СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ И УНИЧТОЖЕНИЯ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ РАКОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2004 года по МПК A61K49/00 

Родственная заявка

Данная заявка представляет собой частичное продолжение одновременно рассматриваемой международной заявки PCT/US 00/05387, поданной 28 февраля 2000 г. и озаглавленной "Способ выявления и уничтожения эпителиальных раковых клеток".

Область изобретения

Данная заявка относится к способам выявления эпителиального рака.

В другом отношении изобретение относится к способам избирательного уничтожения эпителиальных раковых клеток.

В еще одном аспекте изобретение касается способов выявления эпителиальных раковых клеток в присутствии нормальных клеток и/или избирательного уничтожения таких клеток, при которых митохондрии раковых клеток удерживают митохондриальный маркирующий агент в течение времени, достаточного для обеспечения возможности идентификации и/или уничтожения таких клеток.

Определения

Используемые здесь следующие термины имеют указанные значения:

Термины "рак" или "раковые" клетки используются в широком смысле для включения инвазивных раковых клеток, клеток рака in situ и клеток при тяжелой дисплазии.

"Митохондриальный маркирующий агент" обозначает соединение, которое избирательно захватывается митохондриями живых раковых клеток и избирательно удерживается в раковых клетках в течение времени, достаточного для обеспечения возможности их идентификации и/или уничтожения, или инкапаситации.

"Уничтожение" клеток обозначает либо действие, вызывающее смерь клеток, апоптоз, либо изменения клеток, которые делают клетки неспособными к репродукции и метастазированию.

"Аддукт" обозначает ковалентный или нековалентный продукт реакции митохондриального маркирующего агента и средства для химиотерапии рака.

"Адъювант" обозначает митохондриальный маркирующий агент, который в комбинации с другим химиотерапевтическим средством вызывает улучшенное уничтожение раковых клеток либо синергически, либо вследствие дополнительных эффектов с другим средством.

Предпосылки изобретения

В данной области известны диагностические процедуры in vivo для выявления злокачественных или предраковых эпителиальных поражений или карцином с использованием композиций, которые избирательно "окрашивают" ткани, имеющие патологический характер вследствие дисплазии, гиперплазии, онкогенеза и других активных поверхностных поражений. В этих диагностических способах используется краситель, придающий цвет раковому субстрату, который затем может выявляться под светом при видимой длине волн, или флюоресцентный краситель, придающий цвет субстрату, который затем может выявляться при освещении светом с длиной волн, выходящей за пределы видимого спектра.

Например, процедуры с использованием флюоресцеина и производных флюоресцеина раскрыты в публикации Chenz, Chinese Journal of Stomatology (27:44-47 (1992)) и Filurin (Stomatologiia (Russian) 72:44-47 (1993)). Эти процедуры связаны с применением красителя с последующим исследованием под ультрафиолетовым светом для выявления раковой/предраковой ткани, которая избирательно флюоресцентна. В другой процедуре предшествующего уровня техники используется омывание эпителия толуидином синим с последующим обычным визуальным исследованием для выявления любой избирательно окрашенной ткани. Такие процедуры раскрыты, например, в патентах, выданных Burkett (US 6086852), Tucci (US 5372801) и Mashberg (US 4321251). Применение других тиазиновых красителей и оксазиновых красителей аналогичным образом раскрыто в патенте США №5882627, выданном на имя Pomerantz.

До настоящего времени теоретически считалось, что такие красители избирательно "маркировали" раковые ткани, потому что краситель задерживался в относительно более крупных интерстициальных пространствах между клетками раковой ткани и не мог эффективно проникать в более плотные межклеточные соединения нормальной ткани или избирательно удерживаться в таких относительно меньших пространствах.

