СПОСОБ ОПТИМИЗАЦИИ ПРОЦЕДУРЫ ОБЩЕЙ УПРАВЛЯЕМОЙ ГИПЕРТЕРМИИ С ТЕМПЕРАТУРОЙ РАЗОГРЕВА 43-44єC ПУТЕМ ИЗМЕРЕНИЯ ПРОТОКОЛА ХИМИОТЕРАПИИ Российский патент 2004 года по МПК A61K31/704 A61B18/04 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии.

Введение. Использование теплового воздействия - Общей Управляемой Гипертермии (ОУГТ) на опухоль в сочетании с химио- или лучевой терапией - доказало свою клиническую значимость (1, 3, 5). Многие исследователи связывают противоопухолевый эффект гипертермии с прямым увеличением цитотоксичности ряда химиопрепаратов (4, 11), модификацией эффекта химиотерапевтических средств (6, 7, 10), активацией гуморального и клеточного иммунитета (8). Наши предшествующие исследования не позволили провести прямую корреляцию между клиническим эффектом от ОУГТ и уровнем IL-1, IL-2, IL-6, FNO. Более того, у больных с распространенными формами рака отмечалась существенная депрессия иммунного ответа после гипертермии. Считается целесообразным (более эффективным) введение химиотерапевтических средств в период максимальной температуры, при этом дозировки препаратов из-за возрастающей общей токсичности приходится снижать в несколько раз (2). В настоящее время появились новые химиотерапевтические препараты, действующие селективно на различные ферментные системы и гены опухолевой клетки (9). Нами не было обнаружено публикаций о включении в протокол гипертермии препаратов, селективно ингибирующих топоизомеразу I.

Материалы и методы. Исследовали экспрессию генов, ответственных за множественную лекарственную устойчивость (МЛУ) (MDR 1/P- гликопротеина, белка множественной лекарственной устойчивости (MRP), глутатион-S-трансферазы-π (GST-π), топоизомеразы-I, II). Материал забирали до процедуры, на вторые, третьи и четвертые сутки после ОУГТ. Для определения уровня мРНК генов лекарственной устойчивости использовали метод полуколичественной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции со специфическими праймерами к последовательностям генов MDR 1, MRP, GST-π, топоизомеразы I, II, а также β-актина, использующегося в качестве внутреннего стандарта. Выделение суммарной РНК проводили из ткани, хранящейся в жидком азоте, методом экстракции фенолом и додецил сульфатом натрия. Качество и полимерность выделенной РНК оценивали с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле, приготовленном на ТВЕ буфере. Спектральные характеристики РНК определяли на спектрофотометре “Hitachi-557”.

Обратная транскрипция и ПЦР. 1 мкг суммарной РНК прогревали с oligo (dT)_12-16 при 65°С 10 мин, охлаждали до комнатной температуры и хранили до реакции на льду. Реакционная смесь для проведения синтеза кДНК по РНК-матрице в 20 мкл содержала 1 мкг суммарной РНК, 0,5 мкг oligo (dT)_12-16, 2 mM MnCl₂, 20 mМ Трис-HCl (рН 8,3), 100 mM KC1, 50 mМ дитиотрейтол, 200 ед. M-MuLV обратной транскриптазы (“Биосан”, Новосибирск). Реакцию проводили при 37°С в течение 1 ч с последующим нагреванием до 95°С 5 мин. После завершения синтеза кДНК 3 мкл реакционной смеси добавляли в смесь для ПЦР объемом 20 мкл, содержащую 200 mM Трис-HCl (рН 8,4), 500 mM KCl, 7,5 mM MgCl₂, 0,2 mM каждого dNTP, по 500 mM прямого и обратного праймеров, 0,7 ед. Taq-полимеразы (“Биосан”, Новосибирск). Амплификацию проводили при следующих условиях: 95°С, 3 мин, затем 35 циклов 95°С, 45 с; 55°С, 1 мин; 72°С, 2 мин β-актин использовался как внутренний стандарт. Длина продуктов составляла для β-актина 290 пар оснований (по), топоизомеразы II 191 (по). Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили в 1,7%-ном агарозном геле в Трис-боратном буфере, гель окрашивали бромистым этидием, фотографировали и проводили денситометрию с помощью компьютерной программы Scan Image. Величину экспрессии каждого гена представляли в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы каждого гена к интенсивности β-актин-специфической полосы (чертеж).

