ШТАММ № "ТЕ87" ROTAVIRUS КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА СЕРОТИПОВ G8P7 ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2005 года по МПК C12N7/00 A61K39/15 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано при разработке и изготовлении диагностических средств, а также в качестве положительного контроля при проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления ротавируса крупного рогатого скота (КРС) в патологическом материале.

Ротавирусы группы А являются основной причиной острого гастроэнтерита у новорожденных телят. Ротавирусная инфекция КРС (диарея неонатальных телят) - остропротекающая контагиозная болезнь новорожденных телят, характеризующаяся поражением желудочно-кишечного тракта. Антитела к ротавирусу обнаруживают у 80-100% взрослых животных. В ряде экспериментов было показано, что заражение гнотобиотических телят вирулентным штаммом ротавируса вызывает диарею, что доказывает этиологическую роль этого патогена в возникновении гастроэнтеритов. Ротавирусный энтерит обычно осложняется эшерихиозом, а часто и криптоспоридиозом. Болезнь широко распространена во всех географических регионах земного шара, в том числе, в России, и наносит большой экономический ущерб. В связи с этим актуальной остается проблема поиска новых штаммов ротавируса КРС, пригодных для разработки и производства эффективных средств диагностики ротавирусной инфекции.

Ротавирус КРС относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus. По антигенным свойствам выделяют 7 групп ротавирусов (от А до G). КРС наиболее часто поражается ротавирусами группы А, Представители этой группы классифицируются в соответствии с комбинацией двух видов серотипов, называемых G-серотипом, определяемым антигенностью белка наружного капсида VP7, и Р-серотипом, ассоциированным с антигенностью белка наружного капсида VP4 (1).

В зарубежной и отечественной практике известен ряд штаммов ротавируса, используемых для изготовления диагностических и вакцинных препаратов.

Известен штамм SA-11, выращенный на перевиваемой линии клеток почек зеленой мартышки и используемый для изготовления диагностических препаратов (2).

Известен штамм РП-82, адаптированный к культуре перевиваемых клеток Vero и используемый для изготовления вакцин (3).

Известна вакцина против ротавирусных заболеваний крупного рогатого скота, изготовленная на основе двух штаммов ротавируса КРС с серотипами G6P5 и G10P11 (4).

Кроме того, в зарубежных источниках информации имеются сообщения о ряде штаммов ротавирусов КРС, обладающих различными антигенными свойствами.

Известен штамм NCDV, выделенный в США и относящийся к серотипам G6P1 (5).

Известен штамм с486, выделенный в Канаде и относящийся к серотипам G6P1 (6).

Известен штамм UK, выделенный в Великобритании и относящийся к серотипам G6P5 (7).

Известен штамм В641, выделенный в США и относящийся к серотипам G6P5 (8).

Известен штамм В223, выделенный в США и относящийся к серотипам G10P11 (8).

Известен штамм В-60, выделенный в Австралии и относящийся к серотипам G6P5 (9).

Известен штамм В-11, выделенный в Австралии и относящийся к серотипам G10P11 (9).

Известен штамм VMRI, выделенный в США и относящийся к серотипам G6P5 (10).

Известен штамм Cr, выделенный в США и относящийся к серотипам G10P11 (11).

Известен штамм А44, выделенный в Таиланде и относящийся к серотипам G10P11 (12).

Известен штамм 61 А, выделенный в Таиланде и относящийся к серотипам G10P5(12).

Известен штамм А5, выделенный в Таиланде и относящийся к серотипам G8P1 (12).

Известен штамм КК-3, выделенный в Японии и относящийся к серотипам G10P11 (13).

Известен штамм KN-4, выделенный в Японии и относящийся к серотипам G6P11 (13).

Известен штамм J2538, выделенный в Великобритании и относящийся к серотипам G8P1 (14).

Известен штамм V1005, выделенный в Германии и относящийся к серотипам G10P5 (15, 16).

Известен штамм 993/83, выделенный в Германии и относящийся к серотипам G7P16 (17).

Недостатки известных штаммов ротавирусов КРС состоят в том, что среди них нет ни одного, который имел бы серотипы G8P7.

В задачу создания настоящего изобретения входило получить новый производственный штамм ротавируса КРС, обладающий высокой инфекционной и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации и пригодный для изготовления чувствительных и высокоспецифичных диагностикумов.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала производственных штаммов ротавируса КРС, обладающих высокой инфекционной и антигенной активностью и пригодных после инактивации для изготовления высокоспецифичных диагностикумов.

Указанный технический результат достигнут получением штамма "ТЕ87" ротавируса КРС (авторское наименование).

Штамм "ТЕ87" является новым, ранее неизвестным.

Исходный вирус для получения штамма "ТЕ87" выделен из фекалий теленка в возрасте 3 дней с клиническими признаками диареи из СПК «Пановское» Меленковского района Владимирской области в 1999 г. Производственный штамм "ТЕ87" получен путем многократных последовательных пассажей на трехсуточной культуре клеток MDBK.

Штамм "ТЕ87" был депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г. Москва) 25 декабря 2002 г. под регистрационным номером "ТЕ87"-ДЕП. Местом хранения производственного штамма №"ТЕ87"-ДЕП определена коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (ФГУ ВНИИЗЖ, г.Владимир).

Штамм №"ТЕ87"-ДЕП обладает высокой инфекционной и антигенной активностью в нативном виде и после инактивации. Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления диагностических препаратов.

Сущность изобретения пояснена на фото- и графических материалах, где на:

фиг.1 представлена электронная микрофотография вирионов ротавируса КРС из очищенного и концентрированного препарата, полученного из суспензии культурального вируса. Увеличение 140000. Негативное контрастирование 4% ФВК, рН6,8;

фиг.2 - дендрограмма, отражающая уровень нуклеотидных отличий (%) фрагмента гена VP7 (64-315 н.) штаммов ротавирусов КРС;

фиг.3 - дендрограмма, отражающая уровень нуклеотидных отличий фрагмента гена VP4 (1138-1437 н.) штаммов ротавирусов КРС.

Штамм №"ТЕ87"-ДЕП ротавируса КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические свойства

Штамм №"ТЕ87"-ДЕП является РНК-геномным вирусом, относится к семейству Reoviridae, роду Rotavirus, группе А, серотипам G8P7, обладает морфологическими признаками, характерными для представителей рода Rotavirus.

Методом электронной микроскопии негативно контрастированных препаратов обнаруживают сферические частицы со средним диаметром 70 нм. Вирусные частицы имеют характерную для данного рода вирусов морфологическую структуру: центральное ядро окружено радиально расположенными капсомерами, или структурными субъединицами, напоминающими "спицы" колеса. Наряду с полными вирионами в препарате присутствуют "пустые" капсиды (фиг.1).

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм №"ТЕ87"-ДЕП ротавируса КРС относится к группе А, серотипам G8P7. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. При гипериммунизации кроликов концентрированным вирусом индуцируется образование вирусспецифических антител, выявляемых в реакции нейтрализации (РН) в разведении 1:16384-1:32768, в иммуноферментном анализе (ИФА) в разведении 1:32000-1:65000 и в реакции диффузионной преципитации (РДП) в разведении 1:8-1:16. Штамм №"ТЕ87"-ДЕП нейтрализуется антисывороткой против референтного штамма NCDV (серотипы G6P1) в разведении 1:2-1:4.

Для установления G-серотипа штамма №"ТЕ87"-ДЕП был проведен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей фрагмента гена VP7 (64-315 н.) штамма №"ТЕ87"-ДЕП (SEQ ID N01) и других штаммов, G-серотип которых был определен в серологических реакциях рядом исследователей, а также было проведено сравнение предсказанных аминокислотных последовательностей гена фрагмента протеина VP7 этих штаммов. Результаты анализа нуклеотидных последовательностей представлены в виде дендрограммы, отражающей уровень нуклеотидных отличий между фрагментами гена VP7 различных штаммов и изолятов (фиг.2). Установлено, что штамм №"ТЕ87"-ДЕП существенно отличается от ранее изученных штаммов ротавируса КРС по исследованному участку гена VP7 и наиболее сходен со штаммом I-801 (15,1% нуклеотидных отличий, 7,1% аминокислотных отличий), который имеет G-серотип 8. В то же время штамм №"ТЕ87"-ДЕП существенно отличается от штаммов ротавируса КРС других серотипов, таких как, например, штамм NCDV (серотип G6) (29,8% нуклеотидных и 28,6% аминокислотных отличий), штамм В-223 (серотип G10) (31,8% нуклеотидных и 29,8% аминокислотных отличий), штамм Т449 (серотип G1) (31,0% нуклеотидных и 32,1% аминокислотных отличий) и штамм 993/83 (серотип G7) (51,0 % нуклеотидных и 68,8% аминокислотных отличий).

Аналогичный анализ был проведен для установления Р-серотипа штамма №"ТЕ87"-ДЕП. При этом фрагмент гена VP4 (1138-1437 н.) штамма №"ТЕ87"-ДЕП (SEQ ID N02) сравнили с аналогичным фрагментом различных ранее изученных штаммов ротавирусов (фиг.3). Установлено, что штамм №"ТЕ87"-ДЕП наиболее сходен со штаммом TFR-41 (8,3% нуклеотидных и 4,0% аминокислотных отличий), который относится к Р-серотипу 7 и имеет существенные отличия от штаммов ротавируса КРС других Р-серотипов, таких как, например, штамм NCDV (серотип Р1) (29,7% нуклеотидных и 19,8% аминокислотных отличий), штамм В-223 (серотип Р11) (41,1% нуклеотидных и 35,8% аминокислотных отличий) и штамм UK (серотип Р5) (35,0% нуклеотидных и 24,7% аминокислотных отличий).

Таким образом, штамм №"ТЕ87"-ДЕП можно отнести к серотипам G8P7.

Биотехнологические характеристики

Штамм №"ТЕ87"-ДЕП проявляет высокую биологическую и антигенную активность в нативном виде. Штамм предназначен для использования в ПЦР в качестве положительного контроля на серотипы G8P7 ротавируса КРС, а также для получения диагностических сывороток и антигенных препаратов. Ротавирус штамма №"ТЕ87"-ДЕП репродуцируется в монослойных перевиваемых культурах клеток MDBK и Магс-145 и в течение 72-96 часов инкубирования накапливается до 4,5-7,5 Ig ТЦД₅₀/см³. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Хемо- и генотаксономическая характеристика

Штамм №"ТЕ87"-ДЕП является РНК-содержащим вирусом. Нуклеиновая кислота представлена 11 сегментами двунитевой РНК с мол. массой от 0,2 до 2,2 МД.

Вирион состоит из 6 структурных белков:

1) VP1 - полимераза (125 кД);

2) VP2 - белок связывания РНК (94 кД);

3) VP3 - гуанилилтрансфераза (88 кД);

4) VP4 - гемагглютинин (88 кД);

5) VP6 - групповой антиген (41 кД);

6) VP7 - гликопротеин (38 кД).

Физические свойства

Диаметр вириона 70 нм. Коэффициент седиментации 520-530 S. Плотность в градиенте CsCl 1,36 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Вирион штамма №"ТЕ87"-ДЕП устойчив к хлороформу, эфиру, фреону, кислой среде (рН 3-4); высокорезистентен к протеазам. Интактные вирионы устойчивы к хемотрипсину. Сохраняет свои свойства в течение нескольких месяцев при -60°С и менее 30 дней при 4°С. Устойчив к прогреванию, но погибает при 50°С за 1 ч в присутствии 1М MgCl₂. 10% формалин, 5% лизол инактивируют вирус за 2 ч.

Дополнительные признаки и свойства

Патогенность - патогенен для КРС.

Вирулентность - вирулентен для естественно восприимчивых животных при контактном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 10 пассажей.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм №"ТЕ87"-ДЕП по антигенному спектру является оригинальным, в таксономическом отношении новым, ранее неизвестным вариантом ротавируса КРС.

Для снижения его эпизоотической опасности необходимо обеспечить своевременную лабораторную диагностику вновь возникающих очагов болезни, для чего необходимы высокоактивные и специфичные диагностикумы, полученные с использованием данного штамма ротавируса.

По мнению заявителя предлагаемый штамм соответствует условиям патентоспособности «новизна» и «изобретательский уровень». Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования.

Пример 1.

Получение штамма

Штамм ротавируса КРС №"ТЕ87"-ДЕП группы А, серотипов G8P7 был изолирован из полевого материала, поступившего во ВНИИЗЖ в 1999 г. в виде фекалий теленка с диарейным синдромом, при проведении лабораторной диагностики и дифференциации от других кишечных инфекций КРС. При изоляции вируса использовали комплекс биологических и вирусологических методов, которые включали обнаружение ротавируса непосредственно в фекалиях заболевшего животного с помощью ПЦР, выделение вируса из фекалий с последующей адаптацией его в культуре перевиваемых клеток. Были использованы культуры клеток MDBK, Marc-145, КГ-91, Vero. Перививаемые культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах в пластиковых флаконах емкостью 75 см³, отмывали от ростовой среды и заражали 10% суспензией фекалий, приготовленной на среде Игла с антибиотиком в присутствии 100 мкг/см³ трипсина (фирма MERCK). Предварительно для удаления микрофлоры и балластных компонентов 10% суспензию фекалий центрифугировали при 8000 g в течение 20 мин, супернатант использовали для заражения культуры клеток. После инкубирования в течение 1 часа при 37°С во флаконы с зараженной культурой клеток вносили 8-10 см³ поддерживающей среды Игла, содержащей 100 мкг/см³ трипсина, и инкубировали при температуре 37°С 6-7 суток до появления дегенерации клеточного пласта или отделения клеток в поддерживающую среду. Вируссодержащий материал подвергали замораживанию и оттаиванию и центрифугировали при 3000 g в течение 15 минут. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей и исследовали в электрофорезе в агарозном геле на наличие РНК ротавируса. Полученный штамм ротавируса КРС депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г. Москва) 25 декабря 2002 г. под регистрационным шифром №"ТЕ87"-ДЕП. Местом хранения производственного штамма №"ТЕ87"-ДЕП определена коллекция экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных (ВНИИЗЖ, г.Владимир).

Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о хорошей адаптационной активности штамма №"ТЕ87"-ДЕП к использованным клеточным культурам.

Пример 2.

Проверка биологических свойств

Проведена проверка биологических свойств производственного штамма "ТЕ87"-ДЕП (9 пассаж) ротавируса КРС по следующим показателям:

- контаминация бактериальной и грибковой флорой;

- контаминация микоплазмами;

- контаминация чужеродными вирусами (методика ПЦР);

- инфекционная активность штамма (титрование по ЦПД в культуре клеток Магс-145);

- иммуногенность (титрование сыворотки крови лабораторных животных в

непрямом варианте ИФА).

В результате проведенных испытаний получены следующие характеристики штамма №"ТЕ87"-ДЕП:

1. Штамм свободен от контаминации бактериальной и грибковой микрофлорой, а также микоплазмами. Высевы на питательные среды оставались стерильными в течение всего срока наблюдения.

2. Методом ПЦР вирусы - контаминанты не обнаружены.

3. Инфекционная активность производственного штамма №"ТЕ87"-ДЕП

составила 6,5-7,5 Ig ТЦД₅₀/см³.

4. Производственный штамм №"ТЕ87"-ДЕП обладает высокой иммуногенной активностью. Двух-, трехкратное введение штамма №"ТЕ87"-ДЕП кроликам в дозе 750 мкг и морским свинкам в дозе 750 мкг вызывало образование антител, определяемых в непрямом методе ИФА в титре 18-19 log₂ и 13-15 log₂ соответственно.

Пример 3.

Получение гипериммунной сыворотки на кроликах

Для приготовления диагностических сывороток крови кроликов используют очищенный концентрированный инактивированный препарат антигена из штамма №"ТЕ87"-ДЕП ротавируса КРС группы А. 1,0 см³ антигена с содержанием вирусного белка не менее 750 мкг/см³ эмульгируют с равным объемом полного адъюванта Фрейнда в течение 5 минут. Иммунизацию кроликов проводят двух-трехкратно с интервалом 28 дней подкожно в четыре точки вблизи регионарных лимфатических узлов. Через 21 день после каждой иммунизации проводят пробное взятие крови из ушной вены для определения специфической активности сыворотки в непрямом варианте ИФА. Кроликов обескровливают в том случае, если активность сыворотки в ИФА не ниже 18 log₂. Если активность сыворотки ниже, то проводят дополнительную инъекцию очищенным концентрированным инактивированным антигеном из штамма №"ТЕ87"-ДЕП ротавируса КРС группы А с содержанием вирусного белка не ниже 750 мкг/см³.

Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при температуре 37±1°С в течение 30-60 минут, а затем при 4±2°С в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови. Проверку индивидуальных проб сыворотки крови на активность и специфичность проводят в ИФА с набором специфических и гетерологичных антигенов. Для составления серийного препарата используют сыворотки крови, активность которых со специфическим антигеном в непрямом варианте ИФА не ниже 18-19 log₂, а их активность с гетерологичным антигеном не превышает фоновый уровень (реакция с неиммунной сывороткой). Препараты сыворотки, прошедшие проверку на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20-40°С.

Для получения диагностических сывороток крови морских свинок 0,5 см³ очищенного концентрированного антигена из штамма №"ТЕ87"-ДЕП ротавируса КРС группы А с содержанием вирусного белка не менее 150 мкг/см³ вводят животным трехкратно с интервалом 28 дней подкожно в четыре точки вблизи регионарных лимфатических узлов. Через 28 дней после последней иммунизации проводят обескровливание. После проверки индивидуальных проб сыворотки крови на активность и специфичность составляют серийный препарат, для чего используют сыворотки крови, активность которых с гомологичным антигеном не менее 13 log₂, а активность с гетерологичными антигенами не превышает фоновый уровень (реакция с неиммунной сывороткой). Препараты сыворотки, проверенные на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20-40°С.

Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 3, получены диагностические сыворотки со специфической активностью.

Пример 4.

Получение и испытание диагностического антигена

Для приготовления антигена для диагностических целей штамм №"ТЕ87"-ДЕП ротавируса КРС, выращенный в клинских матрасах в монослое клеток MDBK, подвергают замораживанию-оттаиванию для выхода вируса, находящегося в клетках, в культуральную среду.

К инактивированной вируссодержащей суспензии добавляют хлороформ (20% по объему) и шуттелируют в течение 10 мин. Материал подвергают низкоскоростному центрифугированию при 6000 g в течение 30 мин при 4°С. Надосадочную жидкость собирают в один сосуд и добавляют NaCl до конечной концентрации 0,3 М и ПЭГ-6000 в количестве 7% от общего объема жидкости. Интенсивно перемешивают содержимое сосуда до полного растворения ПЭГ и инкубируют 16-18 ч при 4°С. Осадок собирают центрифугированием при 11000 g в течение 30 минут при 4°С, ресуспендируют в буфере TNE (50 мМ трис-HCl; 100 мМ NaCl; 1 мМ ЭДТА, рН 7,2-7,4) до 1/20 исходного объема. Полученную суспензию осветляют низкоскоростным центрифугированием при 6000 g в течение 15 мин при 4°С. Надосадочную жидкость наслаивают на 30% раствор сахарозы, приготовленный на буферном растворе TNE, и центрифугируют при 55000 g в течение 80 мин при 4°С. Осадки ресуспендируют в буферном растворе TNE (1/200 исходного объема). Полученный препарат используют для изготовления диагностических сывороток.

Результаты исследования, приведенные в таблице 3, свидетельствуют о том, что способом, описанным в примере 4, получены антигены, которые являются специфичными, что подтверждено их тестированием с помощью гомологичных и гетерологичных диагностикумов.

Пример 5.

Определение активности и специфичности компонентов ротавируса

Определение активности и специфичности компонентов штамма №"ТЕ87"-ДЕП ротавируса КРС проводят в непрямом сэндвич-варианте ИФА. Для его постановки готовят рабочее разведение специфичной к ротавирусу КРС штамма №"ТЕ87"-ДЕП сыворотки кролика (улавливающие антитела), которое определяют в предварительном опыте путем постановки непрямого варианта ИФА по блок-схеме («шахматный» порядок постановки), используя серийные разведения антител и гомологичного антигена. По 0,1 см³ рабочего разведения улавливающих антител в 0,01 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6-9,5) вносят в 8 лунок 3-х вертикальных рядов 2-х планшетов. После инкубации в течение 16-18 часов при 4°С раствор удаляют, лунки промывают промывочным буфером (0,05 М Трис-HCl с 0,2 М NaCl рН 7,4-7,6; 0,1% твин-20), вносят по 0,1 см³ блокирующего раствора (0,05 М Трис-HCl с 0,2 М NaCl рН 7,4-7,6; 0,1% твин-20 и 10% сыворотки крови лошадей), инкубируют 1 ч при комнатной температуре и снова трижды отмывают промывочным буфером. Далее готовят двукратные разведения положительного контрольного антигена, отрицательного контрольного антигена, а также нормального антигена, приготовленного из культуры клеток MDBK, не инфицированных ротавирусом КРС, начиная с 1:10. Разведения антигенов готовят на блокирующем буфере, снижая содержание сыворотки крови лошадей до 5%. В горизонтальные лунки планшета вносят по 0,1 см³ разведений антигенов, первые вертикальные ряды обоих планшетов заполняют буфером для образцов, что служит контролем неспецифической активности пероксидазных конъюгатов. После инкубации в течение 1 ч при 37°С планшеты вновь трижды отмывают промывочным буфером и вносят по 0,1 см³ специфичной к ротавирусу КРС группы А сыворотки морской свинки (детекторные антитела) в рабочем разведении на блокирующем буфере. Рабочее разведение детекторных антител и антивидового конъюгата определяют методом постановки прямого варианта ИФА, используя серийные разведения сыворотки морской свинки и антивидового конъюгата. После инкубации в течение 1 ч при 37°С планшеты трижды отмывают промывочным буфером и вносят по 0,1 см³ антивидового конъюгата в рабочем разведении. Планшет инкубируют 1 ч и вновь отмывают. В лунки планшета вносят по 0,1 см³ субстратно-индикаторного раствора (0,04% ортофенилендиамин в фосфатно-цитратном буфере рН 4,9 с 0,4% перекиси водорода), инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре, после чего останавливают реакцию внесением 0,05 см³ 10% раствора серной кислоты.