В противовес представлению, что толуидин синий избирательно маркирует раковую эпителиальную ткань потому, что он избирательно удерживается в относительно более крупных интерстициальных пространствах между раковыми клетками, механизм такого избирательного окрашивания эпителиальной ткани катионными красителями, например, такими красителями, как родамин, флюоресцеины, оксазин и тиазиновые красители (включая толуидиновый синий) и другими катионными суправитальными маркирующими агентами, заключается в избирательном захвате и избирательном удерживании агента в митохондриях раковых клеток. Этот избирательный митохондриальный захват и удерживание, очевидно, вызваны более высоким электрическим потенциалом (отрицательным зарядом на внутренней стороне мембраны) митохондрий раковых клеток, по сравнению с митохондриями нормальных клеток (см., например, публикации Chen et al.. Cancer Cells 1. The Transformed Phenotype, 75-85 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984); Lampidis, et al., Cancer Research 43, 716-720 (1983). Действительно, избирательная маркировка раковых клеток и удерживание в митохондриях раковых клеток суправитальных катионных красителей и других суправитальных маркирующих агентов связаны с одной из очень характерных черт раковых клеток, которая, как представляется, ответственна за их быстрый клонирующий рост и способность метастазировать, а именно то, что более высокий электрический потенциал митохондрий раковых клеток является источником клеточной энергии и является движущей силой для продукции клетками АТФ (аденозинтрифосфата).

Сущность изобретения

В настоящее время найден способ выявления in vivo раковых эпителиальных клеток с помощью избирательной маркировки их митохондрий.

В другом отношении, был найден способ лечения для избирательного уничтожения раковых клеток в присутствии нормальных клеток.

Способы выявления, предложенные в настоящей заявке, включают стадии доставки катионного суправитального миохондриального маркирующего агента к ткани в очаге предполагаемого ракового участка на эпителии (который содержит и нормальные, и раковые клетки), вызывая, таким образом, захват и избирательное удерживание указанного агента в митохондриях раковых клеток. Затем раковые клетки могут выявляться любым подходящим способом, например инструментальным или визуальным исследованием под видимым светом или светом с избирательной невидимой длиной волн.

В еще одном варианте реализации после захвата митохондриями маркирующего агента на очаг предполагаемого ракового участка наносится омывающий реагент, увеличивая таким образом скорость высвобождения агента из митохондрий нормальных клеток и дополнительно увеличивая избирательность диагностических способов.

В соответствии с другим важным вариантом реализации изобретения, предоставляется способ избирательного уничтожения эпителиальных раковых клеток, включающий стадию контактирования раковых клеток в очаге предполагаемого ракового участка с катионным суправитальным митохондриальным маркирующим агентом для того, чтобы вызвать гибель клеток или сделать раковые клетки по существу неспособными к размножению. Маркирующий агент может быть доставлен к раковым клеткам в однократной дискретной дозе или постоянно, или повторными дискретными дозами с использованием омывающего реагента после каждой такой дозы или без него.

В еще одном варианте реализации изобретения предоставляется способ повышения избирательности и способности противораковых химиотерапевтических средств уничтожать раковые клетки, включающий стадии либо (1) образования продукта реакции катионного суправитального агента и химиотерапевтического средства и доставки продукта реакции к раковым эпителиальным клеткам, либо (2) комбинирования катионного суправитального агента с противораковым химиотерапевтическим средством для повышения избирательности или способности химиотерапевтического средства уничтожать раковые клетки или с помощью дополнительного, или синергического эффектов, или с использованием их обоих.

Эти и другие варианты реализации изобретения будут очевидны для специалистов в данной области, и изобретение будет лучше понятно из следующих примеров, которые предоставлены для иллюстрации изобретения, а не как характерезующие объем притязаний, который определен только прилагаемой формулой изобретения.

При осуществлении изобретения и в следующих рабочих примерах катионные суправитальные митохондриальные маркирующие агенты включают красители, в том числе толуидиновый синий О, алциан синий, малахит зеленый, феносафранин, акрифлавин, пиронин Y, толуилен синий и бриллиантовый зеленый; и "не красящие" соединения, в том числе пеонидин, окситиамин, тиемоний йодид, эллиптиний ацетат и фуразолий хлорид.

В соответствии с предпочтительным в настоящее время вариантом реализации изобретения, предпочтительными митохондриальными маркирующими агентами являются красители класса оксазина и тиазина. Тиазиновые красители особенно предпочтительны, в частности, толуидиновый синий О, Азур А, Азур В и их аналоги с замещением кольца и N-замещенные аналоги.

Для того чтобы избирательно всасываться и удерживаться в митохондриях раковых клеток, маркирующий агент или продукт реакции маркирующего агента + химиотерапевтического средства должны иметь молекулярную массу ниже приблизительно 5000. Кроме того, ввиду выраженных различий избирательной маркировки и терапевтической активности различных близко родственных аналогов, представляется, что молекулярная структура маркирующего агента заметно воздействует на его способность избирательно маркировать и/или уничтожать живые раковые клетки в присутствии нормальных живых клеток. Эти различия способности маркировки клеток и их уничтожения связаны со структурными признаками, например, локализацией и типом кольцевых заместителей и N-заместителей, молекул маркирующего агента, которые определяют один или несколько или даже все следующие механизмы действия:

1. Структура молекулы маркирующего агента, например положение и природа кольцевых и N-заместителей на катионной молекуле, воздействует на доступность положительного заряда и препятствует способности маркирующего агента или “сгрудившихся” их групп притягиваться отрицательными зарядами на митохондриальных мембранах или внутри митохондрий.

2. Структура молекулы маркирующего агента позволяет ей вклиниваться в "груду" или скапливаться по внешней поверхности митохондриальной ДНК раковых клеток.

3. Структура молекулы маркирующего агента позволяет ей или их сгрудившимся группам связываться со специфическими активными участками, например четырьмя специфическими белками, в митохондриях и/или осаждаться кардиолипинами на внутренней поверхности митохондриальной мембраны.

4. Структура маркирующего агента воздействует на его восстановительный потенциал и его тенденцию изменяться в незаряженную "лейко" форму.

5. Структура маркирующего агента воздействует на его кислотность (рК_а) и, в свою очередь, на способность катионного маркирующего агента к депротонированию при физиологическом рН. Таким образом, катионная форма красителя может притягиваться к внешней поверхности митохондриальной мембраны, после чего катион красителя может потерять протон и одновременно потерять свой положительный заряд, освобождая вследствие этого нейтральную форму красителя, которая может легче проникать через неполярный матрикс мембраны и получать доступ к внутренней среде митохондрия.

Межмолекулярные взаимодействия механизмов 1 (краситель - мембрана), 2 (пара краситель - основание или краситель - краситель) и 3 (краситель - белок или краситель - липид) зависят от гидрофобности-липофильности красителя, которую можно оценить с помощью различных средств, одним из которых является коэффициент распределения между водным раствором и органическим растворителем низкой полярности, таким как 1-октанол (т.е., величин логарифма Р). Механизмы 4 и 5 зависят от гидрофобности-липофильности вследствие воздействия дифференциального растворения реагента и продукта на восстановительный потенциал (окисленные формы в сравнении с восстановленными формами) и рК_а (нейтральные формы в сравнении с заряженными формами). Например, гидрофобность препятствует растворению протонированных третичных алифатических аминов (R₃NH^-), снижая посредством этого их кислотность относительно вторичных аминов (R₂NH-2

В соответствии с предпочтительным в настоящее время вариантом реализации изобретения, используется катионный суправитальный маркирующий агент, имеющий величину логарифма Р от приблизительно -1,0 до приблизительно 5.

Следующие примеры представлены для того, чтобы предоставить возможность специалистам в данной области понять и осуществить изобретение и определить предпочтительный в настоящее время вариант реализации. Эти примеры приведены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема притязаний, который определяется только прилагаемой формулой изобретения.

