит коэффициентом суммарной антиоксидантной активности образца (К).

Пример конкретного выполнения: 1 г сухой аскорбиновой кислоты растворить в 50 мл дистиллированной воды. Подготовить электроды к работе. Для этого серебряный электрод опустить в насыщенный раствор азотнокислой закисной ртути и подключить к стандартному прибору для проведения электролиза в качестве катода. Вторым электродом - анодом - может служить Pt или стекло-графитовый электрод. Установить потенциал: Е=1,5 В. Проводить электролиз 20 с. Вытащить серебряный электрод с нанесенной ртутной пленкой, промыть дистиллированной водой. Хлорид-серебряный электрод заполнить насыщенным раствором КС1. В стеклянный стаканчик (электрохимическая ячейка) залить 5 мл фонового электролита: 0,1М NaSО₄. Электроды опустить в раствор фонового электролита и подключить к прибору - полярографу. Рабочий электрод - ртутно-пленочный, электрод сравнения - хлорид-серебряный. Подготовить прибор к работе, установив вид полярографии: дифференциальная катодная, скорость развертки потенциала 50 мВ/с, начальный потенциал 0 В, диапазон развертки потенциалов 0,6 В. Развертка в катодную область от 0 до -0,6 В. Перемешать раствор с помощью магнитной мешалки 10 с, затем 10 с - успокоение раствора. Далее снять первую волну катодного восстановления кислорода, растворенного в фоновом растворителе, в указанной области потенциалов. Добавлять по каплям приготовленный раствор аскорбиновой кислоты, каждый раз снимая вольтамперограммы первой волны катодного восстановления кислорода. По результатам построить график зависимости относительного тока электровосстановления кислорода от концентрации образца в растворе (C•V) и определить тангенс угла наклона линейной части данного графика, используя компьютерную программу "Статистика" или любую другую программу, позволяющую выполнять указанные операции. Тангенс угла наклона и является коэффициентом антиоксидантной активности образца.

Данным способом были определены значения антиоксидантной активности для известных (стандартных) антиоксидантов: аскорбиновой кислоты (К=27,44 г^-1), глюкозы (К= 24,00 г^-1), резорцина (К=2,81 г^-1), пирокатехина (К=5,27 г^-1), пирогаллола (К= 9,44 г^-1), для различных экстрактов лекарственного растительного сырья (таблица 1), фармацевтических препаратов (таблица 2). Результаты были сопоставлены с известным способом определения суммарной антиоксидантной активности (В. В. Хасанов, К.А. Дычко, Г.Л. Рыжова. Кинетический метод свободно-радикального окисления сульфит-иона для определения антиоксидантов в биообъектах. //Химико-фармацевтический журнал, 2001, 12, с. 36, 37). Результаты удовлетворительно совпадали.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет определить суммарную антиоксидантную активность объектов природного и искусственного происхождения, а также биологических объектов посредством их влияния на процесс электровосстановления кислорода, повысить чувствительность, эффективность, экспрессность, точность и воспроизводимость определения.

Изобретение относится к области определения суммарной активности антиоксидантов в объектах искусственного и природного происхождения пищевой, косметической, фармацевтической промышленности и медицины и может быть использовано для определения суммарной антиоксидантной активности экстрактов растительного сырья, продуктов питания, лекарственных препаратов, биологических объектов. Способ включает процесс восстановления вещества на электроде в растворе электролита. В качестве модельной реакции используют электровосстановление кислорода, который проводят на ртутно-пленочном электроде на фоне 0,1 М Na₂SO₄ в водной среде, 0,1 М NaClO₄ в апротонной среде или 0,9% NaCl в биологических объектах, регистрацию катодных волн одноэлектронного восстановления кислорода ведут в режиме дифференцирования при скорости развертки потенциала 50-100 мВ/с, а суммарную антиоксидантную активность определяют по относительному изменению тока электровосстановления кислорода в интервале потенциалов от 0 до 0,6 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения. Способ повышает чувствительность, точность, экспрессность определения, требует небольшой пробоподготовки, позволяет оценить оптимальные дозы препарата, определить стабильность исследуемых образцов во времени. 2 табл.

Вольтамперометрический способ определения суммарной активности антиоксидантов, включающий процесс восстановления вещества на электроде в растворе электролита, отличающийся тем, что в качестве модельной реакции используется процесс электровосстановления кислорода, который проводят на ртутно-пленочном электроде на фоне 0,1М Na₂SO₄ в водной среде, 0,1М NaClO₄ в апротонной среде или 0,9% NaCl в биологических объектах, регистрацию катодных волн одноэлектронного восстановления кислорода ведут в режиме дифференцирования при скорости развертки потенциала 50-100 мВ/с, суммарную антиоксидантную активность определяют по относительному изменению тока электровосстановления кислорода в интервале потенциалов от 0 до - 0,6 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения.