ШТАММ БАКТЕРИЙ ENTEROBACTER AEROGENES, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРНОГО ПРИ БИОТЕСТИРОВАНИИ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ (S-ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЙ) Российский патент 2004 года по МПК G01N33/18 C12Q1/02 C12Q1/02 C12R1/01 

Изобретение относится к экологии, в частности к оценке степени загрязненности окружающей среды, конкретно воды.

С помощью современных химико-аналитических способов надзора за качеством питьевой воды санэпидслужбой контролируется наличие трех-четырех десятков вредных для здоровья человека веществ (ГОСТ, 1998), в то время как в водоемы их попадает тысячи.

В связи с этим особое значение приобретают различные способы биотестирования воды. Самым сложным в биотестировании является подбор тест-организмов (биотестов, биоиндикаторов) нужной чувствительности. В качестве индикаторов токсичности могут использоваться различные растения, водные беспозвоночные, плесневые грибы, микроорганизмы и др. Предложено использовать даже рыб, а именно их личинки как наиболее чувствительные в онтогенезе рыб к действию токсических веществ (Гелашвили Д.Б. "Экологический мониторинг", Н. Новгород, 2000).

Методы биотестирования активно внедряются в практику надзора за рубежом. Так, во Франции оценка качества воды по токсикологическим показателям является обязательной в "Системе контроля качества пресных вод" на межведомственном уровне. Многотесторная система биологического анализа токсичности вод введена в США (Захарченко М.П. и др., "Гиг. и сан." - 1994. - 9. - С. 3-4).

Наиболее показательными, надежными и быстрореагирующими биоиндикаторами считаются микроорганизмы (Журков B.С. и др., "Гиг. и сан." - 1997. - 1. - С. 11-13; Туманов А. А. и др., "Ж. аналит. химия". - 1998. - Т. 53, 12. - С. 1252-1260), но используются они чаще всего для индикации отдельных токсикантов или родственных химических групп. О содержании токсических примесей судят по ростовым, морфологическим, ферментным и другим реакциям (Туманов А. А. и др., "Ж. аналит. химии". - 2000. - Т. 55, 2. - С. 208-211). Такой подход предусматривает использование значительного числа биотестов, чувствительным к отдельным токсикантам, потому выглядит не менее сложным и громоздким, чем традиционный физико-химический анализ. Он также не дает представления о полном действии имеющихся в воде загрязнителей, тем более об их комбинированной вредности для живых организмов.

Наиболее важной задачей является селекция таких биоиндикаторов, которые бы позволяли судить об интегральной (суммарной) токсичности питьевой воды. Разработанный для этих целей метод биотестирования с помощью дафний дает не очень воспроизводимые результаты (Набока М.В., "Гиг. и сан." - 1993. - 6. - С. 75-76).

Цель изобретения - выделение штамма бактерий, достаточно чувствительного к суммарному действию загрязнителей, для оценки интегральной токсичности питьевой воды: именно бактериальная культура определенной чувствительности позволяет прослеживать реакцию на вредные примеси одновременно на миллионах индивидуальных клеток (особей) и поэтому обеспечивает наибольшую достоверность результатов.

Предлагаемый штамм Enterobacter aerogenes 300 S (S-чувствительный) выделен из озера, расположенного в окрестностях г. Н.Новгорода; депонирован в ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 265 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические свойства: грамотрицательные палочки, подвижные, спор не имеют.

Рост на твердых питательных средах: на МПА (рН 7,0-7,4) через 18 часов роста образуют непрозрачные беловатые круглые с ровным краем колонии, растут на среде ЭНДО.

Рост на жидких питательных средах: на мясопептонном бульоне (МПБ) и минеральной среде 9 при росте вызывают равномерное помутнение при тестировании в течение 18 часов.

Биохимическая активность: метаболизм дыхательный и бродильный; подвижен, глюкозу сбраживает с образованием кислоты и газа, утилизирует арабинозу, сорбит, маннит, малонат и цитрат натрия; образует орнитин, и лизин-декарбоксилазы; не образует уреазу, сероводород и фенилаланиндезаминазу, тест Фогес-Проскауэра положительный, дает слабую реакцию на индол через 20 часов выращивания.

Питательные потребности штамма: хемоорганотроф, не требователен к питательному субстрату; выносит до 1,5% NaCl, 0,003% MgCl₂, 0,0015% ВаСl₂, 0,02% мочевины.