Пример 1

Захват и удерживание митохондриальных маркирующих агентов в живых клетках карциномы

Различные концентрации различных катионных маркирующих агентов (100, 50, 10 и 1 мкг/мл) готовят в среде RPMI, укомплектованной 20% фетальной телячей сывороткой, 1 мМ глутамином, гидрокортизоном, инсулином, трансферрином, эстрадиолом, селеном и гормоном роста.

Клетки карциномы в течение 5 мин инкубируют при 37°С в инкубаторах для тканевой культуры в 5% СО₂ и при относительной влажности 95% с каждым агентом и концентрацией в них и затем дважды промывают 1% уксусной кислотой с использованием 2-минутной инкубации. После инкубации и промывания клетки собирают через 30 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч и 8 ч. Затем клетки экстрагируют 2-бутанолом и анализируют спектрофотометрией для количественного определения маркирующего агента.

Результаты показывают, что существует зависимость скорости накопления маркирующего агента в митохондриях и клеток карциномы и нормальных клеток и избирательности высвобождения маркирующего агента из раковых клеток от концентрации, но эта зависимость от концентрации начинает становиться менее выраженной. Концентрация насыщения для толуидина синего О наступает при концентрации 10 мкг/мл и выше. Аналогичным образом определяют концентрации насыщения для других маркирующих агентов. Остальные эксперименты проводят при концентрации 10 мкг/мл для толуидина синего О и при определенных таким образом концентрациях насыщения для других маркирующих агентов, если не указано иного.

Пример 2

Локализация агентов в митохондриях живых клеток

После инкубации и промывания различных клеточных линий с использованием различных катионных маркирующих агентов анализируют локализацию агентов в митохондриях, используя конфокальную микроскопию высокого разрешения и фазово-контрастную микроскопию.

Живые клетки культивируют в ростовой среде, укомплектованной 20% фетальной телячей сывороткой и факторами роста при температуре, поддерживаемой на уровне 37°С. Эти клетки накапливают и удерживают маркирующие агенты в митохондриях. Когда эти клетки затем сохраняют в лишенной агента среде, клетки карциномы удерживают агент дольше, чем около 1 ч, но нормальные эпителиальные клетки высвобождают агент в пределах приблизительно 15 мин.

В отличие от живых клеток, мертвые клетки или клетки, обработанные агентами, которые рассеивают потенциал митохондриальной мемебраны, теряют окрашивание митохондрий и накапливают агенты в ядре.

Пример 3

Высвобождение агентов из митохондрий с рассеиванием потенциала митохондриальной мемебраны

Известные агенты, которые изменяют митохондриальный электрический потенциал, используют для предварительной обработки эпителиальных раковых клеток с последующей обработкой катионными суправитальными митохондриальными маркирующими агентами. Эти агенты для предварительной обработки включают азидные и цианидные препараты и динитрофенол.

Эпителиальные раковые клетки также предварительно обрабатывают различными красителями, а затем подвергают последующей обработке этими известными агентами. Анализируют высвобождение красителей из клеток или перенос красителей в другие субклеточные компартменты, включая ядро.

Клетки, предварительно обработанные этими агентами, не накапливают красители в митохондриях, и митохондрии предварительно окрашенных клеток высвобождают краситель после последующей обработки этими агентами.

Пример 4

Эксплантаты ткани плоскоклеточных карцином

Свежие эксплантаты резецированных эпителиальных карцином анализируют для выявления захвата и удерживания маркирующего агента. После резекции производят микродиссекцию карцином от окружающих тканей, разрезают на секции размером 3 мм и сохраняют в виде культур тканевых эксплантатов при 37°С. Затем эти эксплантаты инкубируют с различными агентами, а после этого экстрагируют для количественного определения агента.

Карциномы ротовой полости (SqCHN) характеризуются быстрым захватом и длительным удерживанием этих агентов. Агенты начинают высвобождаться из клеток приблизительно через 1 ч культивирования в среде, не содержащей агент. Однако агенты высвобождаются быстрее, когда клетки инкубируют в среде, которая не содержит факторов роста, фетальной телячей сыворотки и других добавок к среде. Эти агенты также быстрее высвобождаются, когда клетки выращивают в неблагоприятных условиях, таких, как более низкие температуры.

