ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ Российский патент 2011 года по МПК G01N27/48 

Изобретение относится к области определения активности антиоксидантов и может быть использовано в пищевой, косметической, фармацевтической промышленностях, а также в медицине и криминалистике.

Известен способ определения суммарной антиоксидантной активности (АОА) биологически активных веществ (патент РФ №2238554, МПК⁷ G01N 33/15, G01N 27/26, опубл. 20.10.2004), включающий подготовку проб анализируемого и стандартного веществ, их электрохимическое окисление в ячейке амперометрического детектора, усиление электрических сигналов, их регистрацию и расчет АОА по предложенной математической зависимости. В этом способе подготовку анализируемых проб осуществляют путем смешения соответствующих веществ с растворителем, не обладающим антиоксидантной способностью. Кроме того, в качестве стандартных веществ используют вещества, обладающие высоким редокс-потенциалом, выбранные из ряда: рутин, кверцетин, дигидрокверцетин.

Основными недостатками данного способа являются "относительно низкая чувствительность, а также сложность аппаратурного оформления, т.к. для реализации способа требуется насос, термостатируемая электрохимическая ячейка, кран дозатор. Кроме того, в этом способе окисление антиоксидантов идет электрохимическим путем на поверхности рабочего электрода, на котором происходит глубокое окисление, не характерное для процессов, происходящих в организме.

Известен также выбранный нами за прототип вольтамперометрический способ определения суммарной активности антиоксидантов (патент РФ №2224997, МПК⁷ G01N 33/00, опубл. 27.02.2004), включающий процесс восстановления вещества на электроде в растворе электролита. В этом способе в качестве модельной реакции используют процесс электровосстановления кислорода, который проводят на ртутно-пленочном электроде на фоне 0,1М Na₂SO₄ в водной среде, 0,1 М NaClO₄ в апротонной среде или 0,9% NaCl в биологических объектах, регистрацию катодных волн одноэлектронного восстановления кислорода ведут в режиме дифференцирования при скорости развертки потенциала 50-100 мВ/с, суммарную антиоксидантную активность определяют по относительному изменению тока электровосстановления кислорода в интервале потенциалов от 0 до -0,6 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения.

Основным недостатком этого способа является низкая чувствительность. Кроме того, способ не достаточно объективно оценивает активность антиоксидантов по отношению к процессам, происходящим в организме, т.к. с помощью модельной реакции, указанной в прототипе, невозможно определять активность антиоксидантов по отношению к ^.ОН радикалам. Как показано в работе (Ю.А.Владимиров. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журнал. - 2000. - №12, т.6. - С.16), наибольший вред здоровью приносят свободные ^.ОН радикалы, т.к. «в нуклеиновых кислотах ^.ОН разрушает углеводные мостики между нуклеотидами и, таким образом, разрывает цепи ДНК и РНК, в результате чего происходят мутации и гибель клеток. Таким образом, радикал ^.ОН - это радикал-разрушитель, радикал-убийца».

Основным техническим результатом предложенного изобретения является повышение чувствительности способа определения активности антиоксидантов в 277 раз. Кроме того, предлагаемый способ позволяет измерять активность антиоксидантов по отношению к наиболее опасным для организма ^.ОН радикалам.

Указанный технический результат достигается тем, что в предлагаемом вольтамперометрическом способе определения активности антиоксидантов, включающем использование модельной реакции в процессе восстановления вещества на электроде в растворе фонового электролита, регистрацию катодных волн восстановления вещества в заданном интервале потенциалов относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения, добавление антиоксиданта и определение антиоксидантной активности по относительному изменению тока электровосстановления, согласно предложенному решению, в качестве модельной реакции используют реакцию, генерирующую ^.ОН радикалы, а регистрацию катодных волн ведут в интервале потенциалов -1,2÷-1,9 В.

