ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS ALCALIGENES MEV, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ, ГРУНТОВЫХ И ПОВЕРХНОСТНЫХ ВОД ОТ НЕФТИ И ПРОДУКТОВ ЕЕ ПЕРЕРАБОТКИ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C02F3/34 B09C1/10 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к области микробиологии и представляет собой новый бактериальный штамм, который может быть использован для очистки почвы, грунтовых и поверхностных вод от нефти и продуктов ее переработки.

Загрязнение окружающей среды нефтью и продуктами ее переработки представляет серьезную угрозу здоровью населения и природе. Тяжелые фракции нефти, токсичные и наиболее трудно разлагаемые, содержат полициклические ароматические углеводороды (ПАУ). ПАУ относятся к категории приоритетных загрязнителей окружающей среды.

Известны штаммы микроорганизмов: Pseudomonas alcaligenes E7 [1], Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР N 103 [2], Pseudomonas alcaligenes B-1 [3], Mycobacterium flavescens EX-91 [4], Rhodococcus species 56Д [5], Pseudomonas putida 9 [6], Rhodococcus species MFN [7], которые могут разлагать углеводороды нефти, в том числе и ПАУ в почве и воде. Недостатком вышеперечисленных штаммов является то, что они осуществляют деструкцию полициклических ароматических углеводородов, содержащих только 2 и 3 бензольных кольца.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes E7 [1], обладающий высокими характеристиками по биодеградации нефти и нефтепродуктов. Однако недостатком этого штамма является то, что из полициклических ароматических углеводородов он утилизирует только нафталин при температуре 20-30°С.

Цель изобретения состоит в получении нового штамма микроорганизмов, быстро и эффективно утилизирующего in situ в почвах, грунтовых и поверхностных водах нефть и продукты ее переработки при комбинированном загрязнении солями тяжелых металлов, а также продуцирующего внеклеточные биологические поверхностно активные вещества (биосурфактанты), которые ускоряют биодеградацию малорастворимых гидрофобных ПАУ.

Предлагаемый штамм Pseudomonas alcaligenes MEV выделен из ризосферы пшеницы и селекционирован путем пересевов отдельных колоний бактерий на чашках с минимальным агаром А [8], который содержит (г/дм²: Na₂HPO₄ × H₂O - 6,0; КН₂РO₄ - 3,0; NaCl - 0,5; NH₄Cl - 1,0; Mg₂SO₄ × 7Н₂О - 0,3; CaCl₂ × 2H₂O - 0,01; агар-агар - 15,0; вода дистиллированная - до 1 дм³; рН - 7,2; в присутствии фенантрена в количестве 300 мг на 1 дм³ питательной среды.

Штамм Pseudomonas alcaligenes MEV идентифицирован в соответствии с определителем Берга [9] и депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером ВКПМ В-8278.

Предлагаемый штамм характеризуется следующими морфологическими и физиолого-биохимическими признаками. Грамотрицательные подвижные палочки размером 2-3 × 0,6-0,8 мкм, спор не образует. На агаризованной питательной среде из кислотного гидролизата рыбной муки на вторые сутки образуются плоские матовые колонии диаметром 2-3 мм. В бульоне из кислотного гидролизата рыбной муки растет в виде пленки и равномерного помутнения.

Штамм является аэробом, обладает оксидазной и каталазной активностью, растет в температурном диапазоне от 8 до 41°С, оптимум 26°С. В качестве источника углерода потребляет ацетат, цитрат, сукцинат, аланин, аргинин. Обладает аргининдигидролазной активностью, восстанавливает нитраты, денитрификационная активность отсутствует. Прототроф, в дополнительных факторах роста не нуждается. Гидролизует желатин, обладает лецитиназной и уреазной активностью. Не гидролизует крахмал и поли-β-оксибутират.

Штамм непатогенен (невирулентен, нетоксичен, токсигенностью не обладает). На штамм оформлено заключение о безопасности.

Генетические особенности. Культура устойчива к пенициллину 50 мкг/см³, канамицину – 50 мкг/см³. Штамм устойчив к ионам тяжелых металлов: Pb, Zn, Mo, Fe - 120 мг/дм³, Сr - 600 мкг/ дм³.

Культура использует в качестве единственного источника углерода нефть, нефтепродукты, полициклические ароматические углеводороды, содержащие 2, 3 и 4 бензольных кольца (нафталин, фенантрен, антрацен, флуорантен), а также фенол (таблица 3).

Штамм продуцирует биологические поверхностно-активные вещества (биосурфактанты). Штамм хорошо растет на богатых питательных средах на основе мясопептонного бульона (МПБ) и ферментативного гидролизата рыбной муки (ФГРМ).

Условия хранения: в лиофилизированном состоянии при 4°С - 3 года; на агаризованном ферментативном гидролизате рыбной муки при 4°С две недели, в пробирках на скошенном агаре под стерильным вазелиновым маслом при 4° - до года. Штамм может поддерживаться регулярными пересевами (1 раз в 2 недели) на агаризованном ферментативном гидролизате рыбной муки с 300 мг/дм³ фенантрена.

Изобретение поясняется следующими примерами.

Пример 1. Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes MEV выращивают аэробно в жидкой среде на ферментативном гидролизате рыбной муки с 200 мг/л фенантрена на качалке при 200 об/мин и температуре 26±2°С в течение 18 часов. Титр выросшей культуры составляет 2,0 × 10⁹ колонии образующих единиц (КОЕ) на 1 см питательной среды.

Пример 2. Штамм Pseudomonas alcaligenes MEV выращивают на синтетической среде следующего состава, г/дм³: (NH₄)₂HPO₄ - 0,5; КН₂РO₄ - 0,7; NaCl - 0,5; MgSO₄·7H₂O - 0,8; дистиллированная вода - до 1 дм³; рН 7,2. Нефть, мазут, дизельное топливо добавляют в питательную среду в количестве 1% от массы питательной среды в качестве единственного источника углерода. Опыт проводят в четырех повторностях. В колбы объемом 100 см³ вносят по 30 см³ минеральной среды и по 300 мг нефти, мазута и дизельного топлива. Колбы засевают клетками штамма Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1·10⁷ КОЕ/см³. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с нефтью и нефтепродуктами. Колбы культивируют на качалке при 200 об/мин и 30°С течение 14 суток. Эффективность биодеградации определяют на газо-жидкостном хроматографе. Результаты эксперимента представлены в таблице 1. Полученные результаты показывают, что в течение 5 суток при 30°С штамм MEV утилизирует нефть, мазут и дизельное на %: 72,0, 53,4, 94,3 соответственно.

Пример 3. Предлагаемый штамм культивируют также как в примере 2. Однако культивирование проводят при 20°С. Результаты представлены в таблице 2.

Пример 4. В колбы на 100 см³ вносят по 30 см³ минеральной среды (состав среды указан в примере 2) и по 200 мг нафталина, фенантрена, антрацена, флуорантена, фенола. Колбы засевают культурой Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1·10⁷ КОЕ/см³. В качестве контролей используют незасеянные колбы со средой, а также с изучаемыми веществами. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, температуре 20°С в течение 5 суток. Эффективность биодеградации определяют на газо-жидкостном хроматографе. Результаты экспериментов показывают, что за 5 дней биодеградация нафталина и фенантрена прошла на 100%, а антрацена, флуорантена и фенола на %: 42,4; 62,1 и 46,3 соответственно (таблица 3).

Пример 5. В колбы на 100 см³ вносят по 30 см³ синтетической среды (состав среды указан в примере 2), 300 мг нефти, 15 мг/дм³ солей Pb, Zn, Mo, Fe и Cr 50 мкг/дм³ и клетки штамма Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1·10⁷ КОЕ/см³. Контролем служит засеянная колба с нефтью. Исследуемые колбы культивируют в четырех повторностях на качалке при 28°С и 200 об/мин в течение 5 дней. Результаты эксперимента показывают, что эффективность деградации нефти предлагаемым штаммом в вариантах с солями металлов и без них не отличается (таблица 4).