Пример 5

Тканевые эксплантаты нормальных эпителиальных клеток

Клетки, полученные хирургическим путем из здоровых областей эпителия ротовой полости, культивируют как нормальные эпителиальные культуры. Затем эти культуры инкубируют с маркирующими агентами для анализа захвата и удерживания агентов.

В отличие от клеток карциномы, нормальные эпителиальные клетки быстро высвобождают эти агенты из их митохондрий и гораздо быстрее из клеток. К 10-15 мин большая часть агента высвобождается из митохондрий.

Пример 6

Аддукты маркирующего агента - химиотерапевтического средства

Вместо агентов примеров 1-5 используют следующие аддукты катионных митохондриальных маркирующих агентов и различных известных химиотерапевтических средств по существу с аналогичными результатами, за исключением того, что существенно улучшаются интенсивность уничтожения раковых клеток и избирательность химиотерапевтического средства.

Маркирующий агент Химиотерапевтическое средство

Толуидин синий О Метотрексат

Родамин 123 Азотистый иприт

Пример 7

Адъювантные композиции

Следующие комбинации известных средств химиотерапии рака с митохондриальными маркирующими агентами проявляют синергический или, по меньшей мере, дополнительный эффект уничтожения раковых клеток

Химиотерапевтическое средство Катионный маркирующий агент

Таксол Толуидин синий

Таксотер Азур А

Винкристин Алциан синий

Избирательные терапевтические эффекты

В следующих примерах лекарственную субстанцию толуидина синего получают в соответствии с процедурами получения, раскрытыми в патенте США №6086852, выданном Burkett 11 июля 2000 г. Затем компоненты лекарственной субстанции фракционируют и отделяют полупрепаративной ВЭЖХ, получая аналоги, идентифицированные в патенте "852, как представленные пиками 5, 6, 7 и 8. Соединения, представленные пиками 7 и 8, представляют собой региоизомеры, имеющие кольцевую метиловую группу в положении -2 (пик 8) и в положении -4 (пик 7). Соединение, представленное пиком 5, представляет собой N-деметилированное производное пика 1, а соединение, представленное пиком 6, представляет собой N-деметилированное производное пика 8.

Пример 8

Соединения, представленные пиками 5, 6, 7 и 8, полученные во время фракционирования толуидина синего О, анализируют для выявления их избирательной токсичности по отношению к живым клеткам карциномы ротовой полости (SqCHN), в сравнении с живыми нормальными эпителиальными клетками ротовой полости. Отдельные культуры плоскоклеточного рака и нормальных эпителиальных клеток инкубируют с фракциями различных красителей, а затем промывают средой без красителя. Затем клетки повторно инкубируют в ростовой среде и наблюдают в течение периода 8 дней для определения степени уничтожения клеток. Соединение пика 6 приводит к гибели 95% клеток карциномы, в сравнении с лишь 20% уничтожения нормальных клеток. Соединение пика 8 проявляет гибель 89% клеток карциномы, тогда как оно вызывает гибель лишь 20% нормальных клеток. Таким образом, избирательное удерживание соединений пиков 6 и 8 избирательно токсично по отношению к клеткам карциномы.

Избирательное введение в митохондрии катионных красителей ведет к разрушению митохондриального электрического потенциала, который является источником клеточной энергии и движущей силой продукции АТФ (аденозинтрифосфата) в клетках. Способность клеток карциномы быстро делиться и метастазировать зависит от доступности этих источников большей энергии.

