Настоящая заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США серийного №60/132068, поданной 30 апреля 1999 г., заявки PCT/US 99/23573, поданной 8 октября 1999 г. (должна быть опубликована в апреле 2000 г.), и британской патентной заявки серийного №GB-0004695.3, поданной 28 февраля 2000 г.
Настоящее изобретение касается способов получения антигенов и иммуногенов, полученных таким путем антигенов и иммуногенов, а также нуклеиновых кислот от вида бактерий Neisseria meningitidis. В частности, оно касается геномных последовательностей данной бактерии: более конкретно - ее серогруппы В.
Предпосылки
Менингококк Neisseria meningitidis - неподвижная грамотрицательная бактерия-диплококк, являющаяся патогеном человека. Она поселяется в глотке, вызывая менингит, а иногда - сепсис в отсутствие менингита. Она близкородственна гонококку N.gonorrhoeae, хотя важным свойством, отчетливо отличающим менингококк от гонококка, является присутствие полисахаридной оболочки, имеющейся у всех патогенных менингококков.
N.meningitidis вызывает и спорадические, и эпидемические случаи заболевания. В Соединенных Штатах Америки частота заражения составляет 0,6-1 случаев на 100 тысяч человек в год, а в случаях вспышек может существенно возрастать (см. Lieberman et al., 1996, "Safety and Immunogenicity of a serogroups A/C Neisseria meningitidis oligosaccharide-protein conjugate vaccine in young children", JAMA, 275 (19), 1499-1503; Schuchat et al., 1997, "Bacterial meningitis in the United States in 1995", New Engl. J. Med., 337 (14), 970-976). В развивающихся странах частота спорадических случаев существенно выше, а в случае эпидемий заболеваемость может достигать 500 случаев на 100000 человек в год. Смертность исключительно высока и составляет 10-20% в США и значительно больше в развивающихся странах. После внедрения вакцины на основе конъюгата против Haemophilus influenzae менингококк N.meningitidis становится основным возбудителем бактериального менингита во всех возрастных группах в США (Schuchat et al., 1997, цит. выше).
На основе параметров оболочечного полисахарида организма были идентифицированы 12 серогрупп N.meningitidis. Группа А представляет патоген, наиболее часто связанный с эпидемическими заболеваниями в присахарских районах Африки. Серогруппы В и С обусловливают подавляющее большинство случаев в Соединенных Штатах Америки и большинстве развитых стран. Серогруппы W 135 и Y вызывают остальные случаи заболевания в США и развитых странах. Применяемая в настоящее время менингококковая вакцина представляет собой тетравалентную полисахаридную вакцину, составленную серогруппами А, С, Y и W 135. Будучи эффективной у подростков и взрослых людей, она вызывает у них слабый иммунный ответ и кратковременную защиту, а также не может быть использована для детей (например, "Morbidity and Mortality Weekly Report", Vol.46, No. RR-5, 1997). Причиной этого является то, что полисахариды являются независимыми от Т-клеток антигенами, индуцирующими слабый иммунный ответ, который не удается бустировать с помощью повторной иммунизации. После достижения успеха в вакцинации против H.influenzae были разработаны вакцины на основе конъюгата против серогрупп А и С, которые находятся на заключительной стадии клинических испытаний (W.D.Zollinger, "New and improved vaccines against meningococcal disease", In "New Generation Vaccines", цит. выше, pp.469-488; Lieberman et al., 1996, цит. выше; Costantino et al., 1992, "Development and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A (menA) and С (menC)", Vaccine, 10, 691-698).
Однако менингококк-В (МеnВ) остается проблемной серогруппой. В настоящее время на данный серотип приходится приблизительно 50% от всех случаев менингита в США, Европе и Южной Америке. “Полисахаридный подход” не может быть применен потому, что оболочечный полисахарид МеnВ представляет собой полимер α(2-8)-сшитой N-ацетилнейраминовой кислоты, который также имеется в тканях млекопитающих. Это обусловливает толерантность к антигену: т.е., если иммунный ответ был вызван, то он окажется аутоиммунным и, следовательно, нежелательным.
С целью исключения индукции аутоиммунитета и обусловливания защитного иммунного ответа оболочечный полисахарид, например, был химически модифицирован путем замены N-ацетильных групп на N-пропионильные группы, в результате чего специфическая антигенность оставалась неизменной (Romero & Outschoorn, 1994, "Current status of Meningococcal group В vaccine candidates: capsular or non-capsular?", Clin. Microbiol. Rev., 7 (4), 559-575).
В альтернативных подходах к вакцинам против МеnВ использовали комплексные смеси белков внешней мембраны (белков ОМР), содержащие как только ОМР, так и ОМР, обогащенные поринами, либо освобожденные от ОМР 4-го класса, которые, как считается, индуцируют выработку антител, блокирующих бактерицидную активность. В указанном подходе получают вакцины, которые пока подробно не исследованы. Они способны защищать от гомологичного штамма, но неэффективны в полном объеме тогда, когда существуют многочисленные антигенные варианты белков внешней мембраны. Для преодоления антигенной вариабельности были сформированы мультивалентные вакцины, содержащие вплоть до девяти различных поринов (например, J.T.Poolman, 1992, "Development of a meningococcal vaccine". Infect. Agents Dis., 4, 13-28). Дополнительными белками, предназначенными для использования в вакцинах с внешнемембранными белками, являются белки “ора” и “орс”, однако ни один из указанных подходов был не способен преодолеть антигенную вариабельность (например, Ala’Aldeen & Borriello, 1996, "The meningococcal transferring-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains". Vaccine, 14 (1), 49-53).
По генам и белкам менингококка и гонококка доступен некоторый объем информации о последовательностях (например, европейская патентная заявка ЕР А-0-467714, международная патентная заявка WO 96/29412), однако она ни в коей мере не является полной. Представление новых последовательностей способно дать возможность идентифицировать секретируемые или находящиеся на внешней клеточной поверхности белки, которые являются потенциальными мишенями для иммунной системы и которые не являются вариабельными по антигенным свойствам или по крайней мере оказываются более консервативными антигенами по сравнению с другими более вариабельными сегментами. Таким образом, предпочтительны такие антигенные последовательности, которые в наибольшей степени консервативны. Далее предпочтительными последовательностями являются те последовательности, специфичные для Neisseria meningitidis или Neisseria gonorrhoeae, которые более высококонсервативны. Например, некоторые из идентифицированных белков могут служить компонентами эффективных вакцин против менингококка-В, некоторые - компонентами вакцин против всех серотипов менингококка, а другие - компонентами вакцин против всех патогенных нейссерий. Идентификация последовательностей у бактерии также должна облегчить формирование биологических зондов, в частности зондов, специфичных для организма.
Таким образом, объектом настоящего изобретения является представление последовательностей ДНК нейссерий, которые: (1) кодируют белки, для которых предсказывается и/или демонстрируется антигенность или иммуногенность; (2) могут быть использованы в качестве зондов или праймеров для амплификации;
и (3) могут быть проанализированы биоинформационными методами.
Краткое описание чертежей
На фиг.1 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 919 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.2 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 279 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.3 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 576-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.4 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 519-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.5 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 121-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.6 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 128-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.7 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 206 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.8 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 287 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.9 изображены продукты экспрессии и очистки белка предсказанной ORF 406 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.10 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 919 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.11 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 279 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.12 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 576-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.13 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 519-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.14 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 121-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.15 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 128-1 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.16 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 206 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.17 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 287 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
На фиг.18 показаны график гидрофильности, антигенный индекс и амфипатичные участки продуктов экспрессии белка предсказанной ORF 406 по результатам клонирования и экспрессии в E.coli.
Изобретение
Первая полная последовательность генома N.meningitidis была заявлена в виде 961 частичных непрерывных нуклеотидных последовательностей, показанных в SEQ ID NO 1-961 в заявке тех же авторов PCT/US 99/23573 (заявка ‘573), поданной 8 октября 1999 г. (должна быть опубликована в апреле 2000 г.).
Полноразмерный геном N. meningitidis в виде единой последовательности также был заявлен в SEQ ID NO 1068 заявки ‘573. Изобретение основывается на полноразмерном геноме N.meningitidis, который приведен в SEQ ID NO 1 настоящей заявки в приложении А к ней. 961 последовательность заявки ‘573 по существу охватывают полный геном N.meningitidis серотипа В (>99,98%). Имеется частичное перекрывание между некоторыми из 961 непрерывной последовательности (“контиги”), показанное в 961 последовательности, причем перекрывание использовали для формирования единой полноразмерной последовательности, показанной в SEQ ID NO 1 в приложении А настоящей заявки, с использованием алгоритма TIGR Assembler [G.S.Sutton et al., 1995, "TIGR Assembler: A new tool for assembling large shotgun sequencing projects", Genome Science & Technology, 1, 9-19]. Некоторые нуклеотиды в указанных контигах ранее были опубликованы (см. международную компьютерную сеть "www" по адресу ftp:llftp.tigr.org/pub/data/n_meningitidis). Координаты 2508 опубликованных последовательностей в представленных контигах приведены в приложении А заявки ‘573. Указанные данные включают номер контига (или идентификатор “ID”), приведенный в первом столбце, название последовательности в соответствии с указанным в Интернете, показано во второй колонке; координаты контигов - в третьей или четвертой колонках, соответственно. Последовательности некоторых ORFs MenB, приведенные в приложении В заявки ‘573, отображены в международной патентной заявке, поданной Chiron SpA 9 октября 1998 г. (PCT/IB 98/01665) и 14 января 1999 г. (РСТ/IB 99/00103), соответственно. Приложение В к настоящей заявке представляет список 2158 открытых рамок считывания, находящихся в пределах полноразмерной последовательности, показанной здесь в SEQ ID NO 1 в приложении А. Информация, включенная в приложение В к настоящей заявке, охватывает наименование последовательности “NMB”, предполагаемый продукт трансляции и положения начального и заключительного нуклеотида в составе SEQ ID NO 1, которые охватывают открытые рамки считывания. В данном тексте указанные открытые рамки считывания обозначены как “открытые рамки считывания NMB”.
В первом аспекте настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, включающую нуклеотидную последовательность N.meningitidis, показанную здесь в SEQ ID NO 1 в приложении А. Также оно представляет нуклеиновую кислоту, включающую последовательности, характеризующиеся идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью, заявленной здесь. В зависимости от конкретной последовательности степень идентичности последовательностей предпочтительно превышает 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или больше). Указанные последовательности охватывают, например, мутантные и аллельные варианты. Степень идентичности последовательностей, упоминавшуюся здесь, определяют по всей длине последовательности с применением алгоритма поиска гомологии по Смиту-Уотерману, использованного в программе MPSRCH (Oxford Molecular), в которой ведется поиск аффинных пробелов при следующих установках: штраф за открытие пробела - 12, штраф за продолжение пробела - 1.
Также настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, включающую фрагмент одной или нескольких нуклеотидных последовательностей, приведенных здесь, включая открытые рамки считывания NMB, показанные в приложении В к настоящей заявке. Фрагмент должен включать по крайней мере “n” расположенных подряд нуклеотидов из состава последовательностей: в зависимости от конкретной последовательности n равно 10 или больше (например, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 75, 100 или больше). Предпочтительно фрагмент уникален для генома N.meningitidis, т.е. он, например, отсутствует в геноме другого организма. Более предпочтительно фрагмент уникален для генома N.meningitidis штамма В. Также настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, которая гибридизует с тем, что предусмотрено в данном тексте. Условия гибридизации описаны в настоящей заявке.
Также настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, включающую последовательности, комплементарные тем последовательностям, которые были описаны выше (например, для антисмысловых конструкций, для зондов или для амплификационных праймеров).
Понятно, что нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может быть получена различными путями (например, с помощью химического синтеза, из ДНК-библиотек, непосредственно от организма и т.п.) и может принимать различные формы (например, одноцепочечную, двухцепочечную, форму векторов, зондов, праймеров и т.п.). Термин “нуклеиновая кислота” охватывает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как те, которые включают модифицированный скелет, а также пептид-нуклеиновая кислота (ПНК) и т.п.
Должно быть понятно, что, с учетом охвата последовательностями SEQ ID NO 1-961 заявки ‘573 по существу полного генома организма и некоторого перекрывания, обращение к SEQ ID NO 1-961 заявки ‘573 включает в объем указанной ссылки полную геномную последовательность, т.е. SEQ ID NO 1 из настоящей заявки. Например, когда две SEQ ID NO перекрываются, изобретение охватывает единую последовательность, которая образована в результате сочетания двух перекрывающихся последовательностей, причем полную последовательность можно будет найти в SEQ ID NO 1. Следовательно, например, нуклеотидная последовательность, которая объединяет две SEQ ID NO, но в своей полноте не присутствует в любой из SEQ ID NO, также попадает в объем настоящего изобретения. Такая последовательность будет присутствовать полностью в составе единой полноразмерной последовательности SEQ ID NO 1 в соответствии с настоящей заявкой.
Настоящее изобретение также предусматривает векторы, включающие нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению (например, экспрессирующие векторы, секвенационные векторы, клонирующие векторы и т.п.), и клетки-хозяева, трансформированные указанными векторами.
В соответствии со следующим аспектом изобретение представляет белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую приведенной здесь нуклеотидной последовательностью N.meningitidis. Также оно предусматривает белки, включающие последовательности, которые проявляют идентичность по последовательности с указанными белками. В зависимости от конкретной последовательности степень идентичности последовательностей предпочтительно превышает 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или больше). Идентичность последовательностей определяют в соответствии с описанным здесь выше. Такие гомологичные белки охватывают мутантные и аллельные варианты, кодируемые приведенными в данном тексте нуклеотидными последовательностями N.meningitidis.
Далее настоящее изобретение представляет белки, включающие фрагменты аминокислотной последовательности, кодируемой нуклеотидной последовательностью N.meningitidis, приведенной в списке последовательностей. Фрагменты должны включать по крайней мере “n” расположенных подряд аминокислот из последовательностей: в зависимости от конкретной последовательности n составляет 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или больше). Предпочтительно фрагменты включают эпитоп из состава последовательности.
Понятно, что белки по настоящему изобретению могут быть получены различными путями (например, в результате рекомбинантной экспрессии, очистки из клеточной культуры, химического синтеза и т.п.) и в различных формах (например, нативной, в форме химер и т.п.). Предпочтительно их получают в существенно изолированной форме (т.е. по существу свободными от других белков клетки-хозяина N.meningitidis).
Различные тесты могут быть использованы для оценки in vivo иммуногенности белков по настоящему изобретению. Например, белки могут быть экспрессированы рекомбинантным путем или химически синтезированы с последующим использованием для скрининга сывороток пациентов с помощью иммуноблоттинга. Положительное взаимодействие между белком и сывороткой пациента указывает на то, что пациент ранее сформировал иммунный ответ на анализируемый белок: т.е. белок иммуногенен. Данный способ также можно использовать для идентификации иммунодоминантных белков.
Также настоящее изобретение предусматривает нуклеиновую кислоту, кодирующую белок по настоящему изобретению.
В следующем аспекте изобретение представляет компьютер, компьютерную память, компьютерный носитель (например, дискету, винчестер, CD-ROM и т.п.) и/или компьютерную базу данных, содержащие информацию о нуклеотидной последовательности нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. Предпочтительно имеется информация об одной или большем числе приведенных в данной заявке нуклеотидных последовательностей N.meningitidis.
Указанное можно использовать для анализа приведенных здесь нуклеотидных последовательностей N.meningitidis. Например, указанное можно использовать для идентификации открытых рамок считывания (ORF) или кодирующих последовательностей в составе последовательности.
Еще в одном аспекте изобретение предусматривает способ идентификации аминокислотной последовательности, включающий стадию поиска потенциальных открытых рамок считывания или кодирующих белок последовательностей в пределах приведенной здесь нуклеотидной последовательности N.meningitidis. Сходным образом изобретение предусматривает использование приведенной здесь нуклеотидной последовательности N.meningitidis в поиске потенциальных открытых рамок считывания или последовательностей, кодирующих белок.
Анализ открытой рамки считывания или кодирующей белок последовательности обычно осуществляют на компьютере с использованием стандартных биоинформационных технологий. Типичными алгоритмами или программами для такого анализа являются ORFFINDER (NCBI), GENMARK [Borodovsky & McIninch, 1993, Computers Chem., 17, 122-133] и GLIMMER [Salzberg et al., 1998, Nucl. Acids Res., 26, 544-548].
Поиск открытой рамки считывания или кодирующей белок последовательности может включать стадии поиска в приведенной здесь нуклеотидной последовательности N.meningitidis старт-кодона и поиска в последовательности внутрирамочного стоп-кодона. Расположенные между ними кодоны представляют собой потенциальную кодирующую белок последовательность. Обычно поиску должны быть подвергнуты все шесть возможных открытых рамок.
Идентифицированную таким путем аминокислотную последовательность можно проэкспрессировать с использованием любой подходящей системы для получения белка. Такой белок можно использовать для формирования антител, которые распознают эпитопы в пределах идентифицированной аминокислотной последовательности. Такие антитела могут быть использованы для скрининга N.meningitidis с выявлением присутствия белка, включающего идентифицированную аминокислотную последовательность.
Кроме того, после идентификации ORF или кодирующей белок последовательности можно провести сравнение последовательности с базами данных по последовательностям. Средства для анализа последовательностей можно найти у NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), например, алгоритмы BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx и tBLASTx [см. также Altschul et al., 1997, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Research, 25, 2289-3402]. Подходящими для сравнения базами данных являются недублированные последовательности из GenBank, EMBL, DDBJ и PDB и недублированные последовательности из CDS-трансляций GenBank, PDB, SwissProt, Spupdate и PIR. Данное сравнение может указывать на функцию белка.
Гидрофобные домены в аминокислотной последовательности могут быть предсказаны с использованием таких алгоритмов, как основанные на статистических анализах алгоритмы от Esposti et al. ["Critical evaluation of the hydropathy of membrane proteins" (1990), Eur. J. Biochem., 190, 207-219]. Гидрофобные домены представляют собой потенциальные трансмембранные участки или гидрофобные сигнальные последовательности: это предполагает, что белки могут секретироваться или выноситься на поверхность клетки. Указанные свойства обычно характерны для эффективных иммуногенов.
Сходным образом трансмембранные домены или сигнальные последовательности могут быть предсказаны с использованием алгоритма PSORT (http://www.psort.nibb.ac.jp), а функциональные домены могут быть предсказаны с использованием программы MOTIFS (GCG Wisconsin & PROSITE).
Также настоящее изобретение представляет нуклеиновую кислоту, которая включает открытую рамку считывания или кодирующую белок последовательность, имеющуюся в приведенной здесь нуклеотидной последовательности N.meningitidis. Кроме того, изобретение предусматривает белок, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую данной открытой рамкой считывания или кодирующей белок последовательностью.
В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение представляет антитела, которые связываются с указанными белками. Антитела могут быть поликлональными или моноклональными и могут быть получены с помощью любого подходящего способа, известного специалистам в данной области техники.
Антитела по настоящему изобретению можно использовать различным образом, например, для подтверждения экспрессированности белка или для установления того, где белок экспрессируется. Помеченное антитело (например, флуоресцентно помеченное для метода FACS) можно проинкубировать с интактными бактериями: присутствие метки на поверхности бактерии подтверждает, например, локализацию белка.
В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение представляет композиции, содержащие белок, антитело и/или нуклеиновую кислоту по настоящему изобретению. Указанные композиции могут быть пригодными в качестве вакцин, в качестве иммуногенных композиций или в качестве диагностических реагентов.
Также настоящее изобретение предусматривает нуклеиновую кислоту, белок или антитело по настоящему изобретению для использования в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов. Также оно предусматривает использование нуклеиновой кислоты, белка или антитела по настоящему изобретению в производстве: (i) лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции нейссериями и (ii) диагностического реагента для установления присутствия бактерий Neisseria или антител, образовавшихся к нейссериям. Упомянутые бактерии Neisseria могут относиться к любому виду или штамму (такому как N.gonorrhoeae), но предпочтительно N.meningitidis, особенно штамму А, штамму В или штамму С.
Еще в одном аспекте настоящее изобретение представляет композиции, содержащие белки, молекулы нуклеиновых кислот или антитела. Более предпочтительные аспекты настоящего изобретения связаны с иммуногенными композициями белков. Далее предпочтительные аспекты настоящего изобретения предусматривают фармацевтические иммуногенные композиции белков или вакцины, а также их использование в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики инфекции нейссериями, предпочтительно инфекции МеnВ.
Также изобретение представляет способ лечения пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и/или антитела по настоящему изобретению.
В соответствии со следующими аспектами изобретение предусматривает различные способы.
Представляется способ получения белков по настоящему изобретению, включающий стадию культивирования клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением в условиях, при которых индуцируется экспрессия белка. Способ, который может дополнительно включать химический синтез белков и/или химический синтез (по крайней мере отчасти) нуклеотидов.
Представляется способ выявления полинуклеотидов по настоящему изобретению, включающий стадии: (а) контактирование нуклеотидного зонда по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях гибридизации с образованием дуплексов и (b) выявление упомянутых дуплексов.
Представляется способ выявления белков по настоящему изобретению, включающий стадии: (а) контактирование антитела по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплексов “антиген-антитело” и (b) выявление упомянутых комплексов.
В другом аспекте настоящее изобретение представляет способ выявления антител, которые избирательным образом связываются с антигенами или полипептидами, или белками, специфичными для какого-либо вида или штамма бактерий Neisseria и предпочтительно для штаммов N.gonorrhoeae, но более предпочтительно для штаммов N.meningitidis, особенно для штамма А, штамма В или штамма С, более предпочтительно МеnВ, причем способ включает стадии: (а) контактирование антигена или полипептида, или белка по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях, подходящих для образования комплексов “антиген-антитело”, и (b) выявление упомянутых комплексов.
Имея общее описание изобретения, указанное может быть более полно понято путем отсылки к нижеследующим примерам, которые приведены с иллюстративной целью и не призваны ограничить настоящее изобретение, за исключением специально оговариваемых случаев.
Методология. Краткое описание стандартных процедур и методов
Общие замечания
Настоящее изобретение представляет нуклеотидные последовательности Neisseria meningitidis MenB и кодируемые ими аминокислотные последовательности. На основе описанных последовательностей могут быть сформированы тесты с нуклеотидными зондами, а также экспрессионные кассеты и векторы. Также белки могут быть синтезированы химическим путем. Экспрессирующими векторами можно трансформировать клетки-хозяева с целью выработки белков. Очищенные или изолированные полипептиды можно использовать для получения антител, предназначенных для выявления белков МеnВ. Также клетки-хозяева или экстракты могут быть использованы в биотестах для выделения агонистов или антагонистов. Кроме того, с помощью указанных последовательностей можно идентифицировать открытые рамки считывания и идентифицировать аминокислотные последовательности. Также белки могут быть использованы в иммуногенных композициях и в качестве компонентов вакцин.
В практике настоящего изобретения будут использованы, если это специально не оговаривается, стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантных ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методы полностью охарактеризованы в литературе, например, у Sambrook, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d Edition; "DNA Cloning" Volumes I and II (D.N.Glover ed. 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J.Gait ed., 1984); "Nucleic Acid Hybridization" (B.D.Hames & S.J.Higgins eds., 1984); "Transcription and Translation" (B.D.Hames & S.J.Higgins eds., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I.Freshney ed., 1986); "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986); B.Perbal, 1984, "A Practical Guide to Molecular Cloning"; периодические выпуски "Methods in Enzymology" (Academic Press Inc.), в частности, тома 154 и 155; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.H.Miller & M.P.Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Mayer & Walker eds., 1987, "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology" (Academic Press, London); Scopes, 1987, "Protein Purification: Principles and Practice", 2d Edition (Springer-Verlag, NY); и "Handbook of Experimental Immunology", Volumes I-IV (D.M.Weir & C.C.Blackwell, 1986).
В настоящей заявке для нуклеотидов и аминокислот используются стандартные аббревиатуры.
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном тексте, в полном объеме включены в виде библиографических ссылок.
Экспрессионные системы
Нуклеотидные последовательности Neisseria MenB могут быть экспрессированы в ряде различных экспрессионных систем: например, для этой цели используются клетки млекопитающих, растительные клетки, бакуловирусы, бактерии и дрожжи.
i. Системы клеток млекопитающих
Экспрессионные системы на основе клеток млекопитающих хорошо известны в данной области техники. Промотором для клеток млекопитающих может служить любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих, инициируя тем самым транскрипцию нижерасположенной (т.е. в 3’-сторону) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор должен включать сайт инициации транскрипции, который обычно располагается проксимально по отношению к 5’-концу кодирующей последовательности, а также бокс ТАТА, обычно находящийся в 25-30 парах нуклеотидах (п.н.) выше сайта инициации транскрипции. Считается, что бокс ТАТА обеспечивает контролируемое РНК-полимеразой II начало синтеза РНК в правильном участке. Промотор клеток млекопитающих также должен включать расположенный выше промоторный элемент, обычно находящийся в 100-200 п.н. выше бокса ТАТА. Верхний промоторный элемент определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может быть активен в любой ориентации (Sambrook et al., 1989, "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed.).
Гены вирусов млекопитающих обычно характеризуются интенсивной экспрессируемостью и характеризуются широким кругом хозяев: следовательно, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, представляют особенно полезные промоторные последовательности. Примерами являются промотор ранних генов вируса SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мыши, промотор главного позднего гена аденовируса (AdMLP) и промотор вируса простого герпеса. Кроме того, последовательности, производные от невирусных генов, таких как ген металлотионеина мыши, также представляют полезные промоторные последовательности. Экспрессия может быть как конститутивной, так и регулируемой (индуцибельной). В зависимости от выбранного промотора многие промоторы могут быть индуцированы с использованием известных субстратов, например, используя промотор вируса опухоли молочной железы мыши (MMTV) с элементом взаимодействия с глюкокортикоидами (GRE), который индуцируется глюкокортикоидом в реагирующих на гормоны трансформированных клетках (см., например, патент США №5783681).
Присутствие “усиливающего” элемента (энхансера), объединенного с промоторными элементами, описанными выше, обычно должно усиливать экспрессию. Энхансер - это регуляторная последовательность ДНК, которая способна стимулировать транскрипцию до тысячекратного усиления в случае соединения с гомологичными или гетерологичными промоторами, при том, что синтез РНК начинается в нормальном инициирующем сайге. Энхансеры также активны тогда, когда они помещаются или выше, или ниже сайта инициации транскрипции, как в нормальной, так и в инвертированной ориентации, или на расстоянии больше 1000 п.н. от самого промотора (Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237; Alberts et al., 1989, "Molecular Biology of the Cell", 2d ed.). В частности, могут быть использованы энхансерные элементы, происходящие от вирусных геномов, поскольку они обычно характеризуются более широким кругом потенциальных хозяев. Примерами являются энхансер раннего гена вируса SV40 (Dijkema et al., 1985, EMBO J., 4, 761) и система “энхансер+промотор”, производная от участка длинных концевых повторов (LTR) вируса саркомы Рауса (German et al., 1982b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777) и цитомегаловируса человека (Boshart et al., 1985, Cell, 41, 521). Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла (Sassone-Corsi & Borelli, 1986, Trends Genet., 2, 215; Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237).
Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клеток млекопитающих. Промоторная последовательность может быть напрямую присоединена к молекуле ДНК: в этом случае первая с N-конца аминокислота в составе рекомбинантного белка всегда должна быть метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если желательно, N-концевая часть может быть отщеплена от белка путем инкубации in vitro с бромцианом.
Как альтернатива, чужеродные белки также могут секретироваться из клетки в питательную среду в результате создания химерных молекул ДНК, которые кодируют химерный белок, включающий лидерный (сигнальный) сегмент, обеспечивающий секрецию чужеродного белка клетками млекопитающих. Предпочтительным является наличие сайтов процессинга между лидерным сегментом и чужеродным геном, которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro. Лидерная последовательность обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот и обеспечивающий секрецию белка из клетки. Аденовирусный трехраздельный лидерный сегмент является примером лидерной последовательности, обеспечивающей секрецию чужеродного белка клетками млекопитающих.
Обычно терминаторы транскрипции и полиадениловые последовательности, распознаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными сегментами, расположенными с 3’-стороны от стоп-кодона, т.е., наряду с промоторными элементами, фланкируют кодирующую последовательность. 3’-Конец зрелой мРНК образуется в результате сайт-специфичного посттранскрипционного расщепления и полиаденилирования (Birnstiel et al., 1985, Cell, 41, 349; Proudfoot & Whitelaw, 1988, "Termination and 3’ end processing of eukaryotic RNA", In "Transcription and splicing", eds. B.D.Hames & D.M.Glover; Proudfoot, 1989, Trends Biochem. Sci., 14, 105). Указанные последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая затем может быть транслирована в полипептид, кодируемый исходной ДНК. Примерами сигналов терминации транскрипции и полиаденилирования являются мотивы, происходящие из генома вируса SV40 (Sambrook et al., 1989, "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells". In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual").
Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, сигнал полиаденилирования и сайт терминации транскрипции, встраивают в состав экспрессирующих конструкций одновременно. Энхансеры, интроны, включающие функциональные донорные и акцепторные сайты сплайсинга, и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессирующую конструкцию, если это желательно. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в виде репликона, т.е. внехромосомного элемента (например, плазмиды), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком как клетки млекопитающего или бактерия. Репликационные системы для млекопитающих включают системы, происходящие от вирусов животных, для репликации которых необходимо участие транс-регулирующих факторов. Например, плазмиды, включающие репликационные системы паповавирусов, таких как вирус обезьян SV40 (Gluzman, 1981, Cell, 23, 175), или полиомавирусов, реплицируются в исключительно большом числе копий в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительными примерами репликонов для клеток млекопитающих являются репликоны, происходящие от бычьего папилломавируса и вируса Эпштейна-Барр. Кроме того, такой репликон может нести две репликационные системы, что тем самым обеспечивает возможность поддержания их, например, в клетках млекопитающих с целью экспрессии и в прокариотических клетках с целью клонирования и амплифицирования. Примерами таких бифункциональных векторов для млекопитающих/бактерий являются векторы рМТ2 (Kaufman et al., 1989, Mol. Cell. Biol., 9, 946) и рНЕВО (Shimizu et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 1074).
Выбор используемых процедур трансформации зависит от вида организма-хозяина, который должен быть трансформирован. Способы внесения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области техники и включают опосредуемую декстраном трансфекцию, преципитацию с фосфатом кальция, трансфекцию с полибреном, слияние протопластов, электропорацию, заключение полинуклеотидов в липосомы и прямое микроинъецирование ДНК в ядра.
Линии клеток млекопитающих, пригодные в качестве хозяев для целей экспрессии, хорошо известны в данной области техники и включают большое число иммортализованных клеточных линий, доступных из Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но тем самым не исчерпываясь, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa человека, клетки почек новорожденных хомячков (ВНК), клетки почки зеленой мартышки (COS), клетки гепатоклеточной карциномы человека (например, HepG2) и множество других клеточных линий.
ii. Экспрессионные системы растительных клеток
В данной области техники известны многочисленные генетические экспрессионные системы, основанные на культурах растительных клеток и цельных растениях. Примеры таких генетических экспрессионных систем для растительных клеток можно найти в патентах США №№5693506, 5659122 и 5608143. Кроме того, такие примеры генетической экспрессии в культивируемых растительных клетках описаны Ценком (Zenk, 1991, Phytochemistry, 30, 3861-3863). Описания сигнальных пептидов растительных белков можно найти, в дополнение к указанным выше источникам, в работах Vaulcombe et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 209, 33-40; Chandler et al., 1984, Plant Mol. Biol., 3, 407-418; Rogers, 1985, J. Biol. Chem., 260, 3731-3738; Rothstein et al., 1987, Gene, 55, 353-356; Whittier et al., 1987, Nucl. Acids Res., 15, 2515-2535; Wirsel et al., 1989, Mol. Microbiol., 3, 3-14; Yu et al., 1992, Gene, 122, 247-253. Описание параметров регуляции экспрессии растительных генов с участием фитогормона - гибберелловой кислоты - и секретируемых ферментов, индуцируемых гибберелловой кислотой, можно найти у R.L.Jones & J.MacMillin, 1984, "Gibberellins", In "Advanced Plant Physiology", ed. M.B.Wilkins, Pitman Publ. Ltd., London, pp.21-52. Материалы, описывающие другие гены, регулируемые с участием метаболических механизмов: Sheen, 1990, Plant Cell, 2, 1027-1038; Maas et al., 1990, EMBO J., 9, 3447-3452; Benkel & Hickey, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1337-1339.
Обычно с использованием методологий, известных в данной области техники, желательную полинуклеотидную последовательность встраивают в состав экспрессионной кассеты, включающей генетические регуляторные элементы, призванные функционировать в растениях. Экспрессионную кассету встраивают в желательный экспрессирующий вектор вместе с сопутствующими последовательностями, расположенными выше и ниже экспрессионной кассеты и пригодными для обеспечения экспрессии в растении-хозяине. Сопутствующие последовательности могут иметь плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивают необходимые характеристики вектору, например, способность переносить ДНК из исходного используемого для клонирования организма-хозяина, такого как бактерия, в желательное растение-хозяин. Базовая бифункциональная (“бактериально-растительная”) векторная конструкция предпочтительно должна включать прокариотический сайт начала репликации, активный в широком круге хозяев, прокариотический селективный маркер и (в случае трансформации бактерий Agrobacterium) последовательности Т-ДНК, что позволит осуществлять перенос генов в геном растений на основе трансформации с помощью Agrobacterium. Когда идентификация гетерологичного гена затруднена, данная конструкция должна предпочтительно также включать селективный маркер, пригодный для выявления того, была ли трансформирована растительная клетка. Обзор по селективным маркерам, например, членам семейства grass, можно найти у Wilmink & Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Rept., 11(2), 165-185.
Также рекомендуется включать последовательности, пригодные для обеспечения интеграции гетерологичной последовательности в геном растения. Ими могут быть транспозонные последовательности и подобное, которые связаны с процессами гомологичной рекомбинации, равно как и Ti-последовательности, которые обусловливают случайное встраивание гетерологичной экспрессионной кассеты в геном растения. Подходящими прокариотическими селективными маркерами являются признаки резистентности к антибиотикам, таким как ампициллин или тетрациклин. Другие последовательности ДНК, детерминирующие дополнительные функции, также могут входить в состав вектора, будучи известными в данной области техники.
Молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть включены в состав экспрессионной кассеты, предназначенной для экспрессии представляющего интерес белка (белков). Обычно используется единственная экспрессионная кассета, хотя возможно использование двух или большего числа таких кассет. Рекомбинантная экспрессионная кассета должна включать в дополнение к последовательности, кодирующей гетерологичный белок, следующие элементы: промоторный сегмент, растительные 5’-нетранслируемые последовательности, инициирующий кодон, присутствие или отсутствие которого зависит от того, имеется ли он в составе анализируемого структурного гена, и сайты терминации транскрипции и трансляции. Уникальные рестрикционные сайты по 5’- и 3’-концам данной кассеты обеспечивают удобное встраивание в состав исходного вектора.
Гетерологичная кодирующая последовательность может относиться к любому белку по настоящему изобретению. Последовательность, кодирующая интересующий белок, будет кодировать сигнальный пептид, который обеспечит процессинг и перемещение белка, если это необходимо, и, как правило, должна быть лишена любой последовательности, которая бы обусловила связывание желательного белка по настоящему изобретению с мембраной. При том, что в большинстве случаев сайт инициации транскрипции будет предназначен для гена, который экспрессируется и транслоцируется в процессе прорастания, путем использования сигнального пептида, обеспечивающего перемещение, также можно обеспечить перемещение желательного белка. В этом случае представляющий интерес белок (белки) будет выводиться из клеток, в которых он был экспрессирован: следовательно, он может быть эффективно собран. Обычно секреция в семенах происходит из алейроновой области или щиткового эпителия в эндосперм семени. Хотя нет конкретной необходимости в секреции белка из клеток, в которых он вырабатывался, такой подход облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.
Поскольку окончательная экспрессия желательного генного продукта должна происходить в эукариотической клетке, желательным является определить, не содержит ли какой-либо из участков клонированного гена последовательности, которые могут быть затем утрачены в виде интронов под действием механизма сплайсинга, свойственного организму-хозяину. Если они есть, то с применением метода направленного (сайт-специфичного) мутагенеза указанный “интронный” участок может быть изменен таким образом, чтобы исключить утрату части генетического материала мРНК из-за наличия ложно-интронных сигналов (Reed & Maniatis, 1985, Cell, 41, 95-105).
Вектор может быть напрямую микроинъецирован в клетки растений с использованием микропипеток, что обеспечит механический перенос рекомбинантной ДНК (Crossway, 1985, Mol. Gen. Genet., 202, 179-185). Также генетический материал может быть перенесен в растительные клетки с использованием полиэтиленгликоля (Krens et al., 1982, Nature, 296, 72-74). Другим способом внесения сегментов нуклеиновых кислот является высокоскоростное баллистическое внесение мелких шариков или частиц (“микроснарядов”), внутри которых или на поверхности которых находится нуклеиновая кислота (Klein et al., 1987, Nature, 327, 70-73; Knudsen & Muller, 1991, Planta, 185, 330-336 - в этих работах описывается применение метода бомбардировки микрочастицами эндосперма с целью получения трансгенных растений ячменя). Еще одним способом внесения может быть слияние протопластов с другими компонентами, такими как миниклетки, клетки, лизосомы или иные, способные участвовать в слиянии тельца, имеющие липидную поверхность (Fraley et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863).
Вектор также может быть внесен в растительные клетки с применением электропорации (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5824). В указанном способе протопласты растений электропорируют в присутствии плазмид, включающих генную конструкцию. Электрические импульсы, характеризующиеся высоким значением напряженности электрического поля, обратимо “продырявливают” биологические мембраны, обеспечивая тем самым проникновение плазмид внутрь. Электропорированные растительные протопласты возобновляют свою клеточную стенку, делятся и образуют каллюсы.
Все растения, из которых могут быть выделены протопласты с последующим культивированием и получением цельных регенерированных растений, могут быть трансформированы в соответствии с настоящим изобретением таким образом, чтобы затем получить цельные растения, несущие перенесенный ген. Известно, что практически все растения могут быть регенерированы из культивируемых клеток или тканей, включая, но тем самым не ограничиваясь, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, плодовых и других деревьев, бобовых растений и овощных культур. Некоторыми подходящими растениями, например, являются виды родов Fragaria (земляника), Lotus (лядвенец), Medicago (люцерна), Onobrychis (эспарцет), Trifolium (клевер), Trigonella (пажитник), Vigna (вигна), Citrus (цитрусы), Linum (лен), Geranium (герань), Manihot (маниок), Daucus (морковь), Arabidopsis (резуховидка), Brassica (капуста, брюква, репа), Raphanus (редька), Sinapis (горчица), Atropa (красавка-беладонна), Capsicum (овощной перец), Datura (дурман), Hyoscyamus (белена), Lycopersicon (помидор), Nicotiana (табак), Solanum (паслен), Petunia (петуния), Digitalis (росичка), Majorana (майоран), Cichorium (цикорий), Helianthus (подсолнечник, топинамбур), Lactuca (латук), Bromus (костер), Asparagus (спаржа), Antirrhinum (львиный зев), Hererocallis, Nemesia, Pelargonium (пеларгония), Panicum (просо), Pennisetum (американское просо), Ranunculus (лютик), Senecio (крестовник), Salpiglossis, Cucumis (огурец, дыня), Browaalia, Glycine (соя), Lolium (плевел), Zea (кукуруза), Triticum (пшеница), Sorghum (сорго) и Datura.
Способы регенерации зависят от вида растения, но в целом всегда вначале получают суспензию трансформированных протопластов, несущих копии гетерологичного гена. Потом формируют каллюсные ткани, в которых могут быть индуцированы побеги с последующим формированием корешков на них. Как альтернатива, в суспензии протопластов можно индуцировать образование эмбрионов. Такие эмбрионы прорастают как обычные эмбрионы, образуя нормальные растения. Культуральные среды обычно должны содержать различные аминокислоты и гормоны, такие как ауксин и цитокины. Также предпочтительным является добавление в культуральную среду глутаминовой кислоты и пролина, особенно для таких видов, как кукуруза и люцерна. Побеги и корешки в норме развиваются одновременно. Эффективность регенерации будет зависеть от культуральной среды, генотипа растения и от параметров конкретной культуры. Если эти три переменных находятся под контролем, то регенерация оказывается воспроизводимой и повторяемой.
В некоторых системах культивирования растительных клеток желательный белок по настоящему изобретению может выделяться сам или, как альтернатива, такой белок можно экстрагировать из цельного растения. В тех случаях, когда желательный белок по настоящему изобретению секретируется в культуральную среду, он может быть собран. Как альтернатива, эмбрионы и беззародышевые “полусемена” или другие растительные ткани могут быть механически разрушены с целью выделения секретируемого белка из клеток и тканей. Полученную смесь можно суспендировать в буферном растворе с целью выделения растворимых белков. Затем для очистки рекомбинантного белка можно использовать стандартные методы выделения и очистки белков. С целью оптимизации экспрессии и выделения гетерологичного белка параметры времени, температуры, рН, содержания кислорода и объема могут быть откорректированы с помощью стандартных процедур.
iii. Бакуловирусные системы
Полинуклеотид, кодирующий белок, также может быть встроен в подходящий экспрессирующий вектор для клеток насекомых: его функциональным образом соединяют с регуляторными элементами в составе такого вектора. При конструировании вектора используют методы, хорошо известные в данной области техники.
В целом, компонентами экспрессионной системы являются поставочный вектор, обычно являющийся бактериальной плазмидой, который включает и фрагмент бакуловирусного генома, и стандартный рестрикционный сайт, предназначенный для встраивания по нему гетерологичного гена или генов, которые будут экспрессироваться; бакуловирус дикого типа, имеющий последовательность, которая гомологична специфичному для бакуловирусов фрагменту доставочного вектора (это обеспечивает гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в бакуловирусном геноме); и подходящие клетки-хозяева насекомого и культуральная среда.
После внесения в состав доставочного вектора последовательности ДНК, кодирующей конкретный белок, данный вектор и вирусный геном дикого типа используют для трансфекции клетки-хозяина насекомого, в которой вектор и вирусный геном могут рекомбинировать. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется, а рекомбинантные бляшки идентифицируют и очищают. Материалы и методы для формирования экспрессионных систем “бакуловирус/клетки насекомых” имеются в продаже в виде специальных наборов, помимо прочего, у фирмы Invitrogen, San Diego, CA (набор "Мах-Вас kit"). Названные методы в целом известны специалистам в данной области техники и подробно охарактеризованы в руководстве Саммерса и Смита (Summers & Smith, 1987, Texas Agricult. Exper. Stat. Bull., No 1555) (здесь и далее цитируется как "Summers & Smith").
