СОРБЕНТ ДЛЯ АФФИННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЛИКОЗИЛИРОВАННОГО ГЕМОГЛОБИНА Российский патент 2004 года по МПК G01N30/48 B01J20/10 B01J20/22 

Изобретение относится к химии полимеров и может быть использовано в медицине для диагностики сахарного диабета, а именно для аффинного определения гликозилированного гемоглобина.

Известен сорбент аналогичного назначения - агароза с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой (м-АФБК), который используется для определения гликозилированного гемоглобина (Каталог фирмы Glico-Gel Pierce Chemical Company, 1986, p.3-7). Емкость агарозы по лиганду составляет 5-15 мкМ на 1 мл сорбента.

Недостатком сорбента на основе агарозы является то, что кратность использования одной порции сорбента ограничивается 3-6 циклами достоверного количественного определения гликозилированного гемоглобина. Это дорогостоящий сорбент.

Известен сорбент аналогичного назначения - сшитый поливиниловый спирт (носитель) с иммобилизованной м-АФБК, который используется для аффинного определения гликозилированного гемоглобина (Ггб) (Патент РФ № 2093525, МПК С 08 F 30/06, опубл. 20.10.97 г.). Емкость агарозы по лиганду составляет 5-15 мкМ на 1 мл сорбента.

Недостатком сорбента на основе поливинилового спирта также следует считать недостаточное количество достоверных определений Ггб на одной порции сорбента (20-30).

Наиболее близким к предложенному по химическому составу является сорбент на основе кремнезема, содержащий привитые группы м-аминофенилбороновой кислоты, имеющий структурную формулу

(RU 2040963, МПК B 01 J 20/10 от 08.09.1995 г.).

Недостатком указанного сорбента является высокое значение неспецифического связывания белков и гликопротеидов, делающее его низкоэффективным при использовании в качестве сорбента для аффинного определения гликозилированного гемоглобина.

Задача изобретения - повышение эффективности сорбента за счет увеличения селективности связывания гликопротеидов.

Поставленная задача решается сорбентом для аффинного определения гликозилированного гемоглобина на основе кремнезема, содержащим иммобилизованную мета-аминофенилбороновую кислоту, в котором в отличие от прототипа в качестве носителя используется пористый силикагель, модифицированный глицерилпропилсиланом, активированный эпихлоргидрином, причем сорбент имеет следующую формулу:

Введение в соответствии с заявленной сущностью в качестве спейсера (мостика) между силикагелем и м-АФБК глицерилпропилсилана и эпихлоргидрина увеличивает гидрофильность сорбента, в результате чего снижается неспецифическая сорбция гликопротеидов, что приводит к повышению селективности определения гликозилированного гемоглобина.

Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина получают следующим образом.

1) Активация эпихлоргидрином пористого силикагеля, модифицированного глицерилпропилсиланом

2) Реакция связывания активированного носителя с м-АФБК

Подтверждением протекания химической реакции между лигандом (м-АБФК) и носителем, активированным эпихлоргидрином, служит результат иодометрического титрования альдегидных групп носителя, получающихся после его окисления периодатом натрия до и после посадки м-АФБК: количество альдегидных групп после связывания м-АФБК на 14, 2±0,6% меньше их количества, полученного для немодифицированного носителя.

Согласно заявленного для получения сорбента использовали силикагель фирмы "Serva" марки SP-500, модифицированный глицерилпропилсиланом (Л.А.Остерман. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985 г., с.60). Носитель представляет собой микрочастицы силикагеля с общей формулой SiO₂·H₂O, пронизанные порами со средним диаметром 500 ангстрем. Поверхность частиц модифицирована глицерилпропилсиланом за счет реакции между его силанольными группами и поверхностными силанольными группами силикагеля. В результате этой модицикации поверхность носителя теряет сорбционную способность и приобретает поверхностные гидроксильные группы.

Указанное соединение активировали эпихлоргидрином в щелочных условиях для введения на поверхность активных оксирановых групп. Затем проводили связывание с м-АФБК в щелочных условиях за счет реакции аминогруппы м-АФБК с оксирановыми группами, связанными с поверхностью сорбента. Непрореагировавшие оксирановые группы устраняли за счет реакции с моноэтаноламином.

Элементный анализ 30 проб полученного сорбента показал, что содержание бора в нем составляет 0,18±0,04%, что подтверждает его высокую специфическую емкость.

Сущность заявленного изобретения подтверждается примерами.

Пример 1

К 50 мл силикагеля фирмы "Serva" марки SP-500, модифицированного глицерилпропилсиланом, суспендированного в 50 мл дистиллированной воды добавляли 10 мл эпихлоргидрина и 20 мл 2М NaOH, встряхивали в течение 15-18 часов при комнатной температуре в присутствии 0,1 г NaBH₄. Затем активированный носитель промывали 100 объемами дистиллированной воды и 0,1 М карбонатным буфером связывания рН 9,5, после чего добавляли м-АФБК из расчета 20 мг/мл носителя и встряхивали при комнатной температуре в течение 18 часов. Отмытый от избытка м-АФБК сорбент использовали для количественного определения Ггб. По данным элементного анализа сорбент содержит 0,18±0,6% бора. В прототипе содержание бора по результатам элементного анализа составляет 0,12%.

Пример 2

Для определения гликозилированного гемоглобина полученный сорбент помещали в колонку (1 мл) и отмывали стартовым буфером (0,025 М натрий-фосфатный буфер, рН 8,5). Гемолизат готовили добавлением к одному объему отмытых эритроцитов трех объемов 0,02% раствора азида натрия. На колонку наносили 0,1 мл гемолизата. Для связывания пробы ток буфера останавливали на 15 минут и промывали колонку стартовым буфером для сбора негликозилированного гемоглобина. Гликозилированный гемоглобин элюировали буфером, содержащим 200 мМ сорбитола рН 8,5. Полученные фракции №1 и 2 фотометрировали при 414 нм. Содержание гликозилированного гемоглобина определяли по формуле

где ОП(1) и ОП(2) - оптическая плотность при 414 нм фракций №1 и 2 соответственно;

V1 и V2 - объем фракций №1 и 2, мл.

Кратность достоверных определений на полученном сорбенте составила 45-50. При попытке дальнейшего использования порции сорбента происходило достоверное снижение количества связанного гемоглобина в пробах, вероятно, за счет частичного разрушения сорбента и связанного с этим снижения емкости.

Пример 3

Для определения гликозилированного гемоглобина полученный сорбент помещали в колонку (1 мл) и отмывали стартовым буфером (0,025 М натрий-фосфатный буфер, рН 8,5). Гемолизат готовили добавлением к одному объему отмытых эритроцитов трех объемов 0,02% раствора азида натрия. В гемолизате проводили определение количества гликозилированного гемоглобина на хроматографе AUTO A1 СТМНА-8110 (Kyoto, Kagaku Co, Japan). Результат этого определения считали истинным значением содержания гликозилированной формы в пробе. На колонку с испытуемым сорбентом наносили 0,1 мл гемолизата. Для связывания пробы ток буфера останавливали на 15 минут и промывали колонку стартовым буфером для сбора негликозилированного гемоглобина. Гликозилированный гемоглобин элюировали буфером, содержащим 200 мМ сорбитола рН 8,5. Полученные фракции №1 и 2 фотометрировали при 414 нм. Содержание гликозилированного гемоглобина определяли по формуле

Кратность достоверных определений (дающих результат, отличающийся от результата, полученного с использованием хроматографа, не более чем на 5%) на полученном сорбенте составила 45-50. При попытке дальнейшего использования порции сорбента происходило достоверное снижение количества связанного гемоглобина в пробах, вероятно, за счет частичного разрушения сорбента и связанного с этим снижения емкости.

Пример 4

Определение Ггб проводили аналогично примеру 3 с той разницей, что вместо предложенного сорбента использовали сорбент, приготовленный по прототипу. Количество гемоглобина, определенное в пробах, на 90±15% превышало количество гликогемоглобина, определенное на хроматографе AUTO A1 СТМНА-8110 (Kyoto, Kagaku Co, Japan), что свидетельствует о том, что использование этого сорбента для количественного определения гликозилированной формы гемоглобина приводит к недостоверным результатам.

Таким образом, заявленный сорбент на основе пористого силикагеля, модифицированного глицерилпропилсиланом и эпихлоргидрином, с иммобилизованной мета-аминофенилбороновой кислотой обеспечивает 45-кратное определение Ггб с высокой точностью, значительно превышающей точность его определения при использовании сорбента по прототипу.

Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина содержит пористый силикагель, модифицированный глицерилпропилсиланом марки SP-500, активированный эпихлоргидрином, общей формулы

Изобретение обеспечивает получение сорбента с высокой селективностью.

Сорбент для аффинного определения гликозилированного гемоглобина на основе кремнезема, содержащий иммобилизованную метааминофенилбороновую кислоту, отличающийся тем, что в качестве носителя используется пористый силикагель, модифицированный глицерилпропилсиланом, активированный эпихлоргидрином, общей формулы