Результаты. Удалось выявить увеличение экспрессии топоизомеразы I, II, мРНК во всех исследуемых гистотипах опухолей на 50-250% от исходного. При этом максимальный уровень экспрессии был зарегистрирован на вторые сутки после ОУГТ, приходя в норму и даже уменьшаясь к 6 суткам после ОУГТ. Также было зафиксировано увеличение экспрессии MDR 1, GST-π, MRP мРНК, которое достигало максимальных значений на вторые сутки после ОУГТ.

Таким образом, использование химиопрепаратов (ингибиторов топоизомеразы I) предпочтительно не в период проведения гипертермии, а в послепроцедурном периоде. Это позволило не только снизить медикаментозную нагрузку в период гипертермии, увеличить безопасность и управляемость процедуры, но и повысить противоопухолевый эффект химиопрепарата, т.к. препарат вводится в эффективной дозировке и оптимальное время (по механизму действия).

Клинические примеры:

1. Больной Т., 46 лет, диагноз: фибросаркома забрюшинного пространства G3T2bN2M1, трижды оперирован по поводу рецидива опухоли забрюшинного пространства с последующими курсами химио- и лучевой терапией. Отмечено прогрессирование основного заболевания. Учитывая резистентность опухоли к ПХТ, решено включить в протокол ПХТ ОУГТ. Гипертермия выполнена по стандартному протоколу с введением химиотерапевтических средств в редуцированной дозировке на максимуме температуры (циклофосфан 200 мг, доксорубицин 20 мг). Объективно отмечен незначительный эффект от гипертермии, выражающийся в уменьшении болевого синдрома, размеры опухоли не изменились. Через 30 дней при МР-томографии выявлено увеличение размеров опухоли, возобновление болевого синдрома, присоединение неврологических расстройств за счет сдавления поясничного нервного сплетения, т.е. выявлено прогрессирование основного заболевания. При первой гипертермии у больного осуществлялся мониторинг количества генов, ответственных за МЛУ, топоизомераз I, II. Было выявлено значительное повышение уровня топоизомераз I, II (более чем на 200%). При этом максимальная экспрессия была выявлена на вторые сутки после проведения гипертермии.

Проведен повторный курс гипертермии. При этом протокол химиотерапии был изменен: А) был использован препарат Кампто (ингибитор топоизомеразы I) в дозе 150 мг/м; Б) протокол химиотерапии начат спустя 36 ч после гипертермии.

При контрольном обследовании (через 28 суток от проведения гипертермии) выявлен регресс опухолевой массы более чем на 50%, исчезновение болевого синдрома и неврологических расстройств. Увеличения общей токсичности, миелосупрессивного эффекта от химиотерапии в данном режиме не отмечено. Проведен сеанс гипертермии по новому протоколу.

2. Больная С, 27 лет, диагноз: рак левой молочной железы T3N2M1, состояние после комбинированной терапии (оперативное вмешательство: мастэктомия, овариоэктомия; 3 курса ПХТ по схеме таксотер+доксорубицин, гормональная терапия: тамоксифен). На контрольном обследовании выявлено прогрессирование основного заболевания - рецидив в месте послеоперационного рубца, метастатическое поражение печени, лимфатических узлов средостения, единичные метастазы в позвоночник. Проведена процедура гипертермии, отличавшаяся тем, что химиопрепараты вводились в отсроченном периоде, через 36 ч после гипертермии. Оценка клинического эффекта через 1 месяц: уменьшение размеров опухолевой массы более 50%, исчезновение болевого синдрома.