Однако представляется, что воздействия на электрический заряд не являются единственным действующим механизмом, потому что соединения, представленные пиком 5 и пиком 7, также являются катионными красителями, но тем не менее они не проявляют аналогичной избирательной токсичности по отношению к карциномам, которую демонстрируют соединения пика 6 и пика 8. Таким образом, как представляется, соединения пиков 6 и 8 имеют другие молекулярные свойства, которые приводят к их избирательной токсичности по отношению к клеткам карциномы.

Пример 9

Терапевтические характеристики соединений пиков 6 и 8 определяются с помощью дальнейших тестов in vitro, проведенных таким же образом, как в примере 8, с использованием других изолятов клеток карциномы и нормальных эпителиальных клеток. Профиль тестирования включает другие плоскоклеточные карциномы головы и шеи, пищевода, легких, шейки матки и кожи, а также другие типы раковых опухолей, включая аденокарциномы, лимфомы и саркомы. Тесты in vivo "задержки опухолевого роста" и "анализ обратного развития опухоли" с использованием пораженных опухолями животных, включая карциномы головы, шеи и легких, имплантированные мышам Balb-C, проводят для анализа терапевтической пользы этих соединений in vivo. Эти дополнительные тесты in vitro и in vivo подтверждают избирательную токсичность соединений пиков 6 и 8 по отношению к более широкому разнообразию типов раковых клеток.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления и уничтожения эпителиальных раковых клеток. Сущность изобретения состоит в избирательной маркировке митохондрий раковых клеток путем доставки к эпителиальным раковым клеткам катионного суправитального митохондриального маркирующего агента. Агент также может включать в себя продукт реакции маркирующего агента и препарата для химиотерапии рака или быть в смеси с ним. Техническим результатом является выявление и избирательное уничтожение эпителиальных раковых клеток в присутствии нормальных клеток. 2 с. и 8 з.п.ф-лы.

1. Диагностический способ выявления in vivo раковых эпителиальных клеток с помощью избирательной маркировки их митохондрий, включающий доставку к эпителию катионного суправитального митохондриального маркирующего агента.2. Способ избирательного уничтожения эпителиальных раковых клеток, включающий доставку к эпителию катионного суправитального митохондриального маркирующего агента, причем митохондриальный маркирующий агент имеет молекулярную массу ниже, чем приблизительно 5000.3. Способ по п.2, в котором агент представляет собой продукт реакции катионного суправитального митохондриального маркирующего агента и препарата для химиотерапии рака, причем митохондриальный маркирующий агент или продукт реакции маркирующего агента и препарата для химиотерапии рака имеет молекулярную массу ниже, чем приблизительно 5000.4. Способ по п.2, в котором агент доставляется к эпителиальным раковым клеткам в комбинации с другим препаратом для химиотерапии рака, который избирательно уничтожает раковые клетки посредством другого механизма, отличного от механизма, которым агент уничтожает раковые клетки.5. Способ по п.1 или 2, в котором катионный суправитальный митохондриальный маркирующий агент имеет молекулярную структуру, которая не препятствует притяжению положительного заряда молекулы маркирующего агента отрицательными зарядами на митохондриальных мембранах.6. Способ по п.1 или 2, в котором катионный суправитальный митохондриальный маркирующий агент имеет молекулярную структуру, которая позволяет маркирующему агенту связываться со специфическим участком в митохондриях.7. Способ по п.1 или 2, в котором катионный суправитальный митохондриальный маркирующий агент имеет молекулярную структуру, которая будет вклиниваться в митохондриальной ДНК или скапливаться вдоль нее.8. Способ по п.1 или 2, в котором катионный суправитальный митохондриальный маркирующий агент имеет молекулярную структуру, которая воздействует на его восстановительный потенциал для обеспечения возможности его изменения в незаряженную лейкоформу перед, во время или после входа в митохондрии.9. Способ по п.1 или 2, в котором катионный суправитальный митохондриальный маркирующий агент имеет молекулярную структуру, которая будет депротонирована при физиологическом рН.10. Способ по п.1 или 2, в котором катионный суправитальный митохондриальный маркирующий агент имеет Log Р от 0 до 5.