СПОСОБ ОЦЕНКИ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СИНОВИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ КРУПНЫХ СУСТАВОВ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/52 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к ревматологии, ортопедии и травматологии, и может быть использовано при определении активности воспалительного процесса для оценки эффективности проводимой терапии.

Для диагностики воспалительных заболеваний суставов используют многочисленные лабораторные методы, в том числе исследование синовиальной жидкости. В синовиальной жидкости определяют величину рН, физико-химические свойства (вязкость), клеточный состав, содержание лизосомальных ферментов и их ингибиторов, количество общего белка, альбумина, гаптоглобина и т.д. [1, 2, 3, 4].

Наиболее близкими к предлагаемому способу по сущности оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости при заболеваниях крупных суставов, взятым в качестве прототипа, является способ электрохемилюминесцентного (ЭХЛ) определения содержания провоспалительных цитокинов, в котором в качестве метки используется N-гидроксисукцинимидэфир (NHS) рутения (II) трис-бипиридина хелат (TAG-метка) [5]. Измерения ЭХЛ проводят с помощью электрохемилюминометра ORIGEN Analyzer, разработанного фирмой “IGEN Inc.” (USA). Ход определения цитокинов с помошью ЭХЛ метода заключается в следующем. Исследуемую пробу инкубируют с TAG мечеными антителами. После инкубации в раствор добавляют биотинилированные антитела (биотин). К образовавшимся в растворе структурам антиген-антитело (сэндвич) добавляют парамагнитные микробусы, покрытые ковалентно связанным с поверхностью бус стрептавидином. Реакция стрептавидина с биотином приводит к образованию конъюгата бусы/сэндвич. В таком виде конъюгант поступает в камеру люминометра Analyzer. Подвижный магнит притягивает конъюгант к электроду, на поверхности которого протекает реакция электрохемилюминесценции, в результате которой освобождается фотон длиной волны 620 Нм, регистрируемый люминометром. Калибровочная кривая строится по нескольким стандартным разведениям рекомбинантного цитокина. Полученные данные обрабатываются на компьютере.

Подбор соотношения антител для определения цитокинов проводится по схеме: соотношение ТАG:Биотин 1:1, 1:2, 2:1, 2:2 мкг/мл при диапазоне стандартных разведений рекомбинантного цитокина от 0,1 до 100 пг/мл. Для работы используют соотношение антител, при котором получена максимальная чувствительность метода.

Подбор оптимального времени инкубации антител с пробой производят путем варьирования между 30, 90, 120, 180 минутами инкубации. Обычно достаточно 120 минут на первую инкубацию антител с пробами и 30 минут на вторую инкубацию иммунных комплексов со стрептавидиновыми бусами. Подобный протокол подходит в случае работы с пробами синовиальной жидкости доноров, но, производя измерения в кондиционной среде, процедуру необходимо корректировать. В этом случае лучше произвести биотинстрептавидиновую реакцию до инкубации стрептавидиновых бус с пробами, предотвращая таким образом связывание свободного биотина кондиционной среды. ЭХЛ протокол для кондиционной среды: 20-30 минут инкубация смеси антител и стрептавидиновых бус и 90-120 минут инкубация с пробами.

ORIGEN технология предусматривает использование в среднем 30 мкг бус на пробу, что обеспечивает эффективную кинетику образования иммунных комплексов. 1 мг DYNABEADS М-280 связывает, как минимум, 300 ПМОЛ свободного биотина или 5-10 мкг биотинилированных антител. Подбор оптимального количества бус для максимально эффективной кинетики образования иммунных комплексов можно осуществить, использовав несколько их разведений в 20, 30, 40 и 60 мкг на пробу [5].