Результаты реакции учитывают с помощью многоканального спектрофотометра-ридера типа «УНИПЛАН» (Россия).

Предельным титром активности антигена считают его максимальное разведение, оптическая плотность которого в 2 раза превышает таковую отрицательного контроля (реакция с нормальным антигеном).

Проба, титр антигена в которой больше, либо равен 1:10, считается положительной.

К выпуску разрешают препараты контрольного вирусспецифического антигена с активностью не менее 1:100, оптическая плотность контрольного отрицательного антигена в разведении 1:10 не должна превышать 0,1-0,2.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:

- штамм "ТЕ87"-ДЕП ротавируса КРС, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;

- штамм "ТЕ87"-ДЕП ротавируса КРС, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой специфической и антигенной активностью, безвредностью и расширяет арсенал средств, пригодных для изготовления средств диагностики ротавирусной инфекции КРС.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость».

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение "Штамм №"TE87" Rotavirus крупного рогатого скота серотипов G8P7 для изготовления диагностических препаратов"

1. Estes M.K., Tanaka T. Nucleic acid probes for rotavirus detection and characterization // DNA probes for infectious diseases /Ed. by F. Tenomer. - Boca Ration: CRC Press, 1989. - P.79-100.

2. Авт. свид. СССР 1645298; С 12 N 7/00, G01N33/53, 30.04.91 г.

3. Марченко А.И., Гусев В.В., Гуненков В.В., Кузнецова Г.Д. Адаптация и накопление авирулентного штамма ротавируса КРС в культуре перевиваемых клеток Vero // Тез. докладов V Всероссийской конф. Научные основы пр-ва вет. био. препаратов, Щелково, 1996. - С. 61.

4. Пат. Японии №2950273; А 61 К 39/15, А 61 К 31/00; 20.09.99 г.

5. Mebus C.A., Kono M., Underdahl N.R., Twiehaus M.J. Cell culture propagation of neonatal calf diarrhea (scours) virus // Can. Vet. J. - 1971. - V. 12. - P.69-72.

6. Babiuk L.A., Mohammed K., Spence L., et al. Rotavirus isolation and cultivation on the presence of trypsin //J. Clin. Microbiol. - 1977. - V.6, N6. - P.610-617.

7. Woode G.N., Bridger J.C., Hall G.A., Dennis M.J. The isolation of a rotavirus-like agent associated with diarhoea in colostrum-deprived calves in Great Britain // Res. Vet. Sci. - 1974. - V. 16. - P.102-105.

8. Woode G.N., Kelso N.E., Simpson T.F., et al. Antigenic relationships among some bovine rotaviruses: serum neutralization and cross-protection in gnotobiotic calves // J. Clin. Microbiol. -1983. - V. 18. - P.358-364.

9. Huang J.A., Nagesha H.S., Snoodgrass D.R., Holmes I.H. Molecular and serological analyses of two bovine rotaviruses (B-11 and B-60) causing calf scours in Australia // J. Clin. Microbiol. - 1992. - V. 30, N 1. - P.85-92.

10. Paul P.S, Lyoo Y.S., Woode G.N., et al. Isolation of a bovine rotavirus with a "super-short" RNA electrophoretic pattern from a calf with diarrhea // J. Clin. Microbiol. - 1988. - V.26. - P.2139-2143.