В предлагаемом способе определения активности антиоксидантов используют метод вольтамперометрии. Измерение вольтамперных зависимостей восстановления вещества проводят с помощью вольтамперометрического анализатора или полярографа любого типа, который подключают к электрохимической ячейке. Электрохимическая ячейка состоит из емкости, в которую наливают фоновый раствор электролита и опускают два электрода - рабочий и электрод сравнения. В качестве фоновых растворов используют хорошо проводящие водные растворы сильных электролитов: KCl, Na₂SO₄, ацетатный или цитратный буферы, а также неводные растворы спиртов, в частности этиленгликоль с добавкой тетраалкиламмония бромида (ТААБ) для электропроводности. В качестве электродов используют хлорид-серебряный электрод сравнения, в качестве рабочего - электрод, инертный в рабочей области потенциалов -1,2÷-1,9 В, например, ртутный пленочный, ртутный сферический, пленочный висмутовый и пленочный свинцовый на графитовых подложках. Как правило, используют ртутный пленочный электрод на серебряной подложке. Подготовленные электроды подключают к анализатору, опускают в электрохимическую ячейку с 10-20 мл фонового раствора и записывают вольтамперограмму фона. Затем проводят модельную реакцию, генерирующую ^.ОН радикалы, с помощью одной из модельных систем: Fe²⁺-ЭДТА, Cu²⁺-ЭДТА, Fe²⁺-HPO₄ ^2-, Na₂SO₃-O₂ и Fe²⁺-H₂O₂ (реакция Фентона). Методика эксперимента заключается в измерении вольтамперометрических зависимостей катодного тока электровосстановления в области потенциалов -1,2÷-1,9 В. При проведении в фоновом растворе электролита модельной реакции, генерирующей ^.ОН радикалы, на вольтамперограммах появляется новая катодная волна, предположительно ^.ОН радикала. При используемых скоростях развертки катодная волна имеет форму пика с максимумом -1,4÷-1,6 В в зависимости от фона. Затем в фоновый раствор электролита добавляют навеску растворимого антиоксиданта или измеренный объем его раствора известной концентрации и повторно измеряют вольтамперометрическую зависимость. При этом величина новой катодной волны, предположительно ^.ОН радикала, уменьшается пропорционально количеству добавленного антиоксиданта.

Оценку антиоксидантной способности (К) проводят, сравнивая высоту катодной волны, предположительно ^.ОН радикала, до (I₀, мкА) и после (It, мкА) внесения антиоксиданта по формуле:

К=X/C·V, г^-1, где Х=(I₀-It)/I₀, С - концентрация вносимого раствора антиоксиданта, г/мл, V - объем вносимого раствора антиоксиданта, мл.

Пример конкретного выполнения 1.

Подготавливают прибор - вольтамперометрический анализатор типа СТА-1 (производства ООО «ИТМ», г.Томск), совмещенный с компьютером, к работе. Для этого устанавливают вид полярографии: постояннотоковая, скорость развертки потенциала 50 мВ/с, начальный потенциал - 0 В, конец развертки потенциала -1,9 В. Развертка в катодную область от 0 до -1,9 В. В качестве рабочего электрода применяют ртутно-пленочный, а в качестве электрода сравнения - хлорид-серебряный.