Пример 6. Культуральную жидкость штамма Pseudomonas alcaligenes MEV, выращенного как в примере 1, отделяют от микробных клеток центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 минут. В качестве биосурфактантсодержащей жидкости в опыте используется культуральная жидкость разведенная дистиллированной водой в 10 раз. Поверхностное натяжение этой жидкости определяют с использованием кольцевого тензио-метра. Контролем служит дистиллированная вода. Результаты определения поверхностного натяжения показывают (таблица 5), что добавление культуральной среды в дистилированную воду приводит к снижению поверхностного натяжения дистиллированной воды с 68,8 дин/см до 31,2 дин/см. Добавление питательной среды в таком же соотношении 1:10 не оказывет влияния на поверхностное натяжение дистиллированной воды. Таким образом, культуральная жидкость предлагаемого штамма содержит биологические поверхностно-активные вещества.

Пример 7. В колбы на 100 см³ вносят по 27 см³ синтетической среды среды и смесь, содержащую по 200 мг нафталина, фенантрена, антрацена, флуорантена. В колбы добавляют по 3 см³ биосурфактантсодержащей кулыуральной среды как в примере 6. Колбы засевают культурой Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1·10⁷ КОЕ/см. В качестве контролей используют колбы со смесью нафталина, фенантрена, антрацена и флуорантена. Культивирование проводят на качалке при 200 об/мин, температуре 20°С в течение 5 суток. Эффективность биодеградации полициклических ароматических углеводородов определяют на газожидкостном хроматографе. Результаты экспериментов показывают (таблица 6), что добавление биосурфактанта повышает эффективность биодеградации ПАУ. Так, за 5 суток в вариантах опыта с добавлением биосурфактанта биодеградация нафталина и фенантрена прошла на 100%, а антрацена и флуорантена на %: 71%, 83% соответственно.

Пример 8. В эксикаторы объемом 3 дм³ с 2 кг дерново-подзолистой почвы вносят 1% по массе нефти, мазута, дизельного топлива и тщательно перемешивают.

Суспензию бактерий штамма Pseudomonas alcaligenes MEV разводят фосфатньм буферньм раствором рН 7,2 и вносят в почву, загрязненную ксенобиотиками из расчета 1·10⁷ КОЕ на 1 г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20°С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в момент начала эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации нефти и продуктов ее переработки предлагаемым штаммом в почве оценивают методом газожидкостной хроматографии. Результаты исследований показывают, что предлагаемый штамм в течение 2 месяцев при температуре 20°С осуществляет деградацию 74% нефти, 63% мазута и 100% дизельного топлива.

Пример 9. Предлагаемый штамм вносят в почву так же как в примере 8. Однако эксперимент проводят при 30°С. Результаты представлены в таблице 8.

Пример 10. В эксикаторы объемом 3 дм с 2 кг дерново-подзолистой почвы вносят 1% по массе смеси нафталина (4 г), фенантрена (4 г), антрацена (4 г), флуорантена (4 г), фенола (4 г) и тщательно перемешивают. Суспензию бактерий штамма Pseudomonas alcaligenes MEV полученную как в примере 1 разводят фосфатным буферным раствором с рН 7,2 до титра 1·10⁸ КОЕ/см³ и вносят в почву, загрязненную ксенобиотиками из расчета 1·10⁷ КОЕ на 1 г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20°С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в начале эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации нефти и продуктов ее переработки предлагаемым штаммом в почве оценивают методом газожидкостной хроматографии. Результаты исследований показывают, что предлагаемый штамм в течение 2 месяцев при температуре 20°С осуществляет деградацию 100% нафталина и фенантрена, 86% флуорантена, 46% антрацена и 63% фенола.