11. Parwani A.V., Hussein H.A., Rosen B.I., et al. Characterization of field strains of group A bovine rotaviruses by using polymerase chain reaction-generated G and P type-specific cDNA probes//J. Clin. Microbiol. - 1993. - V. 31, N 8. - Р.2010-2015.

12. Taniguchi К., Urasawa Т., Pongsuwanna Y., et al. Molecular and antigenic analyses of serotypes 8 and 10 of bovine rotaviruses in Thailand // J. Gen. Virol. - 1991. - V. 72. - P.2929-2937.

13. Murakami Y., Nishioka N., Hashiguchi Y., Kuniyashu C. Serotypes of bovine rotaviruses distinguished by serum neutralization // Infect. Immun. - 1983. - V. 40, N 3. - Р.851-855.

14. Snodgrass D.R., Hoshino Y,, Fitzgerald M,, et al. Identification of four VP4 serological types (P serotypes) of bovine rotavirus using viral reassortants // J.Gen. Virol. - 1992. - V. 73. - P.2319-2325.

15. Brussow H., Marc-Martin S., Eichhorn W., et al. Characterization of a second bovine rotavirus serotype //Arch. Virol. - 1987. - V. 94, N1-2. - P.29-41.

16. Brussow H., Rohwedder A., Nakagomi O., et al. Bovine rotavirus V1005 a P5, not a P12, type like all viruses in a German survey // J. Clin. Microbiol. - 1994. - V. 32, N11. - Р.2876-2879.

17. Brussow H., Nakagomi O., Gerna G., Eichorn W. Isolation of avianlike group A rotavirus from a calf with diarrhea // J. Clin. Microbiol. - 1992. - V. 30. - P.67-73.

Таблица 1
Биологические свойства ротавируса КРС производственного штамма №"ТЕ87"-ДЕПСистема репродукции вирусаВремя проявления биологической активности, часыКол-во адаптационных пассажейТитр инфекционности, Ig ТЦД₅₀/см³MDBK72106,5-7,5Marc-1459644,5-5,0

Таблица 2
Уровень антител в диагностических сыворотках крови кроликов и морских свинок, полученных на антиген из ротавируса КРС штамма №"ТЕ87"-ДЕПНаименование препаратаКоличество серийОбъем, см³Активностьреакция нейтрализации,
log₂ИФА,
log₂Гипериммунная сыворотка кроликов25013,6718,5Гипериммунная сыворотка морских свинок2501,914,0

Таблица 3
Активность различных препаратов ротавируса штамма №"ТЕ87"-ДЕП в ИФА с гомологичными и гетерологичными диагностикумамиДиагностикумыНаименование препаратаКультуральный антиген MDBKКультуральный антиген Marc-145Гомологичный (Rotavirus Elisa Kit фирмы Cypress diagnostics)4,88 Ig ТЦД₅₀/ см³4,88 Ig ТЦД₅₀/см³С гетерологичными диагности-кумамиCoronavirus Elisa Kit (фирмы Cypress diagnostics)н/ан/аSerelisa BVD/MD/DD Ag (фирмы Synbiotics)н/ан/аE. coli K99 (Digestive Elisa Kit фирмы Cypress diagnostics)н/ан/аCryptosporidium parvum (Digestive Elisa Kit фирмы Cypress diagnostics)н/ан/а

н/а - не активен

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Путем последовательных пассажей на трехсуточной культуре клеток MDBK получен новый производственный штамм ротавируса КРС серотипов G8P7. Штамм депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным номером «ТЕ87»-ДЕП. Вирус штамма № «ТЕ87»-ДЕП хорошо размножается в культурах клеток MDBK и Маге-145 и в течение 72-96 час инкубирования накапливается в титрах 4,5-7,5 Ig ТЦД₅₀/мл. Штамм является стабильным и сохраняет свои характеристики при последовательном пассировании в чувствительных биологических системах в течение 9-10 пассажей (срок наблюдения). Штамм № «ТЕ87»-ДЕП обладает широким антигенным спектром действия и высокой биологической активностью и пригоден для изготовления эффективных диагностических препаратов. 3 ил., 3 табл.

Штамм Rotavirus крупного рогатого скота, сем. Reoviridae, род Rotavirus, группа А, серотипы G8P7, коллекция ВГНКИ № «ТЕ87»-ДЕП, для изготовления диагностических препаратов.