По росту содержания отдельных цитокинов (например, интерлейкина-1, интерлейкина-6, фактора некроза опухоли-альфа) судят об активности воспалительного процесса в суставах. Однако при этом практически нет возможности говорить об их эффекторных функциях. Для того чтобы выяснить степень реализации эффекторных функций цитокинов необходимо проведение дополнительных не менее дорогостоящих исследований [6]. Характеристика провоспалительного потенциала синовиальной жидкости при использовании данного способа является неполной, односторонней. Кроме того, способ требует наличия электрохемилюминометра ORIGEN Analyzer, разработанного фирмой “IGEN Inc.” (USA), и приобретения дорогостоящих наборов антител, рекомбинантных цитокинов по каждому отдельному цитокину.

Для проведения полной всесторонней оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости и упрощения способа исследуют потенциальную способность синовиальной жидкости больных с воспалительными заболеваниями крупных суставов модулировать кислородзависимый окислительный метаболизм интактных нейтрофилов здоровых доноров с помощью хемилюминесценции и по величине хемилюминесцентного ответа рассчитывают индекс провоспалительной активности.

Способ осуществляют следующим образом.

Синовиальную жидкость, полученную пункцией сустава больных с воспалительными заболеваниями крупных суставов, в количестве 3-5 мл фильтруют через 2 слоя стерильной марли. Общий объем фильтрата доводят до 5 мл средой 199. Жидкость центрифугируют при 2-4°С в течение 15 мин при 6000 об/мин. Супернатант последовательно фильтруют через миллипоровые фильтры “Millipore” (США) с диаметром пор 45 мкм для удаления клеточного дебриса и с диаметром пор 22 мкм для элиминации вероятных микроорганизмов.

В отфильтрованном супернатанте синовиальной жидкости определяют содержание белка по методу Лоури для унифицированного расчета конечного результата на один грамм белка.

Затем в кювету для хемилюминесцентного исследования, содержащую 0,8 мл раствора Хэнкса без фенолового красного, 0,1 мл 10^-3 М люминола (“Serva”, США), вносят по 0,5×10⁶ клеток интактных нейтрофилов здоровых доноров в объеме 0,1 мл. Интактные нейтрофилы получают из лейкоконцентрата (обогащенной лейкоцитами желатинизированной плазмы крови) на двойном градиенте фиколл-верографин. Количество нейтрофилов в клеточной суспензии подсчитывают в камере Горяева с использованием прижизненной окраски раствором метиленового синего в 3% уксусной кислоте (краска Тюрка) для определения жизнеспособности клеток. Для достижения концентрации 5×10⁶ нейтрофилов в 1 мл клеточную суспензию разводят средой 199.

Параллельно с этим во вторую кювету для хемилюминесцентного исследования, содержащую 0,7 мл раствора Хэнкса без фенолового красного, 0,1 мл 10^-3М люминола (“Sigma”, США) и 0,5×10⁶ нейтрофилов доноров, вносят 0,1 мл синовиальной жидкости больного с воспалительным заболеванием крупных суставов. После этого с помощью биохемилюминометра “СКИФ-0301” (СКТБ “Наука”, Россия) регистрируют хемилюминесцентный ответ клеток тест-системы (см. чертеж). Все измерения проводят в триплете. Величину хемилюминесцентного ответа нейтрофилов доноров на тестируемую синовиальную жидкость, отражающего их окислительный метаболизм, определяют по следующей формуле:

,

где И_хл - индекс хемилюминесцентного ответа (имп/Нф/г белка);

I_сж - количество импульсов хемилюминесиентного ответа нейтрофилов при добавлении тестируемой внутрисуставной жидкости;

I_безсж - количество импульсов хемилюминесцентного ответа нейтрофилов без добавления внутрисуставной жидкости;

N - число нейтрофилов доноров;

Р - содержание белка (г/л) в синовиальной жидкости.

И_хл отражает интегральную провоспалительную активность синовиальной жидкости.

Критерии оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости, используемые в предлагаемом способе:

Провоспалительная активность (И_хл) синовиальной жидкости здорового сустава варьирует от 0,2 до 0,5 имп/Нф/г белка и может быть использована в качестве контрольного значения.

Значения И_хл синовиальной жидкости от 0,7 до 1,5 имп/Нф/г белка коррелируют с объективными клиническими параметрами умеренного течения воспалительного процесса в суставе.