К настоящему времени по данной технологии проведено лечение у 20 больных злокачественными опухолями. Клинический ответ оценивался по общепринятым методикам. Стабилизация процесса выявлена у 50% больных, частичный ответ получен в 30% случаев, полный ответ получен у 20% пациентов. Общую и гематологическую токсичность оценивали по общепринятым методикам. Увеличения токсичности от включения в протокол химиотерапии ингибиторов топоизомеразы I после процедуры гипертермии по оригинальной методике мы не выявили.

Литература

1. Кулемин В.В., Котомин С.В., Альбицкий В.Б., Варигин Ю.А. Общая управляемая гипертермия с гипергликемией и химиотерапией с гипотермией мозга при лечении злокачественных опухолей.// Физическая медицина, 1991, т.1, с.21-29.

2. Патент Российской Федерации №2099029 на изобретение “Способ лечения онкологических заболеваний” с приоритетом от 25 апреля 1996 г.

3. Фрадкин С.З., Жаврид Э.А., Залуцкий И.В., Багдаев Ю.М., Фролов Г.Н. Пути повышения эффективности лечения злокачественных опухолей костей.// Материалы 1-го съезда онкологов стран СНГ. Ч.II. М., 3-6 декабря 1996, с.417.

4. Bakhshangeh A., Brun I. et al. Chemotherapie in Kombination mit Ganzkorperhyperthermie bei fortgeschrittenem malignem Pleuramesotheliom. Dtsch Med Wochenschr 2000 Mar 17; 125(11):317-9.

5. Feyerabend Т., Wiedemann G.J., Steeves R. Advanced nonseminomatous derm cell cancer of the testis with brain metastases: feasibiliti of additional brain irradiation and whole body hyperthermia plus chemotherapy. Oncol Rep 2001 Mar-Apr; 8(2):219-23.

6. Katschinski D.M., Wiedemann G.L. et al. Optimization of chemotherapy administration for clinical 41.8 degrees С whole body hyperthermia. Cancer Lett 1997 May 19; 115(2):195-9.

7. Robins H.I., D’Oleire F. et al. Rationale and clinical status of 41.8 degrees С systemic hyperthermia tumor necrosis factor and melphalan for neoplastic disease. Anticancer Res 1997 Jul-Aug 1997; 17(4B):2891-4.

8. Robins H.I., Kuts M. et al. Cytokine induction by 41.8 degrees С whole body hyperthermia. Cancer Lett 1995 Nov 6; 97(2):195-201.

9. Saltz L.B., Cox J.V., Blance C. et al. Irinotecan plus fluouracil and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engi J Med 2000; 343: 905-14.

10. Toyota N., Strebel F.R. et al. Therapeutic efficacy and apoptosis and necrosis kinetics of doxorubicin compared with cisplatin, combined with wholebody hyperthermia in a rat mammary adenocarcinoma. Int J Cancer 1998 May 18; 76(4):499-505.

11. Westermann A.M., Grosen E.A. et al. A pilot study of whole body hyperthermia and carboplatin in platinum-resistent ovarian cancer. Eur J Cancer 2001 Jun; 37(9): 1111-7.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. Способ включает процедуру общей гипертермии с химиотерапией. При этом в качестве химиотерапевтического средства используют ингибитор топоизомеразы-1, который вводят спустя 24-36 ч после гипертермии. Способ позволяет снизить медикаментозную нагрузку в период гипертермии, увеличить безопасность и управляемость процедуры, повышает противоопухолевую эффективность за счет оптимального времени введения препарата. 1 ил.

Способ оптимизации процедуры общей гипертермии с химиотерапией, отличающийся тем, что в качестве химиотерапевтического средства используют ингибитор топоизомеразы-1, который вводят спустя 24-36 ч после гипертермии.