СПОСОБ ПРОМЫШЛЕННОГО ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2004 года по МПК C12N15/17 C12P21/02 

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению рекомбинантного инсулина человека для приготовления лекарственных форм различного срока действия при лечении сахарного диабета.

Инсулин - гормон поджелудочной железы, регулирующий процессы углеводного обмена и поддержание нормального уровня сахара в крови. Потребности в данном препарате не могут быть покрыты инсулином животного происхождения из-за ограниченности сырьевой базы. Кроме того, существует необходимость в использовании при лечении диабета различных препаратов инсулина. Поэтому разработка способов получения инсулина из рекомбинантных штаммов микроорганизмов является актуальной медицинской задачей.

Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, предложенный J.Nilsson с соавторами (1). Способ заключается в культивировании штамма-продуцента Е. coli, продуцирующего проинсулин, содержащий два синтетических IgG связывающих домена стафилококкового белка А. Авторам удалось добиться высокой продуктивности штамма-продуцента за счет использования ими разработанной богатой питательной среды. Выход проинсулина составлял 3 г/л питательной среды. Схема выделения заключалась в разрушении бактериальных клеток, получении телец включения, содержащих проинсулин, растворении телец включения, окислительного сульфитолиза проинсулина, его ренатурации, очистке ренатурированного белка аффинной хроматографией на IgG-Sepharose, расщеплении проинсулина протеолитическими ферментами (трипсином и карбоксипептидазой Б) и заключительной очистке инсулина высокоэффективной обращенно-фазовой жидкостной хроматографией. Недостатками данного способа являются:

использование богатой питательной среды для выращивания микроорганизма, длительное (около 34 ч) время выращивания, высокая себестоимость целевого продукта, обусловленная использованием для очистки аффинного сорбента, дорогого в производстве и недолговечного при промышленном использовании. Недостатком можно также считать использование в технологии получения инсулина детергента Tween 20. Известно, что использование детергентов при выделении белков приводит к их сорбции на белок и присутствию детергента в конечном продукте.

Известен способ получения рекомбинантного инсулина человека, заключающийся в том, что культивируют клетки штамма-продуцента Escherichia coli ДН5α/рVК100, разрушают бактериальные клетки дезинтеграцией, отделяют фракцию телец включения, содержащих гибридный белок, от водорастворимых примесей при помощи центрифугирования, растворяют тельца включения в буфере, содержащем 8 М мочевину, 1 мМ дитиотреитола, 0,1 М трис НСl, рН 8,0, в течение 12-16 ч. Нерастворившиеся примеси удаляют центрифугированием, после чего увеличивают концентрацию дитиотреитола до 10 мМ и восстанавливают дисульфидные связи при 4°С в течение 1 ч. Раствор разбавляют в 5 раз холодной водой, на рН-метре доводят рН до 4,5 и выдерживают 2 ч при 4°С для формирования осадка. Осадок, содержащий гибридный белок, отделяют центрифугированием и ренатурируют, для чего быстро растворяют в холодной воде при рН 10-12, а затем разводят 10 мМ глициновым буфером рН 10,8 и выдерживают при 4°С в течение ночи. После ультрафильтрации раствор подвергают гель-фильтрации на колонке с сефадексом G-50 и элюируют 10 мМ глициновым буфером. Собирают фракции, содержащие гибридный белок, проводят ультрафильтрацию и лиофильно высушивают. Полученный гибридный белок растворяют в 0,08 М трис НСl буфере, рН 7,5 до концентрации 10 мг/мл и расщепляют одновременно трипсином и карбоксипептидазой Б в соотношении 0,3:1:10 (белок карбоксипептидазы Б : белок трипсинат:гибридный белок) при 37°С в течение 30 мин. Затем добавляют изопропанол до 40%. Смесь немедленно подвергают хроматографической очистке на колонке с ДЭАЕ-сефадексом А-25 и элюируют 0,05 М трис НСl буфером, рН 7,5 с 40% изопропанола с линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,1M. После испарения изопропанола концентрацию хлористого натрия увеличивают до 25% и сдвигают рН до 2,0, добавляя 4 N соляную кислоту. Собирают осадок целевого продукта - инсулина (2).

Однако известный способ имеет ряд существенных недостатков.

Использование гель-фильтрации на начальных стадиях вызывает значительные сложности при масштабировании процесса очистки, так как требует больших объемов сорбента. В полученном таким образом материале должны содержаться примеси небелковой природы, о которых не сообщается. Они могут существенно затруднить проведение регенерации сорбента. Известно также, что при расщеплении гибридного белка трипсином наряду с аргинин- и диаргинининсулином образуется и дезтреонининсулин из-за наличия лизина в положении 29 В-цепи инсулина. Разделение дезтреонининсулина и инсулина представляет определенную проблему из-за близости свойств данных полимеров. Авторы не сообщают, анализировалось ли содержание дезтреонининсулина, хотя при столь высоком соотношении трипсин : гибридный белок (1:10) вероятность его накопления в препарате очень велика.

Известен наиболее близкий к заявленному способ получения рекомбинантного инсулина человека, включающий культивирование штамма продуцента E.coli JM109/pPINS07, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка путем осаждения примесных соединений в 40%-ном изопропаноле с последующей хроматографией на КМ-сефарозе, его последовательное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером рН 5,0-6,0, содержащим 8 М мочевину, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого натрия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) с последующей гель-фильтрацией (3).

К недостаткам способа следует отнести использование значительного количества мочевины на стадии хроматографии на СП-сефарозе и использование органических растворителей на стадии выделения рекомбинантного инсулина.

Задачей изобретения является создание промышленной технологии получения высокоочищенного рекомбинантного инсулина человека, позволяющей легко проводить масштабирование процесса и сократить до минимума число технологических операций производства продукта.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе получения рекомбинантного инсулина человека, включающем культивирование штамма-продуцента Escherichia coli, разрушение бактериальных клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок, их растворение в буфере, содержащем мочевину и дитиотреитол, ренатурацию и очистку ренатурированного гибридного белка, его расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и получением целевого продукта, в качестве штамма-продуцента используют штамм Escherichia coli JM109/pPINS07, очистку ренатурированного гибридного белка осуществляют путем осаждения примесных соединений подкислением до рН 4,0-6,0 с последующей хроматографией надосадочной жидкости на КМ-сефарозе, расщепление гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б осуществляют последовательно, при этом продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03-0,1 М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0-6,0, содержащим 3 М мочевины, с элюцией фракций линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 М в стартовом буфере, а полученную после расщепления карбоксипептидазой Б фракцию инсулина очищают методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенных фазах с последующей гель-фильтрацией и выделяют инсулин в присутствии солей цинка.

Разработанная авторами определенная последовательность и сочетание технологических приемов выделения и очистки позволяют получить высокоочищенную субстанцию рекомбинантного инсулина человека с чистотой не ниже 98% и содержанием бактериальных пептидов и проинсулина требуемого уровня (<10 ррМ). При этом активность полученного инсулина составляет не ниже 27,5 Е/мг. В предлагаемом способе все промежуточные стадии получения рекомбинантного инсулина человека не содержат принципиальных сложностей, препятствующих их масштабированию. Используемые реактивы широко доступны, сорбенты выдерживают многократные циклы. Полученная высокоочищенная субстанция инсулина соответствует требованиям отечественной и зарубежных фармакопеи, что позволяет использовать данную технологию в промышленных условиях.

Способ осуществляется следующим образом.

Для получения рекомбинантного инсулина человека используют рекомбинантный штамм бактерии Escherichia coli JM09/рРNS07 - продуцент гибридного полипептида, содержащего проинсулин человека. Штамм депонирован в Центральной коллекции микроорганизмов Российского акционерного общества “БИОПРЕПАРАТ” ЦКМК “Б” под No ЦКМ В-66ИН.

Выращивание посевной и основной культуры рекомбинантного штамма проводят на питательной среде, содержащей в г/л: гидролизат казеина соляно-кислотный - 20, экстракт пекарских дрожжей - 14, двузамещенный фосфат калия трехводный - 6, однозамещенный фосфат калия - 3, сульфат магния - 0,5, натрий хлористый - 5, глюкозу - 10, ампициллин натриевая соль - 0,05, вода очищенная - остальное. Посевной материал используют для засева ферментера общей емкостью 200-1500 л. Для индукции синтеза гибридного белка в середине логарифмической фазы роста вносят 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид. В процессе выращивания концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 40±15%, количество вводимой глюкозы регулируют по уровню растворенного кислорода и рН. После окончания выращивания культуру концентрируют на сепараторе и разрушают на гомогенизаторе Гаулина в 0,1 М трис буфере, содержащем 1,5 М мочевины и 1 мМ ЭДТА. Тельца включения отделяют центрифугированием.

Выделение гибридного белка из гнанул проводят по следующей схеме.

1. Тельца включения растворяют в буфере, содержащем 0,1 М трис, 8 М мочевину, после чего добавляют 5-10 мМ дитиотреитола.

2. Гибридный белок инсулина ренатурируют путем инкубации в 5-10-кратном объеме 0,1 М глицин-NaOH буфера, рН 9-11 при t=10-14°С.

3. Кислотное осаждение проводят доведением рН до 4,0-6,0 раствором НСl. Образовавшийся осадок отделяют микрофильтрацией.

4. Очистку гибридного белка проводят хроматографией на КМ-сефарозе, уравновешенной 0,05 трис-HCl буфером, рН 7,0-7,5. Белок элюируют уравновешивающим буфером, содержащим 0,25 М NaCl и 1,5 М мочевины.

5. Ферментативное расщепление гибридного белка трипсином проводят при соотношении трипсин : гибридный белок - 1:(500-1000). Реакцию останавливают иодкислением соляной кислотой до рН 3,8-4,0.

6. Продукты трипсинолиза хроматографируют на СП-сефарозе, уравновешенной 0,03 М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0, содержащим 3 М мочевину. Сорбированный белок элюируют линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 М в уравновешивающем буфере. Объединяют фракции, содержащие не менее 95% диаргинининсулина.

7. Ферментативное расщепление диаргинининсулина карбоксипептидазой Б проводят при соотношении карбоксипептидаза Б : диаргинининсулин - 1:(500-1000). Реакцию останавливают добавлением кислоты (НСl) до рН 3,8-4,0.

8. Очистку инсулина методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией проводят на стандартном оборудовании.

9. Фракции, содержащие не менее 98% инсулина, объединяют и добавляют 10% уксуснокислый цинк, рН раствора доводят до 6,3-6,5 и образовавшийся осадок центрифугируют. Окончательную очистку инсулина проводят гель-фильтрацией на сефадексе G-50.

Изобретение иллюстрируется следующим примером.

С. Пример приготовления субстанции инсулина на опытно-промышленном оборудовании

С. 1. Выращивание биомассы продуцента, содержащей гибридный белок

Рабочую культуру клеток рекомбинантного штамма Escherichia coli JM109/рРINS07-продуцента гибридного полипептида (белка), содержащего проинсулин человека, хранят в водно-глицериновом растворе в стеклянных или полимерных ампулах при температуре минус 40°С.

На всех стадиях размножения микробных культур используют питательную среду следующего состава (г/л) (см. табл.1).

Опытно-промышленная линия для выращивания биомассы продуцента состоит из качалки-инкубатора на 12 качалочных колб и ферментеров вместимостью 15, 150 и 1500 л. Посевные культуры готовят в количестве 1/10 от объема засеваемой питательной среды. На первом этапе размножения 2 колбы с питательной средой засевают содержимым одной ампулы с рабочей культурой и инкубируют в качалке при 37°С в течение 18 ч. Выращенной культурой засевают 10-12 колб, содержащих по 100 мл питательной среды, и выращивают до оптической плотности (ОП) 4-6 ед (длина волны - 540 нм, длина оптического пути - 10 мм).

Цепь ферментеров, изготовленная по индивидуальному заказу, имеет согласованные геометрические, физические и массообменные характеристики. Управление процессами подготовки питательных сред и проведения культивирования осуществляется по программам, заложенным в компьютеры.

Результаты даны в табл.2.

Для всех посевных культур проводят структурно-морфологический анализ, при котором оценивается не только “чистота” культур, но и морфологическая структура клеток микроорганизма. По результатам анализа принимается решение о возможности дальнейшего использования посевного материала.

Выращивание основной культуры продуцента проводят в ферментере общей емкостью 1500 л. Состав питательной среды и основные условия культивирования такие же, как и для посевных культур, однако для индуцирования биосинтеза гибридного белка на определенной стадии развития культуры в нее вносится индуктор 1-изопропил-β-D-1-тиогалактопиранозид. Максимальное накопление гибридного белка происходит в том случае, когда индукцию гибридного белка провоцируют в середине логарифмической фазы роста. Для выбранных нами условий выращивания это соответствует накоплению биомассы 7-10 ед. ОП. После добавления индуктора выращивание продолжают до образования внутриклеточных включений гибридного белка “телец включения” у 90-95% клеток. Экспресс-контроль процесса накопления “телец включения” (ТВ) осуществляют с помощью фазово-контрастной микроскопии препаратов “раздавленная капля”.

Основные параметры процесса приведены в таблице 3.

После образования ТВ у 90-95% клеток дальнейшее культивирование может привести к частичному лизису клеток и потере накопленного гибридного белка.

Согласно результатам ретроспективного анализа в культурах накапливается до 3 г/л гибридного белка.

С.2. Выделение “телец включения”

Рост культуры в ферментере останавливают путем резкого сокращения интенсивности перемешивания, включая аэрацию, и захолаживания до 10-14°С. Захоложенную культуру концентрируют на сепараторе в 8-10 раз. Получают 100-125 л суспензии, в которую вводят концентрат буфера (на 50 л воды очищенной – 15 кг мочевины, 1,4 кг натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты и 0,9 кг ТРИС буфера).

Забуференную суспензию дважды пропускают через гомогенизатор Гаулина при давлении 700-800 ат. Температура суспензии не должна быть выше 15-20°С, что достигается охлаждением питателя и приемника гомогенизатора.

Гомогенат клеток пропускают через проточную центрифугу (g=18000). Основная масса “телец включения” (не менее 90%) осаждается в роторе центрифуги, а растворимые белки и остатки клеточных стенок сбрасываются из центрифуги в сборник для инактивации. Влажный осадок телец включения, 8-10 кг, выгружают из ротора центрифуги, фасуют в полиэтиленовую тару, замораживают и хранят в морозильнике при температуре минус 40°С. Срок хранения - до 6 месяцев. Потери гибридного белка при выделении “телец включения” не превышают 15%.

С.3. Выделение гибридного белка

В реактор объемом 250 л заливают 100 л буферного раствора, содержащего 8М мочевины, загружают 10-12 кг пасты телец включения и включают перемешивающее устройство. После растворения телец включения добавляют в реактор 0,150 кг дитиотреитола и продолжают перемешивать в течение 10-12 ч.

В реактор с рубашкой объемом 1200 л заливают 900 л глицин-NaOH буфера, рН 9-11 и охлаждают его до температуры 10-14°С, подавая в рубашку захоложенную воду. После того как буфер охладится, начинают насосом подавать в реактор раствор гибридного белка с восстановленными дисульфидными связями. В течение 20-24 ч инкубируют раствор гибридного белка, перемешивая и поддерживая температуру в реакторе 10-14°С.

После того как 75-80% гибридного белка (ГБ) ренатурирует с образованием правильно замкнутых S-S связей (контроль методом ОФ ВЭЖХ), проводят подкисление реакционной среды в реакторе до рН 4,0-5,5 раствором соляной кислоты. Останавливают перемешивание и через 4-5 ч отделяют сформировавшийся осадок на микрофильтрационной установке. Правильно свернутый гибридный белок сорбируют из фильтрата на ионнообменную колонку объемом 8-10 л, заполненную КМ-сефарозой, предварительно уравновешенной 0,05 М трис-НСl буфером, рН 7,0-7,5.

Сорбированный белок элюируют с колонки, пропуская через нее уравновешивающий буфер с добавлением 0,25 М NaCl и 1,5 М мочевины.

Фракции, содержащие гибридный белок с чистотой не менее 95% (ОФ ВЭЖХ), объединяют и используют для дальнейшей работы.

С.4. Триптический гидролиз гибридного белка и выделение диаргинин-инсулина.

Расщепление ГБ трипсином ведут в реакторе из нержавеющей стали, снабженном перемешивающим устройством и рубашкой.

Раствор ГБ в количестве 100-105 л (содержание белка 1-1,2 кг) вносят в реактор, включают перемешивающее устройство и подают в рубашку захоложенную воду с температурой 10-12°С. Через 30-40 мин после того как раствор ГБ охладится до температуры 10-12°С, измеряют показатель рН раствора ГБ и с помощью 1 М раствора трис-(оксиметил)-аминометана доводят его значение до рН 7,5-8,2. Затем в реактор вносят раствор трипсина из расчета, что количество внесенного в реактор трипсина равно 1/500 части от количества ГБ, находящегося в реакторе. Через 100-120 мин останавливают реакцию расщепления ГБ трипсином, подкисляя содержимое реактора соляной кислотой до рН 3,8-4,0.

Полученный раствор наносят на хроматографическую колонку объмом 20 л, заполненную СП-сефарозой, предварительно уравновешенной 0,03 М аммоний-ацетатным буфером, рН 5,0 с добавкой 3 М мочевины.

После нанесения всего раствора из реактора на колонку ее промывают уравновешивающим буфером до достижения базовой линии контрольного проточного денситометра. Сорбированный материал элюируют линейным градиентом хлористого калия от 0 до 0,5 М в уравновешивающем буфере в течение 8 ч.

Объединяют фракции, содержащие диаргинининсулин с чистотой не менее 95% (ОФ ВЭЖХ), и обрабатывают их карбоксипептидазой Б. Обработку карбоксипептидазой Б ведут в реакторе, снабженном мешалкой, рубашкой, датчиками температуры и рН. Раствор диаргинининсулина заливают в реактор, включают перемешивающее устройство и подают в рубашку захоложенную воду с температурой 12-14°С. После достижения раствором диаргинининсулина температуры 12-14°С с помощью 1М раствора трис-(оксиметил)-аминометана устанавливают рН раствора 7,8-8,0 и добавляют раствор карбоксипептидазы Б из расчета на каждый грамм диаргинининсулина 1 мг карбоксипептидазы В, то есть в соотношении 1000:1. Процесс гидролиза ведут 1,5 ч, затем останавливают добавлением кислоты в реактор до рН раствора 3,8-4,0.

С.5. Очистка инсулина методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ОФ ВЭЖХ)

Очистку инсулина методом ОФ ВЭЖХ проводят на стандартном оборудовании Kiloprep 250 фирмы Waters, США или аналогичном оборудовании других фирм. Установка включает в свой состав следующие элементы:

- блок управления,

- двухголовочный мембранный насос высокого давления,

- насос высокого давления для закачки пробы на разделение,

- ультрафиолетовый детектор с переменной длиной волны,

- препаративная колонка с устройством для радиального сжатия,

- пневморегулируемые клапаны потока на выходе,

- компьютер для управления и обработки данных.

Подготовку хроматографической установки к работе проводят согласно инструкции фирмы изготовителя для отдельных блоков и установки в целом.

Для проведения работ устанавливают картридж, заполненный силикагелем с привитой фазой C₁₈ фирмы "Videk", США, в колонку и создают в рубашке колонки давление согласно прилагаемому к картриджу паспорту. Подключают колонку гибкими армированными шлангами к хроматографу. Промывают колонку последовательно раствором 0,1% ТФУ в количестве 2-3 объема колонки, затем 1-2 объемами ацетонитрила (В) и 1-2 объемами воды. Подготовленная таким образом колонка используется на стадии очистки.

В подготовленную колонку, при помощи насоса для подачи пробы, из емкости подают раствор инсулина с предыдущей стадии в количестве 35-40 г белка. Включают программирующее устройство и ведут разделение по следующей программе (см. табл.4).

Регистрацию процесса разделения ведут при 220 нм на проточном спектрофотометре при чувствительности прибора 2,0. Сбор фракций белка ведут при помощи коллектора хроматографа или вручную. Собранные фракции основного пика инсулина анализируются на содержание примесей методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Фракции инсулина, не содержащие примесей дезамидоинсулина, передают на стадию финишной очистки.

С.6. Финишная очистка и кристаллизация инсулина.

Фракции, содержащие не менее 98% инсулина, объединяют в стеклянном реакторе, снабженном рубашкой, датчиками температуры и рН.

Захолаживают содержимое реактора при перемешивании до 10-12°С и добавляют в реактор 10% раствор уксуснокислого цинка из расчета 5 мл 10% раствора уксуснокислого цинка на 1 г инсулина. Затем доводят рН раствора до значения 6,3-6,5 10% раствором аммиака. Мешалку выключают и захоложенную суспензию оставляют на 10-12 ч для созревания осадка. Осадок отделяют на центрифуге при 5000-6000 об/мин при температуре 10-12°С.

Затем проводят очистку инсулина методом гель-фильтрации на колонке размером 250/60, заполненной сефадексом G-50. Колонку уравновешивают 1М раствором уксусной кислоты. Осадок инсулина, полученный на предыдущей стадии, растворяют в 1М растворе уксусной кислоты и доводят до оптической плотности 80-100 оптических единиц при длине волны, равной 277 нм. Перед нанесением раствора инсулина на колонку его фильтруют через мембрану с размером пор 0,22 мкм. Раствор инсулина вводят в верхнюю часть колонки с помощью перистальтического насоса со скоростью 4,8 мл/см² площади поперечного сечения колонки в час. После введения раствора инсулина в колонку подают элюент, 1 М раствор уксусной кислоты, с той же скоростью. Раствор 1 М уксусной кислоты пропускают через колонку с носителем до отсутствия поглощения в ультрафиолетовой части спектра при 277 нм. Фракции белка объединяют в соответствии с хроматографическими зонами на выходной кривой распределения субстанции инсулина, спектрофотометрически определяют содержание белка и биологическую активность, которая составляет не менее 27,5 Ед/мг инсулина.