Пример 11. В эксикаторы объемом 3 дм³ с 2 кг дерново-подзолистой почвы вносят 20 г нефти и 15 мг/кг почвы солей Pb, Zn, Mo, Fe, и Сr - 50 мкг/кг и клетки штамма Pseudomonas alcaligenes MEV до концентрации 1·10⁷ КОЕ/г почвы. Почву тщательно перемешивают, увлажняют до 60% от общей влагоемкости и экспонируют при 20°С в течение 2 месяцев. Для анализа образцы почвы отбирают в начале эксперимента и через 2 месяца. Эффективность биодеградации нефти предлагаемым штаммом в почве оценивают методом газожидкостной хроматографии. Контролем служит почва с нефтью и внесенными микроорганизмами. Повторность опыта четырехкратная. Результаты эксперимента показывают, что эффективность деградации нефти предлагаемым штаммом в вариантах с солями металлов и без них не отличается (таблица 10).

Таким образом, преимуществом предлагаемого штамма является то, что он утилизирует при температуре 20 - 30°С нефть, мазут и дизельное топливо в почве и воде от 43,4% до 97,3%, а также полициклические ароматические углеводороды, содержащие от 2 до 4 бензольных колец (нафталин, фенантрен, антрацен, флуорантен). Предлагаемый штамм продуцирует биологические поверхностно-активные вещества, что ускоряет деградацию полициклических ароматических углеводородов в водной среде. Устойчивость штамма к ионам тяжелых металлов расширяет диапазон его применения при очистке территорий от комбинированного загрязнения углеводородами нефти и металлами.

Список литературы

1. Патент России №2134723, кл. C 12 N 1/20. Штамм Pseudomonas alcaligenes E7, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

2. Патент России №2157842, кл. C 12 N 1/26. Штамм Trichoderma lignorum Л-1 ГКМ ВИЗР №103 для окисления углеводородов нефти и нефтепродуктов. - 2000.

3. Патент России №2133770, кл. C 12 N 1/20. Штамм Pseudomonas alcaligenes B-1, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

4. Патент России №92005971, кл. C 12 N 1/20. Штамм Mycobacterium flavescens EX-91, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1996.

5. Патент России №95119734, кл. C 12 N 1/20. Штамм Rhodococcus species 56D, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1998.

6. Патент России №2134722, кл. C 12 N 1/20. Штамм Pseudomonas putida 9, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1999.

7. Патент России №2133769, кл. C 12 N 1/20. Штамм Rhodococcus species MFN, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. - 1998.

8. Дэвис Р., Бодстайн Д., Рот Дж. Методы генетической инженерии. Генетика бактерий. Пер. с англ. под редакцией чл. - корр. АН СССР Р.Б.Хесина. - М: Мир, 1984-176 с.

9. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Ninth Edition. Baltimore, Maryland: Williams&Wilkins, 1994. – 787 р.

Штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes MEV выделен из ризосферы пшеницы, депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, г.Москва под номером В-8278. Штамм утилизирует нефть, мазут, дизельное топливо; полициклические ароматические углеводороды (ПАУ), содержащие от 2 до 4 бензольных колец: нафталин, фенантрен, антрацен, флуорантен; фенол. Он устойчив к ионам тяжелых металлов: Pb, Zn, Mo, Fe, Cr. Культура Pseudomonas alcaligenes MEV продуцирует биологические поверхностно-активные вещества (биосурфактанты). Штамм может быть использован для получения препарата для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от нефти, продуктов ее переработки, а также при комбинированном загрязнении углеводородами нефти и металлами. 10 табл.

Сурфактантобразующий штамм бактерий Pseudomonas alcaligenes MEV депонирован в ВКПМ В-8278, используемый для очистки почв, грунтовых и поверхностных вод от нефти и продуктов ее переработки in situ.