Бифункциональные композиции для лечения рака Российский патент 2022 года по МПК A61K31/395 A61K31/40 A61K31/44 A61K31/4427 A61K31/4706 A61K31/4709 A61P35/00 

Область изобретения

Изобретение относится к способам лечения или профилактики рака. В частности, изобретение предполагает использование бифункциональных композиций и соединений для лечения и профилактики рака. Изобретение, строго говоря, относится к использованию композиций, включающих в себя лиганд ДНК или лиганд белка для лечения или профилактики рака. Изобретение также относится к композициям, соединениям и медикаментам, содержащим интеркалятор ДНК и ингибитор белка.

Предпосылки к созданию изобретения

Любое обсуждение известного уровня техники во всем настоящем описании ни в коем случае не следует рассматривать как признание того, что данный известный уровень техники широко известен или составляет часть всеобще известного знания в данной области.

Выживаемость при раковых заболеваниях часто зависит от частоты постановки ранних диагнозов, агрессивности рака, доступности эффективных видов противоракового лечения, направленных на само раковое заболевание, общее здоровье субъекта, проходящего лечение, и/или наличия возможностей, хирургических или иных, для удаления опухолей или раковых клеток.

Все типы рака обычно характеризуются неконтролируемым делением клеток за счет аберрантной молекулярной передачи сигналов, которая позволяет клеткам обходить остановку клеточного цикла/апоптоз. Устойчивость пролиферации клеток часто объясняется, по крайней мере частично, отключением клеточных механизмов к программируемой клеточной смерти.

Однако, для многих видов рака общим является то, что при их лечении неизбирательность нацеливания терапевтического средства и токсичность таких средств ограничивают эффективность противораковой терапии.

Чтобы обойти проблему нацеливания и в то же время проводить терапию, имеющую широкое применение, может быть целесообразным нацеливаться на клеточные процессы, которые существенно усиливаются во время пролиферации клеток, вызванной раком, такие как транскрипция и репликация ДНК, которые необходимы при делении клетки. Механизм действия таких методов лечения часто связан с последующим повреждением ДНК, инициирующим пути апоптоза, которые приводят к клеточной смерти. Селективный апоптоз пролиферирующих раковых клеток имеет решающее значение для эффективного лечения рака.

Молекулы, связывающие ДНК, могут препятствовать синтезу ДНК, блокируя взаимодействия между ДНК и, например, факторами транскрипции, полимеразами, лигазами, нуклеазами, топоизомеразами и геликазами. В частности, воздействие лигандов ДНК, которые интеркалируют между основаниями пар нитей ДНК, особенно эффективно в нарушении клеточных механизмов и комплексов, которые связываются с ДНК и перемещаются по ее длине во время транскрипции и репликации. Однако, в то время как такие лиганды ДНК могут нацеливаться на раковые клетки, они также могут влиять на ход нормального деления клетки и влиять на экспрессию в неделящихся клетках, что приводит к широкому ряду потенциальных побочных эффектов.

К тому же действие лиганда ДНК может быть недостаточным, потому что, несмотря на потенциальный терапевтический эффект вмешательства в синтез ДНК для запуска апоптоза, способность раковых клеток избегать клеточной смерти может свести на нет терапевтический эффект, связанный с нанесением повреждения ДНК в раковых клетках.

В сущности, было бы выгодно сочетать активность лиганда ДНК со средствами создания помех для каскадов передачи сигналов, которые усиливают развитие опухоли и избегание клеточной смерти, и иммунный ответ, который может быть запущен обычным способом, например, откликом на повреждение ДНК.

Один из классов молекул, участвующих в избежании клеточной смерти и развитии опухоли — это протеинкиназы, многие из которых пролиферативные и неизбирательные киназы. К сожалению, ингибирование протеинкиназы, используемой во множестве путей, часто может вызывать побочные эффекты, которые могут служить барьером для успешной разработки и коммерциализации лекарственного средства.

Одна из стратегий ускорения разработки лекарственных средств для новых методов лечения — это перепрофилирование (или перепозиционирование) существующих лицензированных лекарственных средств для новых медицинских показаний. Перепозиционирование — это в сущности использование лекарственного средства с определенными показаниями для нового применения с учетом существующих знаний и данных о безопасности. Недавние примеры перспективного перепозиционирования лекарственных средств для лечения и профилактики рака включает в себя использование противопаразитических и противопсихотических лекарственных препаратов. Также проводились исследования in vitro некоторых противомалярийных лекарственных препаратов, которые показали эффективность против резистивных штаммов малярии; эти препараты были перепрофилированы для введения совместно с химиотерапевтическими лекарственными препаратами, чтобы усилить лечебный эффект путем противодействия или обращения сопротивляемости к хемиотерапевтическим лекарственным препаратам. Конечно, хотя перепрофилирование может позволить ускорить некоторые аспекты разработки лекарственных препаратов с учетом сведений о безопасности, оно не освобождает от необходимости демонстрации того, что перепрофилированный лекарственный препарат действительно эффективен для нового применения путем исследований in vivo и испытаний на людях, так как данные исследований in vitro часто не показательны для результатов исследований in vivo.

Например, в патенте US20110300137 описывается использование противомалярийного лекарственного препарата — люмефантрина — совместно с химиотерапевтическими препаратами, при этом люмефантрин усиливает эффект лечения рака путем ингибирования аутофагии. Аутофагия — это известный механизм, используемый раковыми стволовыми клетками против химиотерапевтических препаратов, который позволяет клеткам оставаться в состоянии покоя до тех пор, пока они снова начнут пролиферировать после удаления химиотерапевтического препарата. В этом состоянии покоя раковые клетки защищены от химиотерапевтических препаратов, которые обычно нацелены на пролиферирующие клетки, что содействует резистентности рака к хемиотерапевтическим препаратам. При ингибировании аутофагии раковые клетки не могут избежать химиотерапевтических препаратов, и резистентность уменьшается, но рак все также лечится за счет активности химиотерапевтических препаратов. Однако, несмотря на то, что люмефантрин продемонстрировал активность против аутофагии in vitro, в исследованиях в патенте US20110300137 ни люмифантрин, ни какой-либо из множества упоминаемых противомалярийных препаратов (некоторые из которых, такие как пиронаридин, имеют очень мало структурных сходств с другими членами группы, о которых заявлено, что они имеют одинаковую активность) не показал или не дал основания считать, что он имеет какую-либо противопролиферативную или апоптическую активность для эффективного лечения или профилактики деления клеток только рака, также не было проведено каких-либо исследований in vivo для валидации полученных данных.

В другом примере — патенте CN1135977C — описано использование противомалярийного лекарственного препарата, пиронаридина, при приготовлении комбинированных противоопухолевых препаратов для лечения опухолей с множественной лекарственной резистентностью. Аналогично, данное раскрытие изобретения относится к совместному или предварительному введению пиронадина c адриамицином (ADR: доксорубицин) к клеточным линиям с множественной лекарственной резистентностью (МЛР) со специфической резистентностью к ADR с целью увеличения цитотоксических эффектов ADR. Хотя было показано, что апоптоз препаратом ADR клеточных линий с МЛР может быть усилен в присутствии пиронаридина (PND) в исследованиях in vitro, не было продемонстрировано или сделано предположение ни о том, что PND может индуцировать апоптоз исключительно в пролиферирующих клетках, ни о том, что любая предложенная активность пиронаридина может быть перенесена и воспроизведена в существующих опухолях. Соответственно, изобретение, заявленное в патенте CN1135977C, посвящено исключительно использованию пиронаридина в сочетании с противоопухолевыми лекарственными препаратами для обращения МЛР в резистентных опухолях in vitro.

Было бы выгодно перепрофилировать известный лекарственный препарат, который имеет связывающую активность применительно к ДНК и белку, такой как противомалярийный препарат с долгой историей допустимого использования, для нового терапевтического применения с целью ускорения разработки лекарственного препарата для видов лечения рака.

Цель данного изобретения — устранить или, по крайней мере, уменьшить один из недостатков прототипа или предоставить полезную альтернативу.

Краткое описание изобретения

К удивлению, было обнаружено, что молекула, содержащая лиганд ДНК и лиганд белка, применима для лечения и профилактики рака. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что противомалярийный лекарственный препарат, содержащий лиганд ДНК и лиганд белка, — пиронаридин — имеет ранее неизвестную противопролиферативную активность по отношению к активно делящимся раковым клеткам, причем эта активность селективна и, следовательно, минимизирует побочные действия. Авторы данного изобретения первыми демонстрируют в исследованиях in vivo, что пиронаридин имеет селективную цитотоксичность и может быть использован для лечения и/или профилактики рака, в противоположность простому усилению эффекта химиотерапевтических препаратов на линии бессмертных раковых клеток с МЛР.

Соответственно, первая особенность данного изобретения в том, что предлагается способ индукции апоптоза в пролиферирующих раковых клетках с целью лечения или профилактики рака у млекопитающего, данный способ включает в себя этап введения этому млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пиронаридина (PND) или производного или его фармацевтически приемлемой соли.

Вторая особенность данного изобретения в том, что предлагается способ индукции апоптоза в пролиферирующих раковых клетках в опухоли млекопитающего, данный способ включает в себя этап введения этому млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пиронаридина (PND) или производного или его фармацевтически приемлемой соли.

Третья особенность данного изобретения в том, что предлагается способ индукции клеточной смерти в раковых клетках в опухоли у млекопитающего, данный способ включает в себя этап введения этому млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пиронаридина (PND) или производного или его фармацевтически приемлемой соли.

Четвертая особенность данного изобретения в том, что предлагается способ индукции клеточной смерти в раковых клетках с целью лечения или профилактики рака у млекопитающего, данный способ включает в себя этап введения этому млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пиронаридина (PND) или производного или его фармацевтически приемлемой соли.

Пятая особенность данного изобретения в том, что предлагается способ уменьшения размера опухоли у млекопитающего, данный способ включает в себя этап введения этому млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пиронаридина (PND) или производного или его фармацевтически приемлемой соли, при этом введение уменьшает размер опухоли путем индукции апоптоза в пролиферирующих раковых клетках в опухоли.

Шестая особенность данного изобретения в том, что предлагается способ лечения или профилактики рака, данный способ включает в себя этап введения субъекту, который в этом нуждается, композиции, содержащей лиганд ДНК и лиганд белка.

Лигандом ДНК может быть любая молекула, которая может связывать ДНК и препятствовать метаболизму ДНК. Под метаболизмом ДНК понимается любой клеточный процесс, с помощью которого ДНК сохраняется или в котором ДНК используется и включена в него, например, синтез ДНК и реакции деградации, происходящие при репликации и репарации ДНК, а также транскрипция. Под репликацией подразумевается любой процесс, при котором копируются последовательности ДНК. Лиганд может связываться с ДНК неспецифически посредством электростатических взаимодействий, посредством специфических взаимодействий бороздчатого связывания и/или посредством интеркаляции между парами оснований. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд ДНК — это интеркалятор ДНК. Интеркалятор ДНК может действовать путем интеркаляции между парами оснований через большую или малую бороздку ДНК и/или интеркаляцией путем ввинчивания.

Лиганд ДНК может содержать плоскую систему колец, которая способствует интеркаляции в ДНК, что позволяет ему встать между двумя соседними парами оснований в двойных нитях ДНК, тем самым деформируя двойную спираль ДНК и/или препятствуя репликации и/или транскрипции ДНК за счет раскручивания, удлинения и/или возникновения сшивок спирали ДНК. Препятствование синтезу ДНК в пролиферирующих клетках, таких как раковые клетки, может замедлить или остановить репликацию ДНК и пролиферацию клеток, нарушить клеточный цикл, уменьшить жизнеспособность клетки и/или привести к клеточной смерти.

В отдельных случаях интеркаляторы ДНК могут индуцировать пути апоптоза за счет ингибирования активности топоизомеразы. Эти интеркаляторы ДНК могут быть названы ингибиторами, или "ядами", топоизомеразы и нацелены на топоизомеразу I и/или топоизомеразу II. Эти интеркаляторы ДНК также могут связывать белки топоизомеразы. Предпочтительно, интеркалятор ДНК может также связывать и ингибировать активность топоизомеразы II. Не ограничиваясь теорией, было предположено, что за счет формирования комплекса с ДНК и топоизомеразой II в пролиферирующей клетке, в которой происходит синтез ДНК, ДНК и топоизомераза II будут захвачены в "раскалываемом комплексе". Это предотвращает повторную сшивку двойной нити ДНК, которая была в начале отрезана топоизомеразой для облегчения раскручивания. Последующие разрывы внешней нити ДНК запускает отклик на повреждение ДНК, который ведет к апоптозу. Этому способу действия может способствовать, или внести в него свой вклад, интеркалятор ДНК, который стабилизирует разрыв двойной нити и/или предотвращающий ренатурацию двух нитей ДНК.

В случаях, когда лиганд ДНК — это интеркалятор ДНК, лиганд белка композиции по данному изобретению может также вносить свой вклад в индукцию пути апоптоза за счет взаимодействия с ДНК и/или топоизомеразой.

Плоская система колец интеркалятора ДНК может содержать два или более сопряженных кольца. Предпочтительно кольца являются ароматическими. Эти кольца могут иметь 5- или 6-членные ароматические соединения и/или могут быть замещенными и/или гетероциклическими. Замещенное ароматическое кольцо — это кольцо, в котором атом водорода замещается другим атомом или группой. Гетероциклическое ароматическое соединение — это соединение, структура кольца которого содержит углерод и по меньшей мере один другой атом, такой как, например, азот, кислород и/или сера. Например, интеркалятор ДНК может содержать бензольное кольцо и/или 6-членное гетороцеклическое соединение, такое как пиридин, пиримидин, пиразин, фосфинин, диазин и/или тиазин. В других примерах интеркалятор ДНК может содержать 5-членное гетероциклическое соединение, такое как пиррол, имидазол, фуран, тиазол и/или тиофен.

В предпочтительных вариантах осуществления плоская система колец содержит по меньшей мере одно пиридиновое кольцо, хотя система колец может содержать 2 или более пиридиновых колец. Плоская система колец может включать в себя три сопряженных ароматических кольца. Эти три соединенных кольца могут быть 5- или 6-членными кольцами. В одном варианте осуществления плоская система колец включает в себя три сопряженных 6-членных ароматических кольца, где по крайней мере одно, а, предпочтительно, два ароматических кольца являются гетероциклическими. Каждое из колец может быть бензольным, в таком случае плоская система колец может быть названа антраценом. Одно или более бензольных колец могут быть галогенированы, нитрированы, сульфонированы, алкилированы, ацилированы и/или замещены стерически допустимыми их комбинациями. Интеркалятор ДНК может быть гетероциклического производного антрацена, в которой по меньшей мере одно из колец имеет кольцевую структуру, содержащую углерод и, по меньшей мере, азот. Производные антрацена с кольцевой структурой, содержащей углерод и один, два или три атома азота, соответственно называются моназаантрацен, диазаантрацен и триаазаантрацен.

Не ограничивающие примеры антраценов/антроценных групп, которые могут формировать часть интеркалятора ДНК, включают в себя 1-моноазаантрацен, 2-моноазаантрацен, 5-моноазаантрацен, 1,2-диазаантрацен, 1,3-диазаантрацен, 1,4-диазаантрацен, 1,5-диазаантрацен, 1,6-диазаантрацен, 1,7-диазаантрацен, 1,8-диазаантрацен, 1,9-диазаантрацен, 1,10-диазаантрацен, 2,3-диазаантрацен, 2,5-диазаантрацен, 2,7-диазаантрацен, 2,8-диазаантрацен и 5,10-диазаантрацен. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения плоская система колец интеркалятора ДНК — это 1,5-диазаантрацен (также известный как бензо(b)-1,5-натиридин), или его производные.

