ШТАММ БАКТЕРИЙ ВИДА ACINETOBACTER CALCOACETICUS VAR. IWOFFII 12R, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ИНДИКАТОРНОГО ПРИ БИОТЕСТИРОВАНИИ ПИТЬЕВОЙ ВОДЫ (R-РЕЗИСТЕНТНЫЙ) Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 C12N1/20 C12R1/01 

Предлагаемое изобретение относится к экологии, в частности к оценке степени загрязненности окружающей среды, конкретно - воды.

С помощью современных химико-аналитических способов надзора за качеством питьевой воды санэпидслужбой контролируется наличие трех-четырех десятков вредных для здоровья человека веществ (ГОСТ, 1998), в то время как в водоемы их попадает тысячи.

В связи с этим особое значение приобретают различные способы биотестирования воды. Самым сложным в биотестировании является подбор тест-организмов (биотестов, биоиндикаторов) нужной чувствительности. В качестве индикаторов токсичности могут использоваться различные растения, водные беспозвоночные, плесневые грибы, микроорганизмы и др. Предложено использовать даже рыб, а именно их личинки как наиболее чувствительные в онтогенезе рыб к действию токсических веществ (Гелашвили Д.Б. “Экологический мониторинг”, Н. Новгород, 2000).

Методы биотестирования активно внедряются в практику надзора за рубежом. Так, во Франции оценка качества воды по токсикологическим показателям является обязательной в “Системе контроля качества пресных вод” на межведомственном уровне. Многотесторная система биологического анализа токсичности вод введена в США (Захарченко М.П. и др., “Гиг. и сан.”. - 1994. - №9. - C.3-4).

Наиболее показательными, надежными и быстрореагирующими биоиндикаторами считаются микроорганизмы (Журков B.C. и др., “Гиг. и сан.” - 1997. - №1. - C.11-13; Туманов А.А. и др., “Ж. аналит. химия”. - 1998. - Т.53, №12. - С.1252-1260), но используются они чаще всего для индикации отдельных токсикантов или родственных химических групп. О содержании токсических примесей судят по ростовым, морфолоргическим, ферментным и другим реакциям (Туманов А.А. и др., “Ж. аналит. химии”. - 2000. - Т55, №2. - С.208-211). Такой подход предусматривает использование значительного числа биотестов, чувствительным к отдельным токсикантам, потому выглядит не менее сложным и громоздким, чем традиционный физико-химический анализ. Он также не дает представления о полном действии имеющихся в воде загрязнителей, тем более об их комбинированной вредности для живых организмов.

Наиболее важной задачей является селекция таких биоиндикаторов, которые бы позволяли судить об интегральной (суммарной) токсичности питьевой воды. Разработанный для этих целей метод биотестирования с помощью дафний дает не очень воспроизводимые результаты (Набока М.В., “Гиг. и сан.” - 1993. - №6. - С.75-76).

Цель изобретения - выделение штамма бактерий, достаточно чувствительного к суммарному действию загрязнителей, для оценки интегральной токсичности питьевой воды: именно бактериальная культура определенной чувствительности позволяет прослеживать реакцию на вредные примеси одновременно на миллионах индивидуальных клеток (особей) и поэтому обеспечивает наибольшую достоверность результатов.

Предлагаемый штамм Acinetobacter calcoaceticus var. Iwoffii 12 R (R-резистентный) выделен из озера, расположенного в окрестностях г.Н.Новгорода; депонирован в ГИСК им. Л.А. Тарасовича под номером 266 и характеризуется следующими признаками:

Культурально-морфологические свойства: грам-отрицательные коккобациллы, неподвижны, спор не имеют; аэроб.

Рост на твердых питательных средах: на мясопептонном агаре (МПА) (рН 7,0-7,4) через 18 ч роста при 37°С образуют мелкие, непрозрачные, беловатые, круглые, с ровным краем колонии, специфических потребностей для роста нет.

Рост на жидких питательных средах: на мясопептонном бульоне (МПБ) и минеральной среде №9 образуют равномерное помутнение при тестировании в течение 18-20 ч.

Биохимическая активность: метаболизм окислительный, не утилизирует глюкозу, утилизирует мальтозу, сорбит, инозит и малонат натрия; не образует оксидазу, уреазу, фенилаланиндезаминазу, лизин- и орнитиндекарбоксилазы; дает отрицательные реакции на лактозу, сахарозу, маннит, цитрат натрия, индол и сероводород, а также на тест Фогес-Проскауэра, обладает каталазой.