Значения И_хл синовиальной жидкости выше 1,5 имп/Нф/г белка коррелируют с объективными клиническими параметрами тяжелого течения воспалительного процесса в суставе с элементами деструкции ткани внутри суставов.

Снижение значений И_хл синовиальной жидкости от 1,5-2 имп/Нф/г белка в процессе и после лечения до 0,5-0,7 имп/Нф/г белка характеризует высокую эффективность проведенной противовоспалительной терапии.

Преимущество заявляемого способа заключается в том, что исследуют не один или несколько компонентов синовиальной жидкости, а цельную синовиальную жидкость, предварительно отцентрифугированную для удаления клеток и последовательно профильтрованную через миллипоровые фильтры с диаметром пор 45 мкм для удаления клеточного дебриса, а для элиминации микробов - диаметром пор 22 мкм.

Кроме этого, способ позволяет выявлять не отдельные факторы и медиаторы воспалительного процесса, а провести интегральную оценку провоспалительной активности синовиальной жидкости, которая по своим свойствам является экссудатом, то есть, в целом, оценить активность воспалительного процесса в пораженном суставе.

Способ апробирован на 168 больных с деформирующими артрозами крупных суставов, лечившихся в ортопедо-травматологическом отделении Областной клинической больницы г.Читы. Интерпретация полученных данных полностью соответствовала клинической картине.

Примеры конкретного выполнения

Пример 1. Больной Ш-ин., 35 лет, поступил 12.11.2001 г. Диагноз: Ревматоидный артрит тазобедренного и коленного суставов. 14.11.2001 г. во время лечебно-диагностической пункции левого тазобедренного сустава была получена синовиальная жидкость. Жидкость исследована по вышеописанной методике. И_хл синовиальной жидкости больного Ш-ина составил 2,23 имп/Нф/г белка. Повторное исследование было проведено 27.11.2001 г. после курса консервативной противовоспалительной терапии, при этом И_хл синовиальной жидкости составил 0,7 имп/Нф/г белка. После курса консервативной терапии у больного отмечено улучшение клинико-лабораторных параметров и 3-кратное снижение провоспалительной активности в синовиальной жидкости.

Пример 2. Больной А-в, 24 года, поступил 6.09.2001 г. Диагноз: Посттравматический артроз правого коленного сустава. 7.09.2001 г. была получена синовиальная жидкость из правого коленного сустава. Оценка провоспалительной активности синовиальной жидкости по предлагаемому способу показала, что И_хл У данного больного составил 1,72 имп/Нф/г белка. 19.09.2001 г. после курса консервативной терапии у больного А-ва на фоне улучшения состояния больного и снижения боли в травмированном суставе была получена синовиальная жидкость, провоспалительная активность которой (И_хл) составила 0,37 имп/Нф/г белка.

Пример 3. Больная М-ева, 37 лет, поступила 14.03.2001 г. Диагноз: Деформирующий артроз тазобедренного сустава 1 стадии. И_хл синовиальной жидкости, полученной 16.03.2001 г., составил 1,57 имп/Нф/г белка. После курса комплексной консервативной терапии (15.04.2001 г.) провоспалительная активность (И_хл) синовиальной жидкости составила 1,1 имп/Нф/г белка. В связи с низкими темпами снижения провоспалительной активности синовиальной жидкости больной М-евой рекомендовано дальнейшее продолжение лечения.

Таким образом, использование предлагаемого способа оценки провоспалительной активности синовиальной жидкости больных с заболеваниями крупных суставов обеспечивает по сравнению с известными способами следующие преимущества: способ более достоверен, так как с его помощью оценивают провоспалительный потенциал ключевых эффекторных клеток воспаления - нейтрофилов, смигрировавших в очаг повреждения в суставах. Кроме того, предлагаемый способ прост в исполнении и более экономичен по сравнению с известными способами, требующими дорогостоящего оборудования и наборов реагентов.