При осуществлении способа в стеклянный стаканчик (электрохимическую ячейку) наливают 10 мл раствора фонового электролита, а именно 0,1 М Na₂SO₄, в него опускают электроды и подключают к прибору. После этого записывают вольтамперограмму (фиг.1) в фоновом растворе в указанной области потенциалов, регистрируя катодные волны кислорода и пероксида водорода (Скуг Д., Уэст Д. Основы аналитической химии / Пер. с англ. под ред. Ю.А.Золотова. - М.: Мир, 1979. - С.69). Затем проводят модельную реакцию, генерирующую ^.ОН радикалы, с помощью модельной системы Fe²⁺-ЭДТА. Для этого дозатором вносят в ячейку 0,03 мл 0,01М раствора этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,025 мл 0,01 М раствора соли Мора - FeSO₄·(NH₄)2SO₄·6H₂O. Перемешивают раствор путем вибрации электродов в течение 5 с. При этом, согласно (X.F.Yang, X.Q.Guo. Fe(II)-EDTA Chelate-Induced Aromatic Hydroxylation of Terephtalate as a New Method for the Evalution of Hydroxil Radical-Scavenging Ability // The Analist. - 2001. - #126. - P.926-932), генерация ^.ОН радикалов протекает из кислорода при участии комплексов железа (II) с ЭДТА. После успокоения раствора в течение 5 с записывают вольтамперограмму и регистрируют исчезновение катодной волны Н₂О₂, и появление новой катодной волны, возможно ^.ОН радикала, в интервале потенциалов -1,3÷-1,8 В, с максимумом при -1,52 В (фиг.2). Затем добавляют в электрохимическую ячейку 0,045 мл раствора, содержащего 45 мкг антиоксиданта - аскорбиновой кислоты и перемешивают. Далее записывают вольтамперограмму и регистрируют при этом уменьшение катодной волны при -1,52 В и сдвиг ее на 20 мВ в положительную область, т.е. при -1,50 В (фиг.3). Оценивают высоту катодных волн при -1,52÷-1,50 В до (Iо, мкА) и после (It, мкА) внесения антиоксиданта и рассчитывают активность антиоксиданта по формуле:

K=X/C·V, г^-1,

где Х=(I₀-It)/I₀, С - концентрация вносимого раствора антиоксиданта, г/мл, V - объем вносимого раствора антиоксиданта, мл.

Х=(4,41-2,46)/4,4=0,44, С=1·10^-3 г/мл, V=0,045 мл,

K=0,44/1·10^-3·0,045=9,8·10³ г^-1.

С помощью модельной системы Fe²⁺-ЭДТА на фоне 0,1 М Na₂SO₄ определяют также антиоксидантную активность других антиоксидантов: сульфита натрия и глюкозы, а на фоне 0,1 М KCl определяют активность аскорбиновой кислоты, сульфита натрия, пирогаллола, пирокатехина и резорцина (см. табл.1). Полученные значения АОА для аскорбиновой кислоты, пирогаллола, пирокатехина и резорцина удовлетворительно коррелируют со способом-прототипом.

Аналогичные результаты были получены при различных концентрациях раствора фонового электролита Na₂SO₄: 0,2 M, 0,5 М и 1 М.

Пример конкретного выполнения 2.

Подготавливают прибор к работе так, как описано в примере 1.

В электрохимическую ячейку наливают 10 мл раствора фонового электролита, а именно 0,1 М KCl, в него опускают электроды и подключают к прибору. После этого записывают вольтамперограмму в фоновом растворе, регистрируя катодные волны кислорода и Н₂О₂ (фиг.4, кривая 1). Затем проводят модельную реакцию, генерирующую ^.ОН радикалы, с помощью модельной системы Cu²⁺-ЭДТА. Для этого дозатором вносят в ячейку 0,03 мл 0,01М раствора ЭДТА и 0,025 мл 0,01М раствора соли меди - CuSO₄·5H₂O. Перемешивают раствор в течение 5 с. При этом генерация ^.ОН радикалов протекает из кислорода при участии комплексов меди с ЭДТА (Christelle Hureau, Peter Faller. Aβ-mediated ROS production by Cu ions: Structural insights, mechanisms and relevance to Alzheimer's disease // Biochimie. - 2009. - V.91, Issue 10. - P.1212-1217). После успокоения раствора в течение 5 с записывают вольтамперограмму и регистрируют исчезновение катодной волны Н₂O₂, и появление новой катодной волны, возможно ^.ОН радикала, в интервале потенциалов -1,2÷-1,7 В с максимумом при -1,48 В (фиг.4, кривая 2). Затем добавляют в электрохимическую ячейку 0,06 мл раствора, содержащего 60 мкг антиоксиданта - аскорбиновой кислоты, и перемешивают. Записывают вольтамперограмму и регистрируют при этом уменьшение и сдвиг катодной волны при -1,45 В (фиг.4, кривая 3). Оценивают высоту катодных волн при -1,48÷-1,45 В до (I₀) и после (It) внесения антиоксиданта и рассчитывают активность антиоксиданта К по формуле, приведенной в примере 1:

K=X/C·V=(4,49-2,62)/4,49/1·10^-3·0,06=6,9·10³ г^-1.

С помощью модельной системы Cu⁺²-ЭДТА определяют также активность аскорбиновой кислоты на другом фоне - 0,1 М Na₂SO₄ (см. табл.1).

Таблица 1 № образца Фоновый раствор Модельная система Антиоксидант Антиоксид. активность, К·10³, г^-1 Интервал потенциалов регистрации катодных волн, В 1 2 3 4 5 6 1 Na₂SO₄ Fe²⁺-ЭДТА Аскорбиновая кислота 9,80 -1,3÷-1,8 2 Na₂SO₄ Fe²⁺-ЭДТА Глюкоза 0,51 -1,3÷-1,8 3 Na₂SO₄ Fe²⁺-ЭДТА Сульфит натрия 2,05 -1,3÷-1,8 4 Na₂SO₄ Cu²⁺-ЭДТА Аскорбиновая кислота 7,15 -1,3÷-1,75 5 KCl Cu²⁺-ЭДТА Аскорбиновая кислота 6,90 -1,2÷-1,7 6 KCl Fe²⁺-ЭДТА Пирокатехин 0,21 -1,2÷-1,7 7 KCl Fe²⁺-ЭДТА Аскорбиновая кислота 8,20 -1,2÷-1,7 8 KCl Fe²⁺-ЭДТА Сульфит натрия 1,73 -1,2÷-1,7 9 KCl Fe²⁺-ЭДТА Резорцин 0,13 -1,3÷-1,7 10 KCl Fe²⁺-НРО₄ ^2- Аскорбиновая кислота 4,09 -1,3÷-1,65 11 KCl Fe²⁺-H₂O₂ Аскорбиновая кислота 5,48 -1,3÷-1,7 12 KCl Na₂SO₃-O₂ Аскорбиновая кислота 8,56 -1,2÷-1,65 13 Ацетатный буфер Fe²⁺-ЭДТА Аскорбиновая кислота 9,70 -1,4÷-1,85 14 Этиленгликоль с ТААБ Fe²⁺-ЭДТА Аскорбиновая кислота 4,30 -1,2÷-1,9 15 Na₂SO₄ Fe²⁺-ЭДТА Этиловый спирт 0,007 -1,2÷-1,7 16 Na₂SO₄ Fe²⁺-ЭДТА Пирогаллол 1,13 -1,3÷-1,7

Аналогичные результаты по измерению активности аскорбиновой кислоты получают при использовании других рабочих электродов: ртутного сферического электрода, пленочного висмутового и пленочного свинцового на графитовых подложках, а также в апротонной среде при использовании неводного электролита - этиленгликоля с добавкой 0,1 М тетраалкиламмония бромида (см. табл.1).

В табл.1 представлены также результаты по определению антиоксидантной активности аскорбиновой кислоты на фоне КСl с использованием модельных реакций, генерирующих ^.ОН радикалы, с помощью других модельных систем: Fe²⁺-Н₂О₂, Fe²⁺-HPO₄ ^2- и Na₂SO₃-O₂.

Из табл.1 следует, что заявляемый интервал потенциалов регистрации катодных волн -1,2÷-1,9 В.

С помощью модельной системы Fe²⁺-ЭДТА на фоне 0,1 М Na₂SO₄ предлагаемым способом определяют также антиоксидантную активность водных экстрактов продуктов природного происхождения - чеснока, мандарина и яблока (см. табл.2).