Питательные потребности штамма: хемоорганотроф, не требователен к питательному субстрату; выносит до 15% NaCl, 2% MgCl₂, 2% BaCl₂, 3% мочевины.

Генетические особенности штамма: в разной степени чувствителен к широкому набору антибиотиков, особенно к хлорамфениколу, норфлоксацину, моксалактаму; устойчив к пенициллину, оксациллину, азтреонаму, цефоперазону.

Нуклеотидный состав ДНК=39% ГЦ, плазмид методом электрофореза в агарозном геле не выявлено.

Продукты, синтезируемые штаммом, вирулентные свойства: непатогенен, сапрофит.

Активность штамма: не ингибируется сравнитель высокими концентрациями ионов различных метеллов, дезинфектантов, моющих средств (МИК=10-20 мг/л).

Способы определения активности штамма: устойчивость к набору солей тяжелых металлов (Cd, Pb, Zn, Сu) изучали общепринятым методом серийных разведений (Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике. - М., 1976. - С.436).

Способ, условия и состав сред для хранения штамма: хранят при температуре +4(±1)(С на МПА с пересевом 1 раз в 4 месяца или в лиофилизированном состоянии.

Условия для размножения штамма: штамм размножают в пробирках с МПБ (рН 7,0-7,4) при 37°С в течение 18-24 ч или на 1,3% МПА.

Условия использования: после выдерживания штамма в исследуемой пробе воды делается дозированный высев на твердую питательную среду (МПА) и по количеству выросших колоний судят о его выживаемости.

Пример биотестирования

Пробы кипяченой и прокипяченной в течение 10 мин исследуемой воды разливают в стерильные стандартные 100-миллилитровые стеклянные флаконы (“сотки”) по 50 мл, добавляют по 0,1 мл одномиллиардной бактериальной взвеси индикаторного штамма. Такое же количество клеток вносят в физраствор, используемый в качестве контроля жизнеспособности этой культуры. В “слепые” контроли для выяснения, нет ли обсемененности проб воды собственной микрофлорой, взвесь индикаторного штамма не добавляют. Содержимое “соток”, закрытых пробками, тщательно перемешивают и ставят в термостат на 37°С.

Через 20 ч выдерживания проб в термостате после эффективного перемешивания делают стерильный засев из каждого флакона по 0,1 мл на агаровые “косяки”: скошенные 1,3% МПА (5 мл) в стеклянных пробирках (15×1,5 см) под одним углом. Жидкость плавными движениями распределяют по всей поверхности “косяка”. “Косяки” выдерживают 20-24 ч в термостате при оптимальной температуре роста индикаторного штамма, после чего проводят считывание результатов - анализ роста колоний на поверхности агара.

Качество исследуемой воды оценивают по способности индикаторного штамма выживать после выдерживания в ней.

Штамм Acinetobacter calcoaceticus var. Iwoffii 12 R (R-резистентный) выживает после выдерживания в течение 20 ч в воде не только из экологически чистых природных источников, удаленных от техногенных загрязнителей, но и в прокипяченной (в течение не менее 10 мин) водопроводной воде (за исключением периода весеннего половодья), а также в бутилированной воде (типа “Сарова”, “Вита” и др.), в том числе минеральной, поскольку он (штамм) выносит достаточно высокое содержание ионов некоторых безвредных солей (Na, Mg, Ca). Вода, убивающая бактерии этого штамма, должна считаться вредной для здоровья человека, а перед использованием ее для питья рекомендуется дополнительная очистка в соответствующих фильтровальных аппаратах.

Изобретение относится к области экологии, в частности к надзору за загрязненностью окружающей среды, конкретно - водных источников. Штамм Acinetobacter calcoaceticus var. Iwoffii 12 R (R-резистентный) выделен из озерной воды и депонирован под номером ГИСК имени Л.А. Тарасевича №266. Штамм выживает в любой экологически чистой воде, может использоваться в качестве индикатор при биотестировании питьевой воды. Изобретение позволяет оценивать качество исследуемой воды по способности индикаторного штамма выживать после выдерживания в ней.

Штамм бактерий Acinetobacter calcoaceticus var. Iwoffii 12 R (R-резистентный), депонирован под №266 в Коллекции Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича, используется для биотестирования питьевой воды.