Список литературы

1. Павлова В.Н. Синовиальная среда суставов. - М.: Медицина, 1980. - 296с.

2. Биохимические исследования синовиальной жидкости у больных при заболеваниях и повреждениях крупных суставов. /Пособие для врачей. - М., 1999. - 42 с.

3. Божкова С.А. и др. Изменения перекисно-оксидантного метаболизма при эндопротезировании тазобедренного сустава. /С.А. Божкова, Е.Г. Мамаева, Е.М. Еропкина и др. // Гений ортопедии. - 2000. - №3. - с.42-47.

4. Finals R.S. Mechanism of joint destruction pain and disability in osteoarthritis. // Drugs. - 1996. - V.52, Suppl. 3. - P.14-20.

5. Крысов С.В., Курамшин Д.Х., Силков С.А., Сенников С.В., Козлов В.А. Использование электрохемилюминесцентного метода для количественного определения цитокинов в различных средах. Клиническая лабораторная диагностика, 2000, №12, с.39-43.

6. Fridman W.H., Tartour E. Cytokines and cell regulation. //Molec. Aspects of Med. -1991. -V.18, N1, - P.1 - 90.

7. Lowry О., Rosebrouch N., Farr A., Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. //J.Biol. Chem. - 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

Изобретение относится к области медицины, в частности к ревматологии, ортопедии и травматологии. Способ обеспечивает повышение точности оценки активности воспалительного процесса при заболеваниях крупных суставов и прост в исполнении. Проводят хемилюминесцентное исследование синовиальной жидкости, при этом определяют в ней содержание белка, затем в кювету для хемилюминесцентного исследования вносят интактные нейтрофилы здоровых доноров, полученных из лейкоконцентрата, подсчитывают их количество и параллельно в другую кювету для хемилюминесцентного исследования вносят интактные нейтрофилы доноров (Нф) и синовиальную жидкость больного, регистрируют хемилюминесцентный ответ клеток тест-системы, рассчитывают индекс хемилюминесцентного ответа (И_хл, имп/Нф/г белка) по формуле , где I_сж - количество импульсов хемилюминесцентного ответа нейтрофилов при добавлении тестируемой синовиальной жидкости, I_безсж - количество импульсов хемилюминесцентного ответа нейтрофилов без добавления тестируемой синовиальной жидкости, N - число нейтрофилов доноров, Р - содержание белка (г/л) в синовиальной жидкости, и при значении И_хл, равном 0,7-1,5 имп/Нф/г белка, диагностируют умеренную степень провоспалительной активности синовиальной жидкости, а при значении И_хл выше 1,5 имп/Нф/г белка - тяжелую степень воспалительного процесса в суставе. 1 ил.

Способ оценки активности воспалительного процесса при заболеваниях крупных суставов путем хемилюминесцентного исследования синовиальной жидкости, отличающийся тем, что определяют в синовиальной жидкости содержание белка, затем в кювету для хемилюминесцентного исследования вносят интактные нейтрофилы здоровых доноров, полученных из лейкоконцентрата, подсчитывают их количество и параллельно в другую кювету для хемилюминесцентного исследования вносят интактные нейтрофилы доноров (Нф) и синовиальную жидкость больного, регистрируют хемилюминесцентный ответ клеток тест-системы, рассчитывают индекс хемилюминесцентного ответа (И_хл, имп/Нф/г белка) по формуле

где I_сж - количество импульсов хемилюминесцентного ответа нейтрофилов при добавлении тестируемой синовиальной жидкости;

I_безсж - количество импульсов хемилюминесцентного ответа нейтрофилов без добавления тестируемой синовиальной жидкости;

N - число нейтрофилов доноров;

Р - содержание белка (г/л) в синовиальной жидкости,

и при значении И_хл, равном 0,7-1,5 имп/Нф/г белка, диагностируют умеренную степень провоспалительной активности синовиальной жидкости, а при значении И_хл выше 1,5 имп/Нф/г белка - тяжелую степень воспалительного процесса в суставе.