В предпочтительных вариантах осуществления, плоская система колец интеркалятора ДНК - это антрацен, диазаантрацен или, более предпочтительно, 1,5-диазаантрацен с одним или более заместителей, выбранных из группы, состоящей из –O^(–), –OH, –OR, –OC₆H₅ , –OCOCH₃, –NH₂, –NR₂, –NHCOCH₃, –R, –C₆H₅, –NO2, –NR⁽⁺⁾, –PR⁽⁺⁾, –SR⁽⁺⁾, –SO₃H, –SO₂R, –CO₂H, –CO₂R, –CONH₂, –CHO, –COR, –CN, –F, –Cl, –Br, –I, –CH₂Cl, –CH=CHNO₂, где R — это любая алкильная группа.

Лигандом белка может быть любая молекула, которая связывает и препятствует активности белка, и может создавать помехи на любом пути передачи сигналов, задействующем этот белок. Следует понимать, что коммуникация внутри и между клетками происходит за счет передачи сигналов по сигнальным путям (процесс также называется сигнальной трансдукцией). В предпочтительных вариантах осуществления лиганд белка связывает белок, задействованный в сигнальном пути, который приводит к раку, его усилению/способствует его прогрессированию. Этот сигнальный путь может быть любым путем, который приводит к любому фенотипу(-ам), связанному(-ым) с раком, включая, помимо прочего, пролиферацию клеток, избежание клеткой апоптоза и/или некроза, избежание клеткой иммунного ответа, встраивание и распространение повреждения ДНК, увеличенную клеточную подвижность и увеличенный клеточный метаболизм. Посредством создания помех на сигнальном пути, который приводит к фенотипу, связанному с раком, лиганд белка может помочь в лечении или профилактике рака за счет уменьшения, минимизации, обращения, предотвращения, замедления или устранения фенотипа, или какого-либо эффекта фенотипа, связанного с раком.

Лиганд белка может создать помехи на сигнальном пути за счет связывания белка или предотвращения пост-трансляционной модификации белка, такой как специфичные реакции расщепления, формирование дисульфидных связей, добавление групп с малым молекулярным весом посредством, например, ацетилирования, амидирования, биотинилирования, цистеинилирования, деамидирования, формилирования, глутатионилирования, гликирования, гликозилирования, гидроксиляции, метилирования, окисления, пальмитоилирования или фосфорилирования и/или сопряжения с другими типами молекул. В других примерах, на сигнальном пути помехи могут создаваться лигандом белка, связывающим белок и предотвращающим удаление групп с малым молекулярным весом, добавленных в ходе любого из вышеперечисленных пост-трансляционных процессов.

Специалисту в данной области очевидно, что один из наиболее распространенным клеточным механизмом сигнальной тансдукции является фосфорилирование белка киназами и дефосфорилирование белка фосфатазами. Соответственно, в предпочтительных вариантах осуществления изобретения лиганды белков создают помехи на сигнальном пути, который приводит к раку, его усилению/способствует его прогрессированию, за счет препятствования состоянию фосфорилирования белка сигнального пути. Под препятствованием подразумевается, что (а) лиганд белка может связать белок сигнального пути и предотвратить или допустить фосфорилирование или дефосфорилирование этого белка; или (б) лиганд белка может связать белок сигнального пути и предотвратить или позволить этому белку фосфорилировать или дефосфорилировать другие субстраты сигнального пути.

Особенно распространенная характеристика рака — это увеличенная активность, гиперэкспрессия или утрата негативной регуляции протеинкиназ, которые в совокупности можно назвать позитивной регуляцией протеинкиназ. В предпочтительных вариантах осуществления лиганд белка связывает протеинкиназу, и более предпочтительно, лиганд белка связывает протеинкиназу, которая задействована в сигнальном пути, который приводит к раку, его усилению/способствует его прогрессированию. Лиганд белка может связывать протеинкиназу и предотвращать, нарушать или уменьшать способность протеинкиназы фосфорилировать мишени, задействованные в сигнальном пути. Действие протеинкиназы может быть предотвращено, нарушено или уменьшено за счет связывания лигандом белка временно, обратимо, постоянно или в ответ на воздействие отдельных стимулов. Действие протеинкиназы может быть предотвращено, нарушено или уменьшено за счет связывания лигандом белка таким как, например, лигандом белка, индуцирующим конформационные изменения в протеинкиназе, лигандом белка, занимающим связывающие участки на протеинкиназе, лигандом белка, блокирующим другие рецепторные участки, которые обычно запускают события фосфориляции, и/или лигандом белка, создающим стерические помехи для активности киназы. Соответственно, лиганд белка можно назвать ингибитором протеинкиназы.

Лиганд белка может связывать и ингибировать любую протеинкиназу, которая имеет позитивную регуляцию в сигнальном пути, который приводит к раку, его усилению/способствует его прогрессированию. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения протеинкиназа — это киназа, задействованная в сигнальном пути MAP (митоген-активированной протеин-) киназы (также известном как путь Ras/MAPK, путь Ras/Raf/MAPK, путь MAP/Erk или путь Ras/Raf/Mek/Erk), который задействован в клеточной пролиферации, жизнестойкости клетки и метастазе. В частности, лиганд белка может связывать и ингибировать MEK (MAPK/Erk киназу), может связывать и ингибировать Raf-киназу, или может связывать и ингибировать ERK (экстрацеллюлярную рецепторную киназу) или их изоформы.

В других вариантах осуществления лиганд протеина связывает протеинкиназу в PI3K/Akt (фосфоинозитид-3-киназа/протеинкиназа B) киназном пути, который является комбинацией множества отдельных путей, задействованных в пролиферации клеток, метаболизме, жизнестойкости клетки и отклике на повреждение ДНК. В частности, лиганд белка может связывать и ингибировать PI3K, Akt, PDK1, GSK-3, Wee1, Myt1, CHK1, CHK2, ATR, ATM, mTOR, CDK2 или PIP5K или их изоформы.

В следующем примере лиганд белка связывает протеинкиназу в RIPK3/RIPK1 (Взаимодействующая с рецептором серин-/треонин-киназа 3; известный также как RIP1 и/или RIP3 киназный путь) киназный путь, который задействован в апоптозе и некроптозе. В частности, лиганд белка может связывать и ингибировать RIPK3, RIPK1, TAK1 или FADD или их изоформы. В других примерах лиганд белка связывает и ингибирует PKC (протеинкиназа C) или ее изоформы, которая задействована в пролиферации, подвижности и жизнестойкости клеток.

В вариантах осуществления данного изобретения лиганд белка — это ингибитор протеинкиназы, причем протеинкиназа выбирается из группы, состоящей из MEK, Raf, ERK, PI3K, Akt, PDK1, GSK-3, Wee1, Myt1, CHK1, CHK2, ATR, ATM, mTOR, CDK2, PIP5K, RIPK3, RIPK1, TAK1, FADD и PCK и/или их изоформ.

Лиганд белка может связывать более одной протеинкиназы. Соответственно, в вариантах осуществления данного изобретения лиганд белка связывает и ингибирует одну или более протеинкиназ, выбранных из группы, состоящей из MEK, Raf, ERK, PI3K, Akt, PDK1, GSK-3, Wee1, Myt1, CHK1, CHK2, ATR, ATM, mTOR, CDK2, PIP5K, RIPK3, RIPK1, TAK1, FADD и PCK и/или их изоформ.

В вариантах осуществления данного изобретения лиганд белка связывает киназу - киназу гликогенсинтазы-3 (GSK-3) - и может быть обозначен как лиганд GSK-3. В этом случае лигандом белка может быть любая молекула, связывающаяся с GSK3α и/или GSK3β, причем следует понимать, что GSK3α и GSK3β — это паралоги, имеющие разные и перекрывающиеся субстраты фосфорилирования и отвечающие на разные и перекрывающиеся молекулярные сигналы. Для удобства обозначения обе молекулы в совокупности будут обозначаться GSK-3, хотя следует понимать, что лиганд GSK-3 может предпочтительно связывать один из паралогов, может связывать паралоги с разной специфичностью и аффинностю и/или может предпочтительно связывать один из паралогов, например, в конкретных локациях клетки, в ответ на различные стимулы и/или при использовании в лечении или профилактике различных видов рака. В качестве альтернативы лиганд GSK-3 может связывать каждый из паралогов на одном и том же участке с похожей специфичностью и аффинностью.

GSK-3 — это пролиферативная неизбирательная киназа, известная тем, что задействована в активации опухоли за счет увеличения клеточного метаболизма и формирования противоапоптических белковых комплексов. GSK-3 присутствует во всей клетке, включая ядро. Соответственно, не ограничиваясь теорией, было предположено, что препятствование передаче сигналов с помощью GSK-3 в пролиферирующих клетках, таких как раковые клетки, может нарушать множество обсуждаемых клеточных процессов, таким образом замедляя или останавливая пролиферацию клеток и/или способствуя клеточной смерти.

В одном или более вариантах осуществления лиганд белка может содержать один или более ароматических 5- или 6-членных колец, причем кольцо (кольца) может быть замещенным и/или гетероциклическим. В других вариантах осуществления лиганд белка может содержать 5- или 6-членные кольца, не являющиеся ароматическими, и эти кольца могут быть замещенными в любом из атомов структуры кольца. В вариантах осуществления изобретения лиганд белка может содержать одно или более бензольных или фениловых колец, которые могут быть галогенизированы, нитрированы, сульфонированы, алкилированы, ацилированы и/или замещены стерически допустимыми их комбинациями. В других вариантах осуществления лиганд белка может содержать одно или более пирролидиновых колец. Лиганд белка может содержать одно или более ароматических 6-членных колец и/или одно или более 5-членных колец, с одним или более замещениями, выбранных из группы, включающей –O^(–), –OH, –OR, –OC₆H₅ , –OCOCH₃, –NH₂, –NR₂, –NHCOCH₃, – R, –C₆H₅, –NO₂, –NR₃⁽⁺⁾, –PR₃⁽⁺⁾, –SR₂⁽⁺⁾, –SO₃H, –SO₂R, –CO₂H, –CO₂R, –CONH₂, –CHO, –COR, –CN, –F, –Cl, –Br, –I, –CH₂Cl, –CH=CHNO₂, –C₂H₅, –CR₂H, –CR₃, где R — это любая алкильная группа. В предпочтительных вариантах осуществления, лиганд белка может содержать фениловое кольцо и одно или более пирролидиновых колец, фениловое кольцо и/или пирролидиновое кольцо может быть замещено одним или более заместителей, выбранных из группы, включающей –O^(–), –OH, –OR, –OC₆H₅, –OCOCH₃, –NH₂, –NR₂, –NHCOCH₃, –R, –C₆H₅, –NO₂, –NR⁽⁺⁾, –PR⁽⁺⁾,–SR₂⁽⁺⁾, –SO₃H, –SO₂R, –CO₂H, –CO₂R, –CONH₂, –CHO, –COR, –CN, –F, –Cl, –Br, –I, –CH₂Cl, –CH=CHNO₂, –C₂H₅, –CR₂H, –CR₃, где R — это любая алкильная группа.

Лиганд белка может связывать или взаимодействовать с белком в отдельных радикалах. Эти радикалы могут быть, например, частью одного или более участков связывания или фосфорилирования белка. В качестве альтернативы эти радикалы могут быть ключевыми для докинга белка или фосфориляции субстрата белка.

В вариантах осуществления изобретения лиганд белка может связывать или взаимодействовать со специфическими радикалами на GSK-3. Например, лиганд GSK-3 может связать активный участок GSK-3β посредством водородных связей с валином 135, глутамином185, и посредством ван-дер-ваальсовых взаимодействий с несколькими дополнительными аминокислотами.

В способах по данному изобретению, лечение и профилактику рака можно проводить путем введения композиции, включающего лиганд ДНК и лиганд белка, где лиганды — отдельные молекулы. Благодаря этому, композиции могут содержать разные молярные отношения двух лигандов, и лиганды могут локализоваться в различных частях клетки и/или локализоваться совместно. Например, композиция может содержать избыточное количество лиганда ДНК (то есть, молярное отношение [лиганд ДНК]:[лиганд белка] от 1000:1 до 1,1:1), или избыточное количество лиганда белка (то есть, молярное отношение [лиганд ДНК]:[лиганд белка] от 1:1000 до 1:1,1), или равновесное молярное отношение лиганда ДНК и лиганда белка. Отношение количества лиганда ДНК к количеству лиганда белка может быть изменено и подобрано в зависимости от факторов, таких как тип рака, подлежащего лечению, стадия рака, возраст субъекта и общее здоровье и чувствительность к эффектам от лиганда ДНК и/или лиганда белка.

В других вариантах осуществления лиганд ДНК и лиганд белка — это отдельные молекулы, сопрягаемые вместе, которые обычно находятся в соотношении 1:1, хотя лиганды могут сопрягаться таким образом, что возникнет избыточное содержание лиганда ДНК или лиганда белка. Например, 1–10 молекул лиганда ДНК могут сопрягаться с одним лигандом белка, или 1–10 молекул лиганда белка могут сопрягаться с одной молекулой ДНК лиганда. Под сопряжением понимается, что лиганд ДНК и лиганд белка изготавливаются по отдельности и связываются при помощи соответствующего и фармацевтически допустимого спейсера или кросс-линкера, или при помощи электростатических или ковалентных взаимодействий, для введения в заданной пропорции. Спейсер или кросс-линкер могут расщепляться под воздействием определенных стимулов, или сопряжение может быть необратимым.

В предпочтительных вариантах осуществления данного изобретения лиганд ДНК и лиганд белка — это компоненты одного состава. Лиганд ДНК и лиганд белка могут быть объединены при помощи соответствующего линкера в одно соединение. Линкер может быть жестким или гибким и/или может иметь любую длину, которая позволит лиганду ДНК связать ДНК, а лиганду белка — связать белок. Линкер не обязательно должен обеспечить одновременное связывание ДНК и белка, хотя в некоторых вариантах осуществления это является предпочтительным. Линкер может содержать аминогруппу. Соединение может содержать другие лиганды и/или активные участки.

В случае, если лиганд ДНК и лиганд белка сопряжены или являются частью одного соединения, очевидно, что это приведет к совместной локализации лиганда ДНК и лиганда белка. В любой заданный момент времени состав или сопряженные лиганды могут быть локализованы таким образом, что только лиганд ДНК или только лиганд белка смогут связать ДНК или белок, соответственно. В качестве альтернативы, соединение или сопряженные лиганды могут быть локализованы таким образом, что и лиганд ДНК, и лиганд белка смогут связать соответствующую молекулу-мишень одновременно. Способность лиганда ДНК и лиганда белка в соединении или сопряженных лигандах связывать ДНК и белок соответственно, как одновременно, так и последовательно, может изменяться во времени или в ответ на клеточную активность.

В предпочтительных вариантах осуществления лиганд ДНК и лиганд белка — это форма пиронаридина (PND), или производного или фармацевтически приемлемой его соли. Пиронаридин имеет химическую формулу C29H32ClN5O2 и химическое наименование 4-[(7-хлор-2-метокси-1,5-дигидробензо[b][1,5]нафтиридин-10-ил)имино]-2,6-бис(пирролидин-1-илметил)циклогекса-2,5-диен-1-он (ранее, 2-метокси-7-хлор-10-(3',5'-бис(пирролин-1-илметил)-4'-гидроксифениламино)бензо(b)-1,5-нафтиридин). Пиронаридин также известен под названием маляридин и бензонафтиридин 7351.

В терапевтическом применении пиронаридин преимущественно используется в виде фосфатной соли, или тетрафосфата пиронаридина, которая имеет химическую формулу C29H44ClN5O18P4 и химическое наименование 4-[(7-хлор-2-метокси-1,5-дигидробензо[b][1,5]нафтиридин-10-ил)имино]-2,6-бис(пирролидин-1-илметил)циклогекса-2,5-диен-1-он; фосфорная кислота.

Тетрафосфат пиронаридина — это часто используемый одобренный противомалярийный агент, который эффективно используется для лечения малярии уже более 30 лет. В последнее время было обнаружено, что он усиливает противоопухолевую активность некоторых распространенных лекарственных препаратов, направленных на виды рака с множественной лекарственной резистентностью, хотя он никогда ни применялся отдельно для лечения и профилактики рака в исследованиях in vivo, ни предлагался в качестве самостоятельной противораковой терапии, которая может быть нацелена на пролиферирующие клетки. К удивлению, посредством настоящего изобретения было обнаружено, что пиронаридин является эффективным противораковым агентом с лигандом ДНК и лигандом белка. Несмотря на то, что соединение имеет две терапевтических мишени, он в целом хорошо переносится и безопасен в использовании. Не ограничиваясь теорией, была сделана гипотеза о том, что пиронаридин селективно нацеливается на пролиферирующие раковые клетки для апоптоза и препятствует молекулярным механизмам, которые при обычных условиях могут позволить раковым клеткам избежать клеточной смерти. То, что пиронаридин селективен при нацеливании на пролиферирующие клетки, важно, так как он уменьшает побочные действия, которые обычно характерны для менее селективны видов лечения рака.

Пиронаридин содержит лиганд, связывающий ДНК, — антраценовую производную от трех сопряженных бензольных колец — и лиганд ДНК, который имеет 6-членное ароматическое кольцо и два 5-членных кольца. В пиронаридине лиганд, связывающий ДНК, замещается 1,5-диаза-антраценом, хотя в вариантах осуществления данного изобретения способ основан на производном пиронаридина, которое может иметь альтернативные замещения в альтернативных положениях в структурах колец. В других производных пиронаридина лиганд ДНК — это гетероциклическое антраценовое производное с азотом в разных положения в структурах колец из сопряженных ароматических колец. Предлагается, что этот структурный аспект пиронаридина (то есть, планарная природа трех сопряженных бензольных колец) позволяет лиганду ДНК пиронаридина действовать как интеркалятор ДНК для участия в индукции апоптоза.

Эта особенность отличает его от других противомалярийных агентов, которые предлагались для усиления активности химиотерапевтических агентов против резистентных клеточный линий, таких как амодиахин, мефлохин, нафтохин, памахин, примахин, пиперакин, тафенохин, мепакрин, галофантрин, пиронаридин, нитазоксанид и атоваквон. Возможно, что разная функциональность пиронаридина (то есть, лечения только рака) и этих агентов объясняется отсутствием структурного сходства между пиронаридином и другими противомалярийными агентами (то есть, он усиливает лечение рака в резистентных клетках путем ингибирования аутофагии).

В пиронаридине лиганд, связывающий белок, содержит фениловую группу, хотя в вариантах осуществления данного изобретения способ основан на производном пиронаридина, которое может иметь альтернативные замещения в альтернативных положениях в бензоловом кольце. В других производных пиронаридина лиганд белка содержит гетероциклическое 6-членное кольцо. В пиронаридине лиганд, связывающий белок, содержит 2 пирролидиновых кольца, хотя в вариантах осуществления данного изобретения способ основывается на производном пиронаридина, которое может иметь одно или более замещенных пирролидиновых колец, или 5-членные кольца с другими молекулами, кроме углерода и азота, в структуре колец.

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения способ включает в себя введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей тетрафосфат пиронаридина.

В способе по данному изобретению, раком может быть любой вид рака, который проявляется как твердая опухоль или рак крови (жидкий), включая, помимо прочего, саркомы, карциномы, лимфомы, лейкоз, миеломы и циркулирующие опухолевые клетки (ЦКО). Например, карцинома поджелудочной железы, мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, мезотелиомы, почек, печени, легких, включая мелкоклеточный рак легкого, немелкоклеточный рак легкого, головы и шеи, пищевода, желчного пузыря, яичников, желудка, шейки матки, щитовидной железы, простаты или кожи. В целом рак характеризуется неконтролируемой пролиферацией клеток.

В других примерах лимфома может представлять собой В-клеточную лимфому, Т-клеточную лимфому, лимфому Ходжкина, неходжкинскую лимфому, волосатоклеточную лимфому, лимфому из мантийных клеток, миелому, лимфому Беркетта или экстранодальную лимфому желудка, молочной железы или мозга.

Саркома может представлять собой, например, фибросаркому, рабдомиосаркому, хондросаркому, лейомиосаркому, мезотелиальную саркому, ангиосаркому, липосаркому, костные опухоли и опухоли центральной и периферической нервной системы, включая астроцитому, нейробластому, глиому и шванномы, или другие опухоли, в том числе меланому, семиному, тетрокарциному, остеосаркому, пигментную ксеродерму, кератокакантому, фолликулярный рак щитовидной железы и саркому Капоши.

Миелома может представлять собой, например, миелому плазматических клеток, или болезнь Келера, или множественную миелому. В других примерах лейкоз может представлять собой миелолейкоз, гранулоцитарный лейкоз, лимфатический лейкоз, лимфолейкоз или лимфобластный лейкоз, истинную полицитемию или эритремию.

В других неограничивающих примерах рак может представлять собой, например, острый лимфобластный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, адренокортикальную карциному, рак, связанный с ВИЧ и СПИДом, первичную лимфому ЦНС, рак анального канала, карциноидные опухоли желудочно-кишечного тракта, астроцитомы головного мозга, атипичные тератоидные/рабдоидные опухоли, базальноклеточную карциному, рак желчных протоков, саркому Юинга, остеосаркому, злокачественную фиброзную гистиоцитому, глиому головного мозга, опухоли бронхов, опухоли сердца, эмбриональные опухоли, опухоли зародышевых клеток, холангиокарциному, хордому, хронический лимфолейкоз, хронический миелогенный лейкоз, хронические миелопролиферативные новообразования, колоректальный рак, краниофарингиому, кожную Т-клеточную лимфому, грибовидный микоз, синдром Сезари, протоковую карциному in situ (DCIS), рак матки, эпендимому, эстезионейробластому, внегонадные зародышевые опухоли, рак глаза, внутриглазную меланому, ретинобластому, рак маточной трубы, рак желудка, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта, рак яичек, рак гортани, рак губы, рта и полости рта, рак молочной железы у мужчин, карциному клеток Меркеля, карциному срединного тракта с изменениями гена NUT, синдромы множественной эндокринной неоплазии, миелодиспластические синдромы, рак носовой полости и придаточных пазух носа, рак носоглотки, рак ротоглотки, нейроэндокринные опухоли поджелудочной железы, папилломатоз, параганглиома, рак околощитовидной железы, рак полового члена, рак глотки, феохромоцитома, опухоли гипофиза, плевропульмональную бластому, первичный рак брюшины, рак слюнных желез, сосудистые опухоли, рак уретры, саркому матки, рак влагалища, рак вульвы и опухоль Вильмса.

Способы по настоящему изобретению могут предотвращать, задерживать или замедлять развитие видов рака, которые, например, могут в обычных условиях развиться из метастаза любого из видов рака, упомянутых выше. Способы также могут предотвратить, задержать или замедлять рецидив любого из вышеупомянутых видов рака после лечения.

Рак может представлять собой любой вид рака, при котором пролиферативная способность раковых клеток модулируется белком любым способом. В некоторых вариантах осуществления рак может представлять собой любой вид рака, при котором раковые клетки сверхэкспрессируют белок. Следует понимать, что под словом "сверхэкспрессируют" подразумевается то, что раковые клетки экспрессируют больше белка, чем здоровая клетка той же ткани или клетка такого же типа. Например, будет считаться, что раковая клетка, находящаяся в опухоли молочной железы, сверхэкспрессирует белок, если, по сравнению с нераковой клеткой ткани молочной железы уровень экспрессии белка в раковой клетке, находящейся в опухоли молочной железы, будет выше. Уровни экспрессии белка в клетке могут быть определены опытным специалистом при помощи хорошо известных методик, таких как, помимо прочих, количественный анализ мРНК, иммунофлуоресценция и вестерн-блоттинг.

Хотя композиция по данному изобретению может использоваться самостоятельно для эффективного лечения и профилактики рака, в некоторых вариантах осуществления способ включает в себя введение нуждающемуся в этом субъекту композиции, содержащей лиганд ДНК, лиганд белка и дополнительный биоактивный агент. Биоактивный агент может быть включен в композицию, содержащую лиганд ДНК и лиганд белка, или биоактивный агент может быть введен совместно с композицией, содержащей лиганд ДНК и лиганд белка. Под совместным введением подразумевается то, что агент и композиция могут быть введены одновременно, или композиция и агент могут быть введены, например, попеременно, или один перед другим, или один после другого, или их комбинация (то есть предварительное введение или последующее введение включено в смысл термина "совместное введение"). Например, биоактивный агент может быть введен предварительно перед композицией, и также может вводиться одновременно или в течение того же самого периода времени, что и композиция. Словосочетание "одновременно" не подразумевает ограничение текущим моментом времени, а, скорее, временные рамки или длительность. Например, биоактивный агент может быть введен субъекту одновременно с композицией по данному изобретению, где это означает, что биоактивный агент введен в соответствии с подходящим расписанием для отдельно взятого периода (дни, недели, месяцы или годы), хотя субъект также получает композицию по данному изобретению одновременно или по другому расписанию на тот же отдельно взятый период (то есть, пациент может получать ежедневно дозу композиции по данному изобретению в течение трех месяцев, в то время как, в течение этих трех месяцев субъект получает еженедельно дозу биоактивного агента).

Биоактивный агент может представлять собой любое соединение, имеющее биологическую активность в отношении рака, включая терапевтическую. Биоактивный агент может обладать способностью связывания или взаимодействия с клетками рака. Биоактивный агент может представлять собой любой агент, лекарственный препарат, соединение или композицию, которые могут быть использованы для детектирования, профилактики и/или лечения рака. В вариантах осуществления данного изобретения биоактивный агент — это терапевтический агент, и более предпочтительно, химиотерапевтический агент. В вариантах осуществления изобретения лиганд ДНК и лиганд белка выполнены в форме пиронаридина (PND) или производного или фармацевтически приемлемой его соли, а биоактивный агент включен в композицию, содержащую пиронаридин, или биоактивный агент вводится совместно с композицией, содержащей пиронаридин.

В особенно предпочтительных вариантах осуществления изобретения биоактивный агент представляет собой химиотерапевтический агент, выбранный из группы, состоящей из абиратерона ацетата, (наб-)паклитаксела, связанного с альбумином, алемтузумаба, алтретамина, аспарагиназы, бендамустина, бевацизумаба, блеомицина, бортезомиба, брентуксимаб ведотина, бусульфана, кабазитаксела, капецитабина, карбоплатина, кармустина, цетуксимаба, хлорамбуцила, цисплатина, кладрибина, кризотиниба, циклофосфамида, цитарабина (Ara-C), дакарбазина, дактиномицина, дазатиниба, даунорубицина, дауноксома (липосомальный даунорубицин), депоцита (липосомальный цитарабин), доцетаксела, доксила (липосомального доксорубицина), доксорубицина, эрибулина мезилата, эрлотиниба, эстрамустина, этопозида, эверолимуса, флоксуридина, флударабина, фторурацила, гефитиниба, гемцитабина, пластинок Глиадел, гидроксимочевины, ибритумомаба, ибритумомаба, идарубицина, ифосфамида, иматиниба, ипилимумаба, иринотекана, иксабепилона, лапатиниба, леналлидомида, ломустина, мехлорэтамина, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата, митомицина, миоксантрона, MG132, нилотиниба, оксалиплатина, паклитаксела, панитумумаба, пазопаниба, пегинтерферона альфа-2b, пеметрекседа, пентостатина, пралатрексата, прокарбазина, ритуксимаба, ромидепсина, руксолитиниба, сипулеуцелина-Т, сорафениба, стрептозоцина, сунитиниба, темозоломида, темсиролимуса, тенипозида, талидомида, тиогуанина, тиотепа, топотекана, тозитумомаба, валрубицина, вандетаниба, вемурафениба, винбластина, винкристина и винорелбина. Опытному специалисту будет очевидно, что это ни в коем случае не исчерпывающий список, и что другие химиотерапевтические агенты, разработанные в будущем, могут подойти для использования в способах по данному изобретению.

В более предпочтительных вариантах осуществления изобретения лиганд ДНК и лиганд белка выполнены в форме пиронаридина (PND) или производного или фармацевтически приемлемой его соли, а биоактивный агент включен в композицию, содержащую пиронаридин, или биоактивный агент вводится совместно с композицией, содержащей пиронаридин, причем биоактивный агент выбирается из группы, состоящей из цисплатина, гемцитабина, бортезомиба и MG132.

В вариантах осуществления изобретения способ включает в себя введение композиции, содержащей два или более биоактивных агентов.

В другом предпочтительном варианте осуществления данного изобретения лиганд ДНК, лиганд белка и/или дополнительный биоактивный агент — это пролекарство. Пролекарство — это лекарственное производное активного лекарственного препарата, которая может быть инертной или иметь меньшую токсичность, чем активный лекарственный препарат, которые может превратиться в активный лекарственный препарат in vivo. Превращение может происходить ферментативными или химическими способами, и/или превращение может запускаться биологическими сигналами, такими как изменения pH, и/или в ответ на связывание клеточного компонента.

В другом аспекте изобретения обеспечивается использование лиганда ДНК и лиганда белка в приготовлении медикамента для лечения и профилактики рака.

Композиции и медикаменты, дозировки и введение

Композиции, соединения и медикаменты по данному изобретению можно вводить пероральным, местным или парентеральным путем, включая внутривенный, внутримышечный, внутрибрюшинный и подкожный. Они могут доставляться инъекцией непосредственно в опухоль. Они также их можно вводить в органы, ткани и клетки ex vivo.

Для внутримышечного, внутрибрюшинного, подкожного и внутривенного применения композиции и медикаменты по настоящему изобретению обычно предоставляются в стерильных водных растворах или суспензиях, забуференных до подходящего pH и изотоничности. Подходящие водные носители включают раствор Рингера и изотонический хлорид натрия. Водные суспензии согласно изобретению могут включать суспендирующие агенты, такие как производные целлюлозы, альгинат натрия, поливинилпирролидон и трагакантовая камедь, а также смачивающий агент, такой как лецитин. Подходящие консерванты для водных суспензий включают этил и н-пропил-п-гидроксибензоат.

Для перорального введения композиции по настоящему изобретению обычно предоставляют в форме таблеток или капсул или в виде водного раствора или суспензии. Таблетки для перорального применения могут включать активный ингредиент, смешанный с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как инертные разбавители, дезинтегрирующие агенты, связывающие агенты, смазывающие агенты, подслащивающие агенты, ароматизирующие агенты, красители и консерванты. Подходящие инертные разбавители включают карбонат натрия и кальция, фосфат натрия и кальция и лактозу. Кукурузный крахмал и альгиновая кислота являются примерами подходящих разрыхлителей. Связующие агенты могут включать крахмал и желатин. Смазывающий агент, если он присутствует, обычно представляет собой стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. При желании таблетки могут быть покрыты материалом, таким как моностеарат глицерина или дистеарат глицерина, для замедления абсорбции в желудочно-кишечном тракте.

Капсулы для перорального применения включают твердые желатиновые капсулы, в которых активный ингредиент смешан с твердым разбавителем, и мягкие желатиновые капсулы, в которых активный ингредиент смешан с водой или маслом, таким как арахисовое масло, жидкий парафин или оливковое масло.

Для местного введения композиции по настоящему изобретению обычно предоставляются в форме жидкости, лосьона, эмульсии, мусса, пасты, крема, мази или геля, и могут быть полезны для лечения или профилактики видов рака кожи или рака около поверхности кожи, такого, чтобы лиганд ДНК и лиганд белка смогли диффундировать к пораженным клеткам. Композиции по настоящему изобретению для местного применения также включают фармацевтически приемлемые консерванты, увлажнители, смягчающие средства, увлажнители, консистенции, хелатообразующие агенты, формообразующие, разбавители и красители.

Эффективные дозы композиций, соединений и лекарственных средств, используемых в настоящем изобретении, могут быть определены обычными методами и, как правило, будут зависеть от используемого терапевтического агента. Конкретный уровень дозировки, требуемый для любого конкретного субъекта, будет зависеть от ряда факторов, включая тяжесть состояния, в котором производится лечение, способ введения и вес субъекта.

Например, 1 стандартная доза может содержать от около 0,1 мг до около 10000 мг одного соединения, содержащего лиганд ДНК и лиганд белка, или альтернативную форму(-ы), производное(-ые) или соль(-и), или их комбинации, и/или их источник(и), описанные в любом аспекте и/или примере изобретения. В другом примере стандартная доза включает от около 50 мг до около 10000 мг, от около 100 мг до около 10000 мг, от около 200 мг до около 10000 мг, от около 500 мг до около 10000 мг, от около 1000 до около 10000 мг, около 2000 мг. до около 10000 мг, от около 4000 мг до около 10000 мг, от около 8000 мг до около 10000 мг, от около 5 мг до около 1000 мг, от около 10 мг до около 1000 мг, от около 20 мг до около 1000 мг, от около 50 мг до около 1000 мг, от около 100 до около 1000 мг, от около 200 мг до около 1000 мг, от около 400 мг до около 1000 мг, от около 800 мг до около 1000 мг, от около 0,5 мг до около 100 мг, от около 1 мг до около 100 мг, от около 2 мг до около 100 мг, от около 5 мг до около 100 мг, от около 10 до около 100 мг, от около 20 мг до около 100 мг, от около 40 мг до около 100 мг или от около 80 мг до около 100 мг. Предпочтительно стандартная доза включает около 25 мг, около 100 мг, около 200 мг, около 300 мг, около 400 мг, около 500 мг, около 600 мг, около 700 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг одного соединения, содержащего лиганд ДНК и лиганд белка, или альтернативную форму(-ы), производное(-ые) или соль(-и), или их комбинации, и/или их источник(и), описанные в любом аспекте и/или примере изобретения.

В других примерах 1 стандартная доза может содержать от около 0,1 мг до около 10000 мг лиганда ДНК и от около 0,1 мг до около 10000 мг лиганда белка, или альтернативной(-ых) формы(форм), производного(-ых) или соли(-ей), или их комбинаций, и/или их источника(-ов), описанных в любом аспекте и/или примере изобретения. В другом примере стандартная доза содержит от около 50 мг до около 10000 мг, от около 100 мг до около 10000 мг, от около 200 мг до около 10000 мг, от около 500 мг до около 10000 мг, от около 1000 до около 10000 мг, около 2000 мг. до около 10000 мг, от около 4000 мг до около 10000 мг, от около 8000 мг до около 10000 мг, от около 5 мг до около 1000 мг, от около 10 мг до около 1000 мг, от около 20 мг до около 1000 мг, от около 50 мг до около 1000 мг, от около 100 до около 1000 мг, от около 200 мг до около 1000 мг, от около 400 мг до около 1000 мг, от около 800 мг до около 1000 мг, от около 0,5 мг до около 100 мг, от около 1 мг до около 100 мг, от около 2 мг до около 100 мг, от около 5 мг до около 100 мг, от около 10 до около 100 мг, от около 20 мг до около 100 мг, от около 40 мг до около 100 мг или от около 80 мг до около 100 мг лиганда ДНК и от около 50 мг до около 10000 мг, от около 100 мг до около 10000 мг, от около 200 мг до около 10000 мг, от около 500 мг до около 10000 мг, от около 1000 до около 10000 мг, от около 2000 мг до около 10000 мг, около 4000 мг до около t 10000 мг, от около 8000 мг до около 10000 мг, от около 5 мг до около 1000 мг, от около 10 мг до около 1000 мг, от около 20 мг до около 1000 мг, от около 50 мг до около 1000 мг, от около 100 до около 1000 мг от около 200 мг до около 1000 мг, от около 400 мг до около 1000 мг, от около 800 мг до около 1000 мг, от около 0,5 мг до около 100 мг, от около 1 мг до около 100 мг, от около 2 мг до около 100 мг, около От 5 мг до примерно 100 мг, от примерно 10 до примерно 100 мг, от примерно 20 мг до примерно 100 мг, от примерно 40 мг до примерно 100 мг или от примерно 80 мг до примерно 100 мг лиганда белка. Предпочтительно стандартная доза содержит около 25 мг, около 100 мг, около 200 мг, около 300 мг, около 400 мг, около 500 мг, около 600 мг, около 700 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг лиганда ДНК и около 25 мг, около 100 мг, около 200 мг, около 300 мг, около 400 мг, около 500 мг, около 600 мг, около 700 мг, около 800 мг, около 900 мг или около 1000 мг лиганда белка, или альтернативной(-ых) формы(форм), производного(-ых) или соли(-ей), или их комбинаций, и/или их источника(-ов), описанных в любом аспекте и/или примере изобретения.

Стандартную дозу можно вводить один, два, три, четыре или пять раз в день, или можно вводить каждый второй или третий день, или один раз в неделю, один раз в две недели или один раз в четыре недели.

В некоторых вариантах осуществления композиции, соединения и медикаменты можно вводить субъекту самостоятельно или в комбинации с другим дополнительным биоактивным агентом(-ами). В таких вариантах осуществления введение может быть одновременным или последовательным.

Обычно при лечебном применении композиции, соединения и медикаменты можно вводить на протяжении всего периода рака. Кроме того, для среднего специалиста в данной области будет очевидно, что оптимальное количество и интервалы между отдельными дозами могут определяться природой и степенью развития болезни или тяжести состояния, в котором производится лечение, формой, путем и местом введения, и характером конкретного субъекта, проходящего лечение. Оптимальные дозировки можно определить с помощью общепринятых методик.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения могут включать введение композиции или медикамента в нескольких отдельных дозах. Соответственно, способы лечения и профилактики, описанные в настоящем документе, включают введение нескольких отдельных доз субъекту, например, в течение определенного периода времени.

Композиции и медикаменты по настоящему изобретению также могут быть полезны в сочетании (вводятся вместе или последовательно) с одним или несколькими дополнительными методами лечения, такими как лучевая терапия, и/или одним или несколькими дополнительными терапевтическими агентами, выбранными из группы, состоящей из различных типов химиотерапевтических лекарственных препаратов, противоопухолевых антибиотиков, ингибиторов топоизомеразы, ингибиторов митоза, кортикостероидов, таргетной терапии, дифференцирующих агентов, гормональной терапии и иммунотерапии.

Определения

Если контекст явно не требует иного, во всем описании и формуле изобретения слова «содержать», «содержащий» и т. п. следует толковать во включающем смысле, а не в исключающем или исчерпывающем смысле; то есть в смысле «включая, но не ограничиваясь».

Термин «лечение» и ему подобные в контексте настоящего описания включает облегчение симптомов, связанных с раком, регрессией и/или ремиссией рака. В некоторых вариантах осуществления лечение замедлит, задержит или остановит пролиферацию раковых клеток или метастазирование рака, замедлит, задержит или остановит увеличение размера опухоли, которое в обычных условиях произойдет в результате клеточной пролиферации внутри опухоли, предотвратит дифференцировку клеточной линии, уменьшит размер опухоли или обратит развитие одной или нескольких опухолей, по крайней мере, временно. Лечение может вылечить рак или отсрочить возникновение осложнений. Следовательно, в контексте этого изобретения слово «лечение» или его производные, когда оно используется в отношении терапевтического применения, включает все аспекты терапии, такие как облегчение боли, связанной с раком, подлежащим лечению, облегчение степени тяжести рака, подлежащего лечению, улучшение одного или нескольких симптомов рака, подлежащего лечению, улучшение общего самочувствия субъекта, которого лечат. Следует понимать, что использование слова «лечение» или его производных означает, что субъект, которого «лечат», может испытать одно или несколько из вышеупомянутых видов пользы. В общем, лечение может быть связано с гибелью пролиферирующих клеток, находящихся в раке.

Термин «профилактика» и ему подобные в контексте настоящего описания относится к предотвращению повторного проявления всех или некоторых симптомов, связанных с раком, после ремиссии указанного рака, а также к предотвращению образования одного или нескольких видов рака, вызванных, например, метастазированием рака. Профилактика может предотвратить осложнения из-за одного или нескольких видов рака или отсрочить осложнения из-за одного или нескольких видов рака. В общем, профилактика может быть связана со смертью пролиферирующих клеток, которые могут вызвать рак или вызвать его распространение или повторное проявление.

В контексте этого описания термин «примерно» будет пониматься как указывающий на обычные допуски, которые квалифицированный специалист мог бы сделать для данного значения.

В контексте этого описания, где для параметра указывается диапазон, следует понимать, что параметр включает в себя все значения в пределах указанного диапазона, включая указанные крайние точки этого диапазона.

В контексте настоящего изобретения термин «субъект» относится к животному, предпочтительно к млекопитающему, наиболее предпочтительно к человеку, которое испытало и/или у которого проявился по меньшей мере один симптом, связанный с раком. Обычно субъектом является индивид, болеющий раком, и он находится под клиническим наблюдением врача-терапевта. Субъект может быть человеком или не-человеком, так что ссылка на субъект или индивид означает человека или не-человека, такого как индивид любого вида, имеющего социальную, экономическую или исследовательскую важность, включая, помимо прочего, членов классификаций овец, крупного рогатого скота, лошадей, свиней, кошачьих, псовых, приматов, грызунов, особенно одомашненных представителей этих классификаций, таких как овцы, домашний рогатый скот, лошади и собаки. Кроме того, как используется здесь, «нуждающийся в этом субъект» может дополнительно быть субъектом, у которого не проявлялись какие-либо симптомы рака, но для которого врач, клиницист или другой медицинский специалист определил, что он подвержен риску развития рака. Например, субъект может считаться подверженным риску развития рака (и, следовательно, нуждающимся в профилактике или профилактическом лечении) вследствие истории болезни субъекта, включая, помимо прочего, семейный анамнез, предрасположенность, сопутствующий рак/наличие внешних причин для развития рака.

В контексте настоящего изобретения под «фармацевтически приемлемым эксципиентом или разбавителем» подразумевается любой наполнитель или разбавитель, который не является нежелательным с биологической точки зрения, то есть вещество может быть включено в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению и введено субъекту, не вызывая любые нежелательные или неуместные биологические эффекты, включая, помимо прочего, нежелательную или чрезмерную токсичность, несовместимость, нестабильность, раздражение, аллергическую реакцию и тому подобное. В предпочтительном варианте осуществления эксципиент или разбавитель одобрен или может быть одобрен органом регулирования и контроля (органом регулирования и контроля может быть, например, федеральное правительство или правительство штата), или внесен в Фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею для использования в субъектах.

Краткое описание чертежей

Здесь варианты осуществления изобретения будут описаны только в качестве примера со ссылками на сопровождающие фигуры, подписи к которым представлены ниже:

Фиг. 1. Химическая структура пиронаридина (PND) тетрафосфата.

Фиг. 2 Транскриптомный анализ возможных путей, активированных пиронаридином (PND). Подсети для наиболее активированных (отмечены квадратами) генов в ответ на обработку PND клеток HL-60. Корреляционный анализ Пирсона транскрипционной сигнатуры PND по сравнению с сигнатурами, депонированными в проекте LINCS. Отмеченные соединения коррелируют с эффектами PND: чем темнее заливка, тем лучше корреляция.

Фиг. 3 Транскриптомный анализ возможных путей активации пиронаридином (PND) и валидация цели. (А) Подсети для наиболее активированных (отмечены квадратами) генов в ответ на обработку PND клеток MDA-MB-231. Корреляционный анализ Пирсона транскрипционной сигнатуры PND по сравнению с сигнатурами, депонированными в проекте LINCS. Отмеченные соединения коррелируют с эффектами PND: чем темнее заливка, тем лучше корреляция. (B) Анализ SDS-PAGE показывает, что PND вызывает ингибирование активности топоизомеразы II в зависимости от дозировки. Полоса 1 — катенированная кинетопластная ДНК (кДНК); Полоса 2 — декатенированная кДНК; Полоса 3 — линейная кДНК; Полоса 4 — кДНК плюс топоизомераза II; Полоса 5 — кДНК плюс топоизомераза плюс 5 мкМ PND; Полоса 6 — кДНК плюс топоизомераза плюс 50 мкМ PND; Полоса 7 — кДНК плюс топоизомераза плюс 500 мкМ PND; Полоса 8 — кДНК плюс топоизомераза II плюс 1 мМ этопозоида (ингибитор Topo II); Полоса 9 — кДНК плюс топоизомераза II плюс PBS; Полоса 10 — кДНК плюс топоизомераза II плюс DMSO.

Фиг. 4. Исследование молекулярного докинга PND. Предсказанное взаимодействие аминокислотных радикалов PND и хинакрина на киназе гликогенсинтазы-3β (A), и PND, специфически взаимодействующий в предсказанном связывающем кармане GSK3β (B).

Фиг. 5. Цитотоксическая концентрация PND 50% (CC50) и индекс селективной цитотоксичности (SCI) в группе клеточных линий человека. SCI рассчитывали следующим образом: SCI = CC50 незлокачественных клеток / CC50 раковых клеток.

Фиг. 6. Характерные кривые доза PND–ответ, использованные для определения значений CC50. Для этих анализов клетки подвергали воздействию PND в течение 72 часов, и их жизнеспособность определялась с помощью анализа DNS. В качестве примера, MDA-MB-231 (A) и HL-60 (B) обрабатывали градиентом концентрации PND, как показано на оси Y; на оси X показан процент цитотоксичности (мертвых клеток). В эту серию экспериментов было включено несколько видов контроля: разбавитель PND — PBS, — содержащийся в экспериментальных образцах (0,5% об./об.); в качестве негативного контроля — необработанные клетки; и в качестве позитивного контроля цитотоксичности — 1 мМ H₂O₂. Каждая экспериментальная точка представляет собой среднее значение четырех повторяющихся результатов, и доверительные интервалы — их соответствующее стандартное отклонение. Цитотоксическая концентрация 50% (CC50) в микромолярных (мкМ) единицах определяется как концентрация PND, необходимая для нарушения плазматической мембраны 50% популяции клеток после 72 часов инкубации.

Фиг. 7 Вызванная PND экстернализация фосфатидилсерина на раковых клетках MDA-MB-231 (A) и HL-60 (B) через 24 часа инкубации. Механизм клеточной смерти изучали после двойного окрашивания клеток аннексином V-FITC и PI и контролировали с помощью проточного цитометра. (A-B) Общий процент клеток, испытывающих апоптоз (ось Y), выражается как сумма ранних и поздних стадий апоптоза (зеленые столбцы); тогда как клетки, окрашенные только PI, будучи отрицательными к аннексину V-FITC, считали популяцией некротических клеток (черные столбцы). Расчеты двустороннего парного t-критерия Стьюдента для клеток, обработанных PND, по сравнению с контролем по обработанным PBS (*) и необработанным (‡) клеткам, стабильно давали значения P <0,001 в обоих случаях. Каждый столбец представляет собой среднее значение трех результатов, а доверительные интервалы — стандартное отклонение. PND оказывал цитотоксическое действие посредством деполяризации митохондриальной мембраны на клетках MDA-MB-231 (C) и HL-60 (D). Клетки обрабатывали PND в течение 6 ч и отслеживали изменения потенциала митохондриальной мембраны (ΔΨm) с помощью их окрашивания JC-1 — образующим агрегаты липофильным флуорохромным реагентом — и исследовали с помощью проточного цитометра. Реагент JC-1 излучает зеленый флуоресцентный сигнал после деполяризации митохондрий. (C–D) Изображено процентное соотношение клеток, излучающих зеленый флуоресцентный сигнал, ось Y, в зависимости от различных способов обработки, ось X. В качестве позитивного контроля возмутителя митохондриального мембранного потенциала (ΔΨm) использовали 1 мМ H₂O₂. Каждый столбец представляет собой среднее значение трех повторяющихся результатов, а доверительные интервалы — стандартное отклонение. К тому же анализы двустороннего парного t-критерия Стьюдента для клеток, обработанных PND, по сравнению с контролем по обработанным PBS (*) и необработанным (‡) клеткам, стабильно давали значения P <0,01 и P <0,001 соответственно.

Фиг. 8. PND нарушил профиль клеточного цикла двух раковых клеток: MDA-MB-231 (A-D) и HL-60 (E-H), — а также продемонстрировал индуцированную апоптозом фрагментацию ДНК в зависимости от дозировки. После 72 ч обработки PND, клетки в 24-луночных культуральных планшетах собирали, фиксировали, пермеабилизировали, окрашивали DAPI и анализировали с помощью проточного цитометра. Процентные соотношения для каждой фазы клеточного цикла представлены по оси Y, тогда как различные виды лечения показаны по оси X. Для этой серии экспериментов были задействованы следующие типы контроля: 1 мМ H₂O₂ использовали в качестве агента нарушения клеточного цикла; 0,1% PBS в качестве контроля растворителя; и необработанные клетки. Каждый столбец обозначает среднее значение трех повторяющихся результатов, а доверительные интервалы — их стандартное отклонение. Для сбора и анализа данных анализа использовали детектор FL 9, одноклеточный вентиль и программное обеспечение Kaluza (Beckman Coulter) для проточной цитометрии.

Фиг. 9. В зависимости от дозировки PND вызывал замедление миграции ДНК. Три различных концентрации PND и хинакрина инкубировали индивидуально со 100 нг плазмидной ДНК, и потенциал образования комплексов анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Продукты реакции разделяли электрофорезом в 1% (вес/объем) агарозном геле в буфере трис/ацетат/ЭДТК и окрашивали бромидом этидия. PI и свободную плазмидную ДНК использовали в качестве позитивного и негативного вида контроля подвижности ДНК соответственно. Загрузочные колодцы расположены в верхней части изображения и обозначены двумя синими стрелками (верхний левый и правый углы). Желтая пунктирная линия показывает максимальную подвижность свободной суперспиральной ДНК, использованной в качестве эталона. Три сдвига подвижности ДНК обозначены синими линиями и стрелками (левая часть изображения). Также направление миграции ДНК указано стрелкой (правая часть изображения); от катода (отрицательного) к аноду (положительного). Показано характерное изображение, используемое для наблюдения потенциального образования комплексов ДНК.

Фиг. 10. ДНК тимуса теленка вызвала гипохромный и батохромный эффект на максимумы поглощения PND. УФ-видимое спектрофотометрическое титрование (300-650 нм) PND (22,8 мкМ) в буфере трис/HCl при последовательном добавлении ДНК (10,1 мМ) из тимуса теленка (ТТ). Стрелка указывает на спектральные изменения при добавлении ДНК. (B) Сводные данные титрования в УФ и видимом диапазоне, полученных при взаимодействии PND и ДНК ТТ.

Фиг. 11. PND вызывал увеличение интенсивности положительных и отрицательных полос спектров кругового дихроизма ДНК из тимуса теленка. Изменения спектров кругового дихроизма (КД) ДНК из тимуса теленка (ТТ). ДНК ТТ (150 мкМ) в буфере трис/HCl подвергали КД-анализу через 30 мин (A) или 20 часов (B) инкубации с PND при молярных отношениях 0,03, 0,06, 0,2 и 0,3. Стрелки указывают на спектральные изменения КД ДНК ТТ в градиенте возрастающих концентраций PND. Контрольные спектры КД с тем же градиентом концентрации PND в отсутствие ДНК ТТ при инкубации в течение 20 ч (C). Миллиградусы = мград

Фиг. 12. Лечение мышей PND приводило к уменьшению роста опухоли. Метастатические опухоли рака молочной железы вырастали в среднем больше у контрольных мышей (750 мм³), чем у мышей, получавших PND (430 мм³), и разница была значительной с 1 по 15 день, значение P в t-тесте равно 0,01. На графике (A) дни 1–9 показаны отдельными столбцами (слева направо) для каждой мыши.

Фиг. 13. Лечение с помощью PND увеличивает активность химиотерапевтических препаратов в низких дозах на клеточных линиях рака молочной железы MDA-MB-231.

Пример 1 — Анализ транскриптома

Транскриптомный анализ был проведен для сравнения эффектов PND с известными сигнатурами лекарств с использованием ряда различных клеточных линий.

Клетки HL-60 (400000 клеток / 2 мл / лунку в 6-луночном планшете) обрабатывали 5,6 мкМ или проводили контроль растворителя PBS в течение 6 часов. РНК экстрагировали на следующий день и подвергали анализу полного транскриптома в Центральной лаборатории геномного анализа Техасского университета в Эль-Пасо. Для каждой обработки было выполнено всего три биологических повтора.

Клетки MDA-MB-231 обрабатывали PND и удваивали концентрацию CC50, или контроль растворителя PBS в течение 6 часов. РНК экстрагировали на следующий день и подвергали анализу полного транскриптома.

Чтобы изучить возможный механизм действия (МД) PND, полученные результаты транскриптома для каждой линии клеток сравнивали с данными экспрессии генов из проекта LINCS (http://www.lincsproject.org), который содержит профили экспрессии генов в различных клетках человека, обработанных соединениями одобренными и отозванными Управлением по контролю за пищевыми продуктами и медикаментами США соединениями, а также различными хорошо изученными химическими реагентами. Было высказано предположение, что профиль экспрессии каждого ведущего соединения должен также вызывать ответ экспрессии клеточного гена, соответствующий известному МД лекарств, депонированных в LINCS. Используя этот подход, сигнатуру клеток, обработанных PND, сравнивали с каждым из 476251 профиля геномной сигнатуры в LINCS. Результаты, показанные на фиг. 2 и 3A, дают основание полагать, что PND может быть ингибитором GSK и ингибитором топоизомеразы соответственно. Активность PND как ингибитора топоизомеразы была подтверждена с использованием набора "TopoGen" для анализа топоизомеразы II, результаты можно увидеть на фиг. 3B.

Пример 2 — докинг GSK-3

Кристаллическая структура GSK была получена из банка данных по белкам (50Y4) и использовалась для моделирования взаимодействий с PND и хинакрином (см. Фиг. 4A). Показано, что PND специфически взаимодействует в пределах предсказанного связывающего кармана GSK3β (см. Фиг. 4B). Эксперименты по докингу проводились с использованием GLIDE 5.0 в пакете "Schrodinger Software". Исследования молекулярного докинга показали, что PND может взаимодействовать с GSK3β с высоким значением скоринг-функции докинга (–9,4 ккал/моль), в то время как SB 216763 (из Примера 1; см. Фиг. 2) имел похожее значение скоринг-функции (–9,2 ккал/моль)). Хинакрин продемонстрировал низкие показатели связывания –7,6 ккал/моль, что указывает на то, что боковая группа PND, вероятно, обеспечивает дополнительные контакты в кармане связывания (см. Фиг. 4A), которые позволяют ему лучше связываться с GSK-3.

Пример 3 — Анализ токсичности PND на клетках рака молочной железы и клетках гемобластоза человека.

Лекарственное средство пиронаридин (PND) представляет собой производное бензонафтиридина, первоначально синтезированное в 1970 году в Китайском институте паразитарных болезней, которое используется в Китае уже более 30 лет для лечения малярии. Ранее было показано, что PND ингибирует образование β-гематина, способствуя индуцированному β-гематином лизису красных кровяных телец, на основании исследований Plasmodium falciparum K1, проведенных in vitro. Кроме того, PND ранее тестировался в комбинации с доксорубицином (DOX) на раковых клетках с множественной лекарственной резистентностью (МЛР) K562/A02 и MCF-7/ADR, и было обнаружено, что он увеличивает чувствительность клеток к доксорубицину. Тем не менее, ранее не было определено и не предполагалось, что PND сам по себе имеет эффект в лечении рака.

Материалы и методы

Получение трафосфата пиронаридина — PND

Пиронаридина тетрафосфата (PND; 2-метокси-7-хлор-10[3,5-бис(пирролидинил-1-метил-)4-гидроксифенил]аминобензил-(b)-1,5-нафтиридин; APExBIO, Хьюстон, Техас, США) исходный раствор и разведения PND были свежеприготовлены с использованием фосфатно-солевого буферного раствора Дульбекко (PBS; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) в качестве растворителя. Как исходные растворы, так и их разведения добавляли непосредственно в лунки, содержащие клетки в культуральной среде. Химическая структура тетрафосфата пиронаридина изображена на Фиг. 1.

Клеточные линии и условия культивирования

В этом исследовании было использовано 19 клеточных линий человека: семь линий рака молочной железы человека: MDA-MB-468, MCF-7, T47D, HCC1419, HCC70, MDA-MB-231 (тройной отрицательный) и его метастатическое производное в легкие (LM) — MDA-MB-231 LM2; четыре клетки лейкемии/лимфомы человека: HL-60, Ramos, Jurkat и CEM; три рака яичников человека: Ovcar 8, Ovcar 5 и Ovcar 3; один рак легкого, одна меланома и одна линия клеток поджелудочной железы: A549, A375, Panc-1 соответственно. Кроме того, для целей селективности/сравнения также были включены клеточные линии незлокачественного происхождения: MCF-10A, HS-27. Питательной средой, используемой для MDA-MB-231, MDA-MB-231 LM2, MDA-MB-468, MCF-7, A549, A375, Panc-1 и HS-27, была среда DMEM (Hyclone, Logan UT), тогда как для T47D, HCC-1419, HCC-70, HL-60, Ramos, Jurkat, CEM, Ovcar 8 и Ovcar 5 была среда RPMI-1640 (Hyclone, Logan UT). Соответственно, в культуральные среды DMEM и RPMI добавляли 10% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (FBS: Hyclone), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина (Thermo Fisher Scientific Inc., Рокфорд, Иллинойс, США). Клетки MCF-10A выращивали в среде DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, 10 мкг/мл рекомбинантного человеческого инсулина (Sigma), 0,5 мкг/мл гидрокортизона (Sigma), 20 нг/мл эпидермального фактора роста, 2,5 мМ L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Кроме того, небольшая модификация культуральной среды для клеточных линий HL-60 и Ovcar 3 заключалась в том, что в среду было добавлено 20% FBS (ATCC, Манассас, Вирджиния, США). Кроме того, для клеток Ovcar 3 требовалось 10 мкг/мл рекомбинантного человеческого инсулина (Sigma). Прилипающие клетки, растущие в фазе логарифмического роста при 60-75% конфлюэнтности, отделяли с помощью фермента HyQtase (Thermo Fisher Scientific Inc.), подсчитывали и высевали в 96-луночные планшеты при плотности 10000 клеток в 100 мкл культуральной среды на лунку. Клетки, растущие в суспензии, обрабатывали аналогично описанному выше, за исключением добавления HyQtase. Обычно условия инкубации всех клеток проходила при 37°C в увлажненной атмосфере с 5% содержанием CO2.

Анализ путем дифференциального ядерного окрашивания для количественной оценки клеточной смерти

Для анализа потенциальной цитотоксической активности PND использовали метод дифференциального окрашивания ядер (DNS), который был утвержден для высокопроизводительного скрининга (HTS) с использованием биовизуализации живых клеток. Для этого анализа клетки высевали при плотности 10000 клеток на лунку в 96-луночный планшет в 100 мкл культуральной среды, инкубировали в течение ночи и обрабатывали градиентом концентраций PND в течение 72 часов. За два часа до визуализации в каждую лунку добавляли два флуоресцентных интеркалятора нуклеиновых кислот, Hoechst 33342 и пропидия йодид (PI; Invitrogen); в конечной концентрации 1 мкг/мл каждый. Благодаря своей высокой проницаемости, Hoechst окрашивает все клетки (все мертвые и живые), тогда как PI окрашивает только мертвые или умирающие клетки. Коллажи из 2 на 2 изображений были получены непосредственно для каждой отдельной лунки культуральных планшетов с помощью анализатора многолуночных планшетов IN Cell 2000, системы HTS и системы многопараметрического анализа (HCA) (GE Healthcare Life Sciences, Питтсбург, Пенсильвания, США). Для каждого планшета предусматривались следующие виды контроля: PBS в качестве контроля растворителя, перекись водорода в качестве позитивного контроля на цитотоксичность и необработанные клетки для определения фона токсичности из-за манипуляции с клетками и внутренних факторов, обычно связанных с протоколом культивирования. Каждую точку экспериментальных данных, а также видов контроля, оценивали по трем результатам. Значения цитотоксической концентрации 50% (CC50) рассчитывали на основе уравнения линейной интерполяции. CC50 определяется как концентрация PND, необходимая для нарушения целостности плазматической мембраны 50% популяции клеток по сравнению с клетками, обработанными растворителем.

Расчет индекса селективной цитотоксичности

Индекс селективной цитотоксичности (SCI) обозначает способность данного экспериментального соединения более эффективно убивать раковые клетки при минимальной токсичности для клеток незлокачественного происхождения. Таким образом, SCI для PND рассчитывали следующим образом: SCI = CC50 незлокачественных клеток / CC50 раковых клеток.

Анализ экстернализации фосфатидилсерина с помощью анализа аннексина V/PI

Чтобы определить, происходит ли гибель клеток при воздействии PND через апоптоз или некроз, клетки MDA-MB-231 и HL-60 окрашивали аннексином V-FITC и PI и контролировали с помощью проточной цитометрии. Клетки высевали в 24-луночные планшеты при плотности 100000 для прилипающих клеток MDA-MB-231 и 200000 для клеток HL-60 в 1 мл культуральной среды. После инкубации в течение ночи клетки обрабатывали PND и инкубировали еще 24 часа. Для клеток MDA-MB-231 неприлипшие клетки собирали в пробирку с температурой льда, в то время как прилипшие клетки отделяли с помощью HyQtase (Thermo Fisher) и инкубировали в течение примерно 5 минут при 37°C. Как неприлипшие, так и отделенные клетки, собранные из каждой отдельной лунки, промывали PBS при температуре льда и центрифугировали при 260g в течение 5 минут. HL-60 центрифугировали сразу после периода инкубации по мере их роста в суспензии. Затем клетки окрашивали смесью аннексина V-FITC и PI в 100 мкл связывающего буфера и инкубировали на льду в темноте в течение 15 минут, следуя инструкциям производителя (Beckman Coulter). Наконец, клетки ресуспендировали путем добавления 400 мкл буфера температуры льда для связывания и анализировали проточной цитометрией (Cytomics FC500; Beckman Coulter). Для этой серии экспериментов клетки обрабатывали PBS в качестве контроля растворителя; обрабатывали H₂O₂ в качестве позитивного контроля цитотоксичности; а необработанные были включены и обрабатывались параллельно. Для каждого образца было собрано 10000 событий/клеток, которые анализировали использованием программного обеспечения CXP (Beckman Coulter). Экспериментальные образцы виды их контроля выполнялись одинаково и оценивались по трем результатам. Для получения общего процента апоптотических клеток была рассчитана сумма ранних и поздних стадий апоптоза.

Полихроматический анализ мембранного потенциала митохондрий

Клетки MDA-MB-231 и HL-60 засевали, как описано в предыдущем разделе, и обрабатывали PND в течение 7 часов. После обработки клетки собирали и окрашивали 2 мкМ флуорофора 5,5', 6,6'-тетрахлор-1,1', 3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианина йодида (JC-1) в соответствии с инструкцией производителя (MitoProbe; Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Клетки со здоровыми поляризованными митохондриями способствуют образованию агрегатов JC-1, которые излучают красный сигнал. Клетки с деполяризованными митохондриями демонстрируют зеленый сигнал из-за диспергированных мономеров JC-1. Одновременно были проанализированы аналогичные виды контроля, указанные выше. Сбор и анализ данных были выполнены с использованием программного обеспечения CXP (Beckman Coulter). Каждая точка данных анализировалась по трем результатам.

Анализ переходов между фазами клеточного цикла

Асинхронные культуры в фазе экспоненциального роста клеток MDA-MB-231 и HL-60 в 24-луночных планшетах обрабатывали несколькими дозами PND. После 72 ч инкубации клетки центрифугировали и обрабатывали, как в предыдущем разделе, фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали флуорофором, интеркалирующим в ДНК — 4,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI); эти три этапа были выполнены путем добавления к клеткам 200 мкл среды для выделения отдельных ядер (NIM) - раствора DAPI (Beckman Coulter). Затем клеточную суспензию инкубировали еще 3 мин при комнатной температуре в темноте. Виды контроля, включенные в серию экспериментов, были аналогичны тем, что описаны для вышеупомянутых экспериментов. Для каждого образца собирали приблизительно 20000 событий/клеток с использованием проточного цитометра, оснащенного твердотельным лазером 405 нм (Gallios; Beckman Coulter). Получение и распределение клеточных субпопуляций в каждом аспекте клеточного цикла осуществлялось с использованием программного обеспечения для проточной цитометрии Kaluza (Beckman Coulter). Кроме того, дублеты эффективно устранялись за счет использования гейта для одиночных клеток при получении протокола клеточного цикла.

Анализ сдвига подвижности ДНК

Как правило, экспериментальное соединение, интеркалирующее или связывающееся с двухцепочечной (дц) ДНК, увеличивает молекулярную массу, возникающую в результате образования комплексов, уменьшая его электрофоретическую подвижность в агарозном геле по сравнению с необработанной дцДНК. Чтобы изучить потенциальное взаимодействие между PND и дцДНК, был проведен анализ изменения подвижности ДНК. Каждая реакционная смесь имела общий объем 10 мкл в PBS pH 7,4. PND (Sigma-Aldrich) и хинакрин (Sigma-Aldrich) были протестированы с тремя отдельными концентрациями 1 мкМ, 0,5 мкМ или 0,25 мкМ соответственно. К каждой реакционной смеси добавляли 100 нг плазмидной дцДНК (pCMV-dR8.91; Addgene, Кембридж, Массачусетс, США), затем смесь инкубировали в течение 30 мин при 37°C и останавливали добавлением 2 мкл буфера для загрузки геля 6X и на лед. Взаимодействие потенциального связывания между PND и хинакрином с дцДНК анализировали с помощью электрофореза в 1% (мас./об.) агарозном геле, растворенном в буфере TAE (0,04 М трис-основание, 0,04 М ацетат и 0,001 М ЭДТА) pH 8,0. Для окрашивания комплексов дцДНК к агарозному гелю добавляли бромид этидия в концентрации 0,5 мкг/мл на протяжении всего процесса электрофореза. Миграцию ДНК визуализировали с помощью системы документирования геля, а изображения получали с помощью УФ-трансиллюминатора (Alpha Innotech, Сан-Леандро, Калифорния, США). Хорошо известное флуоресцентное соединение интеркалятора ДНК — йодид пропидия (PI) — было включено в качестве позитивного контроля в дозе 1 мкг на реакцию. В качестве вида контроля, необработанную плазмидную ДНК включали для определения ее нормальной электрофоретической подвижности в геле.

Анализ взаимодействия PND с ДНК из тимуса теленка методом спектроскопии в УФ и видимом диапазоне

Измерения в УФ и видимом диапазоне проводились на спектрофотометре Varian Cary 100. ДНК из тимуса теленка (ТТ) и буферы были приобретены у Sigma Aldrich. Константу связывания PND с ДНК ТТ определяли титрованием по поглощению при комнатной температуре путем поэтапного добавления раствора ДНК ТТ (10,1 мМ; добавления по 5 мкл) в буфер (5 мМ трис/HCl, 50 мМ NaCl, pH=7,39) при наличии 2 мл рабочего раствора PND (22,8 мкМ) в том же буфере. Спектры поглощения регистрировали при 424 нм, и титрование прекращали по достижении насыщения. Для определения аффинности связывания данные были подведены к уравнению Скэтчарда r/Cf=K(nr) (графики McGhee и von Hippel), где r — количество молей PND, связанных с 1 моль ДНК ТТ, n — количество эквивалентных участков связывания, а K — аффинность комплекса для этих участков связывания. Концентрации свободного (Cf) и связанного (Cb) комплексов рассчитывали из уравнения Cf=C (1–α) и Cb=C–Cf соответственно, где C — общая концентрация PND. Долю связанного комплекса (α) рассчитывали из уравнения α=(Af–A)/(Af–Ab), где Af и Ab — поглощаемость свободного и полностью связанного лекарственного препарата на выбранных длинах волн, а A — поглощаемость в любой момент во время титрования. Из график зависимости r/Cf от r определяется константа связывания Kb как наклон графика [16]. Все эксперименты были выполнены в три раза, и значения Kb были усреднены.

Анализ взаимодействия PND с ДНК из тимуса теленка методом спектроскопии кругового дихроизма

Спектры кругового дихроизма (КД) измеряли на спектрополяриметре JASCO-1100, оборудованном ксеноновой лампой (JASCO, Истон, Мэриленд, США). ДНК ТТ и буферы были приобретены у Sigma Aldrich. Исходный раствор ДНК ТТ готовили в буфере трис/HCl (5 мМ трис/HCl, 50 мМ NaCl, pH = 7,39), и его концентрацию (4,325 мМ) определяли спектрофотометрическим методом при коэффициенте молярной экстинкции 6600 М-1 см-1 на длине волны 260 нм. Разведение 150 мкМ готовили в буфере трис/HCl и использовали для экспериментов. Перед использованием исходный раствор PND 2,0 мМ был свежеприготовлен в MQ-воде. Соответствующий объем этого раствора добавляли к 3 мл рабочих растворов 150 мкМ ДНК ТТ для достижения молярных соотношений 0,03, 0,06, 0,2 и 0,3 PND/ДНК. Образцы готовили в трех экземплярах и инкубировали в течение 30 минут и 20 часов. Все спектры кругового дихроизма ДНК ТТ и ДНК/PND были записаны при 25°C в диапазоне 205–380 нм и окончательно скорректированы с помощью контрольного спектра и подавления шума. Окончательные данные — это среднее значение трех экспериментов, выраженное в миллиградусах (мград).

Статистический анализ

Для каждой точки данных представлено среднее значение трех результатов и соответствующие им стандартные отклонения. Статистическая значимость была определена с помощью двусторонних парных t-критериев Стьюдента, и значение P<0,05 считалось значимым.

Результаты

PND проявляет сильную и избирательную цитотоксичность по отношению к линиям раковых клеток

Потенциальные цитотоксические эффекты PND были проанализированы посредством визуализации живых клеток с использованием анализа дифференциального ядерного окрашивания (DNS) на одиннадцати линиях раковых клеток человека и на доброкачественной контрольной клеточной линии (MCF-10A; Фиг. 5). Для каждой отдельной клеточной линии, для определения CC50 PND на этих клеточных линиях были построены кривые доза–ответ, также с использованием анализа DNS. В целом PND оказывал сильную цитотоксичность на все протестированные клетки с постоянными значениями CC50 при низких микромолярных концентрациях, которые варьировались от 1,6 мкМ до 9,4 мкМ (Фиг. 5). Как показано на Фиг. 6A–B, влияние различных концентраций PND на линию клеток трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231 и линию клеток острого промиелоцитарного лейкоза HL-60 показало, что PND имеет значения CC50 1,6 мкМ и 1,9 мкМ соответственно (Фиг. 6А–В). В этих и других анализах необработанные клетки использовали для определения базальных уровней клеток, погибших в результате манипуляций с клетками и культивированием клеток. Обработанные растворителем клетки также использовали в качестве контроля для неспецифической гибели клеток и для целей нормализации, а обработанные H₂O₂ клетки использовали в качестве позитивного контроля на цитотоксичность (Фиг. 6). PND проявил значительный индекс селективной цитотоксичности (SCI) на четырех из шести протестированных линий клеток рака молочной железы: MDA-MB-231, MDA-MB-231 LM2, MDA-MB-468 и MCF-7 — со значениями SCI 4,13, 2,54, 3,88 и 4,13, соответственно, по сравнению с доброкачественными клетками молочной железы MCF-10A (Фиг. 5). Интересно, что значения SCI (<1) не были благоприятными для T47D и HCC-70 со значениями ниже 1 (Фиг. 5). Кроме того, самое высокое значение SCI для протестированных клеток лейкемии/лимфомы соответствовало линии клеток HL-60 со значением SCI 3,5 (Фиг. 5). Кроме того, PND показал значение SCI равный 3 и 3,3 для клеток Ramos и Jurkat, соответственно, но была отмечена низкая селективность для линии клеток CEM (Фиг. 5). Хорошая селективность была обнаружена на линии клеток меланомы (SCI=3,2) и двух из трех исследованных линий рака яичников (SCI=3,9). Однако низкая селективность (<2,0) была обнаружена на линиях рака поджелудочной железы и легких (Фиг. 5). Поскольку PND показал низкие значения CC50 и значительную селективность (SCI> 3) для линий клеток MDA-MB-231 и HL-60, они обе были отобраны для дальнейшего анализа.

PND вызывает экстернализацию фосфатидилсерина на клетках MDA-MB-231 и HL-60.

Чтобы определить, индуцирует ли PND свою цитотоксичность через апоптоз или некроз, клетки обрабатывали двумя различными концентрациями PND в течение 24 часов: 34 мкМ и 68 мкМ для HL-60 и 11 мкМ и 22 мкМ для MDA-MB-231. Затем клетки окрашивали аннексином V-FITC и PI и анализировали с помощью проточной цитометрии. Было обнаружено, что PND вызывает значительную экстернализацию фосфатидилсерина (PS) в обеих клеточных линиях по сравнению с позитивным и негативным видами контроля (P <0,001; (Fig. 7A–B)). PND индуцировал значительную экстернализацию PS в клетках HL-60 в зависимости от дозы, показывая 14,8% и 30,2% апоптотических клеток при 34 мкМ и 68 мкМ, соответственно (P = 0,0033, Фиг. 7A). Кроме того, PND индуцировал более высокий процент экстернализации PS в клетках MDA-MB-231, чем в клетках HL-60, при обеих концентрациях, исследованных с 67,2% и 71,1% аннексин-положительных клеток при 11 мкМ и 22 мкМ, соответственно (Фиг. 7B). Как и ожидалось, обработанные растворителем и необработанные клетки не показали какого-либо значительного увеличения апоптотической или некротической гибели (Фиг. 7A–B). Кроме того, H₂O₂ индуцировал свой цитотоксический эффект посредством апоптоза и некроза на клетках MDA-MB-231 и HL-60 соответственно (фиг. 7A–B). Таким образом, PND индуцировал экстернализацию PS как в клетках MDA-MB-231, так и в HL-60, что является хорошо известным ранним событием в активации апоптоза.

PND вызывает деполяризацию митохондрий в раковых клетках

Ранним биохимическим событием, запускающим внутренний путь апоптоза, является митохондриальная деполяризация, которую можно количественно оценить с помощью полихроматического реагента JC-1 и проточной цитометрии. JC-1 излучает красный или зеленый сигнал флуоресценции, когда митохондрии поляризованы или деполяризованы, соответственно. Следовательно, клетки MDA-MB-231 и HL-60 инкубировали в течение 6 часов с PND и регистрировали статус митохондриального мембранного потенциала (ΔΨm). Как и ожидалось, основываясь на данных экстернализации PS, обе раковые клетки, обработанные PND, показали значительную деполяризацию митохондрий по сравнению с необработанными клетками и клетками, обработанными растворителем (Фиг. 7C-D). Эти результаты показывают, что PND способен вызывать деполяризацию митохондрий в обоих типах раковых клеток, что дополнительно указывает на то, что PND индуцирует клеточную смерть через внутренний путь апоптоза.

PND нарушает профиль клеточного цикла и демонстрирует фрагментацию ДНК на клетках MDA-MB-231 и HL-60

Чтобы изучить, как клетки MDA-MB-231 и HL-60 пролиферируют в присутствии PND, профиль распределения клеточного цикла был исследован с помощью проточной цитометрии (Фиг. 8). Чтобы определить влияние PND на развитие клеточного цикла, была использована стратегия измерения содержанания ДНК в клетке, которое зависит от флуорофора, интеркалирующего в ДНК, возбуждаемого фиолетовым светом, DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол). После обработки клеток MDA-MB-231 PND наблюдалось значительное уменьшение субпопуляции клеток G0/G1, однако этот эффект не наблюдался в клетках HL-60 (Фиг. 8B и F). PND уменьшал субпопуляции S и G2/M как в клетках MDA-MB-231, так и в HL-60 по сравнению с контролем PBS и контролем необработанными клетками (Фиг. 8B-D и F-H). Кроме того, PND вызывал значительную фрагментацию ДНК в зависимости от концентрации в обеих линиях раковых клеток, о чем свидетельствует значительное увеличение субпопуляции sub-G0/G1 (P <0,0005; Фиг. 8A и E). Различия в процентном содержании обоих типов клеток в каждой фазе клеточного цикла между обработанными PBS и необработанными клетками были несущественными. Эти эксперименты показали, что PND нарушает распределение профиля клеточного цикла и индуцирует фрагментацию ДНК (популяция sub-G0/G1) в обоих типах раковых клеток.

ПНД взаимодействует напрямую с дцДНК

Потенциальное взаимодействие между PND и дцДНК исследовали при помощи анализа сдвига подвижности ДНК с использованием плазмидной ДНК в качестве связывающего субстрата и сравнивали со смесью дцДНК и хинакрина — соединения с похожей структурой, хорошо известного интеркалятора ДНК. Когда 1 мМ PND инкубировали с ДНК, наблюдали заметное уменьшение миграции обработанной PND ДНК по сравнению со свободной плазмидной ДНК (сдвиги указаны в левой части Фиг. 9). Приблизительно половина всей введенной ДНК была расположена в загрузочной лунке с минимальной подвижностью в агарозном геле. Кроме того, когда 0,5 и 0,25 мМ PND инкубировали с ДНК, наблюдалось явное снижение подвижности (отмеченное слева на Фиг. 9). Кроме того, обработка PND не приводила к деградации ДНК, судя по отсутствию фрагментов ДНК, меньших, чем у свободной суперспиральной ДНК (Фиг. 9). В предыдущих исследованиях было обнаружено, что хинакрин, вследствие сходной с PND химической структуры, взаимодействует с ДНК путем интеркаляции. Как показано на Фиг. 9, хинакрин вызывал максимальное замедление подвижности ДНК при наивысшей в исследовании концентрации (1 мМ) , о чем свидетельствует смаз, указывающий на комплексы с суперспиральной ДНК. Кроме того, хинакрин вызывал явное замедление подвижности ДНК, как и PND, в исследовании при 0,5 и 0,25 мМ (Фиг. 9). Как и в случае с ДНК, обработанной PND, хинакрин не проявлял активности деградации ДНК (Фиг. 9). PI, который использовали в качестве позитивного контроля связывания ДНК, также вызывал замедление подвижности ДНК. Наши результаты ясно показывают, что PND может напрямую взаимодействовать с ДНК, вызывая сдвиг ее подвижности в агарозных гелях, и по поведению, сходному с поведением хинакрина, можно предполагать, что PND также обладает способностью интеркалировать между основаниями дцДНК.

PND интеркалирует с ДНК, как определено спектрофотометрическим титрованием в УФ и видимой области

Чтобы дополнительно доказать интеркаляционное взаимодействие PND с ДНК ТТ, спектрофотометрическое титрование проводили в буфере трис/HCl. PND демонстрирует сильные полосы поглощения в области 300-500 нм, характерные для переходов между энергетическими уровнями электронов сопряженных ароматических колец. В целом, гипохромные и батохромные эффекты, наблюдаемые на максимумах поглощения в УФ и видимой области, можно считать свидетельством стэкинг-взаимодействий между сопряженными ароматическими системами, которые интеркалируют между азотистыми основаниями ДНК. На Фиг. 10А показаны спектры поглощения PND в исследуемой области при последовательном добавлении ДНК ТТ. Для диагностики взаимодействия соединение-ДНК был исследован максимум поглощения на 424 нм. Полученные результаты показывают значительный гипохромный эффект (39%) и красное смещение на 8 нм. Кроме того, для определения аффинности связывания [8,5 ± 0,7 x 105 M-1] PND с ДНК ТТ использовалось уравнение Скэтчарда. Все данные связывания PND с ДНК ТТ, показанные на рисунке 10B, сопоставимы с данными хорошо известных интеркалирующих агентов с аналогичной структурой и показывают, что PND также может интеркалировать между основаниями ДНК, как предполагает анализ сдвига подвижности.

PND стабилизирует B-конформацию ДНК ТТ, что наблюдается с помощью спектроскопии кругового дихроизма.

Кроме того, были изучены детальные конформационные изменения ДНК с помощью спектроскопии кругового дихроизма в буфере трис/ HCl. Типичный спектр кругового дихроизма ДНК ТТ в ее B-форме показывает положительную полосу с максимумом на 275 нм, связанным со стэкингом оснований, и отрицательную полосу с минимумом на 248 нм, связанную с правосторонней спиральностью. Следовательно, изменения сигналов КД можно отнести к соответствующим изменениям во вторичной структуре ДНК. На Фиг. 11, A и B показан спектр КД ДНК ТT и эффект ее обработки при помощи увеличивающегося количества PND в течение 30 минут и 20 часов соответственно. Полученные результаты показывают, что PND смог увеличить интенсивность как отрицательных, так и положительных полос, в зависимости от концентрации, но ни в одной из них не было значительных красных сдвигов. Эти результаты сопоставимы с ранее опубликованными аналогичными соединениями, и по ним можно предположить, что PND способен стабилизировать правостороннюю B-форму ДНК без значительных конформационных изменений. Тот факт, что такие же спектральные изменения наблюдались спустя 30 минут и 20 часов инкубации, позволяет предположить, что имеющий место тип взаимодействия происходит за несколько минут, подтверждая интеркаляционный способ связывания. Кроме того, положительный сигнал появился в диапазоне 300–340 нм, в области, где ДНК не поглощает свет, что позволяет предположить, что некоторые асимметричные изменения, возможно, индуцируются на PND при связывании с ДНК ТТ, поскольку в отсутствие нуклеиновой кислоты не наблюдается сигнал PND (см. Фиг.10, C).

Обсуждение

Во всех проанализированных линиях раковых клеток было обнаружено, что обработка PND вызывает клеточную смерть при низких микромолярных концентрациях (от 1,6 мкМ до 9,4 мкМ). Помимо того, что PND менее токсичен для доброкачественных клеток (MCF-10A; CC50 равен 6,6 мкМ), PND проявляет благоприятную селективность в отношении нескольких клеток рака молочной железы, по сравнению с доброкачественными клетками, со значением SCI> 2,5. PND также продемонстрировал благоприятные значения SCI (от 1,43 до 3,47) на клетках лейкемии/лимфомы, показав самую высокую селективность в отношении раковых клеток HL-60.

Механизм действия PND был проанализирован на линиях раковых клеток MDA-MB-231 и HL-60. После воздействия токсичного агента клетки могут пройти два основных пути: некроз или апоптоз. Фосфатидилсерин (PS) предпочтительно расположен на внутренней стороне плазматической мембраны, обращен к цитозолю, и когда клетки инициируют путь апоптоза, он перемещается к внешней стороне плазматической мембраны, что является биохимическим признаком апоптоза. Проточная цитометрия выявила этот аспект апоптоза при использовании йодида пропидия и FITC-сопряженного аннексина V, который имеет высокую аффинность к PS. Обработанные PND клетки MDA-MB-231 и HL-60 постоянно проявляли экстернализацию PS, что позволяет предположить, что PND использует путь апоптоза, чтобы проявить свою цитотоксичность в зависимости от дозы.

Кроме того, апоптоз может инициироваться внутренними или внешними биохимическими путями. Критическое биохимическое событие, запускающее активацию внутреннего пути, происходит через деполяризацию митохондрий. Таким образом, клетки MDA-MB-231 и HL-60 подвергали воздействию PND и окрашивали полихроматическим реагентом JC-1, чтобы выяснить, участвует ли деполяризация митохондрий в их механизме индукции клеточной смерти. Полученные данные ясно показывают, что обе линии раковых клеток демонстрируют значительную митохондриальную деполяризацию после воздействия PND, указывая на то, что внутренний путь апоптоза участвует в его цитотоксическом механизме.

Хорошо известная стратегия изучения профиля клеточного цикла основана на количественной оценке содержания ДНК в клетке с помощью проточной цитометрии. При использовании этого подхода можно выделить три фазы клеточного цикла: G0/G1, S и G2/M. Кроме того, независимо от того, какой сигнал инициации используется для активации апоптотического каскада, сигнал смерти в итоге приводит к фрагментации ДНК — поздний биохимический признак апоптоза. При выполнении анализа клеточного цикла с помощью проточной цитометрии клетки, подвергающиеся фрагментации ДНК, легко идентифицировать по наличию субпопуляции sub-G0/G1, отчетливого пика, локализованного слева от гистограмм клеточного цикла. Таким образом, возникновение индуцированной апоптозом фрагментации ДНК, также как и клеточный цикл, анализировали одновременно после инкубации клеток с PND в течение 72 часов. Эти анализы показали, что PND способен нарушать прогрессирование профиля клеточного цикла на клетках MDA-MB-231 и HL-60, обнаруживая несходный образец для каждой клеточной линии. Кроме того, PND вызывал последовательную фрагментацию ДНК как на клетках MDA-MB-231, так и на HL-60, в зависимости от дозы, подтверждая предыдущие результаты, что PND индуцирует апоптоз.

Взаимодействие между ДНК и лекарствами или белками может быть легко обнаружено по замедлению миграции ДНК во время анализа изменения подвижности с помощью электрофореза в геле. В этих анализах связывания ДНК экспериментальные комплексы соединение-ДНК перемещаются медленнее, чем свободная ДНК (контроль ДНК, не соединенной в комплекс), что наблюдается у ДНК с большей молекулярной массой. Кроме того, при инкубации химического соединения с плазмидной ДНК можно определить, есть ли какие-либо негативные эффекты, приводящие к деградации или фрагментации ДНК. Результаты показывают, что PND напрямую взаимодействует с ДНК, поскольку вызывает значительную замедление ДНК в агарозных гелях в зависимости от концентрации, но не приводит к деградации ДНК. Интеркаляционный способ связывания ДНК с PND был подтвержден спектрофотометрическим титрованием в УФ и видимом диапазоне, а также круговым дихроизмом ДНК ТТ. Кроме того, спектры КД свидетельствовали о стабилизации ДНК ТТ в ее B-форме без заметных конформационных изменений при взаимодействии с PND. В совокупности анализ сдвига подвижности, серия экспериментов в УФ видимом диапазоне и КД предоставляют убедительные доказательства того, что PDN связывает ДНК, интеркалируя с азотистыми основаниями ДНК.

В этом доклиническом исследовании результаты показывают, что PND проявляет сильную цитотоксичность при низких микромолярных значениях CC50 и благоприятном индексе селективной цитотоксичности по отношению к группе раковых клеток человека, демонстрируя значительную селективность против клеток трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231 (класс агрессивных опухолей) и клеток лейкоза HL-60. PND и родственные соединения и производные обладают активностью в качестве противораковых лекарственных препаратов, поскольку PND заметно и последовательно оказывает цитотоксическое действие, активируя путь апоптоза, о чем свидетельствуют экстернализация PS, деполяризация митохондрий, фрагментация ДНК и препятствование клеточному циклу. Кроме того, было обнаружено, что PND взаимодействует с ДНК напрямую, вызывая замедление ДНК во время электрофореза в агарозном геле и спектральные изменения в профиле PND в УФ и видимом диапазоне, а также в спектрах КД ДНК, что позволяет предполагать интеркаляционный способ связывания.

Пример 4 — Анализ активности PND при метастатическом раке молочной железы у мышей

Материалы и методы

12 одинаковым мышам с метастатическими клетками рака молочной железы из клеточной линии MDA-MB-231 LM2-LUC4 вводили водный раствор пиронаридина (PND) или плацебо (вода) каждый день с использованием техники принудительного кормления через желудочный зонд. Лечение начинали, когда опухоли достигли размера 150-300 мм³ (то есть в первый день).

В группе, получавшей PND (n=6), всем 6 мышам давали 160 мг/кг с 1 по 9 день. Мыши 2, 4 и 5, получавшие PND, получали 160 мг/кг в течение всего исследования, в то время как мыши 1, 3 и 6, получавшие PND, имели самые большие опухоли в группе на 9-й день, и их дозы были увеличены на 10-й день до 240 мг/кг, и на 13-й день снова до 320 мг/кг. Контрольным мышам (n=6) на протяжении всего исследования давали плацебо. Размер каждой опухоли измеряли ежедневно. Конечной точкой протокола был момент, когда опухоль достигала размера 1500 мм³, после чего проводилась эвтаназия мыши. Для анализа уровень значимости был установлен на уровне P <0,05.

Результаты

Сравнение размеров опухолей с 1 по 9 день показало, что в среднем опухоли вырастали больше у контрольных мышей (750 мм³), чем у мышей, получавших PND (430 мм³). Разница была существенной, значение P t-критерия равно 0,01 (см. Фиг. 12A). Сравнение размеров опухолей с 1 по 15 день (когда все 12 мышей были живы) показало, что в среднем опухоли в группе плацебо вырастали больше, чем в группе, получавшей PND, и разница была существенной, значение P t-теста равно 0,0001 (см. Фиг. 12B).

Наблюдалась значительная разница в продолжительности выживания в пользу группы, получавшей PND, хотя после 15 дня сравнивать стало сложнее из-за увеличения доз у 3 мышей, получавших PND, и из-за эвтаназии мышей с плацебо.

Во время исследования не было сообщений об отрицательных побочных эффектах, кроме дискомфорта при ходьбе после 15-го дня. У всех 6 мышей, получавших PND, примерно на 20-й день появилось пожелтение глаз, кожи, ушей и лап, вероятно, из-за того, что PND является ярко-желтым пигментом. Потери веса, расстройств пищевого поведения или нарушений ухода за собой не наблюдалось. Вскрытие 6 мышей, получавших PND, не показало никаких признаков накопления PND где-либо, включая желудок, кишечник или печень.

Результаты ясно продемонстрировали, что у мышей, получавших PND, метастатические опухоли рака молочной железы вырастали меньше, и мыши жили дольше, чем мыши, получавшие плацебо.

Пример 5 — Анализ активности PND в сочетании с химиотерапией

Материалы и методы

PND добавляли к культурам линии рака молочной железы MDA-MB-231 через 24 часа после того, как клетки обрабатывали выбранными известными коммерческими химиотерапевтическими препаратами, прежде чем клетки анализировали на клеточную смерть. Известно, что каждое из лекарственных препаратов имеет серьезные побочные эффекты при дозах, которые обычно вводят для лечения рака. Доза химиотерапевтических препаратов была снижена до половины, одной четвертой, одной восьмой и одной шестнадцатой начальной дозы, при этом доза PND оставалась прежней. Эффект этих комбинационных терапий измеряли по концентрации каждого соединения, которое должно быть цитотоксичным по крайней мере для 50 процентов раковых клеток (CC50). Для цисплатина, гемцитабина, бортезомиба и MG132 начальная доза (CC50) составляла 95,42 мкМ, 0,44 мкМ, 0,01 мкМ и 0,5 мкМ соответственно, в то время как доза PND оставалась постоянной равной 5,5 мкМ.

Результаты

Результаты, показанные на Фиг. 12, демонстрируют, что совместное введение PND (где PND вводят после химиотерапевтического лекарственного препарата) может значительно снизить количество лекарственного препарата, необходимого для эффективного уничтожения раковых клеток.

Пример 6 — Лечение поздней стадии рака у собак с помощью PND

Материалы и методы

Было проведено открытое исследование для оценки эффективности увеличения продолжительности жизни и оценки безопасности перорального приема тетрафосфата пиронаридина (PND) у пяти неизлечимо больных раком собак.

У подходящих пациентов было злокачественное новообразование, метастатическое или неоперабельное, для которого стандартные лечебные или паллиативные меры не существовали или больше не были эффективными. Из этических соображений лечения неизлечимо больных собак группы плацебо не было.