Таблица 2 № образца Фоновый раствор Модельная система Антиоксидант Антиоксидантная активность, К, г^-1 Интервал потенциалов регистрации катодных волн, В 1 2 3 4 5 6 1 Na₂SO₄ Fe²⁺-ЭДТА Чеснок 16,62 -1,3÷-1,8 2 Na₂SO₄ Fe²⁺-ЭДТА Мандарин 9,59 -1,3÷-1,8 3 Na₂SO₄ Fe²⁺-ЭДТА Яблоко 6,20 -1,3÷-1,8

Пример конкретного выполнения 3.

Определение чувствительности способа.

Чувствительность предлагаемого способа определения активности антиоксидантов рассчитывают с помощью критерия Зайделя (А.Н.Зайдель. Основы спектрального анализа. - М.: Наука. - 1965). При этом аналитическим сигналом является разность ΔI, мкА между значениями тока пика ^.ОН радикала до (I₀) внесения антиоксиданта и после (It) внесения определенной концентрации С, мг/л антиоксиданта. Сначала находят среднеквадратичное отклонение σi при определении ΔI в 3-х параллельных опытах (в 3-х ячейках) при одинаковой добавке антиоксиданта. Затем строят график в координатах ΔI-С (фиг.5 и 6). Определяют тангенс угла наклона прямой и подставляют в формулу: C_min=2σi·C/ΔI_cp.Таким образом рассчитывают минимальную концентрацию антиоксиданта (предел обнаружения), при которой можно заметить уменьшение пика.

Нами был рассчитан предел обнаружения способа-прототипа. Для этого была измерена величина ΔI - снижение пика кислорода от добавок аскорбиновой кислоты, построен график в координатах ΔI-С (фиг.5) и рассчитан предел обнаружения по критерию Зайделя. Для способа прототипа он равен:

C_min=2·0,078·400/0,623=100,2 (мг/л).

Для предлагаемого способа предел обнаружения, рассчитанный с помощью графика (фиг.6), равен:

C_min=2·0,069·3.15/1.194=0,36 (мг/л).

Таким образом, из фиг.5 и 6, а также из расчетов на примере аскорбиновой кислоты следует, что чувствительность предлагаемого вольтамперометрического способа определения активности антиоксиданта в 277 раз выше чувствительности способа-прототипа. Кроме того, как видно из примеров 1 и 2, предлагаемый способ позволяет определить активность антиоксидантов по отношению к ^.ОН радикалам.

Изобретение может быть использовано в пищевой, косметической, фармацевтической промышленностях, а также в медицине и криминалистике. Предлагаемый способ позволяет измерять активность антиоксидантов по отношению к наиболее опасным для организма ОН радикалам. При осуществлении способа в процессе восстановления вещества на электроде в растворе фонового электролита используют модельную реакцию, генерирующую ОН радикалы, регистрацию катодных волн восстановления вещества ведут в интервале потенциалов -1,2÷-1,9 В относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения. В указанном интервале появляется пик, предположительно ^.ОН радикалов, который уменьшается пропорционально количеству добавленного антиоксиданта. Активность антиоксидантов определяют по относительному уменьшению этого пика. Изобретение позволяет повысить чувствительность способа определения активности антиоксидантов в 277 раз. 6 ил., 2 табл.

Вольтамперометрический способ определения активности антиоксидантов, включающий использование модельной реакции в процессе восстановления вещества на электроде в растворе фонового электролита, регистрацию катодных волн восстановления вещества в заданном интервале потенциалов относительно насыщенного хлорид-серебряного электрода сравнения, добавление антиоксиданта и определение антиоксидантной активности по относительному изменению тока электровосстановления, отличающийся тем, что в качестве модельной реакции используют реакцию, генерирующую ОН радикалы, а регистрацию катодных волн ведут в интервале потенциалов -1,2÷-1,9 В.