Генетические особенности штамма: чувствителен к широкому набору антибиотиков: гентамицину, эритромицину, амикацину, цефокситину, нетилмицину, тетрациклину, канамицину, стрептомицину, цефолотину, и особенно к хлорамфениколу, сульфадиазину и налидиксовой кислоте (Д=3-4 см) и др. Нуклеотидный состав ДНК= 59% ГЦ, из внехромосомных генетических элементов выявлена одна криптическая плазмида с молекулярной массой в 43 МД.

Продукты, синтезируемые штаммом, вирулентные свойства: непатогенен, образование продуктов не имеет значения.

Активность штамма: мало активен, легко ингибируется низкими концентрациями ионов различных метеллов, дезинфектантов, моющих средств (МИК=0,01-0,1 мг/л).

Способы определения активности штамма: устойчивость к набору солей тяжелых металлов (Cd, Pb, Zn, Сu) изучали общепринятым методом серийных разведений (Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. - М., 1976. - С. 436), МИК других веществ определяли после выдерживания и их водных растворах в течение 20 часов (Леванова Г.Ф. и др., "Гигиена и санитария" - 1999. - 2. - С. 77-79).

Способ, условия и состав сред для хранения штамма: хранят при температуре +4(±1)^oС на МПА с пересевом 1 раз в 4 месяца или в лиофилизированном состоянии.

Условия для размножения штамма: штамм размножают в пробирках с МПБ (рН 7,0-7,4) при 37^oС в течение 18-24 часов или на 1,3% МПА.

Условия использования: после выдерживания штамма в исследуемой пробе воды, делается дозированный высев на твердую питательную среду (МПА) и по количеству выросших колоний судят о его выживаемости.

Пример биотестирования.

Пробы кипяченой и прокипяченной в течение 10 мин исследуемой воды разливают в стерильные стандартные 100-миллилитровые стеклянные флаконы ("сотки") по 50 мл, добавляют по 0,1 мл одномиллиардной бактериальной взвеси индикаторного штамма. Такое же количество клеток вносится в физраствор, используемый в качестве контроля жизнеспособности этой культуры. В "слепые" контроли для выяснения, нет ли обсемененности проб воды собственной микрофлорой, взвесь индикаторного штамма не добавляют. Содержимое "соток", закрытых пробками, тщательно перемешивают и ставят в термостат на 37^oС.

Через 20 ч выдерживания проб в термостате, после эффективного перемешивания, делают стерильный засев из каждого флакона по 0,1 мл на агаровые "косяки": скошенные 1,3% МПА (5 мл) в стеклянных пробирках (15•1,5 см) под одним углом. Жидкость плавными движениями распределяют по всей поверхности "косяка". "Косяки" выдерживают 20-24 ч в термостате при оптимальной температуре роста индикаторного штамма, после чего проводят считывание результатов - анализ роста колоний на поверхности агара.

Качество исследуемой воды оценивают по способности индикаторного штамма выживать после выдерживания в ней.

Если штамм сохраняет выживаемость, то это свидетельствует в пользу хорошего качества этой воды, о ее нетоксичности и безвредности для живых организмов. Такой характеристикой при биотестировании индикаторным штаммом Е. aerogenes 300 S обладали артезианская вода из некоторых глубоких скважин Подмосковья, родниковая - из источников, расположенных вдали от автострад, коммуникаций, промышленных и сельскохозяйственных отходов и других загрязнителей (например, из г. Сарова и "Святого" у Печерской Нижегородской церкви), а так же водопроводная вода, очищенная с помощью некоторых аппаратов доочистки. Неочищенная вода из водопроводной сети г. Н.Новгорода убивает этот индикаторный штамм.

Изобретение относится к оценке степени загрязнения окружающей среды. Штамм Enterobacter aerogenes 300S (S-чувствительный) выделен из озерной воды и депонирован под номером ГИСК 265. Он хорошо растет на 1,3% мясо-пептонном агаре, мясопептонном бульоне и в среде Эндо, но легко ингибируется низкими концентрациями ионов различных металлов, дезинфектантов и моющих средств (МИК= 0,01-0,1 мг/л); обладает высокой чувствительностью к незначительным примесям различных экологически вредных веществ в питьевой воде. Штамм является индикаторным для биотестирования питьевой воды, выживает после выдерживания только в экологически чистой воде, лишенной токсических примесей.

Штамм бактерий Enterobacter aerogenes ГИСК № 265, используемый в качестве индикаторного при биотестировании качества питьевой воды.