PND был получен от Mangalam Drugs and Organics, Ltd. и инкапсулирован в желатиновые капсулы для перорального введения дважды в день.

Основным оцениваемым результатом была разница между ожидаемой продолжительностью выживания пациента, оцененной на момент включения в исследование, и его фактической продолжительностью выживания. Вторичными результатами были: противоопухолевая активность, облегчение симптомов, связанных со злокачественными новообразованиями, а также безопасность и переносимость PND.

Исследование на пяти собаках было следующим:

Случай 1, тучноклеточная карцинома: собака (золотистый ретривер), сука, 6 лет, 28,7 кг. Рак был подтвержден гистопатологическим отчетом. В середине мая 2019 года началось введение собаке PND перорально, после которого пациент не получал никаких других противораковых препаратов. На момент включения в исследование ветеринарный врач оценил продолжительность выживания от 4 до 6 месяцев. Пациент получал PND 23 мг/кг/день (325 мг утром и 325 мг вечером).

Случай 2, остеосаркома: Собака (сенбернар), кобель, 5 лет, 49,7 кг. 17 мая 2019 года началось введение PND перорально, после которого пациент не получал никаких других противораковых препаратов. На момент включения в исследование ветеринарный врач оценил продолжительность выживания от 4 до 6 месяцев. Пациент получал PND 20 мг/кг/день (325 мг утром и 650 мг вечером).

Случай 3, веретеноклеточная саркома: собака (бордер-колли), кобель, 9 лет, 28,5 кг. В 2014 году собаке был поставлен диагноз саркома веретеноклеточной структуры низкой степени, и 11 февраля 2019 года ее должны были подвергнуть эвтаназии с ожидаемой продолжительностью выживания 1–2 недели. Вместо этого 11 февраля 2019 года ветеринар начал ввод PND перорально, после которого пациент не получал никаких других противораковых препаратов. Пациент получал PND 15 мг/кг/день (215 мг утром и 215 мг вечером).

Случай 4, неходжкинская лимфома: собака (боксер), сука, 27 кг, 11 лет. Рак был подтвержден отчетом о биопсии. В декабре 2018 года началось введение собаке PND перорально, после которого пациент не получал никаких других противораковых препаратов. Пациент получал PND 15 мг/кг/день (210 мг утром и 210 мг вечером). Однако введение PND прекратился в феврале 2019 года (из-за проблем с доставкой из США в Канаду) и больше не возобновлялся.

Случай 5, тучноклеточная опухоль: собака, кобель, 27,9 кг. Рак был подтвержден гистопатологическим отчетом. Опухоль была удалена с языка хирургическим путем, чистой границы не было. В декабре 2018 года началось введение PND перорально, после которого пациент не получал никаких других противораковых препаратов. Пациент получал PND 15 мг/кг/день (210 мг утром и 210 мг вечером).

Результаты

Случай 1. Сообщений о каких-либо побочных эффектах, связанных с исследуемыми препаратами, не было. В начале исследования были измерены объемы четырех опухолей и сравнивались с последующим измерением. Правый нижнечелюстной узел 2,5 см х 2 см против 2 см х 1 см; левый нижнечелюстной узел 3 см x 2 см против 2,2 см x 1 см; правый подколенный узел (задняя часть колена) 0,5 см x 0,5 см против 0,2 см x 0,2 см; и левый подколенный узел 0,5 см х 0,5 см против 0,2 см х 0,2 см. Собака была все еще жива, и в июне 2019 года произошло облегчение симптомов, связанных со злокачественными новообразованиями, что позволяло вести повседневную деятельность. Во всех случаях при последующих измерениях объем опухоли уменьшился в размерах на клинически значимую величину.

Случай 2. Единственными сообщениями о возможных побочных эффектах, связанных с исследуемым препаратом, были слюнотечение, отек лица и рвота, которые разрешились с помощью дифенгидрамина. Размер опухоли на момент включения в исследование составлял 3,7 см х 2,6 см. По состоянию на июнь 2019 года собака была все еще жива и в хорошей форме, так как облегчение симптомов, связанных со злокачественными новообразованиями, позволяло вести повседневную деятельность.

Случай 3. Сообщений о каких-либо побочных эффектах, связанных с исследуемыми препаратами, не было, за исключением начальной рвоты, которая была под контролем. На момент включения в исследование были измерены объемы трех опухолей: 2 см х 2,5 см; 3 см х 3,8 см; и 3 см х 4 см. При последующем наблюдении объем каждой опухоли уменьшился примерно на 20%. Собака была усыплена в середине мая 2019 года, выживаемость собаки была увеличена на 3 месяца.

Случай 4. Сообщений о каких-либо побочных эффектах, связанных с исследуемыми препаратами, не было. В начале исследования был измерен объем одной опухоли на шее пациента и сравнивался с последующим измерением. К марту 2019 года опухоль уменьшилась на 70%. Собака была усыплена 20 апреля 2019 года, выживаемость собаки была увеличена на 2,5 месяца.

Случай 5. Пациент имел увеличенную левую нижнюю челюсть. В начале исследования был измерен объем одной опухоли и сравнивался с последующим измерением. Размер опухоли остался прежним: 2 см х 1 см против 2 см х 1 см. Собака была все еще жива, и в июне 2019 года произошло облегчение симптомов, связанных со злокачественными новообразованиями, что позволяло вести повседневную деятельность.

Пример 6 — Лечение поздней стадии рака у человека с помощью PND

Материалы и методы

Было проведено открытое исследование с увеличением дозы для оценки продолжительности жизни и оценки безопасности перорального приема тетрафосфата пиронаридина (PND) у пяти неизлечимо больных раком людей с выбранными видами рака. У подходящих пациентов было злокачественное новообразование, метастатическое или неоперабельное, для которого стандартные лечебные или паллиативные меры не существовали или больше не были эффективными. Критерии исключения включали активную клинически значимую инфекцию, неконтролируемое интеркуррентное заболевание, нейтропению и беременность.

PND был получен от Mangalam Drugs and Organics, Ltd, и активный PND был заключен в желатиновые капсулы размера «00» для перорального введения. Каждая капсула содержала либо 125 мг PND и микрокристаллическую целлюлозу с инертным наполнителем (MCC), либо 200 мг PND (без наполнителя).

Перед включением в исследование и перед каждым повышением дозы проверялось, что результаты лабораторных анализов общего анализа крови (CBC) и комплексной метаболической панели (CMP) находятся в пределах нормальных контрольных диапазонов.

Пациентам было предписано увеличить дозу, если не было неприемлемой токсичности. Исследование Arm 1 начиналась с ежедневной дозы 250 мг в течение 2 недель, затем 375 мг в течение 2 недель, затем далее 500. Исследование Arm 2 начиналось с ежедневной дозы 200 мг в течение 2 недель, затем 400 мг в течение 2 недель, затем далее 600 мг. Из этических соображений лечения неизлечимо больных пациентов группы плацебо не было.

Основным оцениваемым результатом была разница между ожидаемой продолжительностью выживания пациента, оцененной на момент включения в исследование (2–4 недели для каждого пациента), и его фактической продолжительностью выживания. Вторичными результатами были: облегчение симптомов, связанных со злокачественными новообразованиями, противоопухолевая активность, а также безопасность и переносимость PND.

Исследование на пяти людях было следующим:

Случай 1, мужчина, 65 лет, опухоль Клатскина печеночного желчного протока (или прикорневая холангиокарцинома), диагностированная в марте 2018 г. 20 декабря 2018 г. пациент начал принимать PND по протоколу по 2 капсулы в день.

Случай 2, мужчина, 43 года, рак легкого, стадия IV, диагностирован в мае 2017 г. Пациенту была назначена химиотерапия с последним курсом в декабре 2018 г., а 22 января 2019 г. он начал принимать PND по 2 капсулы в день.

Случай 3, женщина, 55 лет, рак яичников, стадия IV, диагностирован в июне 2017 г. Пациенту была назначена химиотерапия с последним курсом в ноябре 2018 г., а 15 января 2019 г. она начала принимать PND по 2 капсулы в день.

Случай 4, женщина, 54 года, рак молочной железы, стадия IV, диагностирован в сентябре 2017 г. 20 января 2019 г. пациент начала принимать PND по 2 капсулы в день

Случай 5, женщина, 40 лет, мелкоклеточный рак легкого, стадия IV, диагностирован в апреле 2017 г. пациенту была назначена химиотерапия с последним курсом в декабре 2018 г., а 29 января 2019 г. она начала принимать PND по 2 капсулы в день.

Результаты

Случай 1. Сообщений о каких-либо побочных эффектах, связанных с исследуемыми препаратами, не было. В июне 2019 года пациент был еще жив, его последние результаты CBC и CMP находились в пределах нормы, а облегчение симптомов, связанных со злокачественными новообразованиями, позволяло вести повседневную деятельность.

Случай 2. Сообщений о каких-либо побочных эффектах, связанных с исследуемыми препаратами, не было. Пациент скончался 22 февраля 2019 года от рака легкого.

Случай 3. Сообщений о каких-либо побочных эффектах, связанных с исследуемыми препаратами, не было. Пациент скончалась 29 января 2019 года от рака яичников.

Случай 4: Пациент скончалась 15 февраля 2019 года от рака молочной железы.

Случай 5: Единственным сообщением о нежелательном явлении, связанном с исследуемым препаратом, было раздражение кожи в течение первой недели лечения, которое исчезло в течение недели, возможно, оно было связано с исследуемым препаратом. В июне 2019 года пациент был еще жив, ее последние результаты CBC и CMP находились в пределах нормы, а облегчение симптомов, связанных со злокачественными новообразованиями, позволяло вести повседневную деятельность.

PND, кажется, хорошо переносится (максимальная переносимая доза не была достигнута ни для одного пациента), и, поскольку он продлил жизнь 2 из 5 больных раком пациентов, есть основания для адекватных и хорошо контролируемых исследований, ведущих к утвержденному лекарственному препарату от рака на основе PND, повышающего выживаемость без серьезных побочных эффектов.

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и предназначено для лечения или профилактики рака у млекопитающего. Для индукции апоптоза в пролиферирующих раковых клетках осуществляют введение млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пиронаридина (PND) или его фармацевтически приемлемой соли, по меньшей мере каждый второй или третий день в течение по меньшей мере двух недель. Терапевтически эффективное количество PND или его фармацевтически приемлемой соли составляет по меньшей мере 100 мг. Использование изобретения позволяет индуцировать апоптоз в пролиферирующих раковых клетках. 11 з.п. ф-лы, 13 ил., 6 пр.

1. Способ индукции апоптоза в пролиферирующих раковых клетках с целью лечения или профилактики рака у млекопитающего, данный способ включает в себя этап введения этому млекопитающему композиции, содержащей терапевтически эффективное количество пиронаридина (PND) или его фармацевтически приемлемой соли, по меньшей мере каждый второй или третий день в течение по меньшей мере двух недель,

отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество PND или его фармацевтически приемлемой соли составляет по меньшей мере 100 мг, а PND или его фармацевтически приемлемая соль индуцирует указанный апоптоз.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что терапевтически эффективное количество PND или его фармацевтически приемлемой соли составляет от 100 мг до 1000 мг.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что PND или его фармацевтически приемлемая соль вводится по меньшей мере каждый второй день.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что PND или его фармацевтически приемлемая соль вводится по меньшей мере один раз в день.

5. Способ по любому из пп. 1-4, отличающийся тем, что рак представляет собой опухоль, которая является карциномой, выбранной из группы, состоящей из рака поджелудочной железы, мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, мезотелиомы, почки, печени, легкого, включая мелкоклеточный рак легкого и немелкоклеточный рак легкого, рака головы и шеи, пищевода, желчного пузыря, яичников, желудка, шейки матки, щитовидной железы, простаты и кожи, или опухоль, которая является саркомой, выбранной из группы, состоящей из фибросаркомы, рабдомиосаркомы, хондросаркомы, лейомиосаркомы, мезотелиальной саркомы, ангиосаркомы, липосаркомы, или опухоль центральной и периферической нервной системы, выбранной из группы, состоящей из астроцитомы, нейробластомы, глиомы и шванномы, или другие опухоли, выбранные из группы, состоящей из меланомы, семиномы, тератокарциномы, остеосаркомы, пигментной ксеродермы, кератоакантомы, фолликулярного рака щитовидной железы и саркомы Капоши, или жидкость (рак крови), выбранную из группы, состоящей из В-клеточной лимфомы, Т-клеточной лимфомы, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, волосатоклеточной лимфомы, мантийноклеточной лимфомы, миеломы, лимфомы Беркетта, экстранодальных лимфом желудка, молочной железы или головного мозга, миелома плазматических клеток, болезнь Калера, множественная миелома, миелогенный лейкоз, гранулоцитарный лейкоз, лимфатический лейкоз, лимфоцитарный лейкоз и лимфобластный лейкоз.

6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что рак представляет собой опухоль, а PND или его фармацевтически приемлемая соль индуцирует апоптоз в пролиферирующих раковых клетках в опухоли, тем самым уменьшая размер опухоли.

7. Способ по п. 5, отличающийся тем, что рак представляет собой рак молочной железы.

8. Способ по п. 5, отличающийся тем, что рак представляет собой лимфому.

9. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что композиция включает в себя или вводится совместно с терапевтически эффективным количеством химиотерапевтического лекарственного препарата, выбранного из группы, состоящей из абиратерона ацетата, (наб-) паклитаксела, связанного с альбумином, алемтузумаба, алтретамина, аспарагиназы, бендамустина, бевацизумаба, блеомицина, бортезомиба, брентуксимаб ведотина, бусульфана, кабазитаксела, капецитабина, карбоплатина, кармустина, цетуксимаба, хлорамбуцила, цисплатина, кладрибина, кризотиниба, циклофосфамида, цитарабина (Ara-C), дакарбазина, дактиномицина, дазатиниба, даунорубицина, дауноксома (липосомальный даунорубицин), депоцита (липосомальный цитарабин), доцетаксела, доксила (липосомального доксорубицина), доксорубицина, эрибулина мезилата, эрлотиниба, эстрамустина, этопозида, эверолимуса, флоксуридина, флударабина, фторурацила, гефитиниба, гемцитабина, пластинок Глиадел, гидроксимочевины, ибритумомаба, ибритумомаба, идарубицина, ифосфамида, иматиниба, ипилимумаба, иринотекана, иксабепилона, лапатиниба, леналлидомида, ломустина, мехлорэтамина, мелфалана, меркаптопурина, метотрексата, митомицина, миоксантрона, MG132, нилотиниба, оксалиплатина, паклитаксела, панитумумаба, пазопаниба, пегинтерферона альфа-2b, пеметрекседа, пентостатина, пралатрексата, прокарбазина, ритуксимаба, ромидепсина, руксолитиниба, сипулеуцелина-Т, сорафениба, стрептозоцина, сунитиниба, темозоломида, темсиролимуса, тенипозида, талидомида, тиогуанина, тиотепа, топотекана, тозитумомаба, валрубицина, вандетаниба, вемурафениба, винбластина, винкристина и винорелбина или их комбинации.

10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что химиотерапевтический лекарственный препарат выбран из группы, состоящей из бортезомиба, цисплатина, гемцитабина и MG132.

11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что химиотерапевтический лекарственный препарат представляет собой цисплатин.

12. Способ по п. 10, отличающийся тем, что химиотерапевтический лекарственный препарат представляет собой гемцитабин.