Таким образом, проведение хроматографической очистки на нейтральных носителях позволяет получить инсулин человека с чистотой не ниже 98% и активностью не ниже 27,5 Ед/мг.

Подлинность полученного целевого продукта подтверждена по следующим параметрам:

- по совпадению времени удержания основного пика целевого продукта и международного референс-стандарта USP (Фармакопея USP 23, США);

- по определению биологической активности целевого продукта (ВФС 42-3045-98), которая составляет не менее 27 Ед/мг;

- по совпадению пептидных карт целевого продукта и референс-стандарта USP. Чистота полученного целевого продукта подтверждена по фармакопее USP 23, США и составила:

- по содержанию целевого продукта, определяемого методом ВЭЖХ, не менее 98%;

- по содержанию проинсулина, менее 10 ррм;

- по содержанию бактериальных пептидов, менее 10 ррм;

- по содержанию дезамидоинсулина, менее 2%.

Источники информации

1. Nilson J., Jonasson P., Samuelsson E., Stahl S., Uhlen M. Integrated production of human insulin and its C-peptide. 1996, Journal of biotechnology, v.48, p.241-250.

2. Chen J. - Q., Zhang H. - T., Ни М. - Н., Tang J.-G. Production of human insulin in an E. coli system with met-lys-human proinsulin as the expressed precursor. Applied Biochemistry and Biotechnology, 1995, v.55, p.5-15.

3. Калинин Ю.Т., Ураков Н.Н., Иванов В.Т. и др. Способ получения рекомбинантного инсулина человека., Патент на изобретение RU 2141531 от 26.05.99.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения рекомбинантного инсулина человека, используемого для приготовления лекарственных препаратов для лечения сахарного диабета. Культивирование штамма продуцента E.coli JM109/pPINS07 осуществляют в промышленном ферментере объемом 200-1500 л. Концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне 40±15%. После разрушения клеток дезинтеграцией тельца включения растворяют в буфере, содержащем 8 М мочевину, затем добавляют дитиотреитол. Ренатурацию гибридного белка инсулина проводят в одну стадию путем инкубации в 5-10-кратном объеме буфера до стадии очистки путем кислотного осаждения. Гибридный белок хроматографируют на КМ-сефарозе. Ферментативное расщепление осуществляют последовательно при соотношении трипсин : гибридный белок и карбоксипептидаза Б : гибридный белок - 1:(500-1000). Между стадиями расщепления гибридного белка трипсином и карбоксипептидазой Б проводят хроматографию на СП-сефарозе. Инсулин очищают методом препаративной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии с последующей гель-фильтрацией и выделением в присутствии солей цинка. Изобретение позволяет упростить получение высокоочищенного рекомбинантного инсулина человека и повысить его выход в промышленном масштабе. 4 з.п. ф-лы, 4 табл.

1. Способ промышленного получения рекомбинантного инсулина человека, включающий культивирование штамма - продуцента E.coli JM 109/рРIНS07 в углеводосодержащей питательной среде, разрушение клеток дезинтеграцией, отделение телец включения, содержащих гибридный белок инсулина, их растворение в буфере, содержащем мочевину, ренатурацию, кислотное осаждение, и очистку гибридного белка хроматографией на КМ-сефарозе, ферментативное расщепление трипсином и карбоксипептидазой Б с последующей очисткой и выделением инсулина, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в промышленном ферментере, при этом концентрацию растворенного кислорода поддерживают на уровне (40±15)%, тельца включения растворяют в буфере, содержащем 8 М мочевину, с последующим добавлением дитиотреитола, ренатурацию белка осуществляют в одну стадию путем инкубации в глицин-NaOH буфере до стадии кислотного осаждения, расщепление гибридного белка проводят последовательно при соотношении трипсин : гибридный белок и карбоксипептидаза Б : гибридный белок - 1:(500-1000), а выделение - кристаллизацией в присутствии солей цинка.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что культивирование осуществляют в промышленном ферментере объемом 200-1500 л.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в процессе культивирования количество вводимой глюкозы регулируют по уровню растворенного кислорода и рН.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что инкубацию гибридного белка проводят в 5-10-кратном объеме глицин-NaOH буфера, рН 9-11.5. Способ по п.1, отличающийся тем, что дитиотреитол добавляют до конечной концентрации 5-10 мМ.