Перед встраиванием последовательности ДНК, кодирующей конкретный белок, в состав бакуловирусного генома, описанные выше компоненты, включая промотор, лидерный фрагмент (если он желателен), представляющую интерес кодирующую последовательность и сайт терминации транскрипции, обычно компонуют в промежуточную переносящую конструкцию (доставочный вектор). Такая конструкция может включать единственный ген и функционально присоединенные к нему регуляторные элементы; или множественные гены, каждый из которых имеет “собственный” комплект функционально присоединенных регуляторных элементов;
или множественные гены, находящиеся под контролем одного набора регуляторных элементов. Промежуточные переносящие конструкции часто поддерживаются в виде репликона, такого как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком как бактерия. Такой репликон должен включать репликационную систему, что тем самым обеспечит поддержание в подходящем организме-хозяине с целью клонирования и амплифицирования.
В настоящее время наиболее распространенным доставочным вектором для внесения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Также были сформированы и многие другие векторы, известные специалистам в данной области техники. Они включают, например, pVL985 (в котором изменяется старт-кодон гена полиэдрина с ATG на АТТ и в который вносится клонирующий BamHI-сайт в 32 парах нуклеотидов ниже кодона АТТ: см. Luckow & Summers, 1989, Virology, 17, 31).
Обычно плазмида также включает сигнал полиаденилирования гена полиэдрина (Miller et al., 1988, Ann. Rev. Microbiol., 42, 177), прокариотический ген резистентности к ампициллину (amp) и сайт начала репликации, необходимые для отбора и воспроизведения в клетках Е.coli.
Бакуловирусные доставочные векторы обычно включают бакуловирусный промотор. Бакуловирусный промотор - это любая последовательность ДНК, способная связываться с бакуловирусной РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию нижерасположенной кодирующей последовательности (например, структурного гена) в направлений 5’→3’ с образованием мРНК. Промотор должен включать сайт инициации транскрипции, который обычно помещают проксимально по отношению к 5’-концу кодирующей последовательности. Данный участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы и собственно сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный доставочный вектор также может включать второй домен, определяемый как “энхансер”, который, если присутствует, обычно находится на расстоянии от структурного гена. Экспрессия может быть либо контролируемой, либо конститутивной.
Структурные гены, интенсивно транскрибируемые на поздних этапах вирусного инфекционного цикла, позволяют выделить конкретно применимые промоторные последовательности. Примерами являются последовательности, производные от гена, кодирующего вирусный белок - полиэдрин (Friesen et al., 1986, "The regulation of baculovirus gene expression". In "The Molecular Biology of Baculoviruses", ed. W.Doerfler; европейские патентные публикации №№127839 и 155476), и гена, кодирующего белок p10 (Vlak et al., 1988, J. Gen. Virol., 69, 765).
Последовательность ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть производной от генов, кодирующих секретируемые белки насекомых или бакуловирусов, такие как ген полиэдрина бакуловируса (Carbonell et al., 1988, Gene, 73, 409). Как альтернатива, при том, что сигналы посттрансляционных модификаций в клетках млекопитающих (таких как отщепление сигнального фрагмента, протеолитическое расщепление и фосфорилирование), по-видимому, распознаются и клетками насекомых, а сигналы, необходимые для секреции и накопления в ядре, также, по-видимому, консервативны в клетках позвоночных и беспозвоночных животных, для обеспечения секреции у насекомых также можно использовать лидерные фрагменты, не связанные происхождением с насекомыми, такие как производные от генов, кодирующих α-интерферон человека (Maeda et al., 1985, Nature, 315, 592), рилизинг-фактор гастрина человека (Lebacq-Verheyden et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 3129), интерлейкин-2 человека (Smith et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404), интерлейкин-3 мыши (Miyajima et al., 1987, Gene, 58, 273); и глюкоцереброзидазу человека (Martin et al., 1988, DNA, 7, 99).
Рекомбинантный полипептид или полипротеин может быть экспрессирован внутриклеточно или, если он экспрессируется с участием соответствующих регуляторных элементов, он может секретироваться. Для эффективной внутриклеточной экспрессии нехимерных чужеродных белков обычно нужны гетерологичные гены, которые в идеале включают короткую лидерную последовательность, включающую подходящие сигналы инициации трансляции, предшествующие старт-кодону ATG. Если желательно, остаток метионина с N-конца может быть отщеплен от зрелого полипептида путем инкубации in vitro с бромцианом.
Как альтернатива, рекомбинантные полипротеины или белки, которые в естественных условиях не являются секретируемыми, могут быть секретированы из клеток насекомых путем создания химерных молекул ДНК, которые кодируют химерный белок, включающий фрагмент лидерной последовательности, обеспечивающий секрецию белка, чужеродного для насекомых. Фрагмент лидерная последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот и обеспечивающий перемещение белка в эндоплазматический ретикулюм.
После встраивания последовательности ДНК и (или) гена, кодирующего экспрессионный продукт, являющийся предшественником конкретного белка, клетку-хозяина насекомого одновременно трансформируют гетерологичной ДНК доставочного вектора и геномной ДНК бакуловируса дикого типа, обычно с применением котрансфекционных методов. Промотор и сайт терминации транскрипции данной конструкции обычно должны включать сегмент бакуловирусного генома длиной 2-5 т.п.н. Способы внесения гетерологичной ДНК по желаемому сайту в состав бакуловируса известны в данной области техники (см. Summers & Smith, цит. выше; Ju et al., 1987; Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156; Luckow & Summers, 1989). Например, встраивание может быть произведено внутрь гена, такого как ген полиэдрина, для чего используется двойная гомологичная рекомбинация; также встраивание может быть осуществлено по рестрикционному сайту, искусственно созданному в пределах желательного бакуловирусного гена (Miller et al., 1989, BioEssays, 4, 91). В случае клонирования в состав экспрессирующего вектора последовательности ДНК вместо гена полиэдрина, ее фланкируют с обеих сторон (5’ и 3’) последовательностями, специфичными для гена полиэдрина, и помещают ниже полиэдринового промотора.
Заново сформированный бакуловирусный экспрессирующий вектор последовательно упаковывают в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит с низкой частотой (от примерно 1% до примерно 5%), поэтому подавляющее большинство продуцируемых в результате котрансфекции вирусных частиц представлено вирусом дикого типа. Следовательно, к идентификации рекомбинантных вирусов необходим специальный подход. Преимуществом данной экспрессионной системы является возможность визуального скрининга, позволяющего выявлять рекомбинантные вирусы. Белок полиэдрин, характерный для вирусов дикого типа, вырабатывается в очень большом количестве в ядрах инфицированных клеток на поздних этапах вирусной инфекции. Накапливаемый полиэдрин образует включенные тельца, которые также содержат погруженные в них частицы. Такие включенные тельца размером до 15 мкм интенсивно преломляют свет: это придает им яркое свечение, которое может быть легко выявлено в обычном световом микроскопе. В клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом, включенные тельца отсутствуют. Для разграничения рекомбинантных вирусов и вирусов дикого типа трансфекционный надосадочный слой вносят на монослойную культуру клеток насекомых с применением методов, хорошо известных специалистам в данной области техники. А именно бляшки анализируют под световым микроскопом с целью выявления присутствия (как признака вируса дикого типа) или отсутствия (как признака рекомбинантного вируса) включенных телец ("Current Protocols in Microbiology", Vol.2, eds. Ausubel et al., раздел 16.8 (Suppl. 10, 1990); Summers & Smith, цит. выше; Miller et al., 1989).
Рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы были сконструированы с целью инфицирования различных типов клеток насекомых. Например, помимо прочего, рекомбинантные бакуловирусы были сформированы для: комара Aedes aegypti, совки Autographa californica, тутового шелкопряда Bombyx mori, дрозофилы Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и совки Trichoplusia ni (патентная заявка WO 89/046699; Carbonell et al., 1985, J. Virol., 56, 153; Wright, 1986, Nature, 321, 718; Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156; как обзор см. Fraser et al., 1989, In Vitro Cell. Develop. Biol., 25, 225).
Имеются в продаже клетки и культуральные среды как для прямой, так и химерной экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной экспрессионной системе; технология культивирования клеток в целом хорошо известна специалистам в данной области техники (см., например, Summers & Smith, цит. выше).
Модифицированные клетки насекомых затем могут быть выращены в подходящей питательной среде, которая обеспечит стабильное поддержание плазмиды (плазмид), присутствующей в модифицированном насекомом-хозяине. В случае, когда экспрессия продукта гена находится под индуцибельным контролем, организм-хозяин может быть выращен до очень высоких плотностей с последующей индукцией экспрессии. Как альтернатива, когда экспрессия является конститутивной, искомый продукт будет постоянно экспрессироваться в культуральную среду, а питательная среда при этом может непрерывно циркулировать, что позволяет выделять искомый интересующий продукт и пополнять истощаемую питательную среду. Указанный продукт может быть очищен с помощью таких методов, как хроматография, например, ВЭЖХ, аффинная хроматография, ион-обменная хроматография и т.п.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция растворителем; или подобное. Если необходимо, продукт может быть подвергнут дополнительной очистке, чтобы обеспечить удаление по существу любых белков насекомого, которые также секретируются в культуральную среду или появляются после лизиса клеток насекомого, в результате чего обеспечивается получение продукта, который по сути является свободным от дебриса клеток-хозяев, например, их белков, липидов и полисахаридов.
С целью обеспечения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, производные от полученных трансформантов, инкубируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию последовательности, кодирующей рекомбинантный белок. Такие условия могут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако, такие условия легко могут быть подобраны специалистом в данной области техники на основе сведений, известных в данной области техники.
iv. Бактериальные системы
Методы экспрессии в бактериальных клетках хорошо известны в данной области техники. Бактериальным промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию нижерасположенной (в направлении 3’) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. В промоторе должен присутствовать сайт инициации транскрипции, обычно находящийся проксимально по отношению к 5’-концу кодирующей последовательности. Данный сайт инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы и собственно сайт инициации транскрипции. Бактериальный промотор также может включать второй домен, называемый “оператором”, который может перекрываться с соседним сайтом связывания РНК-полимеразы, с которого начинается синтез РНК. Оператор обеспечивает негативно регулируемую (индуцибельную) транскрипцию: репрессорный белок может связываться на операторе, тем самым подавляя транскрипцию конкретного гена. Конститутивная экспрессия может иметь место в отсутствие негативных регуляторных (репрессорных) элементов, таких как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может обеспечиваться последовательностью связывания ген-активирующего фактора: она, если присутствует, обычно находится проксимально (с 5’-стороны) по отношению к сайту связывания РНК-полимеразы. Примером ген-активирующего белка является катаболический активатор (CAP), который является помощником инициации транскрипции lac-оперона у кишечной палочки Escherichia coli (E.coli) (Raibaud et al., 1984, Annu. Rev. Genet., 18, 173). Таким образом, регуляция экспрессии может быть позитивной или негативной, тем самым усиливая или ослабляя транскрипцию.
Последовательности, кодирующие ферменты метаболического пути, представляют конкретно применимые промоторные последовательности. Примерами являются промоторные последовательности, происходящие от генов, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме сахаров, таких как галактоза, лактоза (lac) (Chang et al., 1977, Nature, 198, 1056) и мальтоза. Дополнительными примерами являются промоторные последовательности, производные от биосинтетических ферментов, таких как ферменты биосинтеза триптофана (trp) (Goeddel et al., 1980, Nucl. Acids Res., 8, 4057; Yelverton et al., 1981, Nucl. Acids Res., 9, 731; патент США №4738921; европейские патентные заявки ЕР 036776 и ЕР 121775). Промоторная система β-лактамазы (bla) (Weissmann, 1981, "The cloning of interferon and other mistakes". In "Interferon 3", ed. I.Gresser) и промоторные системы PL λ-фага (Shimatake et al., 1981, Nature, 292, 128) и фага Т5 (патент США №4689406) также применимы в качестве промоторных последовательностей.
Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также могут выполнять роль бактериальных промоторов. Например, последовательности активации транскрипции одного из бактериальных или бактериофаговых промоторов могут быть соединены с оперонными последовательностями другого бактериального или бактериофагового промотора, в результате чего образуется синтетический химерный промотор (патент США №4551433). Например, промотор tac является химерным промотором trp-lac, состоящим из последовательностей промотора trp и оперона lac, которые находятся под контролем lac-репрессора (Amann et al., 1983, Gene, 25, 167; de Boer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 21). Более того, бактериальный промотор может включать естественно встречающиеся промоторы небактериального происхождения, которые обладают способностью связывать бактериальную РНК-полимеразу и запускать транскрипцию. Естественно встречающийся промотор небактериального происхождения также можно соединить с совместимой РНК-полимеразой с обеспечением высокого уровня экспрессии некоторых генов в прокариотических клетках. Система “РНК-полимераза/промотор” нечетного бактериофага Т7 является примером составной промоторной системы (Studier et al., 1986, J. Mol. Biol., 189, 113; Tabor et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1074). Кроме того, химерный промотор также может состоять из бактериофагового промотора и операторного сегмента генома E.coli (европейская патентная заявка ЕР 267851).
В дополнение к функциональной промоторной последовательности функциональный сайт связывания на рибосоме также применим для обеспечения экспрессии чужеродных генов у прокариот. У E.coli сайт связывания на рибосоме называют последовательностью Шайна-Дальгарно (SD): она включает старт-кодон ATG и последовательность из 3-9 нуклеотидов, расположенную на 3-11 нуклеотидов выше старт-кодона (Shine et al., 1975, Nature, 254, 34). Последовательность SD, как считается, способствует связыванию мРНК на рибосоме за счет спаривания оснований последовательности SD и 3’-конца 16S-pPHK E.coli (Steitz et al., 1979, "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In "Biological Regulation and Development: Gene Expression", ed. R.F.Goldberger). Для экспрессии эукариотических генов и прокариотических генов со “слабым” сайтом связывания на рибосоме часто бывает необходимо оптимизовать расстояние между последовательностью SD и кодоном ATG эукариотического гена (Sambrook et al., 1989, "Expression of cloned genes in Escherichia coli", In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual").
Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клетки. Промоторную последовательность можно напрямую присоединить к этой молекуле ДНК: в этом случае первая аминокислота с N-конца полипептида всегда должна быть метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если желательно, метионин с N-конца полипептида может быть отщеплен путем инкубации in vitro с бромцианом или путем инкубации in vivo или in vitro с бактериальным ферментом - пептидазой N-концевого метионина (европейская патентная заявка ЕР 219237).
Химерные белки являются альтернативой прямой экспрессии. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевой участок эндогенного бактериального белка или другого стабильного белка, соединяют с 5’-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. В результате экспрессии такой конструкции образуется химера (гибрид) двух аминокислотных последовательностей. Например, клеточный ген бактериофага λ может быть соединен по своему 5’-концу с чужеродным геном с последующей экспрессией в бактериальных клетках. Получаемый в результате химерный белок предпочтительно сохраняет в своем составе сайт для процессинга с участием фермента (фактора Ха), в результате чего происходит отщепление бактериофагового белка от продукта чужеродного гена (Nagai et al., 1984, Nature, 309, 810). Химерные белки также могут быть сформированы с использованием последовательностей генов lacZ (Jia et al., 1987, Gene, 60, 197), trpE (Allen et al., 1987, J. Biotechnol., 5, 93; Makoff et al., 1989, J. Gen. Microbiol., 135, 11) и Chey (европейская патентная заявка ЕР 324647). Последовательность ДНК в районе соединения двух кодирующих аминокислоты последовательностей может кодировать сайт расщепления, а может и не кодировать его. Другим примером является химерный белок с убиквитином. Данный химерный белок формируется таким образом, чтобы в пределах собственно убиквитинового сегмента предпочтительно сохранялся сайт-мишень для расщепляющего фермента (например, специфичной по процессингу убиквитина протеазы), необходимый для отделения убиквитина от чужеродного полипептида. С применением такого подхода можно выделять нативные чужеродные белки (Miller et al., 1989, Bio/Technology, 7, 698).
Как альтернатива, чужеродные белки также могут быть секретированы клетками за счет создания химерных молекул ДНК, которые кодируют химерный белок, включающий последовательность сигнального пептида, обеспечивающий секрецию чужеродного белка бактериальными клетками (патент США №4336336). Фрагмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, который обеспечивают секрецию белка из клетки. Такой белок секретируется либо в культуральную среду (у грамположительных бактерий), либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и внешней мембранами клетки (у грамотрицательных бактерий). Предпочтительно на участке между сигнальным пептидом и продуктом чужеродного гена присутствуют сайты процессинга, которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro.
ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может происходить от генов, кодирующих секретируемые бактериальные белки, таких как ген белка внешней мембраны E.coli (ompA) (Masui et al., 1983, In "Experimental Manipulation of Gene Expression"; Ghrayeb et al., 1984, EMBO J., 3, 2437) и сигнальная последовательность гена phoA, кодирующего щелочную фосфатазу E.coli (Oka et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7212). В качестве дополнительного примера можно привести сигнальную последовательность гена α-амилазы различных штаммов палочек Bacillus, которая может быть использована для обеспечения секреции гетерологичных белков из клеток B.subtilis (Palva et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582; европейская патентная заявка ЕР 244042).
Обычно сайты терминации транскрипции, распознаваемые бактериями, представлены регуляторными сегментами, находящимися с 3’-стороны от стоп-кодона: соответственно, наряду с промотором они фланкируют кодирующую последовательность. Указанные последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая затем может быть транслирована в полипептид, кодируемый этой ДНК. Сайты терминации транскрипции, как правило, включают последовательности ДНК примерно из 50 нуклеотидов, способные образовывать выпетленные структуры, которые и обеспечивают остановку процесса транскрипции. Примерами являются сайты терминации транскрипции, производные от генов, имеющих сильные промоторы, таких как ген trp E.coli, равно как и от других биосинтетических генов.
Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, сигнальный сегмент (если он желателен), интересующую кодирующую последовательность и сайт терминации транскрипции, вместе встраивают в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в составе репликона, такого как внехромосомный элемент (например, плазмида), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком как бактерия. Репликон должен включать репликационную систему, которая бы обеспечивала ему способность воспроизводиться в прокариотическом организме, предназначенном либо для экспрессии, либо для клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может быть либо высококопийной, либо низкокопийной плазмидой. Высококопийная плазмида должна в принципе характеризоваться числом копий от примерно 5 до примерно 200, а обычно от примерно 10 до примерно 150. Организм-хозяин, несущий высококопийную плазмиду, предпочтительно должен нести по крайней мере примерно 10 плазмид, а более предпочтительно - по крайней мере примерно 20 плазмид. И высококопийные, и низкокопийные векторы могут быть отобраны на основе того влияния, которое вектор и чужеродный белок оказывают на организм-хозяин.
Как альтернатива, экспрессирующие конструкции могут быть внесены в бактериальный геном с использованием интегрирующего вектора. Интегрирующие векторы обычно имеют в своем составе по крайней мере одну последовательность, гомологичную участку бактериальной хромосомы: это обеспечивает вектору возможность встраиваться. Как считается, такая интеграция обусловливается рекомбинацией между гомологичными участками ДНК в составе вектора и бактериальной хромосомы. Например, интегрирующие векторы, сконструированные на основе ДНК различных штаммов Bacillus, встраиваются в хромосому Bacillus (европейская патентная заявка ЕР 127328). Интегрирующие векторы также могут включать бактериофаговые или транспозонные последовательности.
Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут включать селективные маркеры, обеспечивающие отбор бактериальных штаммов, которые претерпели трансформацию. Селективные маркеры могут экспрессироваться в бактериальном организме-хозяине и могут включать гены, которые делают бактерии резистентными к антибиотикам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин (Davies et al., 1978, Annu. Rev. Microbiol., 32, 469). Селективные маркеры также могут включать биосинтетические гены, такие как гены ферментов, вовлеченных в биосинтез гистидина, триптофана и лейцина.
Как альтернатива, некоторые из описанных выше компонентов могут быть включены вместе друг с другом в состав трансформирующих векторов. Трансформирующие векторы обычно включают селективный маркер, который либо сохраняется в репликоне, либо преобразуются в интегрирующий вектор в соответствии с описанным выше.
Экспрессирующие и трансформирующие векторы (в виде либо внехромосомных репликонов, либо интегрирующих векторов) были сконструированы для многих видов бактерий. Например, экспрессирующие векторы были созданы, помимо прочего, для следующих видов бактерий: сенная палочка Bacillus subtilis (Palva et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582; европейские патентные заявки ЕР 036259 и ЕР 063953; международная патентная заявка WO 84/04541), кишечная палочка Escherichia coli (Shimatake et al., 1981, Nature, 292, 128; Amann et al., 1985, Gene, 40, 183; Studier et al., 1986, J. Mol. Biol., 189, 113; европейские патентные заявки ЕР 036776, ЕР 136829 и ЕР 136907), стрептококки Streptococcus cremoris (Powell et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 655), Streptococcus lividans (Powell et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 655), стрептомицет Streptomyces lividans (патент США №4745056).
Способы внесения экзогенной ДНК в бактериальные организмы-хозяева хорошо известны в данной области техники и обычно включают трансформацию бактерий, обработанных хлористым кальцием или другими агентами, такими как двухвалентные катионы и диметилсульфоксид. ДНК также может быть внесена в бактериальные клетки методом электропорации. Трансформационные процедуры обычно варьируются в зависимости от вида бактерии, который предстоит трансформировать: см., например, Masson et al., 1989, FEMS Microbiol. Lett., 60, 273; Palva et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582; европейские патентные заявки ЕР 036259 и ЕР 063953; международная патентная заявка WO 84/04541 (бактерии рода Bacillus), Miller et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 856; Wang et al., 1990, J. Bacteriol., 172, 949 (бактерии рода Campylobacter), Cohen et al., 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110; Dower et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16, 6127; Kushner, 1978, "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColEl-derived plasmids", In "Genetic Engineering: Proc. Intern. Symp. Genet. Engineering", eds. H.W.Boyer & S.Nicosia; Mandel et al., 1970, J. Mol. Biol., 53. 159; Taketo, 1988, Biochim. Biophys. Acta, 949, 318 (Escherichia), Chassy et al., 1987, FEMS Microbiol. Lett., 44, 173 (молочнокислые бактерии рода Lactobacillus), Fiedler et al., 1988, Anal. Biochem., 170, 38 (псевдомонады рода Pseudomonas), Augustin et al., 1990, FEMS Microbiol. Lett., 66, 203 (бактерии рода Staphylococcus), Barany et al., 1980, J. Bacteriol., 144, 698; Harlander, 1987, "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", In "Streptococcal Genetics", eds. J.Ferretti & R.Curtiss III; Perry et al., 1981, Infect. Immunol., 32, 1295; Powell et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 655; Somkuti et al., 1987, Proc. 4th European Congr. Biotechnol., 1, 412 (бактерии рода Streptococcus).
v. Экспрессия в дрожжах
Дрожжевые экспрессионные системы также хорошо известны специалистам в данной области техники. Дрожжевым промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию нижерасположенной (в 3’-направлении) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор должен включать сайт инициации транскрипции, который обычно расположен проксимально по отношению к 5’-концу кодирующей последовательности. Указанный сайт инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы (т.е. “бокс ТАТА”) и (собственно) сайт инициации транскрипции. Дрожжевой промотор также может включать второй домен, называемый “верхней активаторной последовательностью” (UAS), который, когда присутствует, обычно расположен дистально по отношению к структурному гену. Сегмент UAS обеспечивает регулируемую (индуцибельную) экспрессию. Конститутивная экспрессия имеет место при отсутствии сегмента UAS. Регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, что тем самым либо усиливает, либо ослабляет транскрипцию.
Дрожжи - это организм-ферментер, характеризующийся активным метаболизмом: поэтому гены, кодирующие ферменты метаболических путей, предоставляют применимые промоторные последовательности. Примерами являются гены, кодирующие алкоголь - дегидрогеназу (ADH) (европейская патентная заявка ЕР 284044), енолазу, глюкокиназу, глюкозо-6-фосфатизомеразу, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAP или GAPDH), гексокиназу, фосфофруктокиназу, 3-фосфоглицератмутазу и пируваткиназу (РуК) (европейская патентная заявка ЕР 329203). Дрожжевой ген РНO5, кодирующий кислую фосфатазу, также предоставляет применимые промоторные последовательности (Myanohara et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1).
Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также могут функционировать в качестве дрожжевых промоторов. Например, последовательности UAS одного дрожжевого промотора можно соединить с сайтом активации транскрипции другого дрожжевого промотора, в результате чего получают синтетический химерный промотор. Примерами таких химерных (гибридных) промоторов являются регуляторная последовательность гена ADH, соединенная с сайтом активации транскрипции гена GAPDH (патенты США №№4876197 и 4880734). Другие примеры химерных промоторов включают промоторы, в составе которых находятся регуляторные последовательности генов ADH2, GAL4, GAL10 или РНO5, соединенные с сайтами активации транскрипции генов, кодирующих гликолитические ферменты, таких как гены GAPDH или РуК (европейская патентная заявка ЕР 164556). Кроме того, дрожжевой промотор может включать нативные промоторы недрожжевого происхождения, характеризующиеся способностью связывать дрожжевую РНК-полимеразу и тем самым инициировать транскрипцию. Примеры таких промоторов можно, помимо прочего, найти у Cohen et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1078; Henikoff et al., 1981, Nature, 283, 835; Hollenberg et al., 1981, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96, 119; Hollenberg et al., 1979, "The expression of bacterial antibiotic resistance genes in the yeast Saccharomyces cerevisiae". In "Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance", eds. K.N.Timmis & A.Puhler; Mercerau-Puigalon et al., 1980, Gene, 11, 163; Panthier et al., 1980, Curr. Genet., 2, 109.
Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клеток дрожжей. Промоторная последовательность может быть напрямую присоединена к молекуле ДНК: в этом случае первая аминокислота с N-конца рекомбинантного белка всегда будет метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если желательно, метионин с N-конца белка может быть отщеплен in vitro путем инкубации с бромцианом.
Химерные белки представляют альтернативный подход к дрожжевым экспрессионным системам в той же степени, что и в случае с экспрессионными системами для клеток млекопитающих, растений, бакуловирусов и бактерий. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевую часть эндогенного дрожжевого белка или другого стабильного белка, соединяют с 5’-концом гетерологичной кодирующей последовательности. В результате экспрессии такой конструкции образуется химера двух аминокислотных последовательностей. Например, гены дрожжевой или человеческой супероксиддисмутазы (SOD) могут быть соединены с 5’-концом чужеродного гена с последующей экспрессией в дрожжах. Последовательность ДНК в области соединения двух аминокислотных последовательностей может кодировать расщепляемый сайт, а может и не кодировать его: см., например, европейскую патентную заявку ЕР 196056. Другим примером является химерный убиквитинсодержащий белок. Названный химерный белок конструируют таким образом, чтобы предпочтительно убиквитиновый сегмент сохранял сайт-мишень для расщепляющего фермента (например, специфичной для процессинга убиквитина протеазы) с целью отщепления убиквитина от чужеродного белка. С применением данного способа, следовательно, могут быть выделены нативные чужеродные белки (см., например, международную патентную заявку WO 88/024066).
Как альтернатива, чужеродные белки также могут быть секретированы из клетки в питательную среду путем создания химерных молекул ДНК, которые бы кодировали химерный белок, включающий фрагмент сигнальной последовательности, обеспечивающий секрецию чужеродного белка из дрожжевой клетки. Предпочтительно должны присутствовать кодируемые сайты процессинга, расположенные между сигнальным фрагментом и чужеродным геном, которые бы могли быть расщеплены in vivo или in vitro. Лидерная последовательность обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, который обеспечивает секрецию данного белка из клетки.
ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может происходить от генов, кодирующих секретируемые дрожжевые белки, таких как ген инвертазы (европейская патентная заявка ЕР 012873; японский патент 62/096086) и ген А-фактора дрожжей (патент США №4588684). Как альтернатива, существуют лидерные фрагменты недрожжевого происхождения, такие как лидерный фрагмент гена интерферона, которые также обеспечивают секрецию из клеток дрожжей (европейская патентная заявка ЕР 060057).
Предпочтительным классом обеспечивающих секрецию сигнальных фрагментов являются те лидеры, которые используют фрагмент гена α-фактора дрожжей, в составе которого имеется и “пресигнальный”, и “просигнальный” сегменты. Вариантами фрагментов α-фактора, которые можно использовать, являются полноразмерный препролидер α-фактора (примерно 83 аминокислотных остатка), равно как и укороченные варианты сигнальных фрагментов α-фактора (обычно от примерно 25 до примерно 50 аминокислотных остатков) (патенты США №№ 4546083 и 4870008; европейская патентная заявка ЕР 324274). Дополнительными сигнальными фрагментами, основывающимися на лидере α-фактора, которые обеспечивают секрецию, являются химерные α-факторные сигнальные фрагменты, собранные таким образом, что препоследовательности происходят от одного дрожжевого α-фактора, а пропоследовательности - от другого дрожжевого α-фактора (см., например, международную патентную заявку WO 89/02463).
Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые дрожжами, представлены регуляторными последовательностями, расположенными с 3’-стороны от стоп-кодона: т.е. они наряду с промотором фланкируют кодирующую последовательность. Указанные последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая может быть затем транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примерами сайтов терминации транскрипции и других распознаваемых дрожжами терминирующих последовательностей являются те элементы, которые входят в состав генов, кодирующих гликолитические ферменты.
Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, лидер (если он желателен), интересующую кодирующую последовательность и сайт терминации транскрипции, вместе вносят в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции обычно поддерживаются в виде репликона, такого как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способного стабильно существовать в организме-хозяине, таком как дрожжи или бактерия. Такой репликон может включать две репликационные системы: это обеспечит поддержание, например, в дрожжах с целью экспрессии и в прокариотической клетке с целью клонирования и амплификации. Примерами таких бифункциональных бактериально-дрожжевых векторов являются плазмиды YEp24 (Botstein et al., 1979, Gene, 8, 17-24), pCl/1 (Brake et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 81, 4642-4646) и YRp17 (Stinchcomb et al., 1982, J. Mol. Biol., 158, 157). Кроме того, репликон может являться либо высококопийной, либо низкокопийной плазмидой. Высокопийная плазмида в принципе будет характеризоваться числом копий от примерно 5 до примерно 200, а обычно от примерно 10 до примерно 150. Клетка-хозяин, несущая высококопийную плазмиду, предпочтительно должна нести по крайней мере примерно 10 и более предпочтительно по крайней мере примерно 20 копий. Присутствие высококопийного или низкокопийного вектора может быть отобрано, исходя из того влияния, которое оказывает такой вектор и кодируемый им чужеродный белок на организм-хозяин: см., например. Brake et al., цит. выше.
Как альтернатива, экспрессирующие конструкции могут быть встроены в дрожжевой геном с использованием интегрирующего вектора. Обычно интегрирующие векторы включают по крайней мере одну последовательность, гомологичную участку дрожжевой хромосомы, которая и обеспечивает встраивание этого вектора, а предпочтительно включает две гомологичные последовательности, фланкирующие экспрессирующую конструкцию. Считается, что интеграция является следствием рекомбинации между гомологичными участками ДНК вектора и дрожжевой хромосомы (Orr-Weaver et al., 1983, Meth. Enzymol., 101, 228-245). Интегрирующий вектор может быть направлен в конкретный локус генома дрожжей путем выбора соответствующей гомологичной последовательности, включаемой в состав этого вектора: см. Orr-Weaver et al., цит. выше. Одна или большее число экспрессирующих конструкций могут встраиваться так, что, возможно, обусловят изменение уровня выработки рекомбинантного белка (Rine et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6750). Хромосомные последовательности, включаемые в состав данного вектора, могут находиться в нем либо в виде единственного сегмента, который обусловливает интеграцию всего вектора, либо в виде двух сегментов, которые гомологичны соседним сегментам хромосомы и фланкируют экспрессирующую конструкцию данного вектора - тогда в результате произойдет стабильное встраивание только самой экспрессирующей конструкции.
Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут нести селективные маркеры, обеспечивающие отбор дрожжевых штаммов, прошедших успешную трансформацию. Селективными маркерами могут являться гены, кодирующие ферменты биосинтетических путей, которые могут экспрессироваться в клетках-хозяевах дрожжей, такие как гены ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, а также ALG7 и ген резистентности к G418, которые придают резистентность клеткам дрожжей к туникамицину и G418, соответственно. Кроме того, подходящий селективный маркер также может придавать дрожжам способность расти в присутствии токсичных веществ, таких как ионы металлов. Например, присутствие гена CUP1 обеспечивает дрожжам рост в присутствии ионов меди (Butt et al., 1987, Microbiol. Rev., 51, 351).
Как альтернатива, некоторые из описанных выше компонентов могут быть включены вместе друг с другом в состав трансформирующих векторов. Трансформирующие векторы обычно включают селективный маркер, который либо поддерживается в виде репликона, либо преобразуется в интегрирующий вектор в соответствии с описанным выше.
Экспрессирующие и трансформирующие векторы (в виде либо внехромосомных репликонов, либо интегрирующих векторов) были сконструированы для трансформации многих видов дрожжей. Например, экспрессирующие векторы и способы введения экзогенной ДНК в клетки-хозяева дрожжей были разработаны, помимо прочего, для следующих видов дрожжей: Candida albicans (Kurtz et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6,.142), Candida maltosa (Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141), Hansenula polymorpha (Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol., 132, 3459; Roggenkamp et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 202, 302), Kluyveromyces fragilis (Das et al., 1984, J. Bacteriol., 158, 1165), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al., 1983, J. Bacteriol., 154, 737; Van den Berg et al., 1990, Bio/Technol., 8, 135), Pichia guillerimondii (Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141), Pichia pastoris (Cregg et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 3376; патенты США №№4837148 и 4929555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929; Ito et al., 1983, J. Bacteriol., 153, 163), Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, 1981, Nature, 300, 706) и Yarrowia lipolytica (Davidow et al., 1985, Curr. Genet., 10, 380471; Gaillardin et al., 1985, Curr. Genet., 10, 49).
Способы внесения экзогенной ДНК в дрожжевые клетки-хозяева хорошо известны в данной области техники и обычно включают трансформацию либо сферопластов, либо интактных дрожжевых клеток, обработанных щелочными катионами. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от вида дрожжей, трансформация которого осуществляется: см., например, Kurtz et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 142; Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141 (дрожжи рода Candida); Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol., 132, 3459; Roggenkamp et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 202, 302 (род Hansenula); Das et al., 1984, J. Bacteriol., 158, 1165; De Louvencourt et al., 1983, J. Bacteriol., 154, 1165; Van den Berg et al., 1990, Bio/Technol., 8, 135 (род Kluyveromyces); Cregg et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 3376; Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141; патенты США №№4837148 и 4929555 (род Pichia); Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929; Ito et al., 1983, J. Bacteriol., 153, 163 (род Saccharomyces); Beach & Nurse, 1981, Nature, 300, 706 (род Schizosaccharomyces); Davidow et al., 1985, Curr. Genet., 10, 39; Gaillardin et al., 1985, Curr. Genet., 10, 49 (род Yarrowia).
Определения
Композиция, содержащая X, “в существенной степени свободна от Y” тогда, когда по крайней мере 85% по массе от суммы X+Y в композиции приходится на долю X. Предпочтительно Х составляет по крайней мере примерно 90% по массе от общего количества X+Y в данной композиции, более предпочтительно - по крайней мере примерно 95% или даже 99% по массе.
Термин “гетерологичный” относится к двум биологическим компонентам, которые не встречаются вместе в природе. Такими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные сегменты, такие как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты в природе вместе не обнаруживаются, они могут обладать совместной функциональностью, например, когда промотор, гетерологичный по отношению к гену, функционально с ним соединен. Другим примером является такая ситуация, в которой последовательность нейссерии гетерологична по отношению к мышиной клетке-хозяину.
“Сайт начала репликации” обозначает полинуклеотидную последовательность, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Сайт начала репликации ведет себя как автономная единица полинуклеотидной репликации в клетке, обеспечивая способность к репликации под собственным контролем. Присутствие сайта начала репликации может быть необходимым для обеспечения репликации вектора в конкретной клетке-хозяине. При наличии некоторых сайтов начала репликации экспрессирующий вектор может воспроизводиться в большом числе копий в присутствии подходящих белков внутри клетки. Примерами сайтов начала репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, которые эффективны в клетках дрожжей, а также вирусные Т-антигены, эффективные в клетках COS-7.
Термин “мутантная последовательность” определяет ДНК, РНК или аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной или заявленной последовательности, но имеющую сходство с ней. В зависимости от конкретной последовательности степень гомологии (сходства) при сравнении нативной или заявленной последовательности и мутантной последовательности предпочтительно превышает 50% (например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или больше), что подсчитывают в соответствии с описанным выше. По использованию в данном тексте термин “аллельный вариант” молекулы нуклеиновой кислоты или участка, для которого здесь представляется нуклеотидная последовательность, является молекулой нуклеиновой кислоты или сегментом, который находится в том же самом локусе конкретного генома другого или второго изолята, при том, что, вследствие естественной изменчивости, обусловливаемой, например, мутационным или рекомбинационным процессами, характеризуется сходной, но не идентичной нуклеотидной последовательностью. Кодирующий сегмент аллельного варианта обычно кодирует белок, обладающий сходным уровнем активности по сравнению с таковым у белка, кодируемого тем геном, с которым проводится данное сравнение. Аллельный вариант также может включать изменения в 5’- или 3’-нетранслируемых участках конкретного гена, таких как регуляторные сегменты (см., например, патент США №5753235).
Антитела
По использованию в данном тексте термин “антитело” обозначает полипептид или группу полипептидов, включающие по крайней мере один активный центр антитела (антиген-связывающий сайт). Понятие “антиген-связывающий сайт” обозначает пространственную структуру, параметры поверхности и распределение заряда у которой комплементарны параметрам эпитопа антигена: это обеспечивает связывание антитела с соответствующим антигеном. Понятие “антитело” охватывает, например, антитела позвоночных животных, химерные антитела, гибридные антитела, гуманизованные антитела, измененные антитела, моновалентные антитела, фрагменты Fab и монодоменные антитела.
Антитела, специфичные в отношении белков по настоящему изобретению, применимы в аффинной хроматографии, иммунологических тестах и в выявлении и идентификации белков нейссерии МеnВ. Антитела, индуцированные к белкам по настоящему изобретению, связываются с антигенными полипептидами или белками, или белковыми фрагментами, которые имеются у штаммов Neisseria meningitidis MenB и специфически с ними ассоциированы. В некоторых случаях указанные антигены могут быть связаны с конкретными штаммами, как, например, антигены, специфичные для штаммов МеnВ. Антитела по настоящему изобретению могут быть иммобилизованы на носитель и использованы в иммунологическом тесте или на аффинной хроматографической колонке с целью выявления и/или разделения полипептидов, белков или белковых фрагментов, или клеток, включающих такие полипептиды, белки или белковые фрагменты. Как альтернатива, такие полипептиды, белки или белковые фрагменты могут быть иммобилизованы так, чтобы выявлять антитела, способные связываться специфически с ними.
Антитела, специфичные в отношении белков по настоящему изобретению, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены с применением стандартных методов. В целом, вначале белок используют для иммунизации подходящего животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики и козы являются предпочтительными объектами для получения поликлональных сывороток благодаря получению значительного объема сыворотки крови, а также доступности помеченных антикроличьих и антикозьих антител. Иммунизацию обычно проводят путем перемешивания или эмульгирования конкретного белка в физиологическом растворе, предпочтительно с адъювантом, таким как полный адъювант Фрейнда, с последующим введением полученной смеси или эмульсии парентеральным путем (обычно путем подкожной или внутримышечной инъекции). Обычно достаточными дозами являются по 50-200 мкг за одну инъекцию. Иммунизацию обычно бустируют через 2-6 недель путем одной или нескольких дополнительных инъекций белка в физиологическом растворе, предпочтительно с включением неполного адъюванта Фрейнда. Также антитела могут быть получены альтернативным путем с помощью иммунизации in vitro с применением известных в данной области техники методов, которые с точки зрения целей настоящего изобретения эквивалентны иммунизации in vivo. Поликлональные антисыворотки получают путем отбора крови у иммунизованных животных в стеклянную или пластиковую емкость с последующей инкубацией крови при 25°С в течение 1 часа и затем инкубацией при 4°С в течение 2-18 часов. Сыворотку выделяют центрифугированием (например, при 1000 g в течение 10 минут). У кроликов за один раз можно получить 20-50 мл крови.
Моноклональные антитела получают с использованием стандартного метода Келера-Мильштейна (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256, 495-496) или его модификаций. Обычно в соответствии с описанным выше иммунизуют мышь или крысу. Однако, в отличие от взятия крови у животных с целью получения сыворотки, в данном методе удаляют селезенку (и, что необязательно, некоторые крупные лимфатические узлы) и мацерируют ткань с целью разделения отдельных клеток. Если желательно, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления не специфически адгезировавшихся клеток) путем нанесения клеточной суспензии на планшет или в отдельную планшетную лунку, покрытые белком-антигеном. В-лимфоциты, экспрессирующие связанный с мембраной иммуноглобулин, специфичный в отношении тестируемого антигена, связываются на планшете таким образом, что с остатком суспензии не смываются с него. Затем проводят слияние полученных в результате В-лимфоцитов или же всех мацерированных спленоцитов с миеломными клетками, в результате чего образуются гибридомы: их затем культивируют в селективной среде (например, в среде HAT, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Полученные в результате гибридомы высевают в ограничивающем разведении и тестируют на выработку антител, которые специфическим образом связываются с использовавшимся для иммунизации антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Отобранные гибридомы, секретирующие моноклональные антитела (mAb), затем культивируют либо in vitro (например, в ферментерах в виде пучка полых волокон или стеклянных емкостях для тканевых культур), либо in vivo (в асцитной жидкости у мышей).
Если желательно, антитела (как поликлональные, так и моноклональные) могут быть помечены с применением стандартных методов. Подходящими метками являются флуорофоры, хромофоры, радионуклиды (в частности, 32P и 125I), электронно-плотные реагенты, ферменты и лиганды, для которых известны специфичные партнеры по связыванию. Ферменты обычно выявляют по их каталитической активности. Например, пероксидазу хрена обычно выявляют по ее способности конвертировать 3,3’,5,5’-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, количественно оцениваемый на спектрофотометре. Термин “специфичный партнер по связыванию” обозначает белок, способный связывать молекулу-лиганд, проявляя при этом высокий уровень специфичности, как, например, в случае с антигеном и специфичным в отношении него моноклональным антителом. Другими примерами специфичных партнеров по связыванию являются биотин и авидин (или стрептавидин), иммуноглобулин-G и белок-А, а также многочисленные пары рецепторов и их лигандов, известные в данной области техники. Должно быть понятно, что приведенное выше описание не претендует на классификацию различных маркеров с разделением их на какие-либо классы, поскольку одна и та же метка может быть использована в нескольких различных подходах. Например, изотоп 125I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве электронно-плотного агента. Пероксидаза хрена может являться и ферментом, и антигеном для моноклонального антитела. Кроме того, можно для достижения желаемого эффекта сочетать различные метки. Например, mAb и авидин в одинаковой степени нуждаются в мечении в связи с настоящим изобретением: следовательно, можно пометить mAb биотином и выявлять его присутствие с использованием авидина, помеченного, в свою очередь, изотопом 125I, или с помощью антибиотинового моноклонального антитела, помеченного пероксидазой хрена. Другие варианты и возможности будут очевидны специалистам в данной области техники и в объеме настоящего изобретения рассматриваются как эквивалентные.
Антигены, иммуногены, полипептиды, белки или белковые фрагменты по настоящему изобретению вызывают образование специфических партнеров по связыванию - антител. Указанные антигены, иммуногены, полипептиды, белки или белковые фрагменты по настоящему изобретению включают иммуногенные композиции по настоящему изобретению. Такие иммуногенные композиции могут дополнительно содержать или включать адъюванты, носители или другие композиции, которые стимулируют или усиливают, или стабилизируют антигены, полипептиды, белки или белковые фрагменты по настоящему изобретению. Такие адъюванты и носители будут очевидны для специалистов в данной области техники.
Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции могут содержать полипептиды, антитела или нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению. Фармацевтические композиции должны содержать терапевтически эффективное количество полипептидов, антител или полинуклеотидов, заявленных настоящим изобретением.
Термин “терапевтически эффективное количество” по использованию в данном тексте обозначает количество терапевтического средства, предназначенное для лечения, облегчения симптомов или профилактики конкретного заболевания или состояния или обеспечения проявления выявляемого лечебного или профилактического эффекта. Такой эффект может быть выявлен, например, по уровням химических маркеров или антигенов. Лечебные эффекты также включают ослабление физических симптомов, например, понижение температуры тела у больного с лихорадочным состоянием. Точное эффективное количество в отношении конкретного индивидуума будет зависеть от массы тела и состояния здоровья, от природы и степени выраженности болезненного состояния, а также от типов лекарственных средств или их сочетаний, выбранных для применения. Следовательно, отсутствует необходимость в изначальном точном определении эффективного количества. Однако эффективное количество для конкретной ситуации может быть определено с помощью стандартных испытаний: такой подход находится в области компетенции лечащего врача.
Для целей настоящего изобретения эффективная доза должна находиться в пределах от примерно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг конструкций ДНК в приложении к конкретному субъекту, которому она будет введена.
Фармацевтическая композиция также может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин “фармацевтически приемлемый носитель” обозначает носитель, используемый для введения лекарственного средства, такого как антитела или полипептид, гены или другие лекарственные средства. Данный термин обозначает любой фармацевтический носитель, который сам по себе не индуцирует выработки антител, опасных для индивидуума, получающего фармацевтическую композицию, т.е. который можно ввести, не вызывая незапланированную токсичность. Подходящими носителями могут быть крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры и инактивированные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники.
Могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли: например, соли неорганических кислот, такие как хлориды, бромиды, фосфаты, сульфаты и подобное, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и подобное. Детальное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей можно найти в справочнике Remington’s Pharmaceutical Sciences (Mack Publ. Co., NJ, 1991).
Фармацевтически приемлемые носители в составе терапевтических композиций могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этиловый спирт. Кроме того, в таких составах могут присутствовать вспомогательные компоненты, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные компоненты, используемые для регуляции рН, и подобное. Обычно терапевтические композиции приготавливают в виде составов для инъекций, имеющих форму растворов или суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях непосредственно перед проведением инъекций. Также в определение фармацевтически приемлемого носителя включаются липосомы.
Способы доставки
После приготовления фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть введены больному напрямую. Пациентами, лечение которых проводится, могут быть животные; в частности, лечение может проводиться в отношении человека.
Прямая доставка композиций в принципе должна осуществляться с помощью инъекций - подкожных, внутрибрюшинных, внутривенных или внутримышечных, - или путем доставки в интерстициальную область ткани. Также композиции могут быть введены в повреждение. Другие пути введения включают пероральное и внутрилегочное, в виде суппозиториев и трансдермальное применение или применение “через кожу”, с помощью игл, “генных ружей” или гипоспрэев. Дозировки могут включать в себя режимы однократных или многократных доз.
Вакцины
Вакцины в соответствии с настоящим изобретением могут быть либо профилактическими (т.е. призванными не допускать заражения), либо лечебными (т.е. лечить уже имеющееся заболевание).
Такие вакцины включают иммунизующий антиген (антигены) или иммуноген (иммуногены), иммуногенный полипептид, белок (белки) или белковые фрагменты, или нуклеиновые кислоты (например, рибонуклеиновую кислоту или дезоксирибонуклеиновую кислоту), обычно в сочетании с “фармацевтически приемлемыми носителями”, - т.е. любыми носителями, которые сами по себе не индуцируют выработку антител, опасных для субъекта, получающего данную композицию. Подходящими носителями обычно являются крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры, липидные агрегации (такие как масляные капли или липосомы) и инактивированные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники. Кроме того, указанные носители могут функционировать в качестве иммуностимуляторов (“адъювантов”). Более того, антиген или иммуноген может быть соединен с бактериальным анатоксином, таким как дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, холерный анатоксин, анатоксин Н.pylori и других патогенов.
Предпочтительными адъювантами, предназначенными для усиления эффективности конкретной композиции, являются, тем самым не ограничиваясь: (1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.п.; (2) препараты эмульсий “масло в воде” (вместе с другими специфичными иммуностимуляторами, такими как мурамиловые пептиды [см. ниже], или компоненты бактериальных клеточных стенок, или без них), такие как, например, (а) препарат MF59™ (заявка WO 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5% Твин-80 и 0,5% Span-85 (необязательно включающий различные количества МТР-РЕ [см. ниже], хотя это и не является необходимым), приготавливаемый в виде субмикронных частиц с использованием микродиспергатора, такого как микродиспергатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA); (b) препарат SAF, содержащий 10% сквалана, 0,4% Твин-80, 5% заблокированного полимера L121 и треонил-MDP (см. ниже) либо микродиспергированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный с получением эмульсии более крупных частиц, и (с) адъювантная система Ribi™ (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 2% сквалена, 0,2% Твин-80 и один или несколько компонентов бактериальных клеточных стенок, представленных группой, включающей монофосфориллипид-А (MPL), димиколаттрегалозу (TDM) и препарат скелета клеточных стенок (CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detox™); (3) сапониновые адъюванты, такие как Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), могут быть использованы, равно как и сформированные на их основе частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); (4) полный адъювант Фрейнда (CFA) и неполный адъювант Фрейнда (IFA); (5) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и др.), интерфероны (например, γ-интерферон), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор некроза опухолей (TNF) и др.; (6) детоксицифированные мутантные варианты бактериального АДФ-рибозилирующего токсина, такого как холерный токсин (СТ), коклюшный токсин (РТ) или теплолабильный токсин E.coli (LT), в частности, LT-K63, LT-R72, CT-S109, PT-K9/G129: см., например, международные патентные заявки WO 93/13302 и WO 92/19265; и (7) другие вещества, которые действуют как иммуностимуляторы, усиливающие эффективность данной композиции. Предпочтительными являются квасцы и препарат MF59™.
Как указывалось выше, мурамиловые пептиды включают, тем самым не исчерпываясь, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (треонил-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1’-2’-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ) и т.п.
Вакцинные композиции, содержащие иммуногенные композиции (которые, например, могут содержать антиген, фармацевтически приемлемый носитель и адъювант), обычно должны содержать разбавители, такие как вода, физиологический раствор, глицерин, этанол и т.п. Кроме того, в таких наполнителях могут присутствовать вспомогательные компоненты, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, вещества для поддержания рН и подобное. Как альтернатива, вакцинные композиции, содержащие иммуногенные композиции, могут содержать антиген, полипептид, белок, белковый фрагмент или нуклеиновую кислоту в фармацевтически приемлемом носителе.
Более конкретно, вакцины, содержащие иммуногенные композиции, содержат иммунологически эффективное количество иммуногенных полипептидов, а также любые иные упоминавшиеся выше компоненты, если это необходимо. Под “иммунологически эффективным количеством” понимается то, что введение такого количества субъекту в виде либо однократной дозы, либо многократных доз эффективно с точки зрения лечения или профилактики. Данное количество зависит от физического состояния и состояния здоровья индивидуума, к которому оно применяется, от таксономической принадлежности индивидуума (например, принадлежности к нечеловекообразным приматам, вообще к приматам и т.п.), способности иммунной системы индивидуума вырабатывать антитела, желаемой степени защиты, состава вакцины, оценки ситуации лечащим врачом и других влияющих факторов. Можно ожидать, что данное количество будет попадать в весьма широкий диапазон, который можно установить с применением стандартных испытаний.
Обычно вакцинные композиции или иммуногенные композиции приготавливают в инъецируемой форме в виде либо жидких растворов, либо суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидких носителях перед инъекцией. Препараты также могут быть эмульгированы или инкапсулированы в липосомы для усиления действия адъюванта, что обсуждалось выше в связи с фармацевтически приемлемыми носителями.
Иммуногенные композиции стандартным образом вводят парентерально, например, с помощью инъекции подкожно или внутримышечно. Дополнительными препаратами, пригодными для иных путей введения, являются пероральные и легочные препараты, суппозитории и препараты для трансдермального применения. Режим доз может включать однократную или многократные дозы. Вакцина может быть введена в сочетании с другими иммунорегуляторными средствами.
В качестве альтернативы вакцине, основанной на белковом компоненте, может быть применена ДНК-вакцинация (см., например, Robinson & Torres, 1997, Seminars Immunol., 9, 271-283; Donnelly et al., 1997, Annu. Rev. Immunol., 15, 617-648).
Ген-доставочные системы
Генотерапевтические приспособления для доставки конструкций, несущих кодирующую последовательность терапевтического назначения по настоящему изобретению, которая предназначена для введения млекопитающему для экспрессии в его организме, могут быть введены либо по месту, либо системным путем. Указанные конструкции могут быть связаны с подходами, осуществляемыми in vivo или ex vivo и основанными на вирусных или невирусных векторах. Экспрессию такой кодирующей последовательности можно индуцировать с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности in vivo может носить как конститутивный, так и индуцибельный (регулируемый) характер.
Настоящее изобретение охватывает ген-доставочные системы, способные экспрессировать предусматриваемые нуклеотидные последовательности. Ген-доставочная система предпочтительно основывается на вирусном векторе и, что более предпочтительно, на ретровирусном, аденовирусном, адено-ассоциированном (AAV) вирусном, герпесвирусном или альфавирусном векторе. Вирусный вектор также может быть астровирусным, коронавирусным, ортомиксовирусным, паповавирусным, парамиксовирусным, парвовирусным, пикорнавирусным, поксвирусным или тогавирусным вектором: в качестве обзоров см. Jolly, 1994, Cancer Gene Therapy, 1, 51-64; Kimura, 1994, Hum. Gene Therapy, 5, 845-852; Connelly, 1995, Hum. Gene Therapy, 6, 185-193; Kaplitt, 1994, Nature Genet., 6, 148-153.
Ретровирусные векторы хорошо известны в данной области техники, включая ретровирусы типов В, С и D, ксенотропные ретровирусы, например, штаммы NZB-X1, NZB-X2 и NZB9-1 (см. O’Neill, 1985, J. Virol., 53, 160), политропные ретровирусы, например, MCF и MCF-MLV (см. Kelly, 1983, J. Virol., 45, 291), спумавирусы и лентивирусы; см. "RNA Tumor Viruses", 2d ed., Cold Spring Harbor Lab., 1985.
Фрагменты ретровирусного генотерапевтического вектора могут происходить от различных ретровирусов. Например, входящие в состав ретровирусного вектора длинные концевые повторы (LTR) могут происходить от вируса саркомы мышей, сайт связывания тРНК - от вируса саркомы Рауса, “упаковочный сигнал” - от вируса лейкоза мышей, а сайт начала репликации второй цепи - от вируса лейкоза птиц.
Названные рекомбинантные ретровирусные векторы могут быть использованы для создания компетентных по трансдукции ретровирусных векторных частиц, что достигается путем внесения их в подходящую “упаковочную клеточную линию” (см. патент США №5591624). Ретровирусные векторы могут быть сконструированы с целью обеспечения сайт-специфичной интеграции в ДНК клетки-хозяина, что достигается включением гена химерного интегразного фермента в состав вирусной частицы (см. международную патентную заявку WO 96/37626). Предпочтительно, чтобы такой рекомбинантный вирусный вектор являлся рекомбинантным вирусом, дефектным по репликации.
“Упаковочные клеточные линии”, пригодные для использования для описанных выше ретровирусных векторов, хорошо известны в данной области техники, могут быть легко созданы (см. международные патентные заявки WO 95/30763 и WO 92/05266) и использованы для создания продукционных клеточных линий (также называемых “векторными клеточными линиями”, или “VCL”), предназначенных для выработки рекомбинантных векторных частиц. Предпочтительно упаковочные клеточные линии формируют на основе человеческих клеток (например, клеток линии НТ1080) или на основе клеток норки, которые исключают инактивацию сывороткой человека.
Предпочтительными ретровирусами, пригодными для конструирования ретровирусных генотерапевтических векторов, являются вирус лейкоза птиц, вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус лейкоза мышей, вирус очаговой индукции в клетках норки, вирус саркомы мыши, вирус ретикулоэндотелиоза и вирус саркомы Рауса. Конкретно предпочтительными вирусами лейкоза мышей являются штаммы 4070А и 1504А (Hartley & Rowe, 1976, J. Virol., 19, 19-25), вирус саркомы Абельсона (АТСС №VR-999), вирус Фрэнда (АТСС №VR-245), вирусы Грэффи и Гросса (АТСС №VR-590), вирусы Кирстена, Харви и Раушера (АТСС №VR-998) и вирус лейкоза мышей Молони (АТСС №VR-190). Названные ретровирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как Американская коллекция типовых культур (“АТСС”), находящаяся в Роквилле (штат Мэриленд), или выделены из известных источников с применением стандартных методик.
Примерами известных ретровирусных генотерапевтических векторов, применимых в практике настоящего изобретения, являются те векторы, которые описаны в патентных заявках - британской GB 2200651, европейских ЕР 0415731, ЕР 0345242, ЕР 0334301, международных WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, WO 91/02825, WO 95/07994, патентах США №№5219740, 4405712, 4861719, 4980289, 4777127, 5591624; см. также Vile, 1993, Cancer Res., 53, 3860-3864; Vile, 1993, Cancer Res., 53, 962-967; Ram, 1993, Cancer Res., 53, 83-88; Takamiya, 1992, J. Neurosci. Res., 33, 493-503; Baba, 1993, J. Neurosurgery, 79, 729-735; Mann, 1983, Cell, 33, 153; Cane, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6349; Miller, 1990, Hum. Gene Therapy, 1.
Векторы для генотерапии, основанные на аденовирусах человека, также хорошо известны в данной области техники и применимы в связи с настоящим изобретением: см., например, Berkner, 1988, Biotechniques, 6, 616 и Rosenfeld, 1991, Science, 252, 431, а также международные патентные заявки WO 93/07283, WO 93/06223 и WO 93/07282. Примерами известных аденовирусных генотерапевтических векторов, применимых для целей настоящего изобретения, являются те векторы, которые описаны в цитировавшихся выше источниках и в международных патентных заявках WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984, WO 95/00655, WO 95/27071, WO 95/29993, WO 95/34671, WO 96/05320, WO 94/08026, WO 94/11506, WO 93/06223, WO 94/24299, WO 95/14102, WO 95/24297, WO 95/02697, WO 94/28152, WO 94/24299, WO 95/09241, WO 95/25807, WO 95/05835, WO 94/18922 и WO 95/09654. С другой стороны, может быть применено внесение ДНК, соединенной с убитым аденовирусом, описанное у Curiel, 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154. Ген-доставочные системы по настоящему изобретению также могут основываться на адено-ассоциированных вирусах (вирусах-помощниках аденовирусов) (AAV). Ведущими и предпочтительными примерами таких векторов в связи с их использованием в настоящем изобретении являются векторы, основанные на штамме AAV-2, заявленные Srivastava в международной патентной заявке WO 93/09239. Наиболее предпочтительные AAV-векторы включают два инвертированных концевых повтора из генома AAV, в которых нативные D-последовательности модифицированы путем нуклеотидных замен таким образом, чтобы по крайней мере пять нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, а предпочтительно по крайней мере 10 нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, а наиболее предпочтительно 10 нативных нуклеотидов сохранялись, а остальные нуклеотиды из состава D-последовательности делетируют или заменяют на ненативные нуклеотиды. Нативные D-последовательности из состава инвертированных концевых повторов AAV являются 20-нуклеотидными мотивами, имеющимися в каждом инвертированном концевом повторе AAV (т.е. в каждом концевом участке имеется один такой мотив), которые не участвуют в образовании хелперных частиц. Ненативный заменяющий нуклеотид может быть любым нуклеотидом, помимо нуклеотида, имеющегося в составе нативной D-последовательности в том же положении. Другими применимыми примерами векторов на основе вирусов AAV являются pWP-19 и pWN-1: оба они описаны у Nahreini, 1993, Gene, 124, 257-262. Другим примером такого AAV-вектора является вектор psub201 (см. Samulski, 1987, J. Virol., 61, 3096). Другим примером AAV-вектора является вектор Double-D-ITR. Конструирование вектора Double-D-ITR описано в патенте США №5478745. Другими векторами являются векторы, заявленные Carter в патенте США №4797368 и Muzyczka в патенте США №5139941, а также Chartejee в патенте США №5474935 и Kotin в международной заявке WO 94/288157. Еще одним примером AAV-вектора, применимого в связи с настоящим изобретением, является конструкция SSV9AFABTKneo: она включает энхансер AFP и промотор гена альбумина и обеспечивает экспрессию преимущественно в печени. Ее структура и конструирование описаны у Su, 1996, Hum. Gene Therapy, 7, 463-470. Еще ряд AAV-векторов для генотерапии описан в патентах США №№5354678, 5173414, 5139941 и 5252479.
Генотерапевтические векторы по настоящему изобретению также охватывают векторы на основе герпесвируса. Ведущими и предпочтительными примерами являются векторы на основе вируса простого герпеса, включающие последовательность, кодирующую тимидинкиназу, например, векторы, описанные в патенте США №5288641 и европейской заявке ЕР 0176170 (подана Roizman). Дополнительными примерами векторов на основе вируса простого герпеса являются HFEM/ICP6-LacZ, заявленный в WO 95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, описанный у Geller, 1988, Science, 241, 1667-1669 и в международных патентных заявках WO 90/09441 и WO 92/07945; вектор HSV Us3::pgC-lacZ, описанный у Fink, 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 11-19, и векторы HSV 7134, 2-RH-105 и GAL4, описанные в европейской патентной заявке ЕР 0453242 (Breakefield), а также те, которые внесены в коллекцию АТСС под депозитарными №№АТСС VR-977 и АТСС VR-260.
Также предусматриваются генотерапевтические векторы на основе альфавирусов, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Предпочтительными являются векторы на основе альфавирусов Синдбис. Тогавирусы: вирус Semliki Forest (ATCC VR-67; АТСС VR-1247), вирус Мидлберга (АТСС VR-370), вирус лихорадки реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246), вирус венесуэльского энцефалита лошадей (АТСС VR-923; АТСС VR-1250; АТСС VR-1249; АТСС VR-532) и те тогавирусы, которые описаны в патентах США №№5091309 и 5217879 и в международной патентной заявке WO 92/10578. Более конкретно, применимы альфавирусные векторы, которые описаны в заявке на патент США №08/405627, поданной 15 марта 1995 г., в международных патентных заявках WO 94/21792, WO 92/10578 и WO 95/07994 и в патентах США №№5091309 и 5217879. Такие альфавирусы могут быть доступны из депозитариев или коллекций, таких как коллекция АТСС в Роквилле (штат Мэриленд), или выделены из известных источников с применением стандартных методов. Предпочтительно должны использоваться альфавирусные векторы, характеризующиеся пониженной цитотоксичностью (см. заявку на патент США №08/679640).
ДНК-векторные системы, такие как эукариотические “послойные” экспрессионные системы, также применимы для экспрессии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению: см. международную патентную заявку WO 95/07994, в которой имеется подробное описание эукариотических “послойных” экспрессионных систем. Предпочтительно эукариотические “послойные” экспрессионные системы по настоящему изобретению основываются на альфавирусных векторах, а наиболее предпочтительно - на векторах, в основе которых находится геном вируса Синдбис.
Другие вирусные векторы, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают векторы, происходящие от полиовирусов, например, АТСС VR-58 и тех, которые описаны у Evans, 1989, Nature, 339, 385 и Sabin, 1973, J. Biol. Standard., 1, 115; от риновирусов, например, АТСС VR-1110 и тех, которые описаны у Arnold, 1990, J. Cell. Biochem., L401; от поксвирусов, таких как канареечный поксивирус и вирус коровьей оспы, например, АТСС VR-111 и АТСС VR-2010 и те, которые описаны у Fisher-Hoch, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 317; Flexner, 1989, Ann. N.Y.Acad. Sci., 569, 86; Flexner, 1990, Vaccine, 8, 17; в патентах США №№4603112 и 4769330 и международной патентной заявке WO 89/01973; от вируса обезьян SV40, например, АТСС VR-305 и тех, которые описаны у Mulligan, 1979, Nature, 277, 108 и Madzak, 1992, J. Gen. Virol., 73, 1533; от вируса гриппа, например, АТСС VR-797 и рекомбинантных вирусов гриппа, которые использовались в методиках обратной генетики в соответствии с описанным в патенте США №5166057 и у Enami, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3802-3805; Enami & Palese, 1991, J. Virol., 65, 2711-2713 и Luytjes, 1989, Cell, 59, 110 (см. также McMichael, 1983, New England J. Med., 309, 13 и Yap, 1978, Nature, 273, 238 и Nature, 1979, 277, 108); от вируса иммунодефицита человека в соответствии с описанным в европейской патентной заявке ЕР 0386882 и у Buchschacher, 1992, J. Virol., 66, 2731; от вируса кори, например, АТСС VR-67 и АТСС VR-1247 и тех, которые описаны в европейской патентной заявке ЕР 0440219; от вируса Аура, например, АТСС VR-368; от вируса Бебару, например, АТСС VR-600 и АТСС VR-1240; от вируса Кабассу, например, АТСС VR-922; от вируса Чикункунья, например, АТСС VR-64 и АТСС VR-1241; от вируса Форт-Морган, например, АТСС VR-924; от вируса Гетах, например АТСС VR-369 и АТСС VR-1243; от кызылгачского вируса, например, АТСС VR-927; от вируса Майяро, например, АТСС VR-66; от вируса Мукамбо, например, АТСС VR-580 и АТСС VR-1244; от вируса Ндуму, например АТСС VR-371; от вируса Пиксуна, например, АТСС VR-372 и АТСС VR-1245; от вируса Тонат, например, АТСС VR-925; от вируса Тринити, например, АТСС VR-469; от вируса Уна, например, АТСС VR-374; от вируса Ватароа, например, АТСС VR-926; от вируса Y-62-33, например, АТСС VR-375; от вируса лихорадки Ньонг-Ньонг (вируса восточного энцефалита), например, АТСС VR-65 и АТСС VR-1242; от вируса западного энцефалита, например, АТСС VR-70, АТСС VR-1251, АТСС VR-622 и АТСС VR-1252; и от корона-вирусов, например АТСС VR-740 и тех, которые описаны у Hamre, 1966, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 121, 190.
Доставка композиций по настоящему изобретению в клетки не ограничивается использованием описанных выше вирусных векторов. Могут быть также применены и другие доставочные методы и среды, такие как, например, нуклеотидные экспрессирующие векторы, поликатионно упакованная ДНК, соединенная или не соединенная с убитым аденовирусом: см., например, заявку на патент США №08/366787, поданную 30 декабря 1994 года, и Curiel, 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154; ДНК, соединенная с лигандом: см., например, Wu, 1989, J. Biol. Chem., 264, 16985-16987; доставочные клеточные системы для эукариотических клеток: см., например, патентную заявку США №08/240030, поданную 9 мая 1994 года, и патентную заявку США №08/404796; внесение светополимеризующегося гидрогелевого материала; применение “ручного генного ружья” в соответствии с описанным в патенте США №5149655; использование ионизирующих излучений в соответствии с описанным в патенте США №5206152 и международной патентной заявке WO 92/11033; применение “нейтрализации заряда нуклеотида” или прикрепление к клеточной мембране. Другие подобные подходы описаны у Philip, 1994, Mol. Cell. Biol., 14, 2411-2418 и у Woffendin, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1581-1585.
Может быть применен метод доставки генов частицами: см., например, заявку на патент США №60/023867. Вкратце, последовательность может быть встроена в состав стандартных векторов, в которых имеются обычные регуляторные последовательности, обеспечивающие высокоинтенсивную экспрессию; затем проводят инкубацию с синтетическими ген-переносящими молекулами, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, например, полилизин, протамин и альбумин, связанные с лигандами, маркирующими клетки, такими как асиалооросомукоид, в соответствии с описанным у Wu & Wu, 1987, J. Biol. Chem., 262, 4429-4432, или инсулин в соответствии с описанным у Hucked, 1990, Biochem. Pharmacol., 40, 253-263, или галактоза в соответствии с описанным у Plank, 1992, Bioconjugate Chem., 3, 533-539, или лактоза, или трансферрин.
Для трансформации клетки-хозяина также может быть использована “голая” ДНК. Примерами способов внесения "голой" ДНК являются те способы, которые описаны в международной патентной заявке WO 90/11092 и в патенте США №5580859. Эффективность поглощения может быть повышена с использованием шариков из латекса, которые разрушаются в биологической среде. ДНК, загруженная на шарики из латекса, эффективно доставляются в клетки в результате эндоцитоза, который инициируется этими шариками. Данный способ может быть улучшен путем обработки шариков с целью повышения гидрофобности, что тем самым облегчает разрушение эндосомы и выход ДНК в цитоплазму.
Липосомы, которые могут выполнять роль ген-доставочных систем, описаны в патенте США №5422120, в международных патентных заявках WO 95/13796, WO 94/23697 и WO 91/14445 и европейском патенте ЕР 524968. В соответствии с невирусным способом доставки, описанным в американской патентной заявке №60/023867, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие полипептид, могут быть встроены в стандартные векторы, которые включают обычные регуляторные последовательности, обеспечивающие интенсивную экспрессию, с последующей инкубацией с синтетическими ген-переносящими молекулами, такими как полимерные ДНК-связывающие катионы, например, полилизин, протамин и альбумин, связанные с лигандами, маркирующими клетки, такими как асиалооросомукоид, инсулин, галактоза, лактоза или трансферрин. В других доставочных системах липосомы используют с целью инкапсуляции ДНК, несущей конкретный ген под контролем различных тканеспецифичных или повсеместно активных промоторов. Другими пригодными для использования невирусными доставочными системами являются механические доставочные системы, такие как описанные у Woffendin et al., 1994, Proc. Nafcl. Acad. Sci. USA, 91, (24) 11581-11585. Более того, кодирующая последовательность и продукт ее экспрессии могут быть доставлены путем использования светополимеризующихся гидрогелевых материалов. Можно использовать другие стандартные способы доставки генов, включающих кодирующие последовательности, которые, например, основываются на применении “ручного генного ружья” в соответствии с описанным в патенте США №5149655, на применении ионизирующих излучений, обеспечивающих активацию переносимых генов, в соответствии с описанным в патенте США №5206152 и международной патентной заявке WO 92/11033.
Примерами липосомных и поликатионных ген-доставочных систем являются те системы, которые описаны в патентах США №№5422120 и 4762915, в международных патентных заявках WO 95/13796, WO 94/23697 и WO 91/14445, в европейской патентной заявке ЕР 0524968 и у Stryer, 1975, "Biochemistry", ed. W.H.Freeman, San Francisco, pp.236-240; Szoka, 1980, Biochem. Biophys. Acta, 600, 1; Bayer, 1979, Biochem. Biophys. Acta, 550, 464; Rivnay, 1987, Meth. Enzymol., 149, 119; Wang, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7851; Plant, 1989, Anal. Biochem., 176, 420.
Полинуклеотидная композиция может включать терапевтически эффективное количество генотерапевтической системы в соответствии с термином, определенным выше. Для целей настоящего изобретения эффективная доза должна находиться в пределах от примерно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг ДНК-конструкций в приложении к субъекту, которому они вводятся.
Способы доставки
После включения в состав фармацевтической композиции полинуклеотидные композиции по настоящему изобретению могут быть: (1) напрямую введены субъекту; (2) доставлены ex vivo в клетки, производные от субъекта; или (3) использованы для экспрессии рекомбинантных белков in vitro. Субъектами, которым будут вводиться такие композиции, могут быть млекопитающие или птицы. Также лечение может быть проведено в отношении людей.
Прямое введение композиций в принципе должно осуществляться путем инъекций - подкожных, внутрибрюшинных, трансдермальных или “через кожу”, внутривенных или внутримышечных, или же они должны вводиться в интерстициальное пространство тканей. Также эти композиции могут быть введены в опухоль или повреждения. Другими путями введения являются пероральное и внутрилегочное введение, использование суппозиториев, а также трансдермальное применение или введение с использованием игл, “генных ружей” или гипоспрэев. Дозировки могут быть составлены однократными или многократными дозами (см. международную патентную заявку WO 98/20734).
Способы доставки ex vivo с последующей реимплантацией трансформированных клеток субъекту хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в международной патентной заявке WO 93/14778. Примерами клеток, применимых в способах ех vivo, являются, например, стволовые клетки, в частности, кроветворные клетки, лимфатические клетки, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.
В целом, доставка нуклеиновых кислот в вариантах применения ех vivo и in vitro может быть осуществлена с помощью, например, таких процедур, как-то: трансфекция, опосредуемая декстраном, преципитация с фосфатом кальция, трансфекция с полибреном, слияние протопластов, электропорация, инкапсуляция полинуклеотида(ов) в липосомы и прямое микроинъецирование ДНК в ядра - все эти способы хорошо известны в данной области техники.
Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды и полипептиды
В дополнение к фармацевтически приемлемым носителям и солям, которые были описаны выше, следующие вспомогательные компоненты могут быть использованы в связи с полинуклеотидными и/или полипептидными композициями.
А. Полипептиды
Одним из примеров являются полипептиды, которые, тем самым не ограничиваясь, включают: асиалооросомукоид (ASOR); трансферрин; асиалогликопротеины; антитела; фрагменты антител; ферритин: интерлейкины; интерфероны; колоние-стимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), колоние-стимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колоние-стимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Также могут быть использованы вирусные антигены, такие как капсидные вирусные белки. Также могут быть использованы белки других инвазивных организмов, такие как 17-аминокислотный пептид белка малярийного плазмодия Plasmodium falciparum стадии круглого спорозоита, известный как RII.
В. Гормоны, витамины и т.п.
Другие группы соединений, которые могут быть включены в состав, охватывают, например, гормоны, стероиды, андрогены, эстрогены, тироидный гормон или витамины, например, фолиевую кислоту.
С. Полиалкилены, полисахариды и т.п.
Также полиалкиленгликоль может быть включен в состав фармацевтической композиции вместе с желательными полинуклеотидами и/или полипептидами. В предпочтительном варианте полиалкиленгликолем является полиэтиленгликоль. Кроме того, в состав могут быть включены моно-, ди- или полисахариды. В предпочтительном варианте данного аспекта полисахаридом является декстран или DEAE-декстран. Также в фармацевтической композиции могут быть использованы хитозан и сополимер молочной и гликолевой кислот.
D. Липиды и липосомы
Желательные полинуклеотиды или полипептиды могут быть инкапсулированы в липиды или липосомы перед доставкой их субъекту или в производные от него клетки.
Липидную инкапсуляцию обычно осуществляют с использованием липосом, которые способны стабильно связывать или включать и сохранять нуклеиновую кислоту или полипептид. Соотношение упакованного полинуклеотида и липидного материала может варьироваться, но в принципе близко к 1:1 (мг ДНК к мкмоль липида), или же количество липида несколько выше. Данные по использованию липосом в качестве носителей для доставки нуклеиновых кислот обобщены у Hug & Sleight, 1991, Biochim. Biophys. Acta, 1097, 1-17; Straubinger, 1983, Meth. Enzymol., 101, 512-527.
Липосомные препараты для применения по настоящему изобретению включают катионные (т.е. положительно заряженные), анионные (т.е. отрицательно заряженные) и нейтральные препараты. Катионные липосомы, как было показано, обеспечивают внутриклеточную доставку плазмидной ДНК (Felgner, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7416), мРНК (Malone, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6077-6081) и очищенных транскрипционных факторов (Debs, 1990, J. Biol. Chem., 265, 10189-10192), сохраняющих свою функциональность.
Катионные липосомы являются легкодоступными. Например, N-[1,2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триэтиламмонийные (DOTMA) липосомы доступны под торговой маркой “липофектин” от фирмы Gibco BRL (Grand Island, NY) (см. также Felgner, цит. выше). Другими имеющимися в продаже липосомами являются трансфектаторы (DDAB/DOPE) и DOTAP/DOPE (Boehringer). Другие катионные липосомы могут быть приготовлены из легкодоступных материалов с использованием методик, хорошо известных в данной области техники: см., например, Szoka, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194-4198; а синтез 1,2-бис(олеоилокси)-3-(триметиламмоний)пропановых (DOTAP) липосом описан в международной патентной заявке WO 90/11092.
Сходным образом легкодоступными являются анионные и нейтральные липосомы, такие как получаемые от фирмы Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), или их можно получить с использованием легкодоступных материалов. Такие материалы включают, помимо прочего, фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеоилфосфатидилхолин (DOPC), диолеоилфосфатидилглицерин (DOPG), диолеоилфосфатидилэтаноламин (DOPE). Указанные материалы также могут быть смешаны с исходными материалами DOTMA и DOTAP в подходящих отношениях. Способы приготовления липосом из этих материалов хорошо известны в данной области техники.
Липосомы могут включать многослойные пузырьки (MLV), маленькие однослойные пузырьки (SUV) или крупные однослойные пузырьки (LUV). Различные комплексы липосом и нуклеиновых кислот приготавливают с применением методов, хорошо известных в данной области техники: см., например, Straubinger, 1983, Meth. Immunol., 101, 512-527; Szoka, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194-4198; Papahadjopoulos, 1975, Biochim. Biophys. Acta, 394, 483; Wilson, 1979, Cell, 17, 77; Deamer & Bangham, 1976, Biochim. Biophys. Acta, 443, 629; Ostro, 1977, Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 836; Fraley, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3348; Enoch & Strittmatter, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 145; Fraley, 1980, J. Biol. Chem., 255, 10431; Szoka & Papahadjopoulos, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 145; Schaefer-Ridder, 1982, Science, 215, 166.
Е. Липопротеины
Кроме того, в композицию вместе с полинуклеотидом или полипептидом, предназначенным к доставке, могут быть включены липопротеины. Примерами липопротеинов, которые можно использовать, являются: хиломикроны, HDL, IDL, LDL и VLDL. Также можно использовать мутанты, фрагменты и химеры названных белков. Также можно использовать модификации встречающихся в природе липопротеинов, такие как ацетилированные LDL. Эти липопротеины могут обеспечивать доставку полинуклеотидов к конкретным клеткам, экспрессирующим рецепторы липопротеинов. Предпочтительно, чтобы, в случае включения в композицию липопротеинов наряду с предназначенным для доставки полинуклеотидом, другие лиганды, обеспечивающие направленную доставку к мишеням, в состав такой композиции не включались.
Встречающиеся в природе липопротеины включают липидную и белковую составляющие. Белковый компонент известен под названием “апопротеин”. В настоящее время выделены и идентифицированы апопротеины А, В, С, D и Е. По крайней мере в двух из этих классов имеется по несколько дифференцированных белков, которые обозначаются римскими цифрами: AI, AII, AIV; CI, СII, CIII.
В составе липопротеина может присутствовать более одного апопротеина. Например, встречающиеся в естественных условиях хиломикроны включают апопротеины А, В, С и Е, причем с течением времени они утрачивают апопротеин-А и приобретают апопротеины С и Е. В состав VLDL входят апопротеины А, В, С и Е, в состав LDL - апопротеин-В, а в состав HDL входят апопротеины А, С и Е.
Аминокислотный состав указанных апопротеинов известен и описан, например, у Breslow, 1985, Annu. Rev. Biochem., 54, 699; Law, 1986, Adv. Exp. Med. Biol., 151, 162; Chen, 1986, J. Biol. Chem., 261, 12918; Kane, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2465; Utermann, 1984, Hum. Genet., 65, 232.
В состав липопротеинов входят различные липиды, включая триглицериды, холестерин (свободный или в виде сложных эфиров) и фосфолипиды. Состав липидов во встречающихся в естественных условиях липопротеинах варьируется. Например, хиломикроны в основном состоят из триглицеридов. Более подробное описание липидного состава встречающихся в естественных условиях липопротеинов можно найти, например, в 128-м томе журнала "Methods in Enzymology" (1986). Состав липидов подбирается таким образом, чтобы соответствовать конформации апопротеина, обеспечивая тем самым активность по связыванию на соответствующем рецепторе. Состав липидов также может быть подобран так, чтобы облегчить гидрофобное взаимодействие и связывание с молекулой, связывающей полинуклеотид.
Встречающиеся в естественных условиях липопротеины могут, например, быть выделены из сыворотки крови путем ультрацентрифугирования. Некоторые способы описаны в "Methods in Enzymology" (цит. выше) и у Pitas, 1980, J. Biochem., 255, 5454-5460 и Mahey, 1979, J. Clin. Invest., 64, 743-750.
Липопротеины также могут быть получены in vitro или с помощью рекомбинантных технологий путем экспрессии генов апопротеинов в желательной клетке-хозяине: см., например, Atkinson, 1986, Annu. Rev. Biophys. Chem., 15, 403 и Radding, 1958, Biochim. Biophys. Acta, 30, 443.
Также липопротеины можно приобрести у коммерческих поставщиков, таких как Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, MA, США).
Дополнительное описание липопротеинов можно найти в патентной заявке US №97/14465, поданной Zuckermann et al.
F. Поликатионные агенты
В состав композиции, включающей желательный полинуклеотид и/или полипептид, доставка которого предполагается, могут быть включены поликатионные агенты, как вместе с липопротеинами, так и без них.
Обычно поликатионные компоненты при физиологических значениях рН имеют суммарный положительный заряд и способны нейтрализовывать электрический заряд нуклеиновых кислот, что должно облегчать доставку к желательному месту. Указанные компоненты могут применяться как in vitro и ex vivo, так и in vivo. Поликатионные агенты можно использовать для доставки нуклеиновых кислот пациентам прижизненно путем внутримышечного, подкожного введения и т.п.
Следующие полипептиды являются примерами применимых поликатионных агентов: полилизин, полиаргинин, полиорнитин и протамин. Другими примерами являются гистоны, протамины, человеческий сывороточный альбумин, ДНК-связывающие белки, негистоновые хромосомные белки, капсидные белки ДНК-вирусов, таких как вирус фХ174; транскрипционные факторы также включают участки связывания ДНК и поэтому также могут быть использованы в качестве агентов, конденсирующих нуклеиновую кислоту. Вкратце, базовый домен, на котором связываются последовательности ДНК, входит в состав таких транскрипционных факторов, как С/СЕВР, c-jun, c-fos, АР-1, АР-2, АР-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP и TFIID.
Органическими поликатионными агентами являются спермин, спермидин и путресцин.
Размеры и физические свойства поликатионного агента могут быть экстраполированы, исходя из приведенного выше перечня с целью конструирования других поликатионных агентов полипептидной природы или с целью создания синтетических поликатионных агентов.
G. Синтетические поликатионные агенты
Синтетические поликатионные агенты, которые применимы в фармацевтических композициях, включают, например, DEAE-декстран и полибрен. Липофектин™ и липофектамин™ являются мономерами, которые образуют поликатионные комплексы в случае их комбинирования с полинуклеотидами или полипептидами.
Иммунологические диагностические тесты
Антигены Neisseria MenB или их антигенные фрагменты по настоящему изобретению могут быть использованы в иммунологических тестах, нацеленных на определение уровней антител (или, напротив, антитела к Neisseria MenB могут быть использованы для определения уровней антигенов). Иммунологические тесты, базирующиеся на точно определенных рекомбинантных антигенах, могут быть разработаны с целью замены заразных диагностических тестов. Антитела к белкам Neisseria MenB или их фрагментам могут быть выявлены в составе биологических образцов, таких как, например, кровь или сыворотка крови. В результате разработки подобных иммунологических тестов появляются их многочисленные модификации, широкий круг которых известен в данной области техники. Прописи таких иммунологических тестов могут быть основаны, например, на конкурентном связывании или прямом взаимодействии, или на принципе “сэндвича” (с использованием нескольких антител). В указанных протоколах также, например, могут быть использованы твердые подложки или иммунопреципитация. Во многих тестах используются помеченные антитело или полипептид; метки могут быть, например, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными молекулами или молекулами красителя. Также известны тесты, в которых применяется амплификация сигналов от соответствующего зонда: примерами в этом случае являются тесты, в которых используются биотин и авидин, а также иммунологические тесты, основанные на использовании ферментов или мечении ферментами, такие как ТИФА (твердофазный иммуноферментный анализ).
Наборы, применимые для иммунодиагностики, включающие подходящие помеченные реагенты, формируют путем упаковки подходящих материалов, включая композиции по настоящему изобретению, в соответствующие контейнеры, наряду с другими материалами и реагентами (например, подходящими буферами, растворами солей и т.п.), необходимыми для проведения данного теста, равно как и соответствующими инструкциями.
Гибридизация нуклеиновых кислот
Термин “гибридизация” обозначает связывание двух нуклеотидных последовательностей друг с другом водородными связями. Обычно одну из этих последовательностей фиксируют на твердой подложке, а другая находится в растворе в свободном состоянии. Затем обеспечивают контакт между этими двумя последовательностями в таких условиях, которые благоприятствуют образованию водородных связей. Факторами, которые влияют на образование таких связей, являются: тип и количество растворителя; температура реакции; продолжительность реакции; перемешивание; присутствие компонентов, которые бы предотвращали неспецифическое связывание находящейся в жидкой фазе последовательности с твердой подложкой (раствор Денхардта или реактив BLOTTO); концентрация последовательностей; применение соединений, которые способны увеличивать скорость связывания последовательностей (декстрансульфат или полиэтиленгликоль); и жесткость условий промывки после гибридизации (см. Sambrook et al., цит. выше, том 2, глава 9, стр.9.47-9.57).
Под “жесткостью” понимаются условия проведения реакции гибридизации, которые благоприятствуют связыванию очень сходных последовательностей в отличие от различающихся последовательностей. Например, сочетание температуры и концентрации солей должно выбираться таким образом, чтобы оно было на 120-200°С ниже расчетной температуры диссоциации (Тm) анализируемого гибрида. Параметры температуры и концентрации солей могут быть, как правило, определены эмпирическим путем в предварительных экспериментах, в которых образцы геномной ДНК, иммобилизованной на фильтрах, гибридизуют с анализируемой последовательностью и затем промывают в условиях различной степени жесткости (см. Sambrook et al., стр.9.50).
Переменные, которые необходимо учитывать при осуществлении, например, блоттинга по Саузерну, таковы: (1) сложность структуры ДНК, которая будет подвергнута блоттингу, и (2) уровень гомологии зонда и выявляемых последовательностей. Общее количество исследуемого фрагмента (фрагментов) может варьироваться на порядок - от 0,1 до 1 мкг для расщепленной плазмиды или фага или от 10-9 до 10-8 г для уникального гена из состава сложноорганизованного эукариотического генома. Для менее сложных полинуклеотидов можно использовать существенно менее продолжительные периоды времени блоттинга, гибридизации и экспозиции, меньшие количества исходных полинуклеотидов и меньшие специфические активности зондов. Например, уникальный дрожжевой ген можно выявить при времени экспозиции всего 1 час при количестве исходной дрожжевой ДНК 1 мкг, блоттинге в течение 2 часов и гибридизации в течение 4-8 часов с зондом, имеющим активность 108 имп./мин на 1 мкг. Для уникального гена млекопитающего аналогичный подход будет начинаться с 10 мкг ДНК, блоттинга в течение ночи и гибридизации в течение ночи в присутствии 10% декстрансульфата с использованием зонда со специфической активностью свыше 108 имп./мин на 1 мкг, в результате чего время экспозиции составит примерно 24 часа.
Некоторые факторы могут влиять на температуру диссоциации (Тm) гибрида ДНК/ДНК, образующегося между зондом и анализируемым фрагментом, а следовательно, и на подходящие условия проведения гибридизации и промывки. Во многих случаях зонд гомологичен данному фрагменту не на 100%. Другие обычно учитываемые переменные - это общее содержание пары GC в гибридизующих последовательностях и их длина, а также ионная сила гибридизационного буфера и содержание формамида в нем. Влияние всех этих факторов может быть учтено с помощью общего уравнения:
Тm=81+16,6·(log10Сi)+0,4·(% пары GC)-0,6·(% формамида)-600/n-1,5·(% ошибок),
где Ci - концентрация солей (одновалентных ионов), а n - длина гибрида, выраженная в числе пар нуклеотидов (формула незначительно модифицирована по сравнению с опубликованным у Meinkoth & Wahl, 1984, Anal. Biochem., 138, 267-284).
При конструировании схемы гибридизационного эксперимента по соображениям удобства могут быть изменены некоторые факторы, влияющие на гибридизацию нуклеиновых кислот. Наиболее просты с точки зрения доведения до оптимума температура гибридизации и промывки и концентрация солей, используемых при промывке. При увеличении температуры проведения реакции гибридизации (суть жесткости реакции) становится менее вероятной гибридизация между нуклеотидными цепями, которые негомологичны друг другу - соответственно, снизится фоновый “шум”. Если радиоактивно помеченный зонд не полностью гомологичен иммобилизованному фрагменту (ситуация, обычная в анализе генных семейств и проведении экспериментов по межвидовой гибридизации), то температуру гибридизации нужно снизить - тогда фоновый “шум” возрастет. Температура промывки сходным образом влияет на интенсивность гибридизационного сигнала и уровень фона. Жесткость условий промывки также возрастает при снижении концентраций солей.
В целом, стандартными температурами гибридизации в присутствии 50% формамида являются 42°С для зонда, гомологичного фрагменту-мишени на 95-100%, 37°С при гомологии на уровне 90-95% и 32°С при уровне гомологии 85-90%. Для более низких уровней гомологии содержание формамида должно быть снижено с последующей соответствующей корректировкой температуры на основе вышеприведенного уравнения. Если уровень гомологии между зондом и фрагментом-мишенью неизвестен, то наиболее простым подходом является проведение эксперимента изначально в нежестких условиях гибридизации и промывки. Если после авторадиографического анализа оказываются интенсивными полосы неспецифического связывания и уровень фонового “шума”, то фильтр может быть промыт при высоком уровне жесткости и проэкспонирован повторно. Если время, необходимое для экспозиции, делает данный подход непрактичным, то несколько вариантов жесткости гибридизации и (или) промывки можно протестировать одновременно.
Тесты с нуклеотидными зондами
В таких методах, как ПЦР, тесты с зондами разветвленной ДНК или методики блоттинга, в которых используют нуклеотидные зонды по настоящему изобретению, можно определить присутствие кДНК или мРНК. Про зонд тогда говорят, что он “гибридизуется” с последовательностью по настоящему изобретению, когда он способен образовывать дуплекс или двухцепочечный комплекс, являющийся достаточно стабильным для того, что быть выявленным.
Нуклеотидные зонды должны гибридизоваться с нуклеотидными последовательностями нейссерий по настоящему изобретению (включая и смысловые, и антисмысловые цепи). Хотя аминокислотную последовательность может кодировать много различных нуклеотидных последовательностей, предпочтительна нативная последовательность нейссерии, потому что она является последовательностью, реально присутствующей в клетках. мРНК представляет собой кодирующую последовательность, поэтому зонд должен быть комплементарен кодирующей последовательности; одноцепочечная кДНК комплементарна мРНК, поэтому кДНК-зонд должен быть комплементарен некодирующей последовательности.
Последовательность зонда не обязательно должна быть идентична последовательности нейссерии (или ее комплементу): некоторая вариабельность последовательности и длины может приводить к повышенной чувствительности теста, если нуклеотидный зонд способен образовывать дуплекс с нуклеотидами-мишенями, который можно выявить. Также нуклеотидный зонд может включать дополнительные нуклеотиды, стабилизирующие образующийся дуплекс. Дополнительная последовательность нейссерии также может быть полезной в качестве метки для выявления образовавшегося дуплекса. Например, некомплементарная нуклеотидная последовательность может быть присоединена, к 5’-концу зонда, причем остальная последовательность зонда комплементарна последовательности нейссерии. Как альтернатива, некомплементарные основания или более длинные последовательности могут в составе зонда перемежаться при условии, что комплементарность последовательности зонда по отношению к последовательности нейссерии достаточна для гибридизации с ней, в результате чего образуется пригодный для выявления дуплекс.
Точные длина и последовательность зонда будут зависеть от условий гибридизации, таких как температура, солевые параметры и подобное. Например, для целей диагностики в зависимости от сложности анализируемой последовательности нуклеотидный зонд обычно состоит по крайней мере из 10-20 нуклеотидов, предпочтительно из 15-25, а более предпочтительно по крайней мере из 30 нуклеотидов, хотя он может быть и короче указанного. Как правило, короткие праймеры требуют меньших температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей.
Зонды могут быть приготовлены с помощью методов синтеза, таких как триэфирный метод по Matteucci et al. (J. Amer. Chem. Soc., 1981, 103, 3185) или в соответствии с Urdea et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 7461), или с использованием имеющихся в продаже автоматических синтезаторов олигонуклеотидов.
Химическая природа зонда может быть выбрана в соответствии с предпочтениями. Для некоторых путей использования подходят ДНК или РНК. Для других способов применения могут быть внесены модификации: например, модификации фосфорного скелета, такие как фосфоротиоаты или метилфосфонаты, могут быть использованы для увеличения времени полужизни in vivo, изменения аффинности РНК, повышения устойчивости к нуклеазе (см., например, Agrawal & Iyer, 1995, Curr. Opin. Biotechnol., 6, 12-19; Agrawal, 1996, TIBTECH, 14, 376-387); также можно использовать такие аналоги, как пептид-нуклеиновая кислота (см., например, Соrеу, 1997, TIBTECH, 15, 224-229; Buchardt et al., 1993, TIBTECH, 11, 384-386).
Один из примеров теста на гибридизацию нуклеотидов описан у Urdea et al. в международной патентной заявке WO 92/02526 (см. также патент США №5124246).
Как альтернатива, полимеразная цепная реакция (ПЦР) является другим хорошо известным способом выявления малых количеств нуклеиновых кислот-мишеней. Тест описан у Mullis et al. (Meth. Enzymol., 1987, 155, 335-350), в патентах США №№4683195 и 4683202. Два “праймерных” нуклеотида гибридизуются с нуклеиновыми кислотами-мишенями и используются для праймирования (затравки) реакции. Праймеры могут включать последовательность, которая не гибридизуется с последовательностью амплификационной мишени (или ее комплемента), с целью стабилизации дуплекса или, например, для внесения удобного рестрикционного сайта. Обычно такая последовательность должна фланкировать желательную последовательность нейссерии.
Термостабильная полимераза создает копии нуклеиновых кислот-мишеней от праймеров с использованием исходных нуклеиновых кислот-мишеней в качестве матрицы. После образования под действием полимеразы порогового количества нуклеиновых кислот-мишеней их можно выявить с помощью более традиционных методов, таких как блоттинг по Саузерну. При использовании блоттинга по Саузерну помеченный зонд должен гибридизоваться с последовательностью нейссерии (или с ее комплементом).
Также мРНК или кДНК могут быть выявлены с помощью стандартных методик блоттинга, описанных у Sambrook et al. (цит. выше). мРНК или кДНК, образованная на матрице мРНК с использованием полимеразы, могут быть очищены и отделены с использованием электрофореза в геле. Затем нуклеиновые кислоты в геле промакивают на твердую подложку, такую как нитроцеллюлоза. Твердую подложку экспонируют с помеченным зондом и затем промывают с целью удаления любого непрогибридизовавшего зонда. После этого выявляют дуплексы, включающие помеченный зонд. Обычно зонд помечают радиоактивной составляющей.
ПРИМЕРЫ
Настоящее изобретение основывается на 961 нуклеотидной последовательности из генома N.meningitidis, приведенных в приложении С (SEQ ID NO 1-961) в заявке ‘573, которые вместе представляют собой по существу полный геном N.meningitidis серотипа В, а также на полноразмерной геномной последовательности, приведенной в приложении D (SEQ ID NO 1068) заявки ‘573, и полноразмерной геномной последовательности, показанной в приложении А в данной заявке - SEQ ID NO 1.
Для специалистов в данной области техники должно быть понятно, как такую информацию о последовательностях можно использовать в связи с настоящим изобретением в соответствии с описанным выше.
Стандартные методы и процедуры, которые можно использовать с целью осуществления настоящего изобретения (например, с целью использования заявленных последовательностей для предсказания полипептидов, применимых для вакцинации или в целях диагностики) обобщены выше. Данное обобщение не является ограничением настоящего изобретения, но, напротив, дает примеры, которые можно использовать, хотя это и не является обязательным.
Указанные последовательности происходят от контигов, показанных в приложении С (SEQ ID NO 1-961), и от полноразмерной геномной последовательности, показанной в приложении D (SEQ ID NO 1068), которые были определены в ходе секвенирования генома N.meningitidis (штамм В). Полноразмерная последовательность была выстроена с использованием алгоритма TIGR Assembler в соответствии с описанным у G.S.Sutton et al., 1995, "TIGR Assembler: A new tool for assembling large shotgun sequencing projects", Genome Science & Technology, 1, 9-19 [см. также R.D.Fleischmann et al., 1995, Science, 269, 496-512; C.M.Fraser et al., 1995, Science, 270, 397-403; C.J.Bult et al., 1996, Science, 273, 1058-1073; C.M.Fraser et al., 1997, Nature, 390, 580-586; J.-F.Tomb et al., 1997, Nature, 388, 539-547; H.P.Klenk et al., 1997, Nature, 390, 364-370; C.M.Fraser et al., 1998, Science, 281, 375-388; M.J.Gardner et al., 1998, Science, 282, 1126-1132; К.Е.Nelson et al., 1999, Nature, 399, 323-329]. После этого с использованием описанных выше методов определяли предполагаемые продукты трансляции последовательностей. Компьютерный анализ продуктов трансляции проводили на основе сравнений с базами данных. Соответствующие генные и белковые последовательности, если таковые были, идентифицировали у Neisseria meningitidis (штамм А) и Neisseria gonorrhoeae. Затем белки экспрессировали, очищали и охарактеризовывали с целью оценки их антигенных и иммуногенных свойств.
В частности, нижеследующие методы были использованы для экспрессии, очистки и биохимического анализа белков по настоящему изобретению.
Приготовление хромосомной ДНК
Штамм 2996 N.meningitidis культивировали до экспоненциальной фазы роста в 100 мл среды GC, собирали центрифугированием и ресуспендировали в 5 мл буфера (20% сахарозы, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ ЭДТА, с корректировкой до рН 8,0). После 10-минутной инкубации на льду бактерий лизировали добавлением 10 мл литического раствора (50 мМ NaCl, 1% саркозила натрия, 50 мкг/мл протеиназы-К), и суспензию инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Проводили две фенольные экстракции (с уравновешиванием при рН 8) и одну экстракцию СНСl3/изоамиловым спиртом (24:1). ДНК преципитировали добавлением 0,3 М ацетата натрия и двух объемов этанола и собирали центрифугированием. Осадок промывали 1 раз 70%-ным этанолом и вновь растворяли в 4 мл буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ ЭДТА - рН 8). Концентрацию ДНК определяли путем считывания OD при 260 нм.
Конструирование олигонуклеотидов
Синтетические олигонуклеотидные праймеры конструировали на основе кодирующей последовательности каждой из ORF, используя (а) по мере доступности последовательность менингококка-В или (b) последовательности гонококка/менингококка-А, адаптированные по предпочтительному использованию кодонов менингококка. Любые предсказанные сигнальные пептиды отбрасывали в результате расшифровки последовательности 5’-концевого амплификационного праймера непосредственно вниз от предсказанной лидерной последовательности.
Для большинства ORF 5’-праймеры включали два сайта рестрикционного расщепления (BamHI/NdeI, BamHI/Nhel или EcoRI/NheI - в зависимости от рестрикционной картины гена); 3’-праймеры включали рестрикционный XhoI-сайт. Данную процедуру разрабатывали с целью обеспечения клонирования каждого амплификационного продукта (соответствующего каждой ORF) в состав двух различных экспрессионных систем: pGEX-KG (с использованием либо BamHI/XhoI, либо EcoRI/XhoI) и рЕТ21b+ (с использованием либо NdeI/XhoI, либо NheI/XhoI).
“Хвост” 5’-концевого праймера:
“Хвост” 3’-концевого праймера:
Для некоторых ORF две разные реакции амплификации проводили с целью клонирования каждой ORF в двух экспрессионных системах. Для каждой ORF использовали по два разных 5’-праймера; такой же 3’-XhoI-праймер использовали в соответствии с указанным выше:
“Хвост” 5’-концевого праймера:
“Хвост” 3’-концевого праймера:
Другие ORF клонировали в состав экспрессирующего вектора pTRC и экспрессировали в виде химеры с N-концевой полигистидиновой меткой. Предсказанный сигнальный пептид может быть включен в конечный продукт. Рестрикционные NheI/BamHI-сайты вносили с помощью праймеров:
“Хвост” 5’-концевого праймера:
“Хвост” 3’-концевого праймера:
Наряду с присутствием последовательностей распознавания рестриктазами праймеры включали нуклеотиды, которые гибридизуются с последовательностью, предназначенной для амплификации. Число гибридизующихся нуклеотидов зависело от температуры диссоциации полного праймера, которую определяли для каждого праймера по формуле:
Tm=4(G+C)+2(А+Т) (с исключением “хвоста”);
Тm=64,9+0,41 (%GC)-600/N (полный праймер).
Средняя температура диссоциации отобранных олигонуклеотидов составила 65-70°С для полного олигомера и 50-55°С только для гибридизующегося участка.
Олигонуклеотиды синтезировали с помощью ДНК/РНК-синтезатора Perkin-Elirier модели 394, элюировали с колонок в 2 мл NH4ОH и снимали защиту путем 5-часовой инкубации при 56°С. Олигонуклеотиды преципитировали добавлением 0,3 М ацетата натрия и двух объемов этанола. Затем образцы центрифугировали, и осадки ресуспендировали либо в 100 мкл, либо в 1 мл воды. Величину OD260 определяли с помощью спектрофотометра Perkin-Elmer Lambda Bio, а концентрацию определяли и корректировали до 2-10 пикомоль/мкл.
В таблице показаны прямые и обратные праймеры, использованные для каждой реакции амплификации. В некоторых случаях нужно отметить, что последовательность праймера не обязательно должна совпадать с последовательностью ORF. По завершении исходных реакций амплификации полная 5’- и/или 3’-последовательность может не быть известной для некоторых ORF менингококка, хотя соответствующие последовательности могли быть идентифицированы у гонококка. Последовательности гонококка могут быть, следовательно, использованы в качестве основы для конструирования праймеров для амплификации с внесением изменений в соответствии с предпочтением кодонов. В частности, могут быть изменены следующие кодоны: АТА→АТТ; TCG→ТСТ; CAG→САА; AAG→ААА; GAG→GАА, CGA и CGG→CGC; GGG→GGC.
Амплификация
Протокол стандартной ПЦР был следующим: 50-200 нг геномной ДНК использовали в качестве матрицы в присутствии 20-40 мкМ каждого олигонуклеотида, 400-800 мкМ раствора dNTP, 1×ПЦР-буфера (включающего 1,5 мМ MgCl2), 2,5 единицы ДНК-полимеразы TaqI (с использованием AmpliTaQ от Perkin-Elmer, Platinum от Gibco, ДНК-лолимеразы Pwo или полимеразы Taq от Takara Shuzo).
В некоторых случаях ПЦР оптимизовали добавлением 10 мкл ДМСО или 50 мкл 2 М бетаина.
После горячего старта (добавление полимеразы в ходе предварительной 3-минутной инкубации полной смеси при 95°С) каждый образец подвергали 2-стадийной амплификации: первые 5 циклов проводили при температуре отжига для одного из олигонуклеотидов без “хвоста” для рестрикционных ферментов с последующими 30 циклами, проводившимися при температуре отжига для полноразмерных олигонуклеотидов. После циклов проводили конечную стадию достройки при 72°С в течение 10 минут.
Стандартные циклы были следующими:
Время достройки варьировалось в зависимости от длины ORF, которую амплифицировали.
Реакции амплификации осуществляли с использованием амплификаторов Perkin-Elmer ПЦР-систем 9600 или 2400. Для проверки результатов 1/10 амплификационного объема загружали в 1-1,5%-ный агарозный гель, и размер каждого амплифицированного фрагмента сравнивали с маркерами молекулярной массы ДНК.
Амплифицированную ДНК либо загружали непосредственно в 1%-ный агарозный гель, либо сначала преципитировали этанолом и ресуспендировали в объеме, подходящем для загрузки в 1%-ный агарозный гель. ДНК-фрагмент, соответствующий полосе правильного размера, затем элюировали и очищали из геля с использованием набора для гель-экстракции Qiagen Gel Extraction kit в соответствии с инструкциями изготовителя. Конечный объем ДНК-фрагмента составил 30 мкл или 50 мкл либо воды, либо 10 мМ Трис, рН 8,5.
Расщепление ПЦР-фрагментов
Очищенную ДНК, соответствующую амплифицированному фрагменту, разделяли на 2 аликвоты и подвергали двойному расщеплению с использованием:
NdeI/XhoI или NheI/XhoI для клонирования в состав рЕТ-21b+ и дальнейшей экспрессии белка в виде химеры с С-концевой гистидиновой меткой;
BamHI/XhoI или EcoRI/XhoI для клонирования в состав pGEX-KG и дальнейшей экспрессии белка в виде химеры с N-концевым GST.
Для ORF 76 - NheI/BamHI для клонирования в состав вектора pTRC-HisA и дальнейшей экспрессии белка в виде химеры с N-концевой гистидиновой меткой.
Каждый очищенный ДНК-фрагмент инкубировали (при 37°С в течение времени от 3 часов до ночи) с 20 единицами каждой из рестриктаз (New England Biolabs) либо в 30, либо 40 мкл конечного объема в присутствии подходящего буфера. Затем продукт расщепления очищали с использованием набора для очистки QIAquick PCR purification kit в соответствии с инструкциями изготовителя и элюировали в конечный объем 30 (или 50) мкл либо воды, либо 10 мМ Трис-HCl, рН 8,5. Конечную концентрацию ДНК определяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле в присутствии оттитрованных маркеров молекулярной массы.
Расщепление векторов для клонирования (рЕТ22В, pGEX-KG и pTRC-HisA)
10 мкг плазмиды подвергали двойному расщеплению действием 50 единиц каждой рестриктазы в 200 мкл объема реакции в присутствии подходящего буфера с инкубацией в течение ночи при 37°С. После загрузки полного расщепления в 1%-ный агарозный гель полосу, соответствующую расщепленному вектору, очищали из геля с использованием набора для экстракции Qiagen QIAquick Gel Extraction kit, а ДНК элюировали в 50 мкл 10 мМ Трис-HCl, рН 8,5. Концентрацию ДНК определяли путем измерения OD260 у образца и доводили до 50 мкг/мкл. Для каждой процедуры клонирования использовали по 1 мкл плазмиды.
Клонирование
Фрагменты, соответствующие каждой из ORF, предварительно разрезанные и очищенные, лигировали в состав и рЕТ22b, и pGEX-KG. В конечном объеме 20 мкл фрагмент и вектор в молярном отношении 3:1 лигировали с использованием 0,5 мкл ДНК-лигазы фага Т4 NEB (400 ед./мкл) в присутствии буфера, предоставляемого изготовителем. Реакцию инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов. В некоторых экспериментах лигирование осуществляли с использованием набора для быстрого лигирования от Boehringer в соответствии с инструкциями изготовителя.
С целью внесения рекомбинантной плазмиды в подходящий штамм 100 мкл компетентных клеток E.coli DH5 инкубировали с раствором лигазной реакции в течение 40 минут на льду, затем в течение 3 минут при 37°С и после добавления 800 мкл культурального бульона LB - опять при 37°С в течение 20 минут. После этого клетки центрифугировали при максимальной скорости на эппендорфовской центрифуге и ресуспендировали приблизительно в 200 мкл надосадочной фракции. Затем суспензию вносили в среду LB с ампициллином (100 мкг/мл).
Скрининг рекомбинантных клонов осуществляли путем культивирования 5 случайно отобранных колоний в течение ночи при 37°С либо в 2 мл (клоны pGEX или рТС), либо в 5 мл (клоны рЕТ) бульона LB с 100 мкг/мл ампициллина. Затем клетки осаждали, и ДНК экстрагировали с использованием минипрепаративного набора Qiagen QIAprep Spin Miniprep kit в соответствии с инструкциями изготовителя до конечного объема 30 мкл. По 5 мкл каждого отдельного минипрепарата (приблизительно 1 мкг) расщепляли рестриктазами либо NdeI/XhoI, либо BamHI/XhoI, и весь расщепленный продукт загружали в 1-1,5%-ный агарозный гель (в зависимости от ожидаемого размера вставки) одновременно с “лестничным” маркером молекулярной массой (1 Kb DNA Ladder, Gibco). Скрининг позитивных клонов проводили на основе правильного размера вставки.
Клонирование
Некоторые ORF могут быть клонированы в вектор pGEX-HIS с использованием клонирующих рестрикционных сайтов EcoRI/PstI, EcoRI/SalI или SalI/PstI. После клонирования рекомбинантные плазмиды могут быть внесены в клетки-хозяева E.coli штамма W 3110.
Экспрессия
Каждую ORF, клонированную в состав экспрессирующего вектора, затем можно использовать для трансформации штамма, подходящего для экспрессии рекомбинантного белкового продукта. По 1 мкл каждой конструкции использовали для трансформации 30 мкл E.coli BL21 (вектор pGEX), E.coli TOP10 (вектор pTRC) или E.coli BL21-DE3 (вектор рЕТ) в соответствии с описанным выше. В случае с вектором pGEX-His такой же штамм E.coli (W3110) использовали для исходного клонирования и экспрессии. Отдельные рекомбинантные колонии вносили в 2 мл LB с ампициллином (100 мкг/мл), инкубировали при 37°С в течение ночи, затем разбавляли 1:30 в 20 мл LB с ампициллином (100 мкг/мл) в 100-мл колбах, обеспечивая величину OD600 в диапазоне 0,1-0,15. Колбы инкубировали при 30°С во вращающихся шейкерах с водяной баней до того, как OD указывала на экспоненциальную фазу роста, подходящую для индукции экспрессии (OD=0,4-0,8 для векторов рЕТ и pTRC; OD=0,8-1 для векторов pGEX и pGEX-His). В случае векторов рЕТ, pTRC и pGEX-His экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ IPTG, в то время как в случае с системой pGEX конечная концентрация IPTG составляла 0,2 мМ. Через 3 часа инкубации при 30°С конечную концентрацию образца проверяли по величине OD. Для проверки экспрессии 1 мл каждого образца изымали, центрифугировали на микроцентрифуге, осадок ресуспендировали в ФСБ и анализировали электрофоретически в 12%-ном ДСН-ПААГ с окрашиванием кумасси голубым. Весь образец центрифугировали при 6000 g, и осадок ресуспендировали в ФСБ для дальнейшего использования.
Крупномасштабная очистка слитых с GST белков
Отдельную колонию культивировали в течение ночи при 37°С на LB-агаровой чашке с ампициллином. Бактерий инокулировали в 20 мл жидкой культуральной среды LB с ампициллином в шейкере с водяной баней и культивировали в течение ночи. Бактерий разбавляли 1:30 в 600 мл свежей культуральной среды и оставляли расти при оптимальной температуре (20-37°С) до OD550=0,8-1. Экспрессию белка индуцировали действием 0,2 мМ IPTG с последующей инкубацией в течение 3 часов. Культуру центрифугировали при 8000 об/мин при 4°С. Надосадочную фракцию отбрасывали, и бактериальный осадок ресуспендировали в 7,5 мл холодного ФСБ. Клетки разрушали ультразвуком на льду в течение 30 секунд при 40 Вт с использованием установки Branson B-15, замораживали и оттаивали дважды и центрифугировали вновь. Надосадочную фракцию собирали и смешивали с 150 мкл глутатион-сефарозной 4В смолы (Pharmacia) (с предварительной промывкой в ФСБ), и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Образец центрифугировали при 700g в течение 5 минут при 4°С. Смолу дважды промывали в 10 мл холодного ФСБ в течение 10 минут, ресуспендировали в 1 мл холодного ФСБ и загружали на свободную колонку. Смолу дважды промывали в 2 мл холодного ФСБ до достижения на выходящем протоке величины OD280=0,02-0,06. Слитый с GST белок элюировали добавлением 700 мкл холодного глутатионового элюционного буфера (10 мМ восстановленного глутатиона, 50 мМ Трис-HCl), и отбирали фракции до достижения OD280=0,1. По 21 мкл каждой фракции загружали в 12%-ный ДСН-гель с использованием электрофореза в ДСН-ПААГ от BioRad. Стандартами являлись маркеры молекулярной массы в диапазоне Ml (200; 116,25; 97,4; 66,2; 45; 31; 21,5; 14,4; 6,5 кД) или маркеры Amersham Rainbow Marker (M’’) (220; 66; 46; 30; 21,5; 14,3 кД). Поскольку молекулярная масса GST составляет 26 кД, то эту величину следует добавить к молекулярной массе каждого химерного GST-белка.
Крупномасштабная очистка His-химерных растворимых белков
Отдельную колонию культивировали в течение ночи при 37°С на LB-агаровой чашке с ампициллином. Бактерий инокулировали в 20 мл жидкой культуральной среды LB с ампициллином и инкубировали в течение ночи в шейкере с водяной баней. Бактерий разбавляли 1:30 в 600 мл свежей среды и оставляли расти при оптимальной температуре (20-37°С) до OD550=0,6-0,8. Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ IPTG, и культуру дополнительно инкубировали в течение 3 часов. Культуру центрифугировали при 8000 об/мин при 4°С, надосадочную фракцию отбрасывали, и бактериальный осадок ресуспендировали в 7,5 мл 10 мМ холодного имидазольного буфера (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатного буфера, 10 мМ имидазола, рН 8). Клетки разрушали ультразвуком на льду в течение 30 секунд при 40 Вт с помощью соникатора Branson B-15, дважды замораживали и оттаивали и вновь центрифугировали. Надосадочную фракцию собирали и смешивали с 150 мкл никелевой смолы (Pharmacia) (предварительно промытой в 10 мМ имидазольного буфера), и инкубировали при комнатной температуре с аккуратным перемешиванием в течение 30 минут. Образец центрифугировали при 700 g в течение 5 минут при 4°С. Смолу дважды промывали в 10 мл 10 мМ холодного имидазольного буфера в течение 10 минут, ресуспендировали в 1 мл 10 мМ холодного имидазольного буфера и загружали на одноразовую колонку. Смолу промывали при 4°С в 2 мл 10 мМ холодного имидазольного буфера до достижения на выходящем протоке OD280=0,02-0,06. Смолу промывали 2 мл 20 мМ холодного имидазольного буфера (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатного буфера, 20 мМ имидазола, рН 8) до достижения на выходящем протоке OD280=0,02-0,06. Слитый с His белок элюировали добавлением 700 мкл 250 мМ холодного имидазольного буфера (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатного буфера, 250 мМ имидазола, рН 8), и фракции отбирали до OD280=0,1. По 21 мкл каждой фракции загружали в 12%-ный ДСН-гель.
Крупномасштабная очистка His-химерных нерастворимых белков
Отдельную колонию культивировали в течение ночи при 37°С на LB-агаровой чашке с ампициллином. Бактерий инокулировали в 20 мл жидкой культуральной среды LB с ампициллином в шейкере с водяной баней и инкубировали в течение ночи. Бактерий разбавляли 1:30 в 600 мл свежей среды и оставляли расти при оптимальной температуре (37°С) до OD550=0,6-0,8. Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ IPTG, и культуру дополнительно инкубировали в течение 3 часов. Культуру центрифугировали при 8000 об/мин при 4°С. Надосадочную фракцию отбрасывали, и бактериальный осадок ресуспендировали в 7,5 мл буфера В (8 М мочевины, 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатного буфера, рН 8,8). Клетки разрушали ультразвуком на льду в течение 30 секунд при 40 Вт с помощью соникатора Branson В-15, дважды замораживали и оттаивали и вновь центрифугировали. Надосадочную фракцию хранили при -20°С, а осадки ресуспендировали в 2 мл гуанидинового буфера (6 М гуанидингидрохлорида, 100 мМ фосфатного буфера, 10 мМ Трис-HCl, рН 7,5) и обрабатывали на гомогенизаторе на протяжении 10 циклов. Полученный продукт центрифугировали при 13000 об/мин в течение 40 минут. Надосадочную фракцию смешивали с 150 мкл никелевой смолы (Pharmacia) (предварительно промытой буфером В) и инкубировали при комнатной температуре с аккуратным перемешиванием в течение 30 минут. Образец центрифугировали при 700 g в течение 5 минут при 4°С. Смолу дважды промывали в 10 мл буфера В в течение 10 минут, ресуспендировали в 1 мл буфера В и загружали на одноразовую колонку. Смолу промывали при комнатной температуре в 2 мл буфера В до достижения на выходящем протоке OD280=0,02-0,06. Смолу промывали в 2 мл буфера С (8 М мочевины, 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатного буфера, рН 6,3) до достижения на выходящем протоке OD280=0,02-0,06. Слитый с His белок элюировали добавлением 700 мкл элюционного буфера (8 М мочевины, 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатного буфера, рН 4,5), и фракции отбирали до OD280=0,l. По 21 мкл каждой фракции загружали в 12%-ный ДСН-гель.
Ренатурация His-химерных белков
К денатурированным белкам добавляли 10% глицерина. Затем белки разбавляли до 20 мкг/мл с использованием диализного буфера I (10% глицерина, 0,5 М аргинина, 50 мМ фосфатного буфера, 5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, 2 М мочевины, рН 8,8) и диализовали против того же самого буфера при 4°С в течение 12-14 часов. После этого белок диализовали против диализного буфера II (10% глицерина, 0,5 М аргинина, 50 мМ фосфатного-буфера, 5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, рН 8,8) в течение 12-14 часов при 4°С. Концентрацию белка определяли с помощью формулы:
Белок (мг/мл)=(1,55×OD280)-(0,76×OD260).
Иммунизация мышей
По 20 мкг каждого очищенного белка использовали для иммунизации мышей внутрибрюшинно. В случае некоторых ORF мышей BALB/c иммунизовали с гидроксидом алюминия в качестве адъюванта на 1-й, 21-й и 42-й дни, а иммунный ответ контролировали в образцах, взятых на 56-й день. Для других ORF мышей линии CD1 можно было иммунизовать в той же прописи. Для других ORF мышей CD1 можно было иммунизовать с использованием адъюванта Фрейнда и того же самого протокола иммунизации, за исключением того, что иммунный ответ определяли на 42-й, а не на 56-й день. Сходным образом для еще ряда ORF мышей CD1 можно было иммунизовать с адъювантом Фрейнда, но иммунный ответ контролировали на 49-й день.
Тест ТИФА (анализ сыворотки)
Декапсулированный штамм MenB M7 высевали на чашки с агаром с шоколадом и инкубировали в течение ночи при 37°С. Колонии бактерий собирали с агаровых чашек с использованием стерильного скребка и инокулировали в 7 мл бульона Mueller-Hinton (Difco), содержащего 0,25% глюкозы. Рост бактерий контролировали каждые 30 минут по величине OD620. Бактерий оставляли расти до достижения OD величины 0,3-0,4. Культуру центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин. Надосадочную фракцию отбрасывали, и бактерий однократно промывали в ФСБ, ресуспендировали в ФСБ, содержащем 0,025% формальдегида, и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре и затем в течение ночи при 4°С при перемешивании. В каждую лунку 96-луночного грейнеровского планшета вносили по 100 мкл бактериальных клеток и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки трижды промывали промывочным буфером ФСБТ (0,1% Твин-20 в ФСБ). В каждую лунку добавляли по 200 мкл насыщающего буфера (2,7% поливинилпирролидона-10 в воде), и планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Лунки промывали трижды в ФСБТ. В каждую лунку добавляли по 200 мкл разбавленной сыворотки (буфер для разбавления: 1% БСА, 0,1% Твин-20, 0,1% NaN3 в ФСБ), и планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°С. Лунки трижды промывали в ФСБТ. По 100 мкл конъюгированной с пероксидазой хрена кроличьей антимышиной сыворотки (Dako), разведенной 1:2000 в буфере для разбавления, добавляли в каждую лунку, и планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°С. Лунки трижды промывали в буфере ФСБТ. В каждую лунку добавляли по 100 мкл субстратного буфера для пероксидазы хрена (25 мл нитратного буфера - рН 5, 10 мг O-фенилдиамина и 10 мкл воды), и планшеты оставляли при комнатной температуре на 20 минут. В каждую лунку добавляли по 100 мкл H2SО4 с последующим определением OD490. ТИФА считался позитивным, если OD490 в 2,5 раза превышала показатель соответствующей преиммунной сыворотки.
Процедура FACS-сканирования в тесте на связывание бактерий
Декапсулированный штамм MenB M7 высевали на чашки с агаром с шоколадом и инкубировали в течение ночи при 37°С. Колонии бактерий собирали с агаровых чашек с использованием стерильного скребка и инокулировали в 4 пробирки, содержащие по 8 мл бульона Mueller-Hinton (Difco), содержащего 0,25% глюкозы. Рост бактерий контролировали каждые 30 минут по параметрам ОD620. Бактерий оставляли расти до достижения OD величины 0,35-0,5. Культуру центрифугировали в течение 10 минут при 4000 об/мин. Надосадочную фракцию отбрасывали, и осадок ресуспендировали в блокирующем буфере (1% БСА, 0,4% NaN3) и центрифугировали в течение 5 минут при 4000 об/мин. Клетки ресуспендировали в блокирующем буфере до достижения OD620=0,07. В каждую лунку 96-луночного костаровского планшета добавляли по 100 мкл бактериальных клеток. В каждую лунку добавляли по 100 мкл разведенных (1:200) сывороток (в блокирующем буфере), и планшеты инкубировали в течение 2 часов при 4°С. Клетки центрифугировали в течение 5 минут при 4000 об/мин, надосадочную фракцию отсасывали, и клетки промывали добавлением 200 мкл на лунку блокирующего буфера в каждую лунку. В каждую лунку добавляли по 100 мкл конъюгированного с R-фикоэритрином козьего антимышиного фрагмента антитела F(ab)2, разведенного 1:100, и планшеты инкубировали в течение 1 часа при 4°С. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 5 минут и промывали добавлением 200 мкл на лунку блокирующего буфера. Надосадочную фракцию отсасывали, и клетки ресуспендировали в 200 мкл на лунку ФСБ, содержащего 0,25% формальдегида. Образцы переносили в пробирки FACS-сканера и считывали. Установки на FACS-сканере были такими: FL1 - включен; FL2 и FL3 - выключены; FSC-H Treshold - 92; FSC PMT Voltage - Е02; SSC PMT - 474; Amp. Gains - 7.1; FL-2 PMT - 539. Величины компенсации - 0.
Приготовление ОМV
Бактерий культивировали в течение ночи на 5 чашках GC, собирали петлей и ресуспендировали в 10 мл 20 мМ Трис-HCl. Инактивацию теплом осуществляли при 56°С в течение 30 минут, и бактерий разрушали ультразвуком в течение 10 минут на льду (50% нагрузки в цикле облучения, 50% выходной мощности). Неразрушенные клетки удаляли центрифугированием при 5000 g в течение 10 минут, и общую фракцию клеточных оболочек выделяли центрифугированием при 50000 g в течение 75 минут при 4°С. Для экстрагирования цитоплазматических мембранных белков из неочищенной фракции внешних мембран общую фракцию ресуспендировали в 2%-ном саркозиле (Sigma) и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Суспензию центрифугировали при 10000 g в течение 10 минут с целью удаления агрегаций, и надосадочную фракцию далее подвергали ультрацентрифугированию при 50000 g в течение 75 минут с получением осадка внешних мембран. Внешние мембраны ресуспендировали в 10 мМ Трис-НСl (рН 8), и концентрацию белка определяли в тесте Bio-Rad Protein, используя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.
Приготовление цельных экстрактов
Бактерий культивировали в течение ночи на чашке GC, собирали петлей и ресуспендировали в 1 мл 20 мМ Трис-НСl. Инактивацию нагреванием осуществляли в течение 30 минут при 56°С.
Вестерн-блоттинг
Очищенные белки (500 нг на дорожку), внешнемембранные везикулы (5 мкг) и общие клеточные экстракты (25 мкг), производные от клеток МеnВ штамма 2996, загружали в 15%-ный ДСН-полиакриламидный гель и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Перенос осуществляли в течение 2 часов при 150 мА при 4°С в буфере для переноса (0,3% основный Трис, 1,44% глицина, 20% метанола). Мембраны насыщали путем инкубации в течение ночи при 4°С в насыщающем буфере (10% снятого молока, 0,1% Тритон Х-100 в ФСБ). Мембраны промывали дважды в промывочном буфере (3% снятого молока, 0,1% Тритон Х-100 в ФСБ) и инкубировали в течение 2 часов при 37°С с мышиной сывороткой, разведенной до 1:200 промывочным буфером. Мембраны промывали дважды и инкубировали в течение 90 минут с помеченным пероксидазой хрена антимышиным иммуноглобулином, разведенным до 1:2000. Мембраны промывали дважды 0,1% Тритона Х-100 в ФСБ и проявляли с использованием набора реактивов Opti-4CN Substrate kit (BioRad). Реакцию останавливали добавлением воды.
Тест на бактерицидность
Штамм МС58 культивировали в течение ночи при 37°С на шоколадно-агаровых чашах. По 5-7 колоний отбирали и использовали для высева в 7 мл культурального бульона Mueller-Hinton. Суспензию инкубировали при 37°С в нутаторе и оставляли культивироваться до достижения OD620=0,5-0,8. Культуру разделяли на аликвоты в стерильные 1,5-мл эппендорфовские пробирки и центрифугировали в течение 20 минут при максимальной скорости микроцентрифуги. Полученный осадок промывали один раз в буфере Гея (Gibco) и ресуепендировали в том же буфере до величины OD620=0,5, разводили в буфере Гея до 1:20000 и хранили при 25°С.
В каждую лунку 96-луночного планшета для культур тканей добавляли по 50 мкл буфера Гея + 1% бычьего сывороточного альбумина. В каждую лунку добавляли по 25 мкл разбавленной мышиной сыворотки (1:100) (буфер для разбавления: буфер Гея + 0,2% бычьего сывороточного альбумина), и планшет инкубировали при 4°С. В каждую лунку добавляли по 25 мкл охарактеризованной выше суспензии бактериальных клеток. В каждую лунку добавляли по 25 мкл либо инактивированного нагреванием (при 56°С на водяной бане в течение 30 минут), либо нормального комплемента крольчат. Немедленно вслед за добавлением комплемента крольчат по 22 мкл каждого образца (лунки) высевали на агаровые чашки Meuller-Hinton (время 0). 96-луночные планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С при вращении и затем по 22 мкл каждого образца (лунки) высевали на агаровые чашки Mueller-Hinton (время 1). После инкубации в течение ночи подсчитывали колонии, соответствующие времени 0 и времени 1 час.
Следующие нуклеотидные и аминокислотные последовательности идентифицируются своими обозначениями, имеющими такую форму: [g, m или а] [#] [seq или pep], где “g” обозначает последовательность N.gonorrhoeae, “m” обозначает последовательность N.meningitidis В и “а” обозначает последовательность N.meningitidis А; “#” обозначает номер последовательности; “seq” обозначает нуклеотидную последовательность (ДНК) и “pep” обозначает аминокислотную последовательность. Например, “g001.seq” обозначает последовательность №1 ДНК N.gonorrhoeae. Окончание “-1” или “-2” у этих последовательностей указывает на присутствие дополнительной последовательности, имеющейся для той же ORF. Кроме того, открытые кодирующие рамки обозначены ORF #, где “#” обозначает номер данной ORF и соответствует номеру последовательности, которая кодирует данную ORF; также к обозначениям ORF могут быть добавлены окончания “.ng” или “.а”, указывающие на то, что ORF соответствуют последовательности N.gonorrhoeae или последовательности N.meningitidis А, соответственно. Компьютерный анализ был проведен с целью сравнения последовательностей пептидов “g”, “m” и “а”; и в этих случаях окончание “pep” используется в случаях неполной ясности.
Пример 1 (см. в конце текста).
Олигонуклеотиды, использованные в ПЦР, представлены в таблице.
Пример 2
Экспрессия ORF 919
Праймер, описанный в таблице для ORF 919, использовали для выявления и клонирования ORF 919. Предсказанный ген 919 клонировали в вектор рЕТ и экспрессировали в клетках E.coli. Полученный продукт экспрессии и очистки белка анализировали электрофоретически в ДСН-ПААГ. В панели А показан анализ очистки химерного белка 919-His. Мышей иммунизовали очищенным 919-His, и сыворотку использовали в Вестерн-блоттинге (панель В), в FACS-анализе (панель С), в тесте на бактерицидность (панель D) и в тесте ТИФА (панель Е). Обозначения: M1 - маркер молекулярной массы; РР - очищенный белок; ТР - экстракт общего белка N.meningitidis; OMV - препарат везикул внешней мембраны N.meningitidis. Стрелки указывают на положение основного белкового рекомбинантного продукта (А) и иммунореактивной полосы N.meningitidis (В). Проведенные эксперименты подтверждают, что белок 919 является поверхностно-клеточным белком, т.е. является применимым иммуногеном. Графики гидрофильности, антигенный индекс и участки амфипатичности ORF 919 показаны на фиг.10. Программу AMPHI использовали для предсказывания потенциальных Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9). Нуклеотидная последовательность ORF 919 и кодируемая ею аминокислотная последовательность представлены в примере 1.
Пример 3
Экспрессия ORF 279
Праймер, описанный в таблице для ORF 279, использовали для выявления и клонирования ORF 279. Предсказанный ген 279 клонировали в вектор pGEX и экспрессировали в клетках E.coli. Полученный продукт экспрессии и очистки белка анализировали электрофоретически в ДСН-ПААГ. В панели А показан анализ очистки химерного белка 279-GST. Мышей иммунизовали очищенным 279-GST, и сыворотку использовали в Вестерн-блоттинге (панель В), в FACS-анализе (панель С), в тесте на бактерицидность (панель D) и в тесте ТИФА (панель Е). Обозначения: Ml - маркер молекулярной массы; ТР - экстракт общего белка N.meningitidis; OMV - препарат везикул внешней мембраны N.meningitidis. Стрелки указывают на положение основного белкового рекомбинантного продукта (А) и иммунореактивной полосы N.meningitidis (В). Проведенные эксперименты подтверждают, что белок 279 является поверхностно-клеточным белком, т.е. является применимым иммуногеном. Графики гидрофильности, антигенный индекс и участки амфипатичности ORF 279 показаны на фиг.11. Программу AMPHI использовали для предсказывания потенциальных Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9). Нуклеотидная последовательность ORF 279 и кодируемая ею аминокислотная последовательность представлены в примере 1.
Пример 4
Экспрессия ORF 576
Праймер, описанный в таблице для ORF 576, использовали для выявления и клонирования ORF 576. Предсказанный ген 576 клонировали в вектор pGEX и экспрессировали в клетках E.coli. Полученный продукт очистки белка анализировали электрофоретически в ДСН-ПААГ. В панели А показан анализ очистки химерного белка 576-GST. Мышей иммунизовали очищенным 576-GST, и сыворотку использовали в Вестерн-блоттинге (панель В), в FACS-анализе (панель С), в тесте на бактерицидность (панель D) и в тесте ТИФА (панель Е). Обозначения: Ml - маркер молекулярной массы; ТР - экстракт общего белка N.meningitidis; OMV - препарат везикул внешней мембраны N.meningitidis. Стрелки указывают на положение основного белкового рекомбинантного продукта (А) и иммунореактивной полосы N.meningitidis (В). Проведенные эксперименты подтверждают, что белок 576 является поверхностно-клеточным белком, т.е. является применимым иммуногеном. Графики гидрофильности, антигенный индекс и участки амфипатичности ORF 576 показаны на фиг.12. Программу AMPHI использовали для предсказывания потенциальных Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9). Нуклеотидная последовательность ORF 576 и кодируемая ею аминокислотная последовательность представлены в примере 1.
Пример 5
Экспрессия ORF 519
Праймер, описанный в таблице для ORF 519, использовали для выявления и клонирования ORF 519. Предсказанный ген 519 клонировали в вектор рЕТ и экспрессировали в клетках E.coli.
Полученный продукт очистки белка анализировали методом электрофореза в ДСН-ПААГ. В панели А показан анализ очистки химерного белка 519-His. Мышей иммунизовали очищенным 519-His, и сыворотку использовали в Вестерн-блоттинге (панель В), в FACS-анализе (панель С), в тесте на бактерицидность (панель D) и в тесте ТИФА (панель Е). Обозначения: M1 - маркер молекулярной массы; ТР - экстракт общего белка N.meningitidis; OMV - препарат везикул внешней мембраны N.meningitidis. Стрелки указывают на положение основного белкового рекомбинантного продукта (А) и иммунореактивной полосы N.meningitidis (В). Проведенные эксперименты подтверждают, что белок 519 является поверхностно-клеточным белком, т.е. является применимым иммуногеном. Графики гидрофильности, антигенный индекс и участки амфипатичности ORF 519 показаны на фиг.13. Программу AMPHI использовали для предсказывания потенциальных Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9). Нуклеотидная последовательность ORF 519 и кодируемая ею аминокислотная последовательность представлены в примере 1.
Пример 6
Экспрессия ORF 121
Праймер, описанный в таблице для ORF 121, использовали для выявления и клонирования ORF 121. Предсказанный ген 121 клонировали в вектор рЕТ и экспрессировали в клетках E.coli.
Полученный продукт очистки белка анализировали электрофоретически в ДСН-ПААГ. В панели А показан анализ очистки химерного белка 121-His. Мышей иммунизовали очищенным 121-His, и сыворотку использовали в Вестерн-блоттинге (панель В), в FACS-анализе (панель С), в тесте на бактерицидность (панель D) и в тесте ТИФА (панель Е). Полученные результаты показывают, что белок 121 является поверхностно-клеточным белком. Обозначения: M1 - маркер молекулярной массы; ТР - экстракт общего белка N.meningitidis; OMV - препарат везикул внешней мембраны N.meningitidis. Стрелки указывают на положение основного белкового рекомбинантного продукта (А) и иммунореактивной полосы N.meningitidis (В). Проведенные эксперименты подтверждают, что белок 121 является поверхностно-клеточным белком, т.е. является применимым иммуногеном. Графики гидрофильности, антигенный индекс и участки амфипатичности ORF 121 показаны на фиг.14. Программу AMPHI использовали для предсказывания потенциальных Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9). Нуклеотидная последовательность ORF 121 и кодируемая ею аминокислотная последовательность представлены в примере 1.
Пример 7
Экспрессия ORF 128
Праймер, описанный в таблице для ORF 128, использовали для выявления и клонирования ORF 128. Предсказанный ген 128 клонировали в вектор рЕТ и экспрессировали в клетках Е.coli. Полученный продукт очистки белка анализировали методом электрофореза в ДСН-ПААГ. В панели А показан анализ очистки химерного белка 128-His. Мышей иммунизовали очищенным 128-His, и сыворотку использовали в Вестерн-блоттинге (панель В), в FACS-анализе (панель С), в тесте на бактерицидность (панель D) и в тесте ТИФА (панель Е). Полученные результаты показывают, что белок 128 является поверхностно-клеточным белком. Обозначения: M1 - маркер молекулярной массы; ТР - экстракт общего белка N.meningitidis; OMV - препарат везикул внешней мембраны N.meningitidis. Стрелки указывают на положение основного белкового рекомбинантного продукта (А) и иммунореактивной полосы N.meningitidis (В). Проведенные эксперименты подтверждают, что белок 128 является поверхностно-клеточным белком, т.е. применим в качестве иммуногена. Графики гидрофильности, антигенный индекс и участки амфипатичности ORF 128 показаны на фиг.15. Программу AMPHI использовали для предсказывания потенциальных Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9). Нуклеотидная последовательность ORF 128 и кодируемая ею аминокислотная последовательность представлены в примере 1.
Пример 8
Экспрессия ORF 206
Праймер, описанный в таблице для ORF 206, использовали для выявления и клонирования ORF 206. Предсказанный ген 206 клонировали в вектор рЕТ и экспрессировали в клетках E.coli. Полученный продукт очистки белка анализировали электрофоретически в ДСН-ПААГ. В панели А показан анализ очистки химерного белка 206-His. Мышей иммунизовали очищенным 206-His, и полученную сыворотку использовали в Вестерн-блоттинге (панель В). Заслуживает внимания то, что иммунореактивная полоса в белковом экстракте менингококка соответствует 38 кД вместо 17 кД (панель А). Для получения информации о природе такого иммунологического окрашивания авторы проэкспрессировали ORF 206 в клетках E.coli без полигистидиновой метки, но включая предполагаемый сигнальный сегмент. Данные Вестерн-блоттинга в отношении общебелковых экстрактов E.coli, экспрессирующих данную нативную форму белка 206, показали наличие реактивного бэнда в положении 38 кД, что наблюдалось у менингококка. Сделано заключение, что бэнд 38 кД на панели В является специфичным и что антитела к белку 206, по-видимому, распознают мультимерный белковый комплекс. На панели С показаны данные анализа FACS, на панели D - данные теста на бактерицидность, а на панели Е - тест ТИФА. Согласно полученным результатам белок 206 является поверхностно-клеточным белком. Обозначения: M1 - маркер молекулярной массы; ТР - экстракт общего белка N.meningitidis; OMV - препарат везикул внешней мембраны N.meningitidis. Стрелки указывают на положение основного белкового рекомбинантного продукта (А) и иммунореактивной полосы N.meningitidis (В). Проведенные эксперименты подтверждают, что белок 206 является поверхностно-клеточным белком, т.е. применим в качестве иммуногена. Графики гидрофильности, антигенный индекс и участки амфипатичности ORF 206 показаны на фиг.16. Программу AMPHI использовали для предсказывания потенциальных Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9). Нуклеотидная последовательность ORF 206 и кодируемая ею аминокислотная последовательность представлены в примере 1.
Пример 9
Экспрессия ORF 287
Праймер, описанный в таблице для ORF 287, использовали для выявления и клонирования ORF 287. Предсказанный ген 287 клонировали в вектор pGEX и экспрессировали в клетках E.coli. Полученный продукт очистки белка анализировали электрофоретически в ДСН-ПААГ. В панели А показан анализ очистки химерного белка 287-GST. Мышей иммунизовали очищенным 287-GST, и сыворотку использовали в FACS-анализе (панель В), в тесте на бактерицидность (панель С) и в тесте ТИФА (панель D). Согласно полученным результатам белок 287 является поверхностно-клеточным белком. Обозначения: M1 - маркер молекулярной массы. Стрелка указывает на положение основного белкового рекомбинантного продукта (А). Проведенные эксперименты подтверждают, что белок 287 является поверхностно-клеточным белком, т.е. применим в качестве иммуногена. Графики гидрофильности, антигенный индекс и участки амфипатичности ORF 287 показаны на фиг.17. Программу AMPHI использовали для предсказывания потенциальных Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9). Нуклеотидная последовательность ORF 287 и кодируемая ею аминокислотная последовательность представлены в примере 1.
Пример 10
Экспрессия ORF 406
Праймер, описанный в таблице для ORF 406, использовали для выявления и клонирования ORF 406. Предсказанный ген 406 клонировали в вектор рЕТ и экспрессировали в клетках E.coli. Полученный продукт очистки белка анализировали электрофоретически в ДСН-ПААГ. В панели А показан анализ очистки химерного белка 406-His. Мышей иммунизовали очищенным 406-His, и сыворотку использовали в Вестерн-блоттинге (панель В), в FACS-анализе (панель С), в тесте на бактерицидность (панель D) и в тесте ТИФА (панель Е). Согласно полученным данным белок 406 является поверхностно-клеточным белком. Обозначения: M1 - маркер молекулярной массы; ТР - экстракт общего белка N.meningitidis; OMV - препарат везикул внешней мембраны N.meningitidis. Стрелки указывают на положение основного белкового рекомбинантного продукта (А) и иммунореактивной полосы N.meningitidis (В). Проведенные эксперименты подтверждают, что белок 406 является поверхностно-клеточным белком, т.е. применим в качестве иммуногена. Графики гидрофильности, антигенный индекс и участки амфипатичности ORF 406 показаны на фиг.18. Программу AMPHI использовали для предсказывания потенциальных Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Human Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9). Нуклеотидная последовательность ORF 406 и кодируемая ею аминокислотная последовательность представлены в примере 1.
Приведенные выше примеры призваны проиллюстрировать, но не в чем-либо ограничить настоящее изобретение.
Приложение А. (см. в конце текста).
Приложение В
Открытые рамки считывания NMB
NMB0001: ацетилтрансфераза, предположительно; 491-3.
NMB0002: гипотетический белок; 890-498.
NMB0003: глутамил-тРНК-синтетаза; 2305-914.
NMB0004: EpiH/GdmH-родственный белок; 3154-2513.
NMB0005: арсенатредуктаза; 3504-3154.
NMB0006: родственный тиоредоксину белок; 3628-4304
NMB0007: АТФ-связывающийся белок FtsE клеточных делений; 4304-4951.
NMB0008: белок FtsX клеточных делений, предположительно; 4951-5865.
NMB0009: белок семейства BolA/YrbA; 5959-6204.
NMB0010: фосфоглицераткиназа; 7485-6277.
NMB0011: УДФ-N-ацетилглюкозамин-1-карбоксивинил-трансфераза; 8819-7569.
NMB0012: консервативный гипотетический белок; 10310-9342.
NMB0013: консервативный гипотетический белок; 10792-10346.
NMB0014: трансфераза 3-дезокси-D-маннооктулокозановой кислоты; 12104-10836.
NMB0015: декарбоксилирующая 6-фосфоглюконатдегидрогеназа; 13615-12170.
NMB0016: гипотетический белок; 13911-14144.
NMB0017: УДФ-3-О-3-гидроксимиристоил-N-ацетилглюкозаминдеацетилаза; 16137-15217.
NMB0018: пилин PilE; 17734-17225.
NMB0019: кассета pilS; 18932-18513.
NMB0020: кассета pilS; 19646-19263.
NMB0021: кассета pilS; 20297-19914.
NMB0022: кассета pilS; 21157-20894.
NMB0023: кассета pilS; 21882-21466.
NMB0024: кассета pilS; 22474-22061.
NMB0025: большая кассета pilS; 23489-22821.
NMB0026: кассета pilS; 23868-23594.
NMB0027: пептидилпролильная цис-транс-изомераза FKBP-типа; 24226-23900.
NMB0028: гипотетический белок; 24522-24307.
NMB0029: глицератдегидрогеназа; 24644-25594.
NMB0030: метионил-тРНК-синтетаза; 27729-25675.
NMB0031: (изомеризующая) глюкозамин/фруктозо-6-фосфат-аминотрансфераза; 29683-27848.
NMB0032: гипотетический белок; 29959-30483.
NMB0033: связанная с мембраной литическая муреинтранс-гликозилаза-А, предположительно; 32229-30907.
NMB0034: консервативный гипотетический белок; 32440-33276.
NMB0035: консервативный гипотетический белок; 33276-34439.
NMB0036: консервативный гипотетический белок; 34706-35968.
NMB0037: белок phnA; 36372-36046.
NMB0038: УДФ-М-ацетилглюкозаминпирофосфорилаза; 37817-36450.
NMB0039: гипотетический белок; 38144-37875.
NMB0040: гидролаза, предположительно; 38850-38140.
NMB0041: АВС-переносчик - периплазматический белок, связывающий растворенное вещество; 38909-39907.
NMB0042: консервативный гипотетический белок; 40004-40849.
NMB0043: консервативный гипотетический белок; 40878-41360.
NMB0044: пептидметионинсульфоксидредуктаза; 43033-41468.
NMB0045: белок комплекса распознавания сигналов; 43179-44441.
NMB0046: гипотетический белок; 44451-44672.
NMB0047: консервативный гипотетический белок; 45072-45353.
NMB0048: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 47969-48109.
NMB0049: белок pilC2, “сдвиг рамки”; 48116-51279.
NMB0050: консервативный гипотетический белок; 55173-53026.
NMB0051: белок судорожной подвижности; 56685-55462.
NMB0052: белок судорожной подвижности pilT; 57891-56851.
NMB0053: консервативный гипотетический белок; 58011-58694.
NMB0054: гипотетический белок; 58697-59101.
NMB0055: пирролин-5-карбоксилатредуктаза; 59153-59941.
NMB0056: супрессорный белок DnaK; 60091-60504.
NMB0057: гипотетический белок; 66347-66700.
NMB0058: гипотетический белок; 66731-66885.
NMB0059: белок dnaJ; 66972-68090.
NMB0060: консервативный гипотетический белок; 68289-70304.
NMB0061: дТДФ-6-дезокси-L-ликсо-4-гексулозоредуктаза, “сдвиг рамки”; 70923-69924.
NMB0062: глюкозо-1-фосфаттимидилилтрансфераза; 71828-70965.
NMB0063: дTДФ-D-глюкозо-4,6-дегидратаза; 72958-71894.
NMB0064: УДФ-глюкозо-4-эпимераза; 74093-73077.
NMB0065: гипотетический белок; 74476-75399.
NMB0066: аденин-N-6-метилтрансфераза рРНК; 75687-76418.
NMB0067: белок SiaD биосинтеза капсулярной полисиаловой кислоты, укороченный; 77283-76609.
NMB0068: белок SiaC биосинтеза капсулярной полисиаловой кислоты; 78416-77370.
NMB0069: белок SiaB биосинтеза капсулярной полисиаловой кислоты; 79103-78420.
NMB0070: белок synX биосинтеза капсулярной полисиаловой кислоты; 80240-79110.
NMB0071: белок CtrA экспорта на внешнюю мембрану капсулярного полисахарида; 80375-81547.
NMB0072: белок CtrB экспорта на внутреннюю мембрану капсулярного полисахарида; 81565-82725.
NMB0073: белок CtrC экспорта на внутреннюю мембрану капсулярного полисахарида; 82728-83522.
NMB0074: АТФ-связывающий белок CtrD экспорта капсулярного полисахарида; 83522-84169.
NMB0075: вспомогательный транскрипционный белок Тех, предположительно; 84236-86506.
NMB0076: метилтрансфераза HphIm(C), “сдвиг рамки”; 86540-87539.
NMB0077: сайт-специфичная ДНК-метилаза, укороченная; 87529-87876.
NMB0078: УДФ-глюкозо-4-эпимераза, укороченная; 87922-88575.
NMB0079: дТДФ-D-глюкозо-4,6-дегидратаза; 88694-89578.
NMB0080; глюкозо-1-фосфаттимидилилтрансфераза; 89824-90687.
NMB0081: дТДФ-4-кето-6-дезокси-D-глюкозо-3,6-эпимераза; 90729-91280.
NMB0082: белок-модификатор капсулярного полисахарида LipA; 91308-93419.
NMB0083: белок-модификатор капсулярного полисахарида LipB; 93559-94815.
NMB0084: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 95185-96587.
NMB0085: котранспортер натрия/глутамата; 96808-98019.
NMB0086: гипотетический белок; 98121-99134.
NMB0087: гипотетический белок; 99148-99342.
NMB0088: белок внешней мембраны Р1, предположительно; 101170-99773.
NMB0089: пируваткиназа-II; 102957-101488.
NMB0090: транспозаза семейства IS1016, предположительно, “сдвиг рамки”; 103217-103857.
NMB0091: гипотетический белок; 104399-104632.
NMB0092: гипотетический белок; 104629-104853.
NMB0093: гипотетический белок; 104856-104939.
NMB0094: гипотетический белок; 105228-105413.
NMB0095: гипотетический белок; 105423-105572.
NMB0096: гипотетический белок; 105676-105843.
NMB0097: секреторный белок, предположительно, точковая мутация; 105860-107344.
NMB0098: АВС-переносчик - АТФ-связывающий белок, “сдвиг рамки”; 107313-109396.
NMB0099: гипотетический белок; 109624-109484.
NMB0100: гипотетический белок; 109770-109627.
NMB0101: транспозаза семейства IS1016, предположительно, “сдвиг рамки”; 109850-110489.
NMB0102: гипотетический белок; 110608-111123.
NMB0103: белок резистентности к бактериоцину, предположительно; 111896-111405.
NMB0104: гипотетический белок; 113073-112402.
NMB0105: PhnO-родственный белок; 114197-113358.
NMB0106: каталитическая субъединица аспартаткарбамоил-трансферазы; 114436-115353.
NMB0107: регуляторная субъединица аспартаткарбамоил-трансферазы; 115366-115821.
NMB0108: гипотетический белок: 115889-11651.
NMB0109: консервативный гипотетический белок; 117948-116620.
NMB0110: полипептиддеформилаза; 118018-118518.
NMB0111: метионил-тРНК-формилтрансфераза; 118608-119531.
NMB0112: метилтрансфераза 16S-PHK; 119613-120869.
NMB0113: гипотетический белок; 120892-121431.
NMB0114: азот-регулирующий белок NtrY, предположительно; 121434-123551.
NMB0115: белок-регулятор ассимиляции азота NtrX; 123547-124821.
NMB0116: ДНК-процессирующая субъединица-А; 124915-126105.
NMB0117: белок smg, предположительно; 126134-126592.
NMB0118: ДНК-топоизомераза I; 126667-128970.
NMB0119: гипотетический белок; 128741-129049.
NMB0120: гипотетический белок; 130312-129764.
NMB0121: консервативный гипотетический белок; 130431-130805.
NMB0122: консервативный гипотетический белок; 130897-131463.
NMB0123: ферредоксин бактериального типа 4Fe-4S; 131589-131837.
NMB0124: фактор элонгации трансляции Tu; 132257-133438.
NMB0125: транслоказа препротеина, субъединица SecE; 133638-133913.
NMB0126: белок антитерминации транскрипции NusG; 133918-134451.
NMB0127: рибосомный белок L11 субчастицы 50S; 134555-134986.
NMB0128: рибосомный белок L1 субчастицы 50S; 134989-135681.
NMB0129: гипотетический белок; 135753-135893.
NMB0130: рибосомный белок L10 субчастицы 50S; 135914-136411.
NMB0131: рибосомный белок L7/L12 субчастицы 50S; 136472-136840.
NMB0132: ДНК-зависимая РНК-полимераза, β-субъединица, “сдвиг рамки”; 137027-141208.
NMB0132: ДНК-зависимая РНК-полимераза, β’-субъединица;
141368-145540.
NMB0134: гипотетический белок; 145835-146089.
NMB0135: консервативный гипотетический белок; 146089-146235.
NMB0136: рибосомный белок S12 субчастицы 30S; 146417-146785.
NMB0137: рибосомный белок S7 субчастицы 30S; 146906-147373.
NMB0138: фактор элонгации G (EF-G); 147395-149497.
NMB0139: фактор элонгации трансляции Тu; 149586-150767.
NMB0140: рибосомный белок S10 субчастицы 30S; 150788-151096.
NMB0141: транспозаза, укороченная; 151241-151603.
NMB0142: рибосомный белок L3 субчастицы 50S; 151777-152418.
NMB0143: рибосомный белок L4 субчастицы 50S; 152421-153038.
NMB0144: рибосомный белок L23 субчастицы 50S; 153038-153349.
NMB0145: рибосомный белок L2 субчастицы 50S; 153358-154188.
NMB0146: рибосомный белок S19 субчастицы 30S; 154198-154473.
NMB0147: рибосомный белок L22 субчастицы 50S; 154485-154811.
NMB0148: рибосомный белок S3 субчастицы 30S; 154824-155513.
NMB0149: рибосомный белок L16 субчастицы 50S; 155500-155913.
NMB0150: рибосомный белок L29 субчастицы 50S; 155916-156104.
NMB0151: рибосомный белок S17 субчастицы 30S; 156107-156367.
NMB0152: рибосомный белок L14 субчастицы 50S; 156592-156957.
NMB0153: рибосомный белок L24 субчастицы 50S; 156972-157292.
NMB0154: рибосомный белок L5 субчастицы 50S; 157305-157841.
NMB0155: рибосомный белок S14 субчастицы 30S; 157847-158149.
NMB0156: рибосомный белок S8 субчастицы 30S; 158168-158557.
NMB0157: рибосомный белок L6 субчастицы 50S; 158574-159104.
NMB0158: рибосомный белок L18 субчастицы 50S; 159121-159471.
NMB0159: рибосомный белок S5 субчастицы 30S; 159493-160008.
NMB0160: рибосомный белок L30 субчастицы 50S; 160004-160186.
NMB0161: рибосомный белок L15 субчастицы 50S; 160191-160622.
NMB0162: транслоказа препротеинов, субъединица SecY; 160637-161944.
NMB0163: фактор инициации трансляции IF-1; 161952-162167.
NMB0164: рибосомный белок L36 субчастицы 50S; 162191-162301.
NMB0165: рибосомный белок S13 субчастицы 30S; 162370-162729.
NMB0166: рибосомный белок S11 субчастицы 30S; 162752-163144.
NMB0167: рибосомный белок S4 субчастицы 30S; 163167-163784.
NMB0168: ДНК-зависимая РНК-полимераза, α-субъединица; 163813-164796.
NMB0169: рибосомный белок L17 субчастицы 50S; 164823-165188.
NMB0170: белок-детерминатор септного сайта MinC; 165338-166048.
NMB0171: белок-детерминатор септного сайта MinD; 166079-166891.
NMB0172: фактор топологической специфичности клеточных делений; 166898-167158.
NMB0173: транскрипционный регулятор семейства LysR; 167165-168082.
NMB0174: валил-тРНК-синтетаза; 171252-168418.
NMB0175: консервативный гипотетический белок; 172158-171352.
NMB0176: дегидрогеназа D-аминокислот, малая субъединица; 173595-172342.
NMB0177: котранспортер натрия/аланина, предположительно; 175065-173677.
NMB0178: УДФ-N-ацетилглюкозамин-О-ацилтрансфераза ацильных групп (белков-переносчиков ацильных групп); 176198-175425.
NMB0179: (3R)-гидроксимиристоилдегидратаза белков-переносчиков ацильных групп; 176734-176288.
NMB0180: УДФ-3-O-(3-гидроксимиристоил)-глюкозамин-N-ацилтрансфераза; 177814-176771.
NMB0181: белок внешней мембраны OmpH, предположительно; 178347-177850.
NMB0182: белок внешней мембраны Оmр85; 180806-178416.
NMB0183: консервативный гипотетический белок; 182203-180866.
NMB0184: 1-дезокси-D-ксилулозо-5-фосфатредуктоизомераза; 183422-182241.
NMB0185: фосфатидатцитидилилтрансфераза; 184275-183481.
NMB0186: ундекапренилпирофосфатсинтетаза; 185024-184281.
NMB0187: фактор рециклизации рибосом; 185637-185083.
NMB0188: консервативный гипотетический белок; 186944-185820.
NMB0189: гипотетический белок; 187355-187774.
NMB0190: глюкозо-ингибируемый белок-В клеточных делений; 187935-188555.
NMB0191: белок семейства РаrА; 188657-189427.
NMB0192: рибонуклеаза НII; 191274-190693.
NMB0193: глюкозо-ингибируемый белок-А клеточных делений; 193238-191346.
NMB0194: аминокислотный котранспортер, предположительно; 194991-193567.
NMB0195: белок PdxA биосинтеза пиридоксальфосфата; 195133-196137.
NMB0196: рибонуклеаза-Е; 200197-197441.
NMB0197: гипотетический белок; 200321-200605.
NMB0198: псевдоуридинсинтаза-С большой субчастицы рибосомы; 200690-201679.
NMB0199: синтаза липид-А-дисахарида; 201730-202899.
NMB0200: гипотетический белок; 203501-203115.
NMB0201: гипотетический белок; 203724-204131.
NMB0202: гипотетический белок; 204152-204322.
NMB0203: дигидродипиколинатредуктаза; 205207-204401.
NMB0204: липопротеин, предположительно; 205594-205220.
NMB0205: белок-регулятор поглощения железа; 205813-206244.
NMB0206: лейцил/фенилаланил-тРНК-протеинтрансфераза; 206317-207039.
NMB0207: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; 208326-207298.
NMB0208: ферредоксин бактериального типа 4Fe-4S; 209364-208528.
NMB0209: глутатион-регулируемый белок системы калиевого оттока; 209513-211486.
NMB0210: сайт-специфичная ДНК-метилаза, укороченная; 212082-212401.
NMB0211: дегидратаза L-серина; 214093-212711.
NMB0212: ДНК-гираза, субъединица В; 216580-214193.
NMB0213: гипотетический белок; 216736-217719.
NMB0214: олигопептидаза-А; 217810-219843.
NMB0215: консервативный гипотетический белок; 221035-220472.
NMB0216: каталаза; 222945-221434.
NMB0217: сигма54-фактор RpoN РНК-полимеразы, предположительно; 223293-224141.
NMB0218: гликозилтрансфераза; 226194-225067.
NMB0219: 3-оксоацилсинтаза II белка-переносчика ацильных групп; 227746-226502.
NMB0220: белок-переносчик ацильных групп; 228138-227905.
NMB0221: дигидрооротатдегидрогеназа; 228370-229374.
NMB0222: гипотетический белок; 229540-230010.
NMB0223: гипотетический белок; 230140-230355.
NMB0224: аденилилтрансфераза глутаматаммиаклигазы; 230556-233243.
NMB0225: транспозаза семейства IS30, “сдвиг рамки”; 234513-233551.
NMB0226: консервативный гипотетический белок; 235470-234781.
NMB0227: консервативный гипотетический белок; 236771-235581.
NMB0228: консервативный гипотетический белок; 237637-236903.
NMB0229: консервативный гипотетический белок; “сдвиг рамки”; 238552-237662.
NMB0230: консервативный гипотетический белок; 239196-238552.
NMB0231: гипотетический белок; 239356-239255.
NMB0232: ДНК-хеликаза II; 239380-241584.
NMB0233: гипотетический белок; 241663-241761.
NMB0234: гипотетический белок; 242111-242647.
NMB0235: гипотетический белок; 243052-242894.
NMB0236: гипотетический белок; 243168-243063.
NMB0237: гипотетический белок; 243535-243179.
NMB0238: транспозаза семейства IS1016, вырожденная; 243588-243849.
NMB0239: гипотетический белок; 244051-244668.
NMB0240: гипотетический белок; 244694-246142.
NMB0241: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица А; 246607-246960.
NMB0242: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица В; 246954-247433.
NMB0243: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица С; 247449-248039.
NMB0244: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица D; 248032-249285.
NMB0245: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица Е; 249288-249758.
NMB0246: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица F; 250151-251449.
NMB0247: гипотетический белок; 251452-251886.
NMB0248: консервативный гипотетический белок; 252175-252411.
NMB0249: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица G; 252726-254984.
NMB0250: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица Н; 254990-256063.
NMB0251: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица I; 256147-256623.
NMB0252: гипотетический белок; 256657-257361.
NMB0253: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица J; 257400-258068.
NMB0254: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица К; 258068-258370.
NMB0255: Fic-родственный белок белка клеточной филаментации; 258407-258979.
NMB0256: гипотетический белок; 259106-259444.
NMB0257: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица L; 259496-261517.
NMB0258: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица М; 261616-263109.
NMB0259: НАДФ-дегидрогеназа I, субъединица N; 263122-264561.
NMB0260: гипотетический белок; 264612-264995.
NMB0261: геранилтранстрансфераза; 265863-265087.
NMB0262: экзодезоксирибонуклеаза, малая субъединица; 266188-265967.
NMB0263: консервативный гипотетический белок; 267358-266438.
NMB0264: АВС-переносчик - ATФ-связывающий белок; 269219-267366.
NMB0265: ДНК-хеликаза RuvA кроссоверных связок; 269966-269385.
NMB0266: консервативный гипотетический белок; 270374-270051.
NMB0267: консервативный гипотетический белок; 271155-270439.
NMB0268: РНК-метилтрансфераза семейства TrmH; 271749-271288.
NMB0269: белок клеточной компетентности; 272539-271817.
NMB0270: белок bioH, предположительно; 272538-273284.
NMB0271: гипотетический белок; 273284-274069.
NMB0272: гипотетический белок; 274527-274820.
NMB0273: гипотетический белок; 274861-275283.
NMB0274: АТФ-зависимая ДНК-хеликаза RecQ; 277728-275431.
NMB0275: индол-3-глицерофосфатсинтаза; 278575-277796.
NMB0276: консервативный гипотетический белок; 279582-278629.
NMB0277: фактор вирулентности MviN; 281255-279717.
NMB0278: фактор тиол/дисульфидного обмена DsbA; 281470-282165.
NMB0279: консервативный гипотетический белок; 283229-282228.
NMB0280: белок толерантности к органическим растворителям, предположительно; 283431-285704.
NMB0281: пептидил-пролильная цис-транс-изомераза; 285809-286852.
NMB0282: белок, родственный рибонуклеазе II; 290243-288366.
NMB0283: консервативный гипотетический белок; 290552-291181.
NMB0284: аденилосукцинатлиаза; 291256-292623.
NMB0285: ацетилаза O-антигена, “сдвиг рамки”; 292707-294573.
NMB0286: консервативный гипотетический белок; 295481-294870.
NMB0287: предполагаемая АТФ-зависимая хеликаза DinG; 297668-295521.
NMB0288: гипотетический белок; 297740-297967.
NMB0289: дезоксирибодипиримидинфотолиаза, “сдвиг рамки”; 299363-298066.
NMB0290: транскрипционный регулятор, предположительно; 300264-299356.
NMB0291: консервативный гипотетический белок; 300372-300767.
NMB0292: консервативный гипотетический белок; 300819-301421.
NMB0293: ТоnВ-зависимый рецептор, предположительно; 301610-303718.
NMB0294: белок тиол/дисульфидных обменов DsbA; 303836-304528.
NMB0295: белок комплекса распознавания сигналов; 306232-304865.
NMB0296: CcsA-родственный белок; 306452-307255.
NMB0297: гипотетический белок; 307272-307367.
NMB0298: гипотетический белок; 307401-307583.
NMB0299: comEA-родственный белок; 313097-313540.
NMB0300: гипотетический белок; 313603-313904.
NMB0301: гипотетический белок; 313958-314161.
NMB0302: транспозаза IS1016C2, вырожденная; 314284-314933.
NMB0303: транспозаза, вырожденная; 315024-315307.
NMB0304: белок внешней мембраны 5-го класса, вырожденный; 315549-315295.
NMB0305: гипотетический белок; 315891-315736.
NMB0306: гипотетический белок; 316061-316252.
NMB0307: фосфо-2-дегидро-3-дезоксигептонатальдолаза, phe-чувствительная; 316403-317455.
NMB0308: дигидрофолатредуктаза; 317526-318011.
NMB0309: консервативный гипотетический белок; 318840-318367.
NMB0310: консервативный гипотетический белок; 319280-318855.
NMB0311: гипотетический белок; 319392-319634.
NMB0312: связанный с вирулентностью белок VapA, “сдвиг рамки”; 321089-323177.
NMB0313: консервативный гипотетический белок; 323422-324885.
NMB0314: гипотетический белок; 326057-325092.
NMB0315: консервативный гипотетический белок; 326135-327424.
NMB0316: консервативный гипотетический белок; 328616-327933.
NMB0317: консервативный гипотетический белок; 329164-328694.
NMB0318: белок системы оттока жирных кислот; 329606-330757.
NMB0319: белок системы оттока жирных кислот; 330784-332307.
NMB0320: гипотетический белок; 332373-332519.
NMB0321: рибосомный белок L28 субчастицы 50S; 332560-332790.
NMB0322: рибосомный белок L33 субчастицы 50S; 332825-332977.
NMB0323: белок семейства UbiH; 334353-333172.
NMB0324: рибосомный белок L27 субчастицы 503; 334964-334695.
NMB0325: рибосомный белок L21 субчастицы 503; 335297-334992.
NMB0326: октапренилдифосфатсинтаза; 335521-336492.
NMB0327: консервативный гипотетический белок; “сдвиг рамки”; 336500-336944.
NMB0328: гипотетический белок; 336993-337165.
NMB0329: белок сборки пилей IV-го типа; 337388-339061.
NMB0330: консервативный гипотетический белок; 339358-339152.
NMB0331: киназа, предположительно; 339983-339354.
NMB0332: препилинпептидаза IV-го типа; 340845-339988.
NMB0333: белок сборки пилей PilG; 342151-340922.
NMB0334: глюкозо-6-фосфатизомераза; 342508-344148.
NMB0335: 2,3,4,5-тетрагидропиридин-2-карбоксилат-N-сукцинилтрансфераза; 344361-345179.
NMB0336: еноилредуктаза белка-переносчика ацильных групп; 345337-346119.
NMB0337: аминотрансфераза аминокислот с разветвленной цепью, предположительно; 347364-346369.
NMB0338: гипотетический белок; 347506-347985.
NMB0339: консервативный гипотетический белок; 347999-349165.
NMB0340: лактоилглутатионлиаза, “сдвиг рамки”; 349193-349605.
NMB0341: белок tspA; 352407-349783.
NMB0342: белок-А образования внутриклеточных септ; 352613-353140.
NMB0343: консервативный гипотетический белок; 353158-353433.
NMB0344: белок семейства BolA/YrbA; 353436-353711.
NMB0345: фактор связывания клеток, предположительно; 353763-354626.
NMB0346: гипотетический белок; 354700-355455.
NMB0347: консервативный гипотетический белок; 355531-356019.
NMB0348: консервативный гипотетический белок; 356053-357060.
NMB0349: белок, родственный глутамил-тРНК-синтетазе; 358020-357136.
NMB0350: гипотетический белок; 358760-358311.
NMB0351: трансальдолаза; 359966-358914.
NMB0352: изомераза сахаров семейства KpsF/GutQ; 360063-361034.
NMB0353: консервативный гипотетический белок; 361255-361788.
NMB0354: гипотетический белок; 361788-362366.
NMB0355: консервативный гипотетический белок; 362350-362877.
NMB0356:АВС-переносчик - ATФ-связывающий белок; 362924-363685.
NMB0357: монофункциональная трансгликозилаза биосинтеза пептидогликанов; 364858-364160.
NMB0358: шикимат-5-дегидрогеназа; 365670-364864.
NMB0359: глутаматаммиаклигаза; 365970-367385.
NMB0360: AmpG-родственный белок; 367544-368824.
NMB0361: консервативный гипотетический белок; 368824-369096.
NMB0362: гипотетический белок; 369205-369282.
NMB0363: гипотетический белок; 369610-369744.
NMB0364: белок оперона FrpC; 370088-370858.
NMB0365: регулируемый железом белок FrpC, укороченный; 370878-371150.
NMB0366: гипотетический белок; 372373-371243.
NMB0367: гипотетический белок; 372823-372440.
NMB0368: гипотетический белок; 373350-372895.
NMB0369: гипотетический белок; 373720-373334.
NMB0370: гипотетический белок; 374229-373855.
NMB0371: гипотетический белок; 374658-374254.
NMB0372: гипотетический белок; 375341-374667.
NMB0373: гипотетический белок; 375915-375559.
NMB0374: MafB-родственный белок; 377321-375921.
NMB0375: белок mafA; 378266-377328.
NMB0376: гипотетический белок; 378379-378266.
NMB0377: консервативный гипотетический белок; 379516-378389.
NMB0378: фосфатпермеаза, предположительно; 379807-381378.
NMB0379: кислородо-независимая копропорфириноген-III-оксидаза; 383155-381737.
NMB0380: транскрипционный регулятор семейства Crp/Fnr; 383360-384091.
NMB0381: активатор транскрипции регулона cys; 385157-384210.
NMB0382: белок внешней мембраны 4-го класса; 385521-386246.
NMB0383: гипотетический белок; 386270-386494.
NMB0384: гипотетический белок; 386773-387066.
NMB0385: тиаминмонофосфаткиназа; 387100-388053.
NMB0386: фосфатидилглицерофосфатаза-А; 388049-388531.
NMB0387: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок; 390270-388597.
NMB0388: переносчик сахаров, предположительно; 390657-392009.
NMB0389: альдозо-1-эпимераза; 392016-393023.
NMB0390: мальтозофосфорилаза; 393260-395515.
NMB0391: β-фосфоглюкомутаза; 395531-396193.
NMB0392: 1-аспартатоксидаза; 397882-396377.
NMB0393: белок множественной лекарственной резистентности; 398266-397934.
NMB0394: хинолинатсинтетаза-А; 399530-398421.
NMB0395: консервативный гипотетический белок; 399732-400667.
NMB0396: никотинатнуклеотидпирофосфорилаза; 400888-401766.
NMB0397: гипотетический белок; 401797-402081.
NMB0398: транскрипционный регулятор семейства ArsR; 402176-402454.
NMB0399: экзодезоксирибонуклеаза-III; 402517-403284.
NMB0400: транспозаза, укороченная; 404230-404799.
NMB0401: пролиндегидрогеназа; 409441-405839.
NMB0402: котранспортер натрия и пролина; 411216-409693.
NMB0403: гипотетический белок; 411644-411555.
NMB0404: консервативный гипотетический белок; 411699-412016.
NMB0405: белок компетентности СоmМ; 412033-413526.
NMB0406: консервативный гипотетический белок; 413629-414495.
NMB0407: белок тиол/дисульфидного обмена DsbA; 414501-415142.
NMB0408: фактор резистентности к бацитрацину; 415178-415996.
NMB0409: консервативный гипотетический белок; 417783-416575.
NMB0410: консервативный гипотетический белок; 418062-418514.
NMB0411: консервативный гипотетический белок; 418514-419497.
NMB0412: FtsL-родственный белок белка клеточных делений; 419491-419757.
NMB0413: пенициллин-связывающий белок-2; 419821-421563.
NMB0414: УДФ-N-ацетилмурамоилаланил-D-глутамат-2,6-диаминопимелатлигаза; 421591-423066.
NMB0415: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 423092-424736.
NMB0416: УДФ-N-ацетилмурамоилаланил-D-глутамил-2,6-диаминопимелат-D-аланил-D-аланиллигаза; 424864-426228.
NMB0417: гипотетический белок; 426234-426407.
NMB0418: фосфо-N-ацетилмурамоилпентапептидтрансфераза; 426657-427736.
NMB0419: консервативный гипотетический белок; 427865-428458.
NMB0420: УДФ-N-ацетилмурамоилаланин-О-глутаматлигаза; 428545-429879.
NMB0421: белок FtsW клеточного деления; 430062-431330.
NMB0422: УДФ-N-ацетилглюкозамин-N-ацетилмурамил(пентапептид)пирофосфорилундекапренол-N-ацетилглюкозаминтрансфераза; 431337-432401.
NMB0423: УДФ-N-aцeтилмypaмaтaлaнинлигaзa; 432559-433965.
NMB0424: D-аланин-D-аланинлигаза; 434081-434992.
NMB0425: белок FtsQ клеточных делений; 435006-435710.
NMB0426: белок FtsA клеточных делений; 435799-437040.
NMB0427: белок FtsZ клеточных делений; 437162-438337.
NMB0428: консервативный гипотетический белок; 438479-439786.
NMB0429: гипотетический белок; 440162-440263.
NMB0430: карбоксифосфоенолпируватфосфономутаза, предположительно; 440412-441287.
NMB0431: метилцитратсинтаза/цитратсинтаза-2; 441376-442527.
NMB0432: консервативный гипотетический белок; 442683-443468.
NMB0433: аконитатгидратаза-1; 443549-446152.
NMB0434: консервативный гипотетический белок; 446958-448124.
NMB0435: ацетаткиназа; 448541-449737.
NMB0436: консервативный гипотетический белок; 450078-450716.
NMB0437: консервативный гипотетический белок; 451289-450849.
NMB0438: гипотетический белок; 451463-451828.
NMB0439: консервативный гипотетический белок; 451876-453027.
NMB0440: префенатдегидрогеназа, предположительно; 453959-453090.
NMB0441: нитрилаза; 454044-454853.
NMB0442: белок ОРА, “сдвиг рамки”; 455681-454888.
NMB0443: транспозаза семейства IS30; 456456-457418.
NMB0444: консервативный гипотетический белок; 457979-458830.
NMB0445: фактор резистентности к бицикломицину, предположительно; 459352-460581.
NMB0446: хоризматмутаза/префенатдегидратаза; 460662-461747.
NMB0447: белок репарации ДНК RecO; 461787-462575.
NMB0448: белок PdxJ биосинтеза пиридоксальфосфата; 462602-463327.
NMB0449: гипотетический белок; 463482-463703.
NMB0450: гипотетический белок; 463968-464411.
NMB0451: гипотетический белок; 464424-465188.
NMB0452: холосинтаза белка-переносчика ацильных групп; 465391-465765.
NMB0453: белок mutT; 465850-466656.
NMB0454: гипотетический белок; 466652-467071.
NMB0455: консервативный гипотетический белок; 467123-468262.
NMB0456: N-ацетилмурамоил-L-аланинамидаза; 469573-468326.
NMB0457: консервативный гипотетический белок; 470031-469573.
NMB0458: глутаматрацемаза; 470233-471042.
NMB0459: консервативный гипотетический белок; 473202-472096.
NMB0460: трансферрин-связывающий белок-2; 475573-477708.
NMB0461: трансферрин-связывающий белок-1; 477798-480542.
NMB0462: АВС-переносчик спермидина/путресцина - периплазматический спермидин/путресцин-связывающий белок; 483195-481819.
NMB0463: рибосомный белок S20 субчастицы 30S; 483261-483521.
NMB0464: фосфолипаза-A1, предположительно; 483685-484830.
NMB0465: консервативный гипотетический белок; 484976-485674.
NMB0466: аспартил-тРНК-синтетаза; 485735-487540.
NMB0467: гипотетический белок; 487694-487975.
NMB0468: декарбоксилаза биосинтеза аргинина; 488145-490034.
NMB0469: агматиназа; 490136-491056.
NMB0470: переносчик С4-дикарбоксилата; 491257-492720.
NMB0471: консервативный гипотетический белок; 494006-492933.
NMB0472: 8-амино-7-оксононаноатсинтаза; 494229-495368.
NMB0473: консервативный гипотетический белок; 495381-496025.
NMB0474: белок BioC синтеза биотина, предположительно; 496016-496795.
NMB0475: гипотетический белок; 497063-498451.
NMB0476: гипотетический белок; 498457-499551.
NMB0477: консервативный гипотетический белок; 499566-500099.
NMB0478: гипотетический белок; 500104-500745.
NMB0479: консервативный гипотетический белок; 500771-501127.
NMB0480: TspB-родственный белок; 502193-501801.
NMB0481: гипотетический белок; 502509-502180.
NMB0482: гипотетический белок; 502900-502625.
NMB0483: гипотетический белок; 503191-502910.
NMB0484: гипотетический белок; 503396-503202.
NMB0485; гипотетический белок; 503691-503404.
NMB0486: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 505078-503739.
NMB0487: гипотетический белок; 505244-505152.
NMB0488: гипотетический белок; 505800-505309.
NMB0489: гипотетический белок; 506682-505804.
NMB0490: PspA-родственный белок; 507809-506910.
NMB0491: гипотетический белок; 508744-508304.
NMB0492: гипотетический белок; 509383-509063.
NMB0493: гемагглютинин/гемолизин-родственный белок; 517494-509386.
NMB0494: ДНК-геликаза, укороченная; 518107-517625.
NMB0495: репликационный белок; 519187-518207.
NMB0496: белок, родственный активатору гемолизина; 519134-520810.
NMB0497: гемагглютинин/гемолизин-родственный белок; 520922-526826.
NMB0498: гипотетический белок; 526836-527342.
NMB0499: гипотетический белок; 527471-529090.
NMB0500: гипотетический белок; 529102-529476.
NMB0501: гипотетический белок; 529757-530128.
NMB0502: гипотетический белок; 530166-532115.
NMB0503: гипотетический белок; 532134-532562.
NMB0504: гипотетический белок; 532780-532992.
NMB0506: гипотетический белок; 533691-535208.
NMB0507: гипотетический белок; 535208-535693.
NMB0508: гипотетический белок; 535883-536152.
NMB0509: гипотетический белок; 536335-537114.
NMB0510: гипотетический белок; 537136-537396.
NMB0511: гипотетический белок; 537506-539425.
NMB0512: гипотетический белок; 539437-539856.
NMB0513: гипотетический белок; 539896-540294.
NMB0514: гипотетический белок; 540420-540656.
NMB0515: гипотетический белок; 540656-541036.
NMB0516: гипотетический белок; 541042-541974.
NMB0517: гипотетический белок; 542172-542020.
NMB0518: гипотетический белок; 542486-542734.
NMB0519: гипотетический белок; 542725-542925.
NMB0520: гипотетический белок; 542931-543107.
NMB0521: гипотетический белок; 543492-543947.
NMB0522: транспозаза, укороченная; 543958-544080.
NMB0523: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок, укороченная; 544162-544441.
NMB0524: рибонуклеаза BN, предположительно; 545691-544474.
NMB0525: фактор резистентности к алюминию, предположительно; 546236-546892.
NMB0526: гипотетический белок; 546923-547438.
NMB0527: 6-пирувоилтетрагидробиоптеринсинтаза, предположительно; 547448-547867.
NMB0528: консервативный гипотетический белок; 548139-548507.
NMB0529: консервативный гипотетический белок; 548507-549142.
NMB0530: гликозилгидролаза семейства 3; 550869-549787.
NMB0531: консервативный гипотетический белок; 552446-550929.
NMB0532: протеаза DO; 554147-552651.
NMB0533: эндонуклеаза-III; 554914-554288.
NMB0534: консервативный гипотетический белок; 555373-554963.
NMB0535: переносчик глюкозы/галактозы; 555906-557183.
NMB0536: Na+/H+-антипортер; 557477-558853.
NMB0537: консервативный гипотетический белок; 559809-558988.
NMB0538: консервативный гипотетический белок; 560326-559820.
NMB0539: порфобилиногендеаминаза; 560445-561377.
NMB0540: аспартатаминотрансфераза; 562977-561787.
NMB0541: гипотетический белок; 563556-563062.
NMB0542: гипотетический белок; 563672-563872.
NMB0543: L-лактатпермеаза, предположительно; 565630-564047.
NMB0544: консервативный гипотетический белок; 566621-565902.
NMB0545: консервативный гипотетический белок; 566870-570352.
NMB0546: предпочтительная по пропанолу алкогольдегидрогеназа; 571566-570523.
NMB0547: пилин IV типа; 572238-571852.
NMB0548: белок семейства AcrA/AcrE; 572464-573639.
NMB0549: АВС-переносчик - АТФ-связывающий белок; 573708-575639.
NMB0550: белок тиол/дисульфидного обмена DsbC; 576837-576058.
NMB0551: праймосомный белок n’; 576975-579161.
NMB0552: гипотетический белок; 580284-579214.
NMB0553: транспозаза, предположительно, точковая мутация; 581288-580335.
NMB0554: белок dnaK; 584451-582526.
NMB0555: гипотетический белок; 584931-584662.
NMB0556: репрессорный белок, предположительно; 585119-585802.
NMB0557: консервативный гипотетический белок; 585937-586272.
NMB0558: гипотетический белок; 586435-586896.
NMB0559: белок AarF биосинтеза убихинона; 586934-588442.
NMB0560: серинацетилтрансфераза; 589620-588805.
NMB0561: белок grрЕ; 589804-590379.
NMB0562: консервативный гипотетический белок; 590874-590662.
NMB0563: липопротеин ApbE биосинтеза тиамина; 591955-590903.
NMB0564: Na+-пepeнocящaя НАДФ-хинонредуктаза, субъединица F; 593325-592111.
NMB0565: Na+-переносящая НАДФ-хинонредуктаза, субъединица Е; 593932-593342.
NMB0566: Na+-переносящая НАДФ-хинонредуктаза, субъединица D; 594562-593939.
NMB0567: Nа+-переносящая НАДФ-хинонредуктаза, субъединица С; 595338-594565.
NMB0568: Nа+-переносящая НАДФ-хинонредуктаза, субъединица В; 596563-595334.
NMB0569: Na+-пepeнocящaя НАДФ-хинонредуктаза, субъединица А; 597909-596569.
NMB0570: гипотетический белок; 599680-598262.
NMB0571: консервативный гипотетический белок; 600400-600044.
NMB0572: гипотетический белок; 601002-600400.
NMB0573: транскрипционный регулятор семейства AsnC; 601612-601052.
NMB0574: Т-белок системы расщепления глицина; 602042-603139.
NMB0575: Н-белок системы расщепления глицина; 603304-603687.
NMB0576: глутамил-тРНК-редуктаза; 603842-605086.
NMB0577: NosR-родственный белок; 605365-605934.
NMB0578: АВС-переносчик меди - периплазматический медь-связывающий белок; 605991-607022.
NMB0579: АВС-переносчик меди - АТФ-связывающийся белок; 607083-607700.
NMB0580: дисульфидизомераза белков NosL, предположительно; 607842-608333.
NMB0581: флавопротеин/убихиноноксидоредуктаза системы переноса электронов; 610085-608427.
NMB0582: фактор резистентности к бактериоцину, предположительно; 610757-610218.
NMB0583: транспозаза IS1016C2; 612651-611986.
NMB0584: белок оперона FrpC; 613242-614054.
NMB0585: регулируемый железом белок FrpA, предположительно; 614074-617979.
NMB0586: адгезин, предположительно; 619176-618265.
NMB0587: мембранный белок; 620128-619256.
NMB0588: АВС-переносчик - ATФ-связывающий белок; 620907-620155.
NMB0589: рибосомный белок L19 субчастицы 50S; 621563-621201.
NMB0590: тРНК-(гуанин-N1)-метилтрансфераза, “сдвиг рамки”; 622329-621582.
NMB0591: фактор RimM процессинга 163-рРНК; 622838-622332.
NMB0592: рибосомный белок S16 субчастицы 30S; 623099-622857.
NMB0593: консервативный гипотетический белок; 625570-623147.
NMB0594: сенсорная гистидинкиназа; 627094-625691.
NMB0595: ДНК-связывающий регулятор ответов; 627785-627111.
NMB0596: гипотетический белок; 629789-627978.
NMB0597: гипотетический белок; 630132-629782.
NMB0598: белок семейства Maf/YceF/YhdE; 630749-630144.
NMB0599: консервативный гипотетический белок; 631572-630805.
NMB0600: гипотетический белок; 632272-631589.
NMB0601: консервативный гипотетический белок; 632479-632279.
NMB0602: белок hitA; 632849-632529.
NMB0603: фосфорибозил-АТФ-циклогидролаза; 633244-632924.
NMB0604: цинк-содержащая алкогольдегидрогеназа; 634449-633388.
NMB0605: белок семейства деацетилаз гистонов; 636107-635001.
NMB0606: консервативный гипотетический белок; 636235-636498.
NMB0607: мембранный белок-переносящий белок SecD; 636710-638563.
NMB0608: мембранный белок-переносящий белок SecF; 638570-639502.
NMB0609: рибосомный белок S15 субчастицы 30S; 639728-639994.
NMB0610: АВС-переносчик спермидина/путресцина - АТФ-связывающийся белок; 640243-641499.
NMB0611: АВС-переносчик спермидина/путресцина - пермеаза; 641518-642480.
NMB0612: АВС-переносчик спермидина/путресцина - пермеаза; 642483-643367.
NMB0613: гипотетический белок; 643392-643496.
NMB0614: оксидоредуктаза, предположительно; 643496-644788.
NMB0615: переносчик аммония AmtB, предположительно; 646340-645039.
NMB0616: транспозаза семейства IS1016, вырожденная; 647272-646871.
NMB0617: фактор терминации транскрипции Rho; 648837-647581.
NMB0618: фосфоенолпируватсинтаза; 651441-649060.
NMB0619: консервативный гипотетический белок; 651853-652671.
NMB0620: фосфогликолатфосфатаза; 653575-652916.
NMB0621: консервативный гипотетический белок; 654440-653616.
NMB0622: внешнемембранный белок-переносчик липопротеинов; 654867-655487.
NMB0623: АВС-переносчик спермидина/путресцина - периплазматический спермидин/путресцин-связывающий белок; 655763-656899.
NMB0624: белок, родственный галактозилтрансферазе, “сдвиг рамки”; 657035-658253.
NMB0625: консервативный гипотетический белок; 658297-658824.
NMB0626: фактор-3 высвобождения пептидной цепи; 660797-659205.
NMB0627: фосфорибозил-АМФ-циклогидролаза; 661299-660907.
NMB0628: белок hisF; 662097-661333.
NMB0629: фосфорибозилформимино-5-аминоимидазолкарбоксамидриботидизомераза; 662847-662113.
NMB0630: амидотрансфераза HisH; 663518-662883.
NMB0631: фосфатацетилтрансфераза Pta, предположительно; 665151-663652.
NMB0632: АВС-переносчик трехвалентного железа - АТФ-связывающийся белок; 666394-665339.
NMB0633: АВС-переносчик трехвалентного железа - пермеаза; 667932-666418.
NMB0634: АВС-переносчик трехвалентного железа - периплазматический связывающий белок; 668995-668003.
NMB0635: транспозаза семейства IS30; 670247-669285.
NMB0636: гипотетический белок; 670794-670414.
NMB0637: аргининосукцинатлиаза; 672228-670855.
NMB0638: УТФ-глюкозо-1-фосфатуридилилтрансфераза; 673116-672250.
NMB0639: консервативный гипотетический белок; 673743-673147.
NMB0640: гипотетический белок; 673969-673739.
NMB0641: неорганическая пирофосфатаза; 674610-674080.
NMB0642: дАТФ-пирофосфогидролаза; 675169-674714.
NMB0643: MafB-родственный белок; 675614-677437.
NMB0644: гипотетический белок; 677443-677904.
NMB0645: рибонуклеаза, “сдвиг рамки”; 677948-678275.
NMB0646: рибонуклеазный ингибитор barstar; 678290-678574.
NMB0647: гипотетический белок; 679091-680326.
NMB0648: гипотетический белок; 680357-680776.
NMB0649: гипотетический белок; 680970-681191.
NMB0650: гипотетический белок; 681167-681583.
NMB0651: гипотетический белок; 681687-682073.
NMB0652: белок mafA; 682199-683137.
NMB0653: MafB-родственный белок; 683144-684409.
NMB0654: гипотетический белок; 684415-684729.
NMB0655: гипотетический белок; 684867-685571.
NMB0656: гипотетический белок; 685600-685926.
NMB0657: гипотетический белок; 686024-686224.
NMB0658: гипотетический белок; 686055-686312.
NMB0659: гипотетический белок; 686346-686744.
NMB0660: гипотетический белок; 686929-687315.
NMB0661: бис(5’-нуклеозил)-тетрафосфатаза - белок TrkG
Trk-симметричной системы поглощения калия, “сдвиг рамки”; 689659-687362.
NMB0662: рибонуклеаза, предположительно; 690126-689740.
NMB0663: белок NsgA внешней мембраны; 690786-690265.
NMB0664: гипотетический белок; 691151-690960.
NMB0665: белок семейства кислородо-независимых копропор-фириноген-III-оксидаз; 692546-691374.
NMB0666: ДНК-лигаза; 695128-692606.
NMB0667: гипотетический белок; 696562-695279.
NMB0668: белок ampD; 697352-696783.
NMB0669: консервативный гипотетический белок; 697436-698428.
NMB0670: тимидилаткиназа; 698491-699108.
NMB0671: малатоксидоредуктаза (НАД-зависимая); 699333-700610.
NMB0672: тетраацилдисахарид-4’-киназа; 701160-702191.
NMB0673: гипотетический белок; 702394-702978.
NMB0674: консервативный гипотетический белок; 703050-703229.
NMB0675: 3-дезокси-D-маннооктулозонатцитидилтрансфераза; 703229-703987.
NMB0676: гипотетический белок; 704013-704411.
NMB0677: гипотетический белок; 704610-704723.
NMB0678: триптофансинтаза, α-субъединица; 705306-706088.
NMB0679: ацетил-КоА-карбоксилаза, β-субъединица карбоксилтрансферазы; 706129-706998.
NMB0680: белок крипт; 707672-707064.
NMB0681: консервативный гипотетический белок; 707781-708002.
NMB0682: дигидрооротаза; 708368-709399.
NMB0683: фактор-В утилизации азот-содержащих компонентов; 710195-709773.
NMB0684: рибофлавинсинтаза, β-субъединица; 710749-710276.
NMB0685: гипотетический белок; 711120-710800.
NMB0686: рибонуклеаза-III; 711287-712003.
NMB0687: ГТФ-связывающий белок Era; 712003-712974.
NMB0688: N-(5’-фосфорибозил)антранилатизомераза; 715446-714823.
NMB0689: фактор GreB элонгации транскрипции; 715996-715508.
NMB0690: амидофосфорибозилтрансфераза; 717640-716099.
NMB0691: фактор выработки колицина-V, предположительно; 718450-717956.
NMB0692: белок tpc; 719441-718446.
NMB0693: фолилполиглутаматсинтаза/дигидрофолатсинтаза; 720728-719457.
NMB0694: белок folI; 721205-720762.
NMB0695: гипотетический белок; 721569-721213.
NMB0696: АВС-переносчик аминокислот - АТФ-связывающийся белок, “сдвиг рамки”; 722369-721645.
NMB0697: диметиладенозинтрансфераза; 723321-722545.
NMB0698: гипотетический белок; 723518-724204.
NMB0699: триптофансинтаза, β-субъединица; 724290-725489.
NMB0700: IgA-специфичная сериновая эндопептидаза; 731118-725674.
NMB0701: гипотетический белок; 731531-731280.
NMB0702: белок компетентности ComA; 732529-734601.
NMB0703: липопротеин компетентности ComL; 735635-734835.
NMB0704: псевдоуридинсинтаза-D большой субчастицы рибосомы; 735634-736755.
NMB0705: белок-переносчик; 737858-736914.
NMB0706: консервативный гипотетический белок; 738418-739194.
NMB0707: редкий липопротеин-В, предположительно; 739249-739725.
ММВ0708: ДНК-полимераза III, δ-субъединица; 739730-740725.
NMB0709: гипотетический белок; 740849-741265.
NMB0710: гипотетический белок; 741293-741856.
NMB0711: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 742826-741946.
NMB0712: компонент σ32 РНК-полимеразы; 744182-743313.
NMB0713: аполипопротеин-N-ацилтрансфераза, предположительно; 746012-744441.
NMB0714: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 746771-746019.
NMB0715: гипотетический белок; 746967-747284.
NMB0716: гипотетический белок; 747440-747727.
NMB0717: цитохром, предположительно; 748209-747796.
NMB0718: феррохелатаза; 749572-748493.
NMB0719: квеуин-тРНК-рибозилтрансфераза; 750697-749585.
NMB0720: треонил-тРНК-синтетаза; 751005-752915.
NMB0721: фактор-3 инициации трансляции; 752990-753454.
NMB0722: рибосомный белок L35 субчастицы 50S; 753604-753798.
NMB0723: рибосомный белок L20 субчастицы 50S; 753814-754170.
NMB0724: фенилаланил-тРНК-синтетаза, α-субъединица; 754519-755508.
NMB0725: метилаза-модификатор HgaI-1; 755694-756749.
NMB0726: рестриктаза HgaI II-типа; 756755-758221.
NMB0727: N6-аденин-специфичная ДНК-метилаза; 758221-758868.
NMB0728: фенилаланил-тРНК-синтетаза, β-субъединица; 758896-761256.
NMB0729: фактор интеграции в хозяина, α-субъединица; 761333-761632.
NMB0730: гипотетический белок; 762257-762739.
NMB0731: гипотетический белок; 763002-763226.
NMB0732: аденозилметионин-8-амино-7-оксононаноатаминотрансфераза; 763559-764857.
NMB0733: детиобиотинсинтаза; 764867-765501.
NMB0734: гипотетический белок; 765519-765992.
NMB0735: 4-гидроксибензоатоктапренилтрансфераза; 766025-766912.
NMB0736: азот-регуляторный белок IIA системы PTS; 767100-767546.
NMB0737: НРr-киназа/фосфатаза, предположительно; 767551-768510.
NMB0738: консервативный гипотетический белок; 768494-769345.
NMB0739: консервативный гипотетический белок; 769429-770943.
NMB0740: фактор RecN репарации ДНК; 771255-772925.
NMB0741: консервативный гипотетический белок; 775384-773948.
NMB0742: консервативный гипотетический белок; 775684-776040.
NMB0743: метилтрансфераза UbiE биосинтеза убихинона/менахинона; 776097-776831.
NMB0744: гипотетический белок; 777054-777530.
NMB0745: 2-амино-4-гидрокси-6-гидроксиметилдегидротеридинпирофосфокиназа; 778153-777662.
NMB0746: консервативный гипотетический белок; 778537-778166.
NMB0747: консервативный гипотетический белок; 779157-778594.
NMB0748: хозяинный фактор-I; 779535-779245.
NMB0749: пенициллин-связывающий белок-4; 780602-779667.
NMB0750: комиграторный фактор бактериоферритина; 780923-781360.
NMB0751: интеграза/рекомбиназа XerD; 781415-782287.
NMB0752: ассоциированный с бактериоферритином ферредоксин, предположительно; 782462-782659.
NMB0753: консервативный гипотетический белок; 782828-783058.
NMB0754: гипотетический белок; 783066-783173.
NMB0755: гипотетический белок; 783194-783334.
NMB0756: дТДФ-L-рамнозосинтаза, предположительно; 784398-783481.
NMB0757: фосфорибозиламиноимидазолсукцинокарбоксамидсинтаза; 784598-785458.
NMB0758: полирибонуклеотиднуклеотидилтрансфераза; 785695-787815.
NMB0759: консервативный гипотетический белок; 788619-787894.
NMB0760: диаминопимелатэпимераза; 789006-789854.
NMB0761: гипотетический белок; 789940-790164.
NMB0762: гипотетический белок; 790198-790653.
NMB0763: цистеинсинтаза; 790653-791582.
NMB0764: консервативный гипотетический белок; 792048-792950.
NMB0765: сигнальная пептидаза-I; 794128-793112.
NMB0766: ГТФ-связывающий белок LepA; 796064-794274.
NMB0767: 5-метилтиоаденозиннуклеозидаза/S-аденозилгомоцистеиннуклеозидаза; 796909-796211.
NMB0768: фактор судорожной подвижности PilT; 797095-798204.
NMB0769: ДНК-полимераза III, δ’-субъединица, предположительно; 798241-799215.
NMB0770: белок PilZ сборки пилей IV-го типа; предположительно; 799222-799569.
NMB0771: консервативный гипотетический белок; 799577-800353.
NMB0772: консервативный гипотетический белок; 800382-800594.
NMB0773: консервативный гипотетический белок; 800698-801006.
NMB0774: урацилфосфорибозилтрансфераза; 801115-801738.
NMB0775: гипотетический белок; 801764-802081.
NMB0776: консервативный гипотетический белок; 802335-802751.
NMB0777: уропорфириноген-III-синтаза HemD, предположительно; 802796-803533.
NMB0778: уропорфириноген-III-С-метилтрансфераза HemX, предположительно; 803611-804882.
NMB0779: гипотетический белок; 804882-806102.
NMB0780: гипотетический белок; 806138-806575.
NMB0781: уропорфириногендекарбоксилаза; 806732-807793.
NMB0782: фактор репарации ДНК RadA; 807982-809358.
NMB0783: консервативный гипотетический белок; 810116-809640.
NMB0784: предшественник белка-Е фагового шока, предположительно; 810717-810361.
NMB0785: полипептид 135-кД экзооксирибонуклеазы-V; 814370-810759.
NMB0786: консервативный гипотетический белок; 815358-814453.
NMB0787: АВС-переносчик аминокислот – периплазматический белок, связывающий аминокислоты; 815643-816467.
NMB0788: АВС-переносчик аминокислот - пермеаза; 816514-817173.
NMB0789: АВС-переносчик аминокислот - ATФ-связывающий белок; 817186-817938.
NMB0790: фосфоглюкомутаза; 819343-817964.
NMB0791: пептидил-пролильная цис-транс-изомераза; 820019-819513.
NMB0792: белок-переносчик семейства NadC; 821553-820141.
NMB0793: гипотетический белок; 821759-821553.
NMB0794: гипотетический белок; 822146-821787.
NMB0795: пептидил-тРНК-гидролаза; 822988-822413.
NMB0796: консервативный гипотетический белок; 823319-823044.
NMB0797: консервативный гипотетический белок; 823749-823315.
NMB0798: белок FtsH клеточных делений; 825932-823968.
NMB0799: белок FtsJ клеточных делений; 826616-825999.
NMB0800: консервативный гипотетический белок; 826726-827007.
NMB0801: дегидратаза δ-аминолевулиновой кислоты; 827193-828191.
NMB0802: цистатионин-γ-синтаза; 829414-828260.
NMB0803: консервативный гипотетический белок; 829606-830376.
NMB0804: НАДФ+-нитроредуктаза, предположительно; 830489-831151.
NMB0805: транспозаза семейства IS30; 831295-832257.
NMB0806: консервативный гипотетический белок; 833050-832295.
NMB0807: консервативный гипотетический белок; 833965-833078.
NMB0808: гипотетический белок; 834551-833988.
NMB0809: консервативный гипотетический белок; 835399-834605.
NMB0810: транскрипционный регулятор семейства TetR; 836104-835457.
NMB0811: УДФ-N-ацетилпирувоилглюкозаминредуктаза; 837156-836119.
NMB0812: консервативный гипотетический белок; 838579-837203.
NMB0813: гипотетический белок; 838634-838819.
NMB0814: гистидил-тРНК-синтетаза; 838914-840062.
NMB0815: аденилосукцинатсинтетаза; 840163-841464.
NMB0816: гипотетический белок; 841592-841903.
NMB0817: гипотетический белок; 841932-842312.
NMB0818: гипотетический белок; 842329-842736.
NMB0819: гипотетический белок; 842856-843245.
NMB0820: гипотетический белок; 843456-843845.
NMB0821: гипотетический белок; 843962-844519.
NMB0822: белок теплового шока HtpX; 845866-844826.
NMB0823: аденилаткиназа; 845878-846522.
NMB0824: оротидин-5’-фосфатдекарбоксилаза; 847051-847788.
NMB0825: АДФ-гептозосинтаза, предположительно; 847846-848814.
NMB0826: специфичная для С5-цитозина ДНК-метилаза; 848854-850086.
NMB0827: белок, родственный рестриктазе II-го типа, “сдвиг рамки”; 850091-851119.
NMB0828: АДФ-L-глицеро-D-манногептозо-6-эпимераза; 851251-852252.
NMB0829: М-белок рестриктазы I-типа EcoR124II; 852329-853870.
NMB0830: консервативный гипотетический белок; 853870-854877.
NMB0831: S-белок рестриктазы I-го типа, вырожденный; 855046-856216.
NMB0832: нуклеаза антикодонов; 856277-857416.
NMB0833: белок, родственный рестриктазе I-го типа; 857416-857799.
NMB0834: транспозаза семейства IS30; 858756-857794.
NMB0835: R-белок рестриктазы I-типа EcoR124II, предположительно; 858832-861594.
NMB0836: АТФ-зависимая Clp-протеаза, АТФ-связывающаяся субъединица ClpA; 863945-861639.
NMB0837: консервативный гипотетический белок; 864249-863950.
NMB0838: белок семейства “домена холодового шока”; 864492-864692.
NMB0839: белок pmbA; 866323-864995.
NMB0840: консервативный гипотетический белок; 866446-866979.
NMB0841: гипотетический белок; 867029-867742.
NMB0842: специфичная для одноцепочечной ДНК экзонуклеаза RecJ; 867814-869511.
NMB0843: полимераза polyA; 869811-871169.
NMB0844: гипотетический белок; 871345-871665.
NMB0845: PhoH-родственный белок; 872732-871782.
NMB0846: белок, родственный фактору биосинтеза липополисахаридов; 873905-872874.
NMB0847: гипотетический белок; 874235-874065.
NMB0848: гипотетический белок; 874369-875070.
NMB0849: дезоксицитидинтрифосфатдеаминаза, предположительно; 875703-875140.
NMB0850: гипотетический белок; 876185-875772.
NMB0851: ассоциированный с рекомбинацией белок RdgC; 877146-876250.
NMB0852: ключевая ГТФаза; 878634-877180.
NMB0853: консервативный гипотетический белок; 879413-878787.
NMB0854: гистидил-тРНК-синтетаза; 880709-879417.
NMB0855: фактор резистентности к бактериоцину, предположительно; 881459-880806.
NMB0856: гипотетический белок; 882208-881744.
NMB0857: гипотетический белок; 882441-882268.
NMB0858: гипотетический белок; 882645-882448.
NMB0859: гипотетический белок; 883025-882651.
NMB0860: гипотетический белок; 883340-883086.
NMB0861: гипотетический белок; 883975-883433.
NMB0862: гипотетический белок; 884091-883975.
NMB0863: гипотетический белок; 884410-884141.
NMB0864: гипотетический белок; 884966-884679.
NMB0865: гипотетический белок; 885445-884975.
NMB0866: гипотетический белок; 886357-885491.
NMB0867: белок семейства YabO/YceC/SfhB; 886521-887441.
NMB0868: консервативный гипотетический белок; 888163-887525.
NMB0869: гипотетический белок; 889009-888221.
NMB0870: 3-метил-2-оксобутаноатгидроксиметилтрансфераза; 889502-890290.
NMB0871: пантоат-β-аланинлигаза; 890416-891249.
NMB0872: консервативный гипотетический белок; 891416-893257.
NMB0873: липопротеин LolB внешней мембраны, предположительно; 893400-893978.
NMB0874: консервативный гипотетический белок; 893991-894833.
NMB0875: рибозофосфатпирофосфокиназа; 895258-896238.
NMB0876: рибосомный белок L25 субчастицы 50S; 896308-896877.
NMB0877: пенициллин-связывающий белок; 898174-897008.
NMB0878: треониндегидратаза; 898322-899845.
NMB0879: АВС-переносчик сульфатов - АТФ-связывающийся белок; 900978-899908.
NMB0880: АВС-переносчик сульфатов - пермеаза; 901835-900978.
NMB0881: АВС-переносчик сульфатов - пермеаза; 902923-902090.
NMB0882: гипотетический белок; 903214-903543.
NMB0883: консервативный гипотетический белок; 903878-904384.
NMB0884: супероксиддисмутаза; 905491-904907.
NMB0885: репликационная ДНК-хеликаза; 905655-907058.
NMB0886: белок FimT фимбрий; 907370-908035.
NMB0887: белок PilV сборки пилей IV-го типа, предположительно; 908056-908667.
NMB0888: гипотетический белок; 908667-909605.
NMB0889: гипотетический белок; 909587-910177.
NMB0890: белок, родственный пилину IV-го типа; 910170-910655.
NMB0891: гипотетический белок; 911708-911944.
NMB0892: AzlC-родственный белок; 912795-912376.
NMB0893: дезоксиуридин-5'-трифосфатнуклеотидгидролаза; 912995-913444.
NMB0894: аминотрансфераза класса I; 913525-914709.
NMB0895: консервативный гипотетический белок; 914975-915751.
NMB0896: интеграза, “сдвиг рамки”; 916283-917352.
NMB0897: гипотетический белок; 917468-917845.
NMB0898: гипотетический белок; 917894-918079.
NMB0899: гипотетический белок; 918396-918749.
NMB0900: гипотетический белок; 919621-920535.
NMB0901: белок, родственный D-лактатдегидрогеназе; 92088-920599.
NMB0902: гипотетический белок; 921133-920945.
NMB0903: гипотетический белок; 921429-921139.
NMB0904: гипотетический белок; 921686-921429.
NMB0905: гипотетический белок; 921936-921724.
NMB0906: гипотетический белок; 922860-922009.
NMB0907: гипотетический белок; 923244-922888.
NMB0908: гипотетический белок; 923512-923315.
NMB0909: гипотетический белок; 924280-923759.
NMB0910: транскрипционный регулятор; 925000-924287.
NMB0911: транспозаза семейства IS30; 926382-925420.
NMB0912: гипотетический белок; 926526-927149.
NMB0913: белок реmК; 927552-927208.
NMB0914: белок pemI; 927790-927557.
NMB0915: гипотетический белок; 928640-928152.
NMB0916: гипотетический белок; 928799-928662.
NMB0917: белок “death-on-curing”; 929446-929081.
NMB0918: гипотетический белок; 929574-929446.
NMB0919: транспозаза IS1016, предположительно; 930929-929973.
NMB0920: изоцитратдегидрогеназа; 934317-932095.
NMB0921: гипотетический белок; 934522-934325.
NMB0922: α-2,3-сиалилтрансфераза; 934750-935862.
NMB0923: цитохром-с; 936488-936033.
NMB0924: оксидоредуктаза семейства дегидрогеназ/редуктаз коротких цепей; 936607-937425.
NMB0925: белок семейства гидролаз ацил-КоА-тиосложноэфирных связей; 937925-937482.
NMB0926: белок ОРА; 940336-939513.
NMB0927: пролиниминопептидаза; 941840-942769.
NMB0928: гипотетический белок; 944025-942832.
NMB0929: дигидродипиколинатсинтаза; 944909-944037.
NMB0930: белок семейства ксантин/урацилпермеаз; 945369-946757.
NMB0931: РНК-метилтрансфераза семейства TrmH; 947574-946825.
NMB0932: консервативный гипотетический белок; 948129-947644.
NMB0933: белок семейства цитидин/дезоксицитидинилатдеаминазы; 948580-948137.
NMB0934: белок, родственный ДНК-трансформирующему белку tfoX; 948853-948625.
NMB0935: тРНК-δ(2)-изопентенилпирофосфаттрансфераза; 949798-948860.
NMB0936: гипотетический белок; 951481-950180.
NMB0937: фактор элонгации Р (EF-P); 951788-952345.
NMB0938: гипотетический белок; 953235-952402.
NMB0939: консервативный гипотетический белок; 953933-953355.
NMB0940: гомосерин-O-ацетилтрансфераза; 955069-953933.
NMB0941: рибосомный белок L36 субчастицы 50S; 955756-955634.
NMB0942: рибосомный белок L31 субчастицы 50S, предположительно; 956031-955759.
NMB0943: 5,10-метилентетрагидрофолатредуктаза; 956231-957106.
NMB0944: 5-метилтетрагидроптероилтриглутаматгомоцистеинметилтрансфераза; 957247-959520.
NMB0945: гипотетический белок; 959535-959696.
NMB0946: белок семейства пероксиредоксинов-2/глутаредоксин; 959802-960536.
NMB0947: липоамиддегидрогеназа, предположительно; 960788-962188.
NMB0948: сукцинатдегидрогеназа, субъединица цитохрома-b556; 962470-962844.
NMB0949: сукцинатдегидрогеназа, гидрофобный мембранный якорный белок; 962841-963179.
NMB0950: сукцинатдегидрогеназа, флавопротеиновая субъединица; 963185-964945.
NMB0951: сукцинатдегидрогеназа, Fe/S-белок; 965068-965772.
NMB0952: консервативный гипотетический белок; 965779-966024.
NMB0953: гипотетический белок; 966024-966104.
NMB0954: цитратсинтаза; 966139-967419.
NMB0955: 2-оксоглутаратдегидрогеназа, компонент Е1;
967627-970452.
NMB0956: 2-оксоглутаратдегидрогеназа, компонент Е2, дигидролипоамидсукцинилтрансфераза; 970555-971733.
NMB0957: 2-оксоглутаратдегидрогеназа, компонент Е3, липоамиддегидрогеназа; 972101-973531.
NMB0958: гипотетический белок; 973659-973943.
NMB0959: сукцинил-КоА-синтетаза, β-субъединица; 974045-975208.
NMB0960: сукцинил-КоА-синтетаза, α-субъединица; 975222-976109.
NMB0961: белок funZ; 978267-976675.
NMB0962: эксцизиаза АВС, А-субъединица; 981150-978304.
NMB0963: белок, родственный предшественнику фосфатидилсериндекарбоксилазы; 981305-982099.
NMB0964: ТоnВ-зависимый рецептор; 985503-983230.
NMB0965: гипотетический белок; 985832-985564.
NMB0966: пара-аминобензоатсинтаза/глутаминамидотрансфераза, компонент II; 985925-986512.
NMB0967: антранилатфосфорибозилтрансфераза; 986579-987634.
NMB0968: гипотетический белок; 987644-987729.
NMB0969: гипотетический белок; 988030-987792.
NMB0970: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 988106-989527.
NMB0971: гипотетический белок; 989493-989780.
NMB0972: гипотетический белок; 989788-989982.
NMB0973: гипотетический белок; 989993-990274.
NMB0974: гипотетический белок; 990284-990559.
NMB0975: гипотетический белок; 990690-991004.
NMB0976: TspB-родственный белок; 990991-991383.
NMB0977: модулятор-В активности лекарственных веществ, предположительно; 991676-992146.
NMB0978: НАД+-трансгидрогеназа, β-субъединица; 993742-992360.
NMB0979: гипотетический белок; 994205-993825.
NMB0980: НАД+-трансгидрогеназа, α-субъединица; 995750-994212.
NMB0981: фосфосеринфосфатаза; 996040-996870.
NMB0982: белок, родственный хлоридному каналу; 997018-998157.
NMB0983: фосфорибозиламиноимидазолкарбоксамидформилтрансфераза/ИМФ-циклогидролаза; 998324-999901.
NMB0984: транспозаза, предположительно, вырожденная; 1000517-1001457.
NMB0985: Е16-родственный белок; 1001522-1002016.
NMB0986: гипотетический белок; 1001997-1002425.
NMB0987: N-ацетилмурамоил-L-аланинамидаза, предположительно; 1002736-1003278.
NMB0988: гипотетический белок; 1003278-1003478.
NMB0989: гипотетический белок; 1003484-1003645.
NMB0990: гипотетический белок; 1003859-1004260.
NMB0991: транспозаза IS1106; 1005417-1004308.
NMB0992: адгезин; 1007326-1005554.
NMB0993: рубредоксин; 1009428-1009261.
NMB0994: белок семейства ацил-КоА-дегидрогеназ; 1011202-1010114.
NMB0995: белок, родственный стимулятору инфицирования макрофагов; 1012020-1011340.
NMB0996: гипотетический белок; 1012411-1012043.
NMB0997: D-лактатдегидрогеназа; 1014397-1012709.
NMB0998: оксидоредуктаза, предположительно; 1014921-1018751.
NMB0999: белок семейства NifR3/SMM1; 1018935-1019933.
NMB1000: транспозаза IS1106, предположительно, “сдвиг рамки”; 1020537-1021551.
NMB1001: интегразный белок, вырожденный; 1023183-1022614.
NMB1002: гипотетический белок; 1024370-1023498.
NMB1003: гипотетический белок; 1024711-1024418.
NMB1004: гипотетический белок; 1024962-1024720.
NMB1005: гипотетический белок; 1025179-1024958.
NMB1006: гипотетический белок; 1025360-1025184.
NMB1007: транскрипционный регулятор; 1025451-1025819.
NMB1008: гипотетический белок; 1025824-1026444.
NMB1009: консервативный гипотетический белок; 1026440-1026631.
NMB1010: гипотетический белок; 1026658-1027218.
NMB1011: гипотетический белок; 1027252-1028196.
NMB1012: гипотетический белок; 1028284-1028784.
NMB1013: гипотетический белок; 1028801-1028971.
NMB1014: консервативный гипотетический белок; 1029045-1029635.
NMB1015: транспозаза IS150, предположительно, “сдвиг рамки”; 1029653-1030443.
NMB1016: консервативный гипотетический белок; 1031794-1031192.
NMB1017: АВС-переносчик сульфатов – периплазматический сульфат-связывающий белок; 1033574-1032522.
NMB1018: консервативный гипотетический белок; 1034162-1033683.
NMB1019: фосфорибозиламиноимидазолкарбоксилаза, АТФазная субъединица; 1035345-1034212.
NMB1020: гипотетический белок; 1035887-1035345.
NMB1021: антранилатсинтаза, компонент I; 1037359-1035887.
NMB1022: транспозаза семейства IS30; 1038444-1037482.
NMB1023: консервативный гипотетический белок; 1039543-1038587.
NMB1024: консервативный гипотетический белок; 1040502-1039639.
NMB1025: консервативный гипотетический белок; 1040896-1040537.
NMB1026: консервативный гипотетический белок; 1040971-1041447.
NMB1027: белок dnaJ, укороченный; 1041473-1042192.
NMB1028: консервативный гипотетический белок; 1042197-1043069.
NMB1029: аспартатаммиаклиаза; 1044541-1043147.
NMB1030: консервативный гипотетический белок; 1045565-1045005.
NMB1031: 3-изопропилмалатдегидрогеназа; 1046798-1045731.
NMB1032: рестриктаза NlaIV II-типа; 1047563-1046835.
NMB1033: модификаторная метилаза NlaIV; 1048850-1047582.
NMB1034: 3-изопропилмалатдегидратаза, малая субъединица; 1049666-1049028.
NMB1035: гипотетический белок; 1049982-1049731.
NMB1036: 3-изопропилмалатдегидратаза, большая субъединица; 1051488-1050082.
NMB1037: глутаматцистеинлигаза; 1051748-1053094.
NMB1038: белок RadC репарации ДНК; 1053220-1053894.
NMB1039: консервативный гипотетический белок; 1053970-1054692.
NMB1040: гипотетический белок; 1054848-1056125.
NMB1041: ГТФ-связывающийся белок; 1056133-1057308.
NMB1042: АТФаза транспорта катионов семейства Е1-Е2; 1057308-1059776.
NMB1043: гипотетический белок; 1059940-1060142.
NMB1044: ферредоксин-НАД-редуктаза; 1061316-1060543.
NMB1045: гипотетический белок; 1062298-1061507.
NMB1046: треонинсинтаза; 1063753-1062347.
NMB1047: гипотетический белок; 1064197-1063829.
NMB1048: гипотетический белок; 1065918-1064452.
NMB1049: транскрипционный регулятор, предположительно; 1066174-1067085.
NMB1050: транспозаза семейства IS30; 1068512-1067550.
NMB1051: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок; 1070544-1068637.
NMB1052: белок dedA; 1071207-1070566.
NMB1053: белок внешней мембраны класса 5; 1072189-1071374.
NMB1054: транспозаза IS1106, вырожденная; 1073920-1072988.
NMB1055: серингидроксиметилтрансфераза; 1075474-1074227.
NMB1056: гипотетический белок; 1075753-1075544.
NMB1057: γ-глутамилтранспептидаза; 1077776-1075959.
NMB1058: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 1078161-1077902.
NMB1059: консервативный гипотетический белок; 1078505-1078720.
NMB1060: фруктозо-1,6-бифосфатаза; 1079840-1078869.
NMB1061: консервативный гипотетический белок; 1080931-1080089.
NMB1062: консервативный гипотетический белок; 1081610-1081011.
NMB1063: дигидронеоптеринальдолаза; 1081666-1082019.
NMB1064: консервативный гипотетический белок; 1082056-1082589.
NMB1065: белок сrсВ; 1083465-1083109.
NMB1066: гипотетический белок; 1084174-1083497.
NMB1067: белок FtsK клеточных делений; 1084339-1087380.
NMB1068: γ-глутамилфосфатредуктаза; 1088870-1087611.
NMB1069: глутамат-5-киназа; 1089992-1088886.
NMB1070: 2-изопропилмалатсинтаза; 1090477-1092027.
NMB1071: консервативный гипотетический белок; 1092125-1092784.
NMB1072: полипротеиндиацилглицерилтрансфераза; 1093721-1092873.
NMB1073: консервативный гипотетический белок; 1094922-1093795.
NMB1074: ацетилглутаматкиназа; 1095092-1095985.
NMB1075: консервативный гипотетический белок; 1098302-1097637.
NMB1076: DnaA-родственный белок; 1098967-1098302.
NMB1077: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок, укороченный; 1099623-1099075.
NMB1078: транскрипционный регулятор семейства UmuD/LexA; 1100312-1099875.
NMB1079: гипотетический белок; 1100580-1100425.
NMB1080: белок nеr, “сдвиг рамки”; 1100802-1101061.
NMB1081: фаговая транспозаза; 1101126-1103108.
NMB1082: гипотетический белок; 1103120-1103317.
NMB1083: белок-В транспозиции фаговой ДНК, предположительно; 1103481-1104650.
NMB1084: гипотетический белок; 1104655-1105173.
NMB1085: N-ацетилмурамоил-L-аланинамидаза, предположительно; 1105319-1105861.
NMB1086: гипотетический белок; 1106234-1106467.
NMB1087: гипотетический белок; 1106758-1107060.
NMB1088: консервативный гипотетический белок; 1107278-1107111.
NMB1089: гипотетический белок; 1107506-1107841.
NMB1090: гипотетический белок; 1107856-1108119.
NMB1091: гипотетический белок; 1108119-1108313.
NMB1092: гипотетический белок; 1108319-1108822.
NMB1093: гипотетический белок; 1109412-1108825.
NMB1094: гипотетический белок; 1109497-1111044.
NMB1095: консервативный гипотетический белок; 1111047-1112612.
NMB1096: консервативный гипотетический белок; 1112602-1113894.
NMB1097: криптический Mu-фаговый G-белок, предположительно; 1114007-1114419.
NMB1098: белок I, предположительно; 1114653-1115711.
NMB1099: транспозаза семейства IS30; 1116767-1115805.
NMB1100: гипотетический белок; 1116795-1117274.
NMB1101: консервативный гипотетический белок; 1117277-1117696.
NMB1102: гипотетический белок; 1117746-1118336.
NMB1103: гипотетический белок; 1118336-1118530.
NMB1104: белок фаговой капсулы; 1118536-1119942.
NMB1105: гипотетический белок; 1120010-1120384.
NMB1106: гипотетический белок; 1120391-1120753.
NMB1107: гипотетический белок; 1121610-1121011.
NMB1108: гипотетический белок; 1121780-1123933.
NMB1109: белок фагового вириона, предположительно; 1123936-1125264.
NMB1110: белок “хвоста” 43-кД; 1125257-1126399.
NMB1111: белок-V сборки базальной пластинки, предположительно; 1126399-1127064.
NMB1112: консервативный гипотетический белок; 1127168-1127512.
NMB1113: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 1127529-1128580.
NMB1114: консервативный гипотетический белок; 1128580-1129137.
NMB1115: белок фибрилл “хвоста”, предположительно; 1129151-1131121.
NMB1116: гипотетический белок; 1131560-1132084.
NMB1117: гипотетический белок; 1132350-1132204.
NMB1118: консервативный гипотетический белок; 1132762-1132478.
NMB1119: консервативный гипотетический белок; 1132842-1133444.
NMB1120: гипотетический белок; 1133426-1133719.
NMB1121: консервативный гипотетический белок; 1133719-1133925.
NMB1122: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок, “сдвиг рамки”; 1135181-1134041.
NMB1198: консервативный гипотетический белок; 1199352-1198465.
NMB1161: гипотетический белок; 1167620-1167426.
NMB1162: гипотетический белок; 1168307-1167663.
NMB1163: гипотетический белок; 1168675-1168307.
NMB1164: гипотетический белок; 1169353-1168685.
NMB1165: оксидоредуктаза, короткая субъединица семейства дегидрогеназ/редуктаз; 1170237-1169521.
NMB1128: консервативный гипотетический белок; 1139597-1138287.
NMB1167: гипотетический белок; 1171869-1171666.
NMB1168: фитоенсинтаза, предположительно; 1172903-1172034.
NMB1131: шаперон HscA; 1142897-1141038.
NMB1132: гипотетический белок; 1143630-1142977.
NMB1171: консервативный гипотетический белок/анкирин-родственный белок; 1176464-1175706.
NMB1172: ферредоксин типа 2Fe-2S; 1176860-1176522.
NMB1173: гипотетический белок; 1177278-1177138.
NMB1136: гипотетический белок; 1146017-1145337.
NMB1175: консервативный гипотетический белок; 1178247-1178053.
NMB1176: консервативный гипотетический белок; 1178719-1178321.
NMB1139: ацетил-КоА-карбоксилаза, карбоксилтрансферазная α-субъединица; 1147851-1146895.
NMB1140: белок mesJ, “сдвиг рамки”; 1149229-1147948.
NMB1179: РНК-метилтрансфераза семейства TrmH; 1182124-1181516.
NMB1180: гипотетический белок; 1182411-1182178.
NMB1181: гипотетический белок; 1182945-1182583.
NMB1182: гипотетический белок; 1183262-1182960.
NMB1145: УДФ-N-ацетилмурамат::L-аланил-γ-D-глутамил-мезо-диаминопимелатлигаза; 1152664-1151291.
NMB1146: биотинсинтетаза; 1153923-1152874.
NMB1185: гипотетический белок; 1186675-1186043.
NMB1148: гипотетический белок; 1154845-1154693.
NMB1187: гипотетический белок; 1187052-1186912.
NMB1150: дегидратаза дигидроксикислот; 1157144-1155288.
NMB1189: сульфитредуктазный гемопротеин, β-компонент; 1191122-1189356.
NMB1190: сульфитредуктазный (НАДФ) флавопротеин, α-компонент, 1192963-1191152.
NMB1153: сульфатаденилилтрансфераза, 1-я субъединица; 1162210-1160927; плазмидный белок.
NMB1192: сульфатаденилилтрансфераза, 2-я субъединица; 1195208-1194288.
NMB1155: фосфоаденозинфосфосульфатредуктаза; 1163950-1163213.
NMB1194: сирогемсинтаза; 1197448-1196000.
NMB1195: гипотетический белок; 1197732-1197577.
NMB1158: Ni-зависимая гидрогеназа, субъединица цитохрома-b; 1166365-1165712.
NMB1197: консервативньлй гипотетический белок; 1199352-1198465.
NMB1199: ГТФ-связывающийся белок ТурА; 1201433-1199625.
NMB1200: белок семейства рибонуклеаз II-го типа; 1202272-1204644.
NMB1201: ИМФ-дегидрогеназа; 1206449-1204989.
NMB1202: гипотетический белок; 1207237-1206779.
NMB1203: протеин-РII-уридилилтрансфераза; 1209886-1207331.
NMB1204: транскрипционный регулятор; 1210255-1209938.
NMB1205: гипотетический белок; 1210426-1210283.
NMB1206: бактериоферритин-В; 1211053-1210583.
NMB1207: бактериоферритин-А; 1211545-1211084.
NMB1208: гипотетический белок; 1211610-1211810.
NMB1209: гипотетический белок; 1211900-1212100.
NMB1210: токсин-активирующий белок, предположительно; 1212121-1212585.
NMB1211: гипотетический белок; 1212984-1212745.
NMB1212: гипотетический белок; 1213319-1212984.
NMB1213: гипотетический белок; 1213678-1213319.
NMB1214: гемагглютинин/гемолизин-родственный белок; 1220496-1213678.
NMB1215: гипотетический белок; 1220814-1220659.
NMB1216: синтетаза липоевой кислоты; 1221989-1221009.
NMB1217: липоатпротеинлигаза-В; 1222554-1221985.
NMB1218: консервативный гипотетический белок; 1222882-1222610.
NMB1219: белок-переносчик, предположительно; 1223067-1224134.
NMB1220: белок семейства стоматинов/Мес-2; 1225281-1224337.
NMB1221: гипотетический белок; 1225703-1225299.
NMB1222: урацил-ДНК-гликозилаза; 1225784-1226440.
NMB1223: сайт-специфичная ДНК-метилаза, вырожденная; 1226520-1229028.
NMB1224: гипотетический белок; 1229552-1229154.
NMB1225: гипотетический белок; 1230112-1229600.
NMB1226: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок; 1232500-1230581.
NMB1227: консервативный гипотетический белок; 1232972-1232580.
NMB1228: гомосериндегидрогеназа; 1233145-1234449.
NMB1229: гипотетический белок; 1234445-1234876.
NMB1230: ДНК-связывающийся белок HU-β; 1235207-1234941.
NMB1231: АТФ-зависимая протеаза La; 1237851-1235392.
NMB1232: консервативный гипотетический белок; 1238285-1239202.
NMB1233: экзодезоксирибонуклеаза-V, α-субъединица; 1240978-1239236.
NMB1234: АВС-переносчик - ATФ-связывающийся белок; 1241741-1241049.
NMB1235: консервативный гипотетический белок; 1242981-1241737.
NMB1236: гипотетический белок; 1243186-1243461.
NMB1237: рекомбинантный белок RecR; 1244140-1243523.
NMB1238: белок, родственный пептидил-пролильной цис-транс-изомеразе; 1245742-1244207.
NMB1239: консервативный гипотетический белок; 1246176-1245805.
NMB1240: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок; 1246326-1247951.
NMB1241: тРНК-нуклеотидилтрансфераза; 1248026-1249276.
NMB1242: гипотетический белок; 1249502-1249807.
NMB1243: ДНК-хеликаза RuvB кроссоверных связок; 1249892-1250920.
NMB1244: рибулозофосфат-3-эпимераза; 1251674-1250949.
NMB1245: гипотетический белок; 1252367-1252035.
NMB1246: консервативный гипотетический белок; 1253294-1252434.
NMB1247: рибофлавинсинтаза, α-субъединица; 1254006-1253305.
NMB1248: белок-А биосинтеза молибдоптерингуанинового динуклеотида, “сдвиг рамки”; 1254659-1254085.
NMB1249: нитрат/нитритный сенсор, предположительно; 1254901-1256670.
NMB1250: транскрипционный регулятор семейства LuxR; 1256670-1257323.
NMB1251: транспозаза семейства IS30; 1258731-1257769.
NMB1252: фосфорибозилформилглицинамидинциклолигаза; 1259914-1258883.
NMB1253: гипотетический белок; 1260672-1261346.
NMB1254: ГТФ-циклогидролаза II; 1261342-1261932.
NMB1255: гликозилтрансфераза, вырожденная; 1262256-1263263.
NMB1256: ГТФ-циклогидролаза II/3,4-дигидрокси-2-бутанон-4-фосфатсинтаза; 1263728-1264816.
NMB1257: сайт-специфичная ДНК-метилаза, вырожденная; 1265357-1265130.
NMB1258: консервативный гипотетический белок; 1267046-1265739.
NMB1259: транспозаза семейства IS30; 1267584-1268546.
NMB1260: фермент EcoPI рестрикционно-модификационной системы III-го типа, res-субъединица; 1271565-1268629.
NMB1261: фермент EcoPI рестрикционно-модификационной системы III-го типа, mod-субъединица, точковая мутация, “сдвиг рамки”; 1273661-1271581.
NMB1262: пептидил-пролильная цис-транс-изомераза; 1274334-1273780.
NMB1263: CobW-родственный белок; 1275316-1274402.
NMB1264: консервативный гипотетический белок; 1275771-1275502.
NMB1265: консервативный гипотетический белок; 1276061-1275771.
NMB1266: белок-регулятор поглощения цинка, предположительно; 1276582-1276109.
NMB1267: низкомолекулярная протеинтирозинфосфатаза; 1277108-1276656.
NMB1268: консервативный гипотетический белок; 1278348-1277236.
NMB1269: гипотетический белок; 1279559-1278465.
NMB1270: консервативный гипотетический белок; 1281272-1279644.
NMB1271: фактор периплазматического транспорта ртути, предположительно; 1281584-1281375.
NMB1272: гипотетический белок; 1281765-1281625.
NMB1273: белок AlgI альгинат-O-ацетилирования, предположительно; 1282215-1283648.
NMB1274: гипотетический белок; 1283662-1284642.
NMB1275: гипотетический белок; 1284642-1286083.
NMB1276: КоА-лигаза жирных кислот с длинной цепью; 1286122-1287672.
NMB1277: белок-переносчик семейства ВССТ; 1289792-1287768.
NMB1278: сайт-специфичная рекомбиназа; 1290081-1292084.
NMB1279: связанная с мембраной литическая муреинтранс-гликозилаза-В, предположительно; 1293319-1292213.
NMB1280: белок, родственный ацил-КоА-дегидрогеназе очень длинных цепей; 1294948-1293524.
NMB1281: транскрипционно-репарационный фактор сочетания; 1295133-1299269.
NMB1282: аспартат-1-декарбоксилаза; 1299421-1299801.
NMB1283: 2-дегидро-3-дезоксифосфооктонатальдолаза; 1299826-1300665.
NMB1284: гипотетический белок; 1300683-1301120.
NMB1285: енолаза; 1301171-1302454.
NMB1286: консервативный гипотетический белок; 1302471-1302746.
NMB1287: ферредоксин, предположительно; 1303080-1302793.
NMB1288: рибонуклеозиддифосфатредуктаза, β-субъединица; 1304479-1303328.
NMB1289: рестриктаза II-го типа, предположительно; 1305706-1304522.
NMB1290: специфичная для С5-цитозина ДНК-метилаза, 1306712-1305702.
NMB1291: рибонуклеозиддифосфатредуктаза, α-субъединица; 1309049-1306773.
NMB1292: гипотетический белок; 1309394-1309209.
NMB1293: гипотетический белок; 1309563-1309886.
NMB1294: 1-ацил-sn-глицерол-3-фосфатацилтрансфераза; 1310967-1310203.
NMB1295: формамидопиримидин-ДНК-гликозилаза; 1311882-1311058.
NMB1296: гипотетический белок; 1312599-1311937.
NMB1297: связанная с мембраной литическая муреинтранс-гликозилаза-D; 1312778-1314751.
NMB1298: малая субъединица рибосомной псевдоуридинсинтазы-А; 1314822-1315511.
NMB1299: переносчик, зависимый от натрия и хлора, вырожденная; 1316091-1317454.
NMB1300: цитидилаткиназа; 1317701-1318354.
NMB1301: рибосомный белок S1 субчастицы 30S; 1318513-1320195.
NMB1302: фактор хозяинной интеграции, β-субъединица; 1320209-1320520.
NMB1303: транскрипционный регулятор семейства MerR; 1321281-1320877.
NMB1304: алкогольдегидрогеназа класса III; 1321402-1322535.
NMB1305: эстераза, предположительно; 1322547-1323371.
NMB1306: консервативный гипотетический белок; 1323765-1324913.
NMB1307: нуклеозиддифосфаткиназа; 1324975-1325397.
NMB1308: консервативный гипотетический белок; 1325543-1326634.
NMB1309: фактор биогенеза фимбрий и судорожной двигательной активности, предположительно; 1326640-1327398.
NMB1310: белок gсрЕ; 1327417-1328679.
NMB1311: гипотетический белок; 1328970-1328737.
NMB1312: АТФ-зависимая Clp-протеаза, протеолитическая субъединица; 1329655-1329128.
NMB1313: триггерный фактор; 1331148-1329838.
NMB1314: белок FtsK клеточных делений; 1333791-1331356.
NMB1315: урацилпермеаза; 1334014-1335222.
NMB1316: гипотетический белок; 1335289-1335726.
NMB1317: гипотетический белок; 1335865-1336266.
NMB1318: ЦДФ-диацилглицеросерин-O-фосфатидилтрансфераза; 1336343-1337086.
NMB1319: консервативный гипотетический белок; 1337090-1337860.
NMB1320: рибосомный белок L9 субчастицы 50S; 1338540-1338091.
NMB1321: рибосомный белок S18 субчастицы 30S; 1338787-1338560.
NMB1322: белок n праймосомной репликации, предположительно; 1339096-1338797.
NMB1323: рибосомный белок S6 субчастицы 30S; 1339465-1339100.
NMB1324: тиоредоксинредуктаза; 1340571-1339624.
NMB1325: АТФаза катионного транспорта семейства Е1-Е2; 1340710-1342869.
NMB1326: АВС-эксцизиназа, субъединица С; 1342969-1344819.
NMB1327: консервативный гипотетический белок; 1345045-1346445.
NMB1328: консервативный гипотетический белок; 1346570-1347283.
NMB1329: гипотетический белок; 1347649-1347840.
NMB1330: гипотетический белок; 1348276-1347917.
NMB1331: АВС-эксцизиназа, субъединица В; 1350416-1348392.
NMB1332: С-концевая пептидаза; 1352229-1350748.
NMB1333: консервативный гипотетический белок; 1354146-1352359.
NMB1334: гипотетический белок; 1354238-1354471.
NMB1335: белок сrеА; 1354474-1355031.
NMB1336: консервативный гипотетический белок; 1355036-1355581.
NMB1337: консервативный гипотетический белок; 1355577-1356029.
NMB1338: изомераза, предположительно; 1356698-1356045.
NMB1339: пролил-тРНК-синтетаза; 1358473-1356764.
NMB1340: гипотетический белок; 1358924-1359151.
NMB1341: пируватдегидрогеназа, компонент E1; 1359167-1361827.
NMB1342: пируватдегидрогеназа, компонент Е2, дигидролипоамидацетилтрансфераза, “сдвиг рамки”; 1361979-1363583.
NMB1343: гипотетический белок; 1363680-1364114.
NMB1344: пируватдегидрогеназа, компонент Е3, липоамиддегидрогеназа; 1364135-1365916.
NMB1345: гипотетический белок; 1367830-1366283.
NMB1346: ТоnВ-зависимый рецептор, предположительно, “сдвиг рамки”; 1369731-1367957.
NMB1347: экстрагенный белок-супрессор SuhB; 1370786-1370004.
NMB1348: РНК-метилаза, предположительно; 1371030-1371842.
NMB1349: гипотетический белок; 1371906-1372760.
NMB1350: гипотетический белок; 1372967-1373305.
NMB1351: белок fmu/fmv, предположительно; 1373656-1374909.
NMB1352: гипотетический белок; 1375272-1375703.
NMB1353: белок семейства альдегиддегидрогеназ; 1377097-1375757.
NMB1354: консервативный гипотетический белок; 1377755-1377105.
NMB1355: глутамил-тРНКGln-амидотрансфераза, субъединица С, предположительно; 1377906-1378193.
NMB1356: глутамил-тРНКGln-амидотрансфераза, субъединица А; 1378259-1379701.
NMB1357: консервативный гипотетический белок; 1379701-1380630.
NMB1358: глутамил-тРНКGln-амидотрансфераза, субъединица В; 1380676-1382103.
NMB1359: ЦДФ-6-дезокси-δ-3,4-глюкозинредуктаза, предположительно; 1382318-1383325.
NMB1360: пиридоксамин-5-фосфатоксидаза; 1384090-1383461.
NMB1361: консервативный гипотетический белок; 1384312-1385361.
NMB1362: антипортер оксалата/формиата, предположительно; 1386974-1385436.
NMB1363: экзодезоксирибонуклеаза, большая субъединица; 1388622-1387270.
NMB1364: NН3-зависимая НАД+-синтетаза NadE, предположительно; 1388819-1389637.
NMB1365: консервативный гипотетический белок; 1390183-1389713.
NMB1366: тиоредоксин; 1390481-1390810.
NMB1367: консервативный гипотетический белок; 1391930-1390869.
NMB1368: АТФ-зависимая РНК-хеликаза, предположительно; 1392141-1393526.
NMB1369: гипотетический белок; 1394572-1394021.
NMB1370: гипотетический белок; 1395217-1394860.
NMB1371: ацетилорнитинаминоктрансфераза; 1395561-1396754.
NMB1372: АТФ-зависимая Clp-протеаза, АТФ-связывающаяся субъединица ClpX; 1398104-1396863.
NMB1373: фактор-А связывания на рибосомах; 1398295-1398663.
NMB1374: тРНК-псевдоуридинсинтаза-В; 1398699-1399619.
NMB1375: модификаторная метилаза, предположительно, “сдвиг рамки”; 1399839-1401945.
NMB1376: консервативный гипотетический белок, точковая мутация; 1401938-1404712.
NMB1377: L-лактатдегидрогеназа; 1406036-1404867.
NMB1378: консервативный гипотетический белок; 1406327-1406770.
NMB1379: белок nifS; 1406802-1408013.
NMB1380: белок nifU; 1408280-1408663.
NMB1381: белок семейства HesB/YadR/YfhF; 1408693-1409070.
NMB1382: консервативный гипотетический белок; 1409254-1409036.
NMB1383: шаперон HscB; 1409336-1409833.
NMB1384: ДНК-гираза, субъединица А; 1409934-1412681.
NMB1385: транспозаза семейства IS 1016, вырожденная; 1412841-1413241.
NMB1386: транспозаза, предположительно, “сдвиг рамки”; 1413303-1413955.
NMB1387: гипотетический белок; 1414840-1414292.
NMB1388: глюкозо-6-фосфатизомераза; 1416500-1414857.
NMB1389: белок семейства RpiR/YebK/YfhH; 1417469-1416624.
NMB1390: глюкокиназа; 1418505-1417522.
NMB1391: оксидоредуктаза семейства Sol/DevB; 1419181-1418489.
NMB1392: глюкoзo-6-фocфaт-1-дeгидpогeнaзa; 1420906-1419464.
NMB1393: фосфоглюконатдегидрогеназа; 1421474-1423306.
NMB1394: 4-гидрокси-2-оксоглутаратальдолаза/2-дегидро-3-дезоксифосфоглюконатальдолаза; 1423490-1424125.
NMB1395: Zn-содержащая алкогольдегидрогеназа; 1425427-1424390.
NMB1396: A/G-специфичная аденингликозилаза; 1425581-1426627.
NMB1397: гипотетический белок; 1426793-1426972.
NMB1398: Cu/Zn-сулероксиддисмутаза; 1427047-1427604.
NMB1399: транспозаза IS1106; 1429146-1428175.
NMB1400: белок семейства АВС-переносчиков; 1431631-1429406.
NMB1401: транспозаза IS1016C2; 1432983-1432447.
NMB1402: гипотетический белок; 1433320-1433751.
NMB1403: FrpA/C-родственный белок; 1433795-1433983.
NMB1404: гипотетический белок; 1434021-1434746.
NMB1405: FrpA/C-родственный белок; 1434763-1435962.
NMB1406: гипотетический белок; 1436396-1436755.
NMB1407: FrpA-родственный белок, вырожденный; 1436755-1437881.
NMB1408: гипотетический белок; 1437960-1438451.
NMB1409: FrpA/C-родственный белок; 1438582-1439007.
NMB1410: гипотетический белок; 1439247-1439783.
NMB1411: транспозаза IS1016C2; 1440610-1439960.
NMB1412: белок оперона FrpC; 1441216-1442022.
NMB1413: транспозаза семейства IS1016, предположительный “сдвиг рамки”; 1442715-1442132.
NMB1414: белок оперона FrpC; 1442798-1443568.
NMB1415: регулируемый железом белок FrpC; 1443588-1449074.
NMB1416: аминопептидаза-N; 1452022-1449422.
NMB1417: консервативный гипотетический белок; 1452947-1452156.
NMB1418: белок семейства HtrB/MsbB; 1454563-1453697.
NMB1419: эндодезоксирибонуклеаза RuvC кроссоверных сцеплений; 1455150-1454617.
NMB1420: белок-стимулятор Fis инверсионного фактора, предположительно; 1455392-1455156.
NMB1421: белок nifR3; 1456432-1455425.
NMB1422: АТФ-зависимая РНК-хеликаза; предположительно; 1456798-1458168.
NMB1423: консервативный гипотетический белок; 1458746-1459870.
NMB1424: гипотетический белок; 1459903-1460928.
NMB1425: температурозависимая лизил-тРНК-синтетаза; 1462560-1461052.
NMB1426: гипотетический белок; 1463968-1462718.
NMB1427: гипотетический белок; 1464208-1464032.
NMB1428: аминопептидаза, предположительно; 1464426-1466219.
NMB1429: белок РоrА внешней мембраны; 1468209-1467034.
NMB1430: фактор элонгации транскрипции GreA; 1470964-1470491.
NMB1431: гипотетический белок; 1471298-1471050.
NMB1432: 3-фосфошикимат-1-карбоксивинилтрансфераза; 1471360-1472658.
NMB1433: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 1473237-1472707.
NMB1434: белок семейства кардиолипинсинтетаз; 1474971-1473448.
NMB1435: белок семейства транслоказ лекарственной резистентности; 1476489-1475086.
NMB1436: консервативный гипотетический белок; 1476774-1477550.
NMB1437: консервативный гипотетический белок; 1477550-1478248.
NMB1438: консервативный гипотетический белок; 1478248-1479699.
NMB1439: фосфорибозиламиноимидазолкарбоксилаза, каталитическая субъединица; 1480370-1479888.
NMB1440: гипотетический белок; 1481131-1480421.
NMB1441: O-метилтрансфераза, предположительно; 1481799-1481134.
NMB1442: фактор MutL репарации ошибок; 1482139-1484112.
NMB1443: ДНК-полимераза III, субъединицы γ и θ; 1484210-1486321.
NMB1444: консервативный гипотетический белок; 1486404-1486736.
NMB1445: белок rесА; 1489556-1488513.
NMB1446: 3-дегидрохинатдегидратаза; 1489810-1490571.
NMB1447: АТФ-зависимая ДНК-хеликаза Rep; 1490594-1492606.
NMB1448: белок Р, индуцируемый повреждениями ДНК; 1493734-1492781.
NMB1449: ТоnВ-зависимый рецептор, точковая мутация; 1496967-1493881.
NMB1450: ферредоксин-НАДФ-редуктаза; 1497241-1498017.
NMB1451: ДНК-полимераза III, субъединица ε; 1499643-1498234.
NMB1452: консервативный гипотетический белок; 1500459-1501595.
NMB1453: гипотетический белок; 1502335-1501847.
NMB1454: ферредоксин бактериального типа 4Fe-4S; 1503891-1502398.
NMB1455: гипотетический белок; 1504075-1503959.
NMB1456: гипотетический белок; 1504347-1504153.
NMB1457: транскетолаза; 1504419-1506395.
NMB1458: фумаратгидратаза II-го класса; 1506547-1507932.
NMB1459: консервативный гипотетический белок; 1508923-1508003.
NMB1460: белок связывания с одноцепочечной нуклеиновой кислотой; 1509972-1509451.
NMB1461: белок семейства транслоказ лекарственной резистентности; 1511361-1509979.
NMB1462: трансгликозилаза, предположительно; 1512092-1511472.
NMB1463: транспозаза IS1106, вырожденная; 1512998-1512596.
NMB1464: консервативный гипотетический белок; 1513541-1513053.
NMB1465: белок ОРА, “сдвиг рамки”; 1515309-1514483.
NMB1466: консервативный гипотетический белок; 1515639-1516367.
NMB1467: экзополифосфатаза; 1516487-1517992.
NMB1468: гипотетический белок; 1518527-1518207.
NMB1469: гипотетический белок; 1518607-1518527.
NMB1470: гипотетический белок; 1519392-1518850.
NMB1471: триптофанил-тРНК-синтетаза; 1520471-1519464.
NMB1472: белок сlрВ; 1520732-1523308.
NMB1473: аминотрансфераза I-го класса; 1524612-1523401.
NMB1474: 4-оксалокротонаттаутомераза, предположительно; 1524910-1524704.
NMB1475: консервативный гипотетический белок; 1525255-1526058.
NMB1476: НАЦ-специфичная глутаматдегидрогеназа; 1527384-1526122.
NMB1477: гипотетический белок; 1527562-1527396.
NMB1478: фосфогликолатфосфатаза, “сдвиг рамки”; 1527786-1528489.
NMB1479: регуляторный белок RecX; 1528560-1529018.
NMB1480: гипотетический белок; 1529095-1529253.
NMB1481: гипотетический белок; 1529262-1529393.
NMB1482: белок семейства ацил-КоА-тиосложноэфирных гидролаз; 1529409-1529888.
NMB1483: липопротеин NlpD, предположительно; 1531499-1530255.
NMB1484: белок SurE выживания в стационарной фазе роста; 1532501-1531758.
NMB1485: консервативный гипотетический белок; 1534074-1532521.
NMB1486: гипотетический белок; 1534263-1534126.
NMB1487: белок сборки фимбрий; 1535230-1534445.
NMB1488: НАДФ+-зависимая сукцинатсемиальдегиддегидрогеназа; 1536772-1535342.
NMB1489: гипотетический белок; 1537259-1537750.
NMB1490: гипотетический белок; 1538345-1537917.
NMB1491: гипотетический белок; 1538785-1538699.
NMB1492: гипотетический белок; 1538860-1538795.
NMB1493: белок-А углеродного голодания; 1538892-1540970.
NMB1494: консервативный гипотетический белок; 1540963-1541154.
NMB1495: гипотетический белок; 1541371-1541562.
NMB1496: консервативный гипотетический белок; 1541673-1542230.
NMB1497: ТоnВ-зависимый рецептор; 1543234-1545996.
NMB1498: аспартокиназа, α- и β-субъединицы; 1549220-1548006.
NMB1499: рибонуклеаза РН; 1550148-1549423.
NMB1500: консервативный гипотетический белок; 1550694-1550233.
NMB1501: белок семейства HesA/MoeB/ThiF; 1550911-1551684.
NMB1502: гипотетический белок; 1551825-1552349.
NMB1503: гипотетический белок; 1552608-1552814.
NMB1504: консервативный гипотетический белок; 1552706-1553557.
NMB1505: никотинатфосфорибозилтрансфераза; 1553601-1554806.
NMB1506: аргинил-тРНК-синтетаза; 1554901-1556616.
NMB1507: гипотетический белок; 1556714-1557070.
NMB1508: гипотетический белок; 1557130-1558584.
NMB1509: АВС-переносчик аминокислот - пермеаза; 1560344-1559601.
NMB1510: белок семейства термонуклеаз; 1561224-1560526.
NMB1511: рибозо-5-фосфатизомераза-А; 1561934-1561266.
NMB1512: белок семейства YgbB/YacN; 1562493-1562014.
NMB1513: консервативный гипотетический белок; 1563214-1562528.
NMB1514: ДНК-полимераза III, ε-субъединица; 1563945-1563214.
NMB1515: белок-переносчик, предположительно; 1565411-1564104.
NMB1516: белок fixS; 1565589-1565404.
NMB1517: гипотетический белок; 1565885-1565589.
NMB1518: ацетаткиназа; 1566236-1567429.
NMB1519: фактор DsbD тиол/дисульфидного обмена; 1569752-1567950.
NMB1520: гипотетический белок; 1570337-1569819.
NMB1521: белок, родственный фитоенсинтазе; 1571249-1570425.
NMB1522: пептидил-пролильная цис-транс-изомераза SlyD FKBP-типа; 1571803-1571324.
NMB1523: гипотетический белок; 1572276-1572569.
NMB1524: оксидоредуктаза, предположительно; 1572682-1574046.
NMB1525: VirG-родственный белок, “сдвиг рамки”; 1576262-1574233.
NMB1526: малый основной белок-В; 1577081-1576638.
NMB1527: АДФ-гептозо-ЛПС-гептозилтрансфераза II; 1578146-1577139.
NMB1528: цистеинметилтрансфераза метилированных ДНК/белков, предположительно; 1579353-1578547.
NMB1529: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 1579597-1580409.
NMB1530: сукцинилдиаминопимелатдесукцинилаза; 1582228-1581086.
NMB1531: консервативный гипотетический белок; 1582961-1582344.
NMB1532: консервативный гипотетический белок; 1583504-1582998.
NMB1533: внешнемембанный белок Н.8; 1584150-1583602.
NMB1534: гипотетический белок; 1584287-1584150.
NMB1535: гипотетический белок; 1584404-1584874.
NMB1536: препротеин субъединицы SесА транслоказы; 1584984-1587731.
NMB1537: ДНК-праймаза; 1587879-1589648.
NMB1538: σ-фактор РНК-полимеразы RpoD; 1589838-1591763.
NMB1539: транспозаза IS1106; 1591913-1592917.
NMB1540: лактоферрин-связывающий белок А; 1597271-1594443.
NMB1541: лактоферрин-связывающий белок В; 1599481-1597271.
NMB1542: гипотетический белок; 1600504-1600722.
NMB1543: консервативный гипотетический белок; 1600871-1602082.
NMB1544: гипотетический белок; 1602097-1602405.
NMB1545: гипотетический белок; 1602412-1602609.
NMB1546: гипотетический белок; 1602795-1603076.
NMB1547: гипотетический белок; 1603107-1603406.
NMB1548: белок tspB, предположительно; 1603741-1605384.
NMB1549: гипотетический белок; 1606176-1606325.
NMB1550: консервативный гипотетический белок; 1606332-1606613.
NMB1551: консервативный гипотетический белок; 1606617-1607717.
NMB1552: белок PivNM-1A инверсии гена пилина; 1608019-1608972.
NMB1553: транспозаза, укороченная; 1612022-1611708.
NMB1554: ЦТФ-синтаза; 1613884-1612253.
NMB1555: КоА-лигаза жирных кислот с длинной цепью; 1615666-1613999.
NMB1556: тРНК-(5-метиламинометил-2-тиоуридилат)-метилтрансфераза; 1616840-1615740.
NMB1557: консервативный гипотетический белок; 1617439-1616969.
NMB1558: диацилглицерокиназа; 1618115-1617735.
NMB1559: глутатионсинтетаза; 1619386-1618430.
NMB1560: глутаминил-тРНК-синтетаза; 1621164-1619479.
NMB1561: транскрипционный регулятор семейства DeoR; 1622049-1621279.
NMB1562: консервативный гипотетический белок; 1622994-1622095.
NMB1563: транскрипционный регулятор семейства GntR; 1623859-1623146.
NMB1564: консервативный гипотетический белок; 1624850-1624431.
NMB1565: гипотетический белок; 1625639-1624971.
NMB1566: фосфорибозилглицинамидформилтрансфераза; 1626281-1625658.
NMB1567: стимулятор инфекции макрофагов; 1627206-1626391.
NMB1568: χ-субъединица холофермента ДНК-полимеразы, предположительно; 1627905-1627468.
NMB1569: аминопептидаза A/I, “сдвиг рамки”; 1629499-1627971.
NMB1570: консервативный гипотетический белок; 1629544-1630656.
NMB1571: консервативный гипотетический белок; 1630656-1631723.
NMB1572: аконитатгидратаза-2; 1631936-1634518.
NMB1573: орнитинкарбамоилтрансфераза, катаболическая; 1634663-1635655.
NMB1574: редуктоизомераза гидроксикетокислот; 1636895-1635885.
NMB1575: консервативный гипотетический белок; 1637268-1636978.
NMB1576: ацетолактатсинтаза-III, малая субъединица; 1637826-1637338.
NMB1577: ацетолактатсинтаза-III, большая субъединица; 1639564-1637840.
NMB1578: консервативный гипотетический белок; 1640685-1641335.
NMB1579: АТФ-фосфорибозилтрансфераза; 1641417-1642067.
NMB1580: гипотетический белок; 1642174-1643070.
NMB1581: гистидинолдегидрогеназа; 1643070-1644356.
NMB1582: гистидинолфосфатаминотрансфераза; 1644405-1645499.
NMB1583: имидазолглицерофосфатдегидратаза; 1645499-1646413.
NMB1584: дегидрогеназа 3-гидроксикислот; 1646511-1647377.
NMB1585: транскрипционный регулятор семейства MarR; 1647658-1648086.
NMB1586: гипотетический белок; 1648100-1648963.
NMB1587: протеаза, предположительно; 1650120-1649020.
NMB1588: ЦДФ-диацилглицерол-глицерол-3-фосфат-3-фосфатидилтрансфераза; 1651479-1650919.
NMB1589: гипотетический белок; 1652036-1651797.
NMB1590: консервативный гипотетический белок; 1652675-1652343.
NMB1591: транскрипционный регулятор MtrA; 1652804-1653706.
NMB1592: гипотетический белок; 1653729-1654313.
NMB1593: консервативный гипотетический белок; 1654445-1655305.
NMB1594: АВС-переносчик спермидина/путресцина - периплазматический спермидин/путресцин-связывающий белок; 1656479-1655352.
NMB1595: аланил-тРНК-синтетаза; 1656684-1659305.
NMB1596: гипотетический белок; 1659348-1659551.
NMB1597: гипотетический белок; 1659569-1659997.
NMB1598: гипотетический белок; 1660094-1660282.
NMB1599: гипотетический белок; 1660300-1660584.
NMB1600: гипотетический белок; 1660624-1660878.
NMB1601: транспозаза IS1106; 1661075-1662079.
NMB1602: транспозаза, предположительно; 1663112-1661997.
NMB1603: фактор резистентности к теллуриту, предположительно; 1663289-1664230.
NMB1604: фосфоглицератмутаза; 1664989-1664309.
NMB1605: А-субъединица топоизомеразы-IV; 1665137-1667437.
NMB1606: сенсорная гистидинкиназа; 1667460-1669033.
NMB1607: регулятор σ54-зависимого ответа; 1669029-1669493.
NMB1608: консервативный гипотетический белок; 1669600-1670349.
NMB1609: белок семейства пересульфирующих ферментов; 1672860-1671694.
NMB1610: гипотетический белок; 1673766-1673008.
NMB1611: гипотетический белок; 1673866-1674114.
NMB1612: АВС-переносчик аминокислот – периплазматический белок связывания аминокислот; 1674169-1674972.
NMB1613: фумаратгидратаза класса I; 1675282-16768002.
NMB1614: белок TrkA системы Trk поглощения калия; 1676903-1678312.
NMB1615: гипотетический белок; 1678758-1679018.
NMB1616: фосфометилпиримидинкиназа; 1679755-1680558.
NMB1617: фактор резистентности к теллуриту, предположительно; 1681480-1680614.
NMB1618: рибонуклеаза HI; 1681594-1682028.
NMB1619: консервативный гипотетический белок; 1682889-1683290.
NMB1620: консервативный гипотетический белок; 1683333-1684514.
NMB1621: глутатионпероксидаза; 1685113-1684583.
NMB1622: редуктаза окиси азота; 1687547-1685295.
NMB1623: основной внешнемембранный белок, индуцируемый в анаэробных условиях; 1687918-1689087.
NMB1624: консервативный гипотетический белок; 1689215-1689967.
NMB1625: белок PivNM-1B инверсии гена пилина; 1691651-1690698.
NMB1626: консервативный гипотетический белок; 1693053-1691953.
NMB1627: консервативный гипотетический белок; 1693338-1693057.
NMB1628: белок tspB, предположительно; 1695347-1693797.
NMB1629: гипотетический белок; 1695690-1695328.
NMB1630: гипотетический белок; 1696057-1695758.
NMB1631: гипотетический белок; 1696449-1696088.
NMB1632: гипотетический белок; 1696752-1696555.
NMB1633: гипотетический белок; 1697067-1696759.
NMB1634: консервативный гипотетический белок; 1698296-1697091.
NMB1635: гипотетический белок; 1698662-1698444.
NMB1636: белок ОРА, “сдвиг рамки”; 1700231-1701047.
NMB1637: консервативный гипотетический белок; 1701808-1701254.
NMB1638: белок семейства YhbX/YhjW/YijP/YjdB; 1703518-1701887.
NMB1639: гипотетический белок; 1703921-1703595.
NMB1640: фосфосеринаминотрансфераза; 1705027-1703924.
NMB1641: консервативный гипотетический белок; 1705374-1705820.
NMB1642: белок-А утилизации азота; 1705851-1707350.
NMB1643: фактор инициации трансляции IF-2; 1707365-1710250.
NMB1644: гипотетический белок; 1711755-1710418.
NMB1645: гипотетический белок; 1713169-1711832.
NMB1646: гемолизин, предположительно; 1713312-1713935.
NMB1647: котранспортер аминокислот, предположительно; 1715420-1714005.
NMB1648: консервативный гипотетический белок; 1715747-1716472.
NMB1649: белок-В формирования дисульфидных связей; 1717022-1716537.
NMB1650: лейцин-зависимый регуляторный белок; 1718177-1717716.
NMB1651: аланинрацемаза; 1718502-1719557.
NMB1652: консервативный гипотетический белок; 1720979-1719627.
NMB1653: консервативный гипотетический белок; 1721266-1720997.
NMB1654: консервативный гипотетический белок; 1722129-1721395.
NMB1655: аденин-специфичная метилаза, предположительно; 1723321-1722413.
NMB1656: гипотетический белок; 1723454-1724044.
NMB1657: белок, родственный белку-1 оперона соmЕ; 1725327-1724713.
NMB1658: флавопротеин метаболизма ДНК и пантотената; 1731065-1732246.
NMB1659: гуанозин-3’,5’-бис(дифосфат)-3’-пирофосфогидролаза; 1734472-1732319.
NMB1660: ДНК-зависимая РНК-полимераза, субъединица ω; 1734770-1734567.
NMB1661: гуанилаткиназа; 1735446-1734832.
NMB1662: аденинфосфорибозилтрансфераза; 1735607-1736170.
NMB1663: консервативный гипотетический белок; 1737007-1736222.
NMB1664: протеаза, предположительно; 1737332-1738684.
NMB1665: консервативный гипотетический белок; 1739253-1738870.
NMB1666: гипотетический белок; 1739498-1739253.
NMB1667: гипотетический белок; 1740061-1739858.
NMB1668: рецептор гемоглобина; 1742596-1740224.
NMB1669: белок PigA голодания по железу; 1743420-1742794.
NMB1670: белок семейства PqiA; 1743706-1745214.
NMB1671: белок pqiB; 1745210-1746868.
NMB1672: консервативный гипотетический белок; 1746871-1747386.
NMB1673: ДНК-3-метиладенингликозилаза I, предположительно; 1747393-1747941.
NMB1674: белок семейства GDSL-липаз; 1747934-1748572.
NMB1675: гипотетический белок; 1748797-1749102.
NMB1676: глициндегидрогеназа (декарбоксилирующая); 1749136-1751984.
NMB1677: цитохром-с5; 1753288-1752452.
NMB1678: аминотрансфераза ароматических аминокислот; 1754906-1753716.
NMB1679: тРНК-(урацил-5)-метилтрансфераза; 1756015-1754930.
NMB1680: хоризматсинтаза; 1756162-1757259.
NMB1681: гипотетический белок; 1757354-1757776.
NMB1682: В-субъединица топоизомеразы-IV; 1759838-
1757856.
NMB1683: белок семейства MutT/nudix; 1760429-1759908.
NMB1684: серил-тРНК-синтетаза; 1760595-1761887.
NMB1685: D-лактатдегидрогеназа; 1762966-1761971.
NMB1686: фактор-1 высвобождения пептидной цепи; 1764167-1763094.
NMB1687: консервативный гипотетический белок; 1765042-1764275.
NMB1688: L-аспарагиназа I; 1766051-1765053.
NMB1689: белок dedA, предположительно; 1767007-1766327.
NMB1690: белок семейства фосфоглюкомутаз/фосфоманномутаз; 1768532-1767201.
NMB1691: дигидроптероатсинтаза; 1769519-1768665.
NMB1692: белок, родственный хоризматмутазе; 1770552-1769662.
NMB1693: гипотетический белок; 1770643-1772754.
NMB1694: консервативный гипотетический белок; 1774305-1772824.
NMB1695: гипотетический белок; 1774424-1775401.
NMB1696: белок-переносчик ацильных групп; 1775800-1775558.
NMB1697: белок-переносчик ацильных групп, предположительно; 1776072-1775815.
NMB1698: ацилтрансфераза, предположительно; 1776827-1776072.
NMB1699: гипотетический белок; 1777185-1776823.
NMB1700: гипотетический белок; 1777345-1777707.
NMB1701: гипотетический белок; 1777763-1778260.
NMB1702: 3-оксоацилредуктаза белков-переносчиков ацильных групп; 1778291-1779016.
NMB1703: 3-оксоацилсинтаза II белков-переносчиков ацильных групп; 1779013-1780260.
NMB1704: β-1,4-глюкозилтрансфераза; 1780467-1781222.
NMB1705: α-1,2-N-ацетилглюкозаминтрансфераза; 1781226-1782287.
NMB1706: гипотетический белок; 1782329-1782496.
NMB1707: зависимый от натрия и хлора переносчик; 1782677-1784011.
NMB1708: NosX-родственный белок; 1784846-1784189.
NMB1709: тимидилатсинтаза; 1785648-1784857.
NMB1710: НАДФ-специфичная глутаматдегидрогеназа; 1786032-1787363.
NMB1711: транскрипционный регулятор семейства GntR; 1788280-1787504.
NMB1712: белок, родственный L-лактатпермеазе; 1788711-1789007.
NMB1713: транспозаза семейства IS30; 1790361-1789399.
NMB1714: белок системы канала-насоса неспецифического лекарственного оттока; 1791874-1790474.
NMB1715: белок MtrD неспецифической переносимой системы резистентности; 1795132-1791932.
NMB1716: белок мембранного слияния; 1796382-1795147.
NMB1717: транскрипционный регулятор MtrR; 1796785-1797414.
NMB1718: гипотетический белок; 1797953-1797699.
NMB1719: компонент MtrF насоса системы оттока; 1798240-1799805.
NMB1720: полипептид 125-кД экзодезоксирибонуклеазы-V; 1803085-1799879.
NMB1721: консервативный гипотетический белок; 1804596-1803190.
NMB1722: цитохром С555, “сдвиг рамки”; 1804923-1804801.
NMB1723: цитохром-с-оксидаза, субъединица III; 1806129-1805035.
NMB1724: цитохром-с-оксидаза, субъединица II; 1806939-1806331.
NMB1725: цитохром-с-оксидаза, субъединица I; 1808411-1806969.
NMB1726: консервативный гипотетический белок; 1808726-1810471.
NMB1727: консервативный гипотетический белок; 1810539-1810964.
NMB1728: белок ExbD транспорта биополимеров; 1812088-1811657.
NMB1729: белок ЕхbВ транспорта биополимеров; 1812753-1812094.
NMB1730: белок ТоnВ; 1813661-1812822.
NMB1731: консервативный гипотетический белок; 1813916-1814551.
NMB1732: белок-переносчик, предположительно; 1815806-1815009.
NMB1733: гипотетический белок; 1816445-1815945.
NMB1734: глутаредоксин; 1817423-1816785.
NMB1735: ГТФ-пирофосфокиназа; 1817566-1819776.
NMB1736: транспозаза, предположительно, “сдвиг рамки”; 1820048-1820856.
NMB1737: секреторный белок, предположительно; 1822426-1821026.
NMB1738: секреторный белок, предположительно; 1823922-1822498.
NMB1739: гипотетический белок; 1824158-1824508.
NMB1740: гипотетический белок; 1824635-1825042.
NMB1741: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 1825116-1826455.
NMB1742: гипотетический белок; 1826503-1826790.
NMB1743: гипотетический белок; 1826798-1826992.
NMB1744: гипотетический белок; 1827003-1827284.
NMB1745: гипотетический белок; 1827294-1827569.
NMB1746: гипотетический белок; 1827700-1827987.
NMB1747: белок tspB, предположительно; 1828031-1829533.
NMB1748: консервативный гипотетический белок; 1829537-1829824.
NMB1749: консервативный гипотетический белок; 1829837-1830919.
NMB1750: белок PivNM-2 инверсии гена пилина; 1831548-1832495.
NMB1751: транспозаза, вырожденная; 1833264-183887.
NMB1752: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 1833772-1833299.
NMB1753: VapD-родственный белок; 1834647-1835081.
NMB1754: белок, родственный белку-А криптической плазмиды; 1835182-1835084.
NMB1755: гипотетический белок; 1835328-1835669.
NMB1756: гипотетический белок; 1835980-1836171.
NMB1757: гипотетический белок; 1836529-1836756.
NMB1758: гипотетический белок; 1837008-1837217.
NMB1759: консервативный гипотетический белок; 1837403-1838764.
NMB1760: консервативный гипотетический белок; 1839128-1839631.
NMB1761: консервативный гипотетический белок; 1839797-1841047.
NMB1762: белок-активатор гемолизина НесВ, предположительно; 1843162-1841378.
NMB1763: токсин-активирующий белок, предположительно; 1843675-1843220.
NMB1764: гипотетический белок; 1844155-1843844.
NMB1765: гипотетический белок; 1844466-1844170.
NMB1766: гипотетический белок; 1845460-1844450.
NMB1767: гипотетический белок; 1845945-1845532.
NMB1768: белок, родственный гемагглютинину/гемолизину; 1853493-1845952.
NMB1769: предполагаемая укороченная транспозаза семейства IS1016; 1853631-1853822.
NMB1770: транспозаза семейства IS30; 1854072-1855034.
NMB1771: гипотетический белок; 1855539-1855108.
NMB1772: гипотетический белок; 1857374-1855539.
NMB1773: гипотетический белок; 1857783-1857412.
NMB1774: гипотетический белок; 1858438-1858064.
NMB1775: гипотетический белок; 1860252-1858450.
NMB1776: гипотетический белок; 1860353-1860252.
NMB1777: гипотетический белок; 1861364-1861122.
NMB1778: гипотетический белок; 1861489-1861388.
NMB1779: белок, родственный гемагглютинину/гемолизину; 1867499-1861515.
NMB1780: гемолизин-активаторный белок НесВ, предположительно; 1869350-1867611.
NMB1781: гипотетический белок; 1869919-1869752.
NMB1782: гипотетический белок; 1870236-1869937.
NMB1783: предполагаемый секреторный белок, “сдвиг рамки”; 1871826-1870605.
NMB1784: гипотетический белок; 1872240-1871890.
NMB1785: гипотетический белок; 1872472-1872236.
NMB1786: гипотетический белок; 1873623-1872472.
NMB1787: N-ацетил-γ-глутамилфосфатредуктаза; 1874156-1875196.
NMB1788: АТФ-зависимая ДНК-хеликаза RecG; 1878304-1876265.
NMB1789: фактор SecB экспорта белков; 1878833-1878393.
NMB1790: глутаредоксин-3; 1879111-1878857.
NMB1791: белок цитоплазматических аксиальных нитей, “сдвиг рамки”; 1879236-1880813.
NMB1792: сенсорная гистидинкиназа; 1881795-1880854.
NMB1793: регулятор ответов, предположительно, “сдвиг рамки”; 1882272-1881854.
NMB1794: переносчик цитрата; 1883808-1882498.
NMB1795: гипотетический белок; 1884071-1883916.
NMB1796: консервативный гипотетический ответ; 1884950-1884381.
NMB1797: пенициллин-связывающий белок-3; 1885109-1886515.
NMB1798: транспозаза семейства IS1016, предположительно, “сдвиг рамки”; 1887236-1886597.
NMB1799: S-аденозилметионинсинтетаза; 1888654-1887488.
NMB1800: гипотетический белок; 1888703-1888903.
NMB1801: белок семейства HtrB/MsbB; 1889000-1889893.
NMB1802: O-сиалогликопротеинэндопептидаза; 1891004-1889943.
NMB1803: фактор биогенеза цитохрома-с, предположительно; 1892308-1891124.
NMB1804: фактор биогенеза цитохрома-с, предположительно; 1894316-1892304.
NMB1805: цитохром-с4; 1895153-1894533.
NMB1806: консервативный гипотетический белок; 1895353-1895985.
NMB1807: пенициллин-связывающий белок-1; 1898505-1896112.
NMB1808: белок pilM; 1898657-1899769.
NMB1809: белок pilN, “сдвиг рамки”; 1899775-1900371.
NMB1810: белок pilO; 1900375-1901019.
NMB1811: белок pilP; 1901040-1901582.
NMB1812: белок pilQ, “сдвиг рамки”; 1901604-1903908.
NMB1813: шикиматкиназа; 1904813-1905322.
NMB1814: 3-дегидрохинатсинтаза; 1905405-1906481.
NMB1815: консервативный гипотетический белок; 1907451-1908290.
NMB1816: консервативный гипотетический белок; 1908323-1908784.
NMB1817: рибофлавин-специфичная деаминаза; 1908819-1909925.
NMB1818: белок биосинтеза липополисахаридов, предположительно; 1910123-1911541.
NMB1819: гипотетический белок; 1911541-1911693.
NMB1820: фактор гликозилирования пилина РglВ; 1911712-1912950.
NMB1821: фактор гликозилирования пилина РglС; 1913086-1914258.
NMB1822: фактор гликозилирования пилина PglD; 1914309-1916216.
NMB1823: валинпируватаминотрансфераза; 1916275-1917564.
NMB1824: консервативный гипотетический белок; 1918455-1917622.
NMB1825: гипотетический белок: 1919103-1918903.
NMB1826: консервативный гипотетический белок; 1919452-1919084.
NMB1827: ДНК-полимераза III, α-субъединица; 1919852-1923283.
NMB1828: консервативный гипотетический белок; 1924652-1923723.
NMB1829: ТоnВ-зависимый рецептор; 1926848-1924725.
NMB1830: фосфогликолатфосфатаза, предположительно; 1926996-1927652.
NMB1831: белок lytB; 1928711-1927746.
NMB1832: сигнальная пептидаза липопротеина; 1929267-1928743.
NMB1833: изолейцил-тРНК-синтетаза; 1933332-1930546.
NMB1834: рибофлавинкиназа/ФМН-аденилилтрансфераза; 1934394-1933477.
NMB1835: тирозил-тРНК-синтетаза; 1936217-1934925.
NMB1836: белок WbpC биосинтеза липополисахаридов, предположительно; 1938151-1936283.
NMB1837: гипотетический белок; 1938466-1938215.
NMB1838: ГТФ-связывающий белок, предположительно; 1939615-1938527.
NMB1839: формиаттетрагидрофолатлигаза; 1941406-1939733.
NMB1840: консервативный гипотетический белок; 1941581-1942009.
NMB1841: белок, родственный маннозо-1-фосфатгуанилтрансферазе; 1942741-1942049.
NMB1842: 4-гидроксифенилацетат-3-гидроксилаза, малая субъединица, предположительно; 1943257-1942760.
NMB1843: транскрипционный регулятор семейства MarR; 1943812-1943375.
NMB1844: гипотетический белок; 1943938-1943819.
NMB1845: тиоредоксин; 1944662-1944156.
NMB1846: белок семейства Mrp/NBP35; 1945032-1946108.
NMB1847: белок pilC1, “сдвиг рамки”; 1947287-1950374.
NMB1848: гипотетический белок; 1952279-1951938.
NMB1849: карбамоилфосфатсинтаза, малая субъединица; 1952589-1953719.
NMB1850: гипотетический белок; 1954091-1954363.
NMB1851: гипотетический белок; 1954440-1954697.
NMB1852: консервативный гипотетический белок; 1954697-1955083.
NMB1853: гипотетический белок; 1955422-1955691.
NMB1854: гипотетический белок; 1955768-1956406.
NMB1855: карбамоилфосфатсинтаза, большая субъединица; 1956438-1959650.
NMB1856: транскрипционный регулятор семейства LysR; 1960777-1959881.
NMB1857: модулятор-В активности лекарственных веществ; 1961016-1961591.
NMB1858: гипотетический белок; 1961977-1961594.
NMB1859: изомераза S-аденозилметионин:тРНК-рибозилтрансферазы; 1963108-1962071.
NMB1860: ацетил-КоА-карбоксилаза, белок-переносчик биотинкарбоксила; 1963464-1963916.
NMB1861: ацетил-КоА-карбоксилаза, биотинкарбоксилаза; 1964031-1965389.
NMB1862: метилтрансфераза рибосомного белка L11; 1965653-1966537.
NMB1863: олигорибонуклеаза; 1966558-1967118.
NMB1864: глутамат-1-семиальдегид-2,1-аминомутаза; 1968808-1967528.
NMB1865: гипотетический белок; 1968821-1969036.
NMB1866: консервативный гипотетический белок; 1969593-1970918.
NMB1867: 1-дезоксиксилулозо-5-фосфатсинтаза; 1972919-1971009.
NMB1868: интеграза/рекомбиназа XerC; 1973909-1973007.
NMB1869: фруктозобифосфатальдолаза; 1974093-1975154.
NMB1870: гипотетический белок; 1975177-1976136.
NMB1871: консервативный гипотетический белок; 1976286-1976960.
NMB1872: аланинацетилтрансфераза рибосомных белков, предположительно; 1976960-1977397.
NMB1873: ДНК-полимераза фагового типа, предположительно; 1977394-1978128.
NMB1874: оротатфосфорибозилтрансфераза; 1978193-1978831.
NMB1875: гипотетический белок; 1978908-1979339.
NMB1876: N-ацетилглутаматсинтаза; 1979339-1980646.
NMB1877: белок семейства пролилолигопептидаз; 1980850-1982862.
NMB1878: транскрипционный регулятор семейства АrаС; 1983567-1982983.
NMB1879: гипотетический белок; 1983936-1983628.
NMB1880: АВС-переносчик - периплазматический белок, связывающий растворенные вещества, предположительно; 1984172-1985134.
NMB1881: консервативный гипотетический белок; 1985694-1986014.
NMB1882: ТоnВ-зависимый рецептор; 1986131-1988305.
NMB1883: гипотетический белок; 1988727-1988440.
NMB1884: консервативный гипотетический белок; 1989047-1988727.
NMB1885: протеин-L-изоаспартат-О-метилтрансфераза; 1989783-1989130.
NMB1886: консервативный гипотетический белок; 1990389-1989889.
NMB1887: триозофосфатизомераза; 1990568-1991338.
NMB1888: фактор SecG мембранного транспорта белков; 1991348-1991695.
NMB1889: гипотетический белок; 1992486-1992575.
NMB1890: консервативный гипотетический белок; 1992709-1993074.
NMB1891: белок семейства транскрипционных регуляторов “спираль-поворот-спираль”; 1993074-1993382.
NMB1892: гипотетический белок; 1993495-1993704.
NMB1893: консервативный гипотетический белок, “сдвиг рамки”; 1994615-1993771.
NMB1894: лейцил-тРНК-синтетаза, укороченная; 1994851-1994723.
NMB1895: метилаза аденина в составе ДНК, укороченная; 1994987-1994847.
NMB1896: рестриктаза DpnI II-типа; 1995774-1994974.
NMB1897: лейцил-тРНК-синтетаза; 1998538-1995911.
NMB1898: липопротеин; 1998808-1999320.
NMB1899: гипотетический белок; 1999330-1999770.
NMB1900: полифосфаткиназа; 1999849-2001996.
NMB1901: транспозаза IS1016C2, вырожденная; 2002232-2002770.
NMB1902: ДНК-полимераза III, β-субъединица; 2004113-2003013.
NMB1903: белок-инициатор DnaA репликации хромосом; 2005904-2004351.
NMB1904: рибосомный белок L34; 2006196-2006327.
NMB1905: белковый компонент рибонуклеазы-Р; 2006333-2006695.
NMB1906: консервативный гипотетический белок; 2006763-2006981.
NMB1907: белок 60-кД внутренней мембраны; 2007156-2008790.
NMB1908: консервативный гипотетический белок; 2009599-2008877.
NMB1909: белок семейства Maf/YceF/YhdE; 2010236-2009649.
NMB1910: консервативный гипотетический белок; 2010384-2010884.
NMB1911: рибосомный белок L32 субчастицы 50S; 2010921-2011097.
NMB1912: консервативный гипотетический белок; 2011275-2011799.
NMB1913; белок синтеза жирных кислот/фосфолипидов; 2011891-2012943.
NMB1914: гипотетический белок; 2013082-2013330.
NMB1915: гипотетический белок; 2013360-2013746.
NMB1916: 3-оксоацилсинтаза III белка-переносчика ацильных групп; 2013931-2014890.
NMB1917: консервативный гипотетический белок; 2014940-2015344.
NMB1918: малонил-КоА-трансацилаза белка-переносчика ацильных групп; 2015441-2016364.
NMB1919: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок; 2016505-2018367.
NMB1920: ГМФ-синтаза; 2018470-2020032.
NMB1921: 3-оксоацилредуктаза белка-переносчика ацильных групп; 2020097-2020840.
NMB1922: транспозаза IS1106, вырожденная; 2021273-2021118.
NMB1923: консервативный гипотетический белок; 2021377-2021757.
NMB1924: белок семейства инозитолмонофосфатаз; 2022673-2021981.
NMB1925: консервативный гипотетический белок; 2022876-2023598.
NMB1926: гликозилтрансфераза LgtE биосинтеза лакто-N-неотетраозы; 2025680-2024841.
NMB1927: белок, родственный гликозилтрансферазе биосинтеза лакто-N-неотетраозы; 2025817-2025725.
NMB1928: гликозилтрансфераза LgtB биосинтеза лакто-N-неотетраозы; 2026656-2025832.
NMB1929: гликозилтрансфераза LgtA биосинтеза лакто-N-неотетраозы; 2027747-2026701.
NMB1930: глицил-тРНК-синтетаза, β-субъединица; 2029827-2027767.
NMB1931: гипотетический белок; 2030256-2029912.
NMB1932: глицил-тРНК-синтетаза, α-субъединица; 2031238-2030336.
NMB1933: АТФ-синтаза F1, ε-субъединица; 2032065-2031646.
NMB1934: АТФ-синтаза F1, β-субъединица; 2033473-2032079.
NMB1935: АТФ-синтаза F1, γ-субъединица; 2034386-2033514.
NMB1936: АТФ-синтаза F1, α-субъединица; 2035958-2034414.
NMB1937: АТФ-синтаза F1, δ-субъединица; 2036502-2035972.
NMB1938: АТФ-синтаза F0, В-субъединица; 2036977-2036510.
NMB1939: АТФ-синтаза F0, С-субъединица; 2037284-2037051.
NMB1940: АТФ-синтаза F0, А-субъединица; 2038207-2037344.
NMB1941: гипотетический белок; 2038550-2038200.
NMB1942: гипотетический белок; 2038997-2038707.
NMB1943: гипотетический белок; 2039340-2039170.
NMB1944: белок семейства РаrВ; 2040252-2039395.
NMB1945: 3-октапренил-4-гидроксибензоаткарбоксилиаза; 2040407-2040976.
NMB1946: внешнемембранный липопротеин; 2041904-2041044.
NMB1947: АВС-переносчик - пермеаза; 2042749-2042066.
NMB1948: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок; 2043488-2042754.
NMB1949: цитоплазматическая литическая муреинтрансгликозилаза, предположительно; 2044018-2045865.
NMB1950: рибосомный белок S21 субчастицы 30S; 2046157-2046366.
NMB1951: консервативный гипотетический белок; 2046405-2046944.
NMB1952: фактор-В жесткого голодания; 2047538-2047149.
NMB1953: фактор-А жесткого голодания; 2048215-2047613.
NMB1954: гипотетический белок; 2050146-2048488.
NMB1955: фактор резистентности к кадмию; 2050933-2050310.
NMB1956: рибосомный белок L31 субчастицы 50S; 2051451-2051239.
NMB1957: белок, родственный ацетилтрансферазе, “сдвиг рамки”; 2051688-2052197.
NMB1958: тиоредоксин, предположительно; 2052770-2052273.
NMB1959: консервативный гипотетический белок; 2053150-2052770.
NMB1960: гипотетический белок; 2053632-2053153.
NMB1961: VacJ-родственный белок; 2054464-2053640.
NMB1962: гипотетический белок; 2054739-2054464.
NMB1963: консервативный гипотетический белок; 2055380-2054793.
NMB1964: консервативный гипотетический белок; 2055911-2055420.
NMB1965: консервативный гипотетический белок; 2056738-2055965.
NMB1966: АВС-переносчик - АТФ-связывающийся белок; 2057586-2056789.
NMB1967: транскрипционный регулятор семейства АrаС; 2057759-2058673.
NMB1968: альдегиддегидрогеназа А; 2058936-2060375.
NMB1969: серотип-1-специфичный антиген, предположительно; 2061412-2064657.
NMB1970: компонент I пара-аминобензоатсинтетазы/4-амино-4-дезоксихоризматлиаза, предположительно; 2065692-2067470.
NMB1971: консервативный гипотетический белок; 2069049-2067535.
NMB1972: шаперонин 60-кД; 2071379-2069748.
NMB1973: шаперонин 10-кД; 2071762-2071475.
NMB1974: транспозаза IS1016C2, вырожденная; 2071990-2072639.
NMB1975: переносчик, зависимый от натрия и хлора; 2072855-2074387.
NMB1976: диаминопимелатдекарбоксилаза; 2075759-2074518.
NMB1977: гипотетический белок; 2075940-2075773.
NMB1978: белок cyaY; 2076011-2076331.
NMB1979: консервативный гипотетический белок; 2076361-2077374.
NMB1980: консервативный гипотетический белок; 2077403-2077819.
NMB1981: консервативный гипотетический белок; 2077844-2078347.
NMB1982: ДНК-полимераза I, 2078496-2081309.
NMB1983: гипотетический белок; 2082658-2083326.
NMB1984: транспозаза IS1106, “сдвиг рамки”; 2083391-2084499.
NMB1985: фактор адгезии и проникновения; 2089191-2084821.
NMB1986: гипотетический белок; 2089756-2089328.
NMB1987: белок ThdF окисления тиофена/фурана; 2090041-2091384.
NMB1988: регулируемый железом белок внешней мембраны FrpB; 2092611-2094752.
NMB1989: АВС-переносчик трехвалентного железа - периплазматический связывающий белок; 2095472-2096434.
NMB1990: АВС-переносчик трехвалентного железа - пермеаза; 2096601-2097566.
NMB1991: АВС-переносчик трехвалентного железа - пермеаза; 2097559-2098530.
NMB1992: гипотетический белок; 2098577-2099200.
NMB1993: АВС-переносчик трехвалентного железа - АТФ-связывающийся белок; 2099286-2100041.
NMB1994: адгезин/инвазин, предположительно; 2100342-2101433.
NMB1995: азот-регулирующий белок P-II, “сдвиг рамки”; 2101839-2101423.
NMB1996: фосфорибозилформилглицинамидинсинтаза; 2101990-2105949.
NMB1997: гидроксиацилглутатионгидролаза; 2106047-2106802.
NMB1998: сериновая пептидаза; 2107119-2111411.
NMB1999: переносчик магния; 2111646-2113097.
NMB2000: консервативный гипотетический белок; 2114094-2113189.
NMB2001: консервативный гипотетический белок; 2114339-2115091.
NMB2002: гипотетический белок; 2115113-2115328.
NMB2003: консервативный гипотетический белок; 2115476-2115820.
NMB2004: консервативный гипотетический белок; 2115820-2116509.
NMB2005: глутамат-N-ацетилтрансфераза/ацетилтрансфераза аминокислот; 2116579-2117796.
NMB2006: белок, родственный хлорному каналу; 2117859-2119265.
NMB2007: АТФ-зависимая РНК-хеликаза НгрА, укороченная; 2119458-2120846.
NMB2008: АВС-переносчик - белок, родственный АТФ-связывающемуся белку; 2120993-2122633.
NMB2009: АТФ-зависимая РНК-хеликаза НгрА, вырожденная; 2122680-2122859.
NMB2010: белок семейства YhbX/YhjW/YijP/YjdB; 2123074-2124648.
NMB2011: АТФ-зависимая РНК-хеликаза НгрА, укороченная; 2124717-2128133.
NMB2012: транскрипционный регулятор семейства НТН3; 2129260-2128172.
NMB2013: гипотетический белок; 2129920-2129279.
NMB2014: гипотетический белок; 2130249-2130004.
NMB2015: гипотетический белок; 2130614-2130880.
NMB2016: белок, родственный пилину IV-го типа; 2131493-2131047.
NMB2017: ComEA-родственный белок; 2132027-2131584.
NMB2018: консервативный гипотетический белок; 2138411-2137752.
NMB2019: белок KdtB биосинтеза каркасной части липополисахаридов; 2138949-2138440.
NMB2020: консервативный гипотетический белок; 2139756-2139076.
NMB2021: консервативный гипотетический белок; 2140179-2139916.
NMB2022: консервативный гипотетический белок; 2140722-2140255.
NMB2023: консервативный гипотетический белок; 2141162-2140779.
NMB2024: консервативный гипотетический белок; 2141826-2141224.
NMB2025: консервативный гипотетический белок; 2142422-2141826.
NMB2026: АВС-переносчик - пермеаза; 2144046-2142454.
NMB2027: глюконатпермеаза; 2144385-2145767.
NMB2028: терморезистентная глюкокиназа; 2145790-2146305.
NMB2029: гомосеринкиназа, “сдвиг рамки”; 2147564-2146650.
NMB2030: 3-деметилубихинон-9-3-метилтрансфераза; 2148329-2147604.
NMB2031: переносчик триптофана; 2148481-2149719.
NMB2032: липополисахаридгликозилтрансфераза, “сдвиг рамки”; 2149872-2150922.
NMB2033: гистидинолфосфатаза, предположительно; 2151173-2151733.
NMB2034: 1-ацил-sn-глицерол-3-фосфатацилтрансфераза, предположительно; 2151765-2152505.
NMB2035: консервативный гипотетический белок; 2152505-2153194.
NMB2036: тРНК-псевдоуридинсинтаза-А; 2154495-2155390.
NMB2037: гипотетический белок; 2155415-2155651.
NMB2038: PemK-родственный белок; 2155642-2155962.
NMB2039: основной внешнемембранный белок PIB; 2157487-2158479.
NMB2040: фактор ThiC биосинтеза тиамина; 2161479-2159581.
NMB2041: белок, родственный тиаминпирофосфокиназе; 2162093-2162965.
NMB2042: АВС-переносчик спермидина/путресцина - АТФ-связывающийся белок; 2162977-2163912.
NMB2043: транспозаза IS1106, предположительно, точковая мутация; 2165702-2164734.
NMB2044: фосфоенолпируват-протеин-фосфотрансфераза; 2168278-2166506.
NMB2045: фосфопереносящий белок НРr; 2168547-2168281.
NMB2046: компонент IIАВ системы PTS; 2169074-2168619.
NMB2047: гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансфераза, предположительно; 2169697-2169137.
NMB2048: ДНК-лигаза; 2170590-2169769.
NMB2049: белок семейства глиоксалаз-II; 2170682-2171311.
NMB2050: консервативный гипотетический белок; 2173305-2171524.
NMB2051: убихинолцитохром-с-редуктаза, цитохром-c1; 2174444-2173647.
NMB2052: убихинолцитохром-с-редуктаза, цитохром-b; 2175793-2174447.
NMB2053: убихинолцитохром-с-редуктаза, Fe/S-субъединица; 2176393-2175815.
NMB2054: консервативный гипотетический белок; 2177265-2176519.
NMB2055: транскрипционный регулятор семейства LysR; 2177396-2178322.
NMB2056: рибосомный белок S9 субчастицы 30S; 2178972-2178583.
NMB2057: рибосомный белок L13 субчастицы 50S; 2179413-2178985.
NMB2058: консервативный гипотетический белок; 2180081-2179779.
NMB2059: гипотетический белок; 2180421-2180095.
NMB2060: глицеро-3-фосфатдегидрогеназа (НАД+); 2181465-2180479.
NMB2061: фосфоенолпируваткарбоксилаза; 2184290-2181591.
NMB2062: белок thiF; 2184460-2185227.
NMB2063: белок slyX, предположительно; 2186018-2185797.
NMB2064: консервативный гипотетический белок; 2187407-2186022.
NMB2065: белок hemK, “сдвиг рамки”; 2188764-2187496.
NMB2066: белок tldD; 2190271-2188832.
NMB2067: консервативный гипотетический белок; 2190661-2191881.
NMB2068: флавопротеин оксидазы D-аминокислот; предположительно; 2191881-2192978.
NMB2069: тиаминфосфатпирофосфорилаза; 2193003-2193617.
NMB2070: гипотетический белок; 2194042-2194233.
NMB2071: белок thiG; 2194450-2195235.
NMB2072: гипотетический белок; 2195352-2195492.
NMB2073: гипотетический белок; 2195580-2195780.
NMB2074: гипотетический белок; 2196867-2196004.
NMB2075: белок BirA/вспомогательный фактор Bvg; 2198657-2196882.
NMB2076: белок aut; 2199160-2198657.
NMB2077: метилентетрагидрофолатдегидрогеназа/метенилтетрагидрофолатциклогидролаза, “сдвиг рамки”; 2199800-2200650.
NMB2078: консервативный гипотетический белок; 2201296-2200718.
NMB2079: аспартатсемиальдегиддегидрогеназа; 2201472-2202584.
NMB2080: гипотетический белок; 2203345-2202818.
NMB2081: гипотетический белок; 2203700-2203359.
NMB2082: экзодезоксирибонуклеаза; 2204466-2203690.
NMB2083: цистеинил-тРНК-синтетаза; 2205970-2204552.
NMB2084: гипотетический белок; 2206648-2205985.
NMB2085: гипотетический белок; 2207707-2206661.
NMB2086: ГТФ-связывающий белок; 2208944-2207793.
NMB2087: гипотетический белок; 2209792-2209433.
NMB2088: консервативный гипотетический белок; 2210766-2209894.
NMB2089: консервативный гипотетический белок; 2210812-2211156.
NMB2090: фосфогептозоизомераза; 2211164-2211754.
NMB2091: гемолизин, предположительно; 2211821-2212426.
NMB2092: гипотетический белок; 2212437-2213066.
NMB2093: метионинаминопептидаза; 2213109-2213885.
NMB2094: гипотетический белок; 2214043-2214339.
NMB2095: белок адгезинового комплекса, предположительно; 2214580-2214951.
NMB2096: малат:хиноноксидоредуктаза; 2216608-2215145.
NMB2097: гипотетический белок; 2216749-2216663.
NMB2098: консервативный гипотетический белок; 2217735-2217148.
NMB2099: консервативный гипотетический белок; 2218377-2217799.
NMB2100: гипотетический белок; 2218455-2218685.
NMB2101: рибосомный белок S2 субчастицы 30S; 2218861-2219586.
NMB2102: фактор элонгации TS (EF-TS); 2219718-2220569.
NMB2103: уридилаткиназа; 2220789-2221505.
NMB2104: белок mafA, “сдвиг рамки”; 2221692-2222652.
NMB2105: белок mafB; 2222695-2224143.
NMB2106: гипотетический белок; 2224143-2224496.
NMB2107: MafB-родственный белок; 2224527-2225288.
NMB2108: гипотетический белок; 2225301-2225504.
NMB2109: гипотетический белок; 2225639-2225887.
NMB2110: гипотетический белок; 2225887-2226255.
NMB2111: MafB-родственный белок; 2226268-2227110.
NMB2112: гипотетический белок; 2227306-2227572.
NMB2113: гипотетический белок; 2227598-2227897.
NMB2114: MafB-родственный белок; 2227948-2228583.
NMB2115: гипотетический белок; 2228589-2228930.
NMB2116: гипотетический белок; 2228971-2229312.
NMB2117: MafB-родственный белок, вырожденный; 2229645-2230340.
NMB2118: гипотетический белок; 2230340-2230654.
NMB2119: MafB-родственный белок; 2230709-2231464.
NMB2120: гипотетический белок; 2231471-2231869.
NMB2121: гипотетический белок; 2232031-2232372.
NMB2122: MafB-родственный белок; 2232409-2232510.
NMB2123: гипотетический белок; 2232518-2232871.
NMB2124: гипотетический белок; 2232922-2233047.
NMB2125: гипотетический белок; 2233047-2233418.
NMB2126: транспозаза семейства IS1016, предположительно, “сдвиг рамки”; 2234296-2233462.
NMB2127: лротеаза, предположительно; 2235364-2234381.
NMB2128: CinA-родственный белок; 2236204-2235407.
NMB2129: аргининосукцинатсинтаза; 2236517-2237857.
NMB2130: гипотетический белок; 2237908-2238147.
NMB2131: гипотетический белок; 2238143-2238355.
NMB2132: белок, родственный трансферрин-связывающему белку; 2239900-2238437.
NMB2133: белок семейства котранспортеров натрия и дикарбоксилата; 2241384-2240158.
NMB2134: консервативный гипотетический белок; 2241857-2243761.
NMB2135: консервативный гипотетический белок; 2243771-2247985.
NMB2136: переносчик пептидов; 2249471-2250925.
NMB2137: гипотетический белок; 2251451-2251660.
NMB2138: фактор-2 высвобождения пептидной цепи; 2252924-2251824.
NMB2139: консервативный гипотетический белок; 2253920-2253030.
NMB2140: консервативный гипотетический белок; 2254265-2254711.
NMB2141: гипотетический белок; 2254787-2255092.
NMB2142: консервативный гипотетический белок; 2255187-2256050.
NMB2143: консервативный гипотетический белок; 2256043-2256786.
NMB2144: σ-фактор, предположительно; 2256811-2257395.
NMB2145: гипотетический белок; 2257404-2257580.
NMB2146: гипотетический белок; 2257703-2257810.
NMB2147: гипотетический белок; 2257842-2258261.
NMB2148: транспозаза семейства IS30; 2258738-2259700.
NMB2149: гипотетический белок; 2260052-2259795.
NMB2150: гипотетический белок; 2261006-2260440.
NMB2151: фосфорибозиламинглицинлигаза; 2262344-2261076.
NMB2152: гипотетический белок; 2262502-2262816.
NMB2153: консервативный гипотетический белок; 2263482-2262874.
NMB2154: флавопротеин транспорта электронов, α-субъединица; 2264480-2263548.
NMB2155: флавопротеин транспорта электронов, β-субъединица; 2265240-2264494.
NMB2156: гептозилтрансфераза-1; 2266435-2265470.
NMB2157: пиразинамидаза/никотинамидаза РnсА, предположительно; 2267107-2266475.
NMB2158: консервативный гипотетический белок; 2267221-2267898.
NMB2159: глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа; 2269163-2268162.
NMB2160: белок MutS репарации ошибок в ДНК; 2269607-2272198.
NMB0505: гипотетический белок; 533467-533186.
NMB1123: гипотетический белок; 1135584-1135390.
NMB1124: гипотетический белок; 1136271-1135627.
NMB1125: гипотетический белок; 1136639-1136271.
NMB1126: гипотетический белок; 1137317-1136649.
NMB1127: белок семейства оксидоредуктаз, короткоцепочечных дегидрогеназ/редуктаз; 1138201-1137485.
NMB1129: гипотетический белок; 1139833-1139630.
NMB1130: фитоенсинтаза, предпочтительно; 1140867-1139998,
NMB1133: консервативный гипотетический белок/анкирин-родственный белок; 1144428-1143670.
NMB1134: ферредоксин типа 2Fe-2S; 1144824-1144486.
NMB1135: гипотетический белок; 1145242-1145102.
NMB1137: консервативный гипотетический белок; 1146211-1146017.
NMB1138: консервативный гипотетический белок; 1146683-1146285.
NMB1141: РНК-метилтрансфераза семейства TrmH; 1150088-1149480.
NMB1142: гипотетический белок; 1150375-1150142.
NMB1143: гипотетический белок; 1150909-1150547.
NMB1144: гипотетический белок; 1151226-1150924; липопротеин.
NМВ1147: гипотетический белок; 1154639-1154007; гомология с плазмидными белками Y4SH-RISHN и PX02-BACAN.
NMB1149: гипотетический белок; 1155016-1154876.
NMB1151: гемопротеин сульфитредуктазы, β-компонент; 1159086-1157320.
NMB1152: флавопротеин (НАДФ+) сульфитредуктазы, α-компонент; 1160927-1159116.
NMB1154: сульфатаденилилтрансфераза, 2-я субъединица; 1163172-1162252.
NMB1156: сирогемсинтаза; 1165412-1163964.
NMB1157: гипотетический белок; 1165696-1165541.
NMB1159: консервативный гипотетический белок; 1167316-1166429; внутренняя мембрана.
NMB1160: консервативный гипотетический белок; 1167316-1166429.
NMB1166: консервативный гипотетический белок; 1171633-1170323.
NMB1169: шаперон HscA; 1174933-1173074.
NMB1170: гипотетический белок; 1175666-1175013.
NMB1174: гипотетический белок; 1178053-1177373.
NMB1177: ацетил-КоА-карбоксилаза, карбоксилтрансферазная α-субъединица; 1179887-1178931.
NMB1178: белок mesJ, “сдвиг рамки”; 1181265-1179984.
NMB1183: УДФ-N-ацетилмурамат:L-аланил-γ-D-глутамил-мезо-диаминопимелатлигаза; 1184700-1183327.
NMB1184: биотинсинтетаза; 1185959-1184910.
NMB1186: гипотетический белок; 1186881-1186729.
NMB1188: дегидратаза дигидроксикислот; 1189180-1187324.
NMB1191: сульфатаденилилтрансфераза, 1-я субъединица; 1194246-1192963.
NMB1193: фосфоаденозинфосфосульфатредуктаза; 1195986-1195249.
NMB1196: Ni-зависимая гидрогеназа, субъединица цитохромового-b типа; 1198401-1197748.
Изобретение относится к биотехнологии. Представлены иммуногенные белки, полученные из Neisseria, с аминокислотной последовательностью, приведенной в описании, и соответствующие нуклеотидные последовательности. Представлено антитело, полученное с помощью указанного белка, и композиция для лечения, профилактики и диагностики инфекций, вызванных Neisseria. Изобретение позволяет получить эффективные иммуногенные композиции против всех серотипов менингококка. 10 н. и 5 з.п. ф-лы, 53 ил., 1 табл.
| ЕР 0467714 A1, 22.01.1992 | |||
| WO 9629412 A1, 26.09.1996 | |||
| US 5389515 А, 14.02.1995 | |||
| WO 9817805 А, 30.04.1998 | |||
| ЩЕЛКУНОВ С.Н | |||
| Конструирование гибридных молекул ДНК | |||
| - Новосибирск: Наука, 1987, с.205-224. |
