Настоящее изобретение касается антигенов бактерий рода Neisseria.
Предпосылки для изобретения
Бактерии Neisseria meningitidis и Neisseria gonorrhoeae являются неподвижными грамотрицательными бактериями-диплококками, проявляющими патогенность в отношении человека. N.meningitidis образуют колонии в глоточном отделе и вызывают менингит (а также, в отдельных случаях, септинцемию без менингита); N.gonorrhoeae образуют колонии в половых путях, вызывая гоноррею. Несмотря на то, что они образуют колонии в разных частях тела и вызывают совершенно разные заболевания, эти два патогена очень близки друг к другу, хотя имеется и отчетливое различие между менингококком и гонококком, связанное с наличием полисахаридной капсулы, которая имеется у всех патогенных менингококков.
Гонококк N.gonorrhoeae обусловливает приблизительно 800 тысяч заболеваний в год за период 1983-90 гг. только в США (глава, написанная Meitzner & Cohen, 1997, "Vaccines Against Gonococcal Infection", In "New Generation Vaccines", 2d ed., ed. Levine, Woodrow, Kaper & Gobon, Marcel Dekker, NY, pp. 817-842). Это заболевание имеет широкую распространенность, хотя смертность от него низка. Очень желательной является вакцинация против возбудителя гонорреи, однако многочисленные такие попытки были безуспешными. Основными «антигенами-кандидатами» для создания таких вакцин являются расположенные на поверхности белки, такие как пили, порины, ассоциированные с помутнением белки (Opas) и другие поверхностные белки, такие как Lip, Laz, IgA1-протеаза и трансферрин-связывающие белки. Также в качестве вакцины предлагалось использовать липополисахарид (LOS) (Meitzner & Cohen, цит. выше).
Менингококк N.meningitidis обусловливает и эндемическую, и эпидемическую форму заболевания. В США уровень заболеваемости составляет 0,6-1 на 100 тысяч человек в год, и этот показатель может повышаться в условиях вспышки заболевания (см. Lieberman et al., 1996, "Safety and Immunogenicity of a Serogroups A/C Neisseria meningitidis Oligosaccharide-Protein Conjugate Vaccine in Young Children", JAMA, 275 [19], 1499-1503; Schuchat et al., 1997, "Bacterial Meningitis in the United States in 1995", New England J. Med., 337 [14], 970-976). В развивающихся странах частота эндемических случаев заболевания существенно выше, и при возникновении эпидемий этот показатель может достигать 500 случаев на 100 тысяч человек в год. Уровень смертности очень высок - примерно 10-20% в США и еще выше в развивающихся странах. После внедрения комбинированной вакцины против Haemophilus influenzae менингококк N.meningitidis становится основным возбудителем бактериальных форм менингита во всех возрастных группах в США (Schuchat et al., 1997, цит. выше).
Исходя из параметров составляющих капсулу менингококка полисахаридов было идентифицировано 12 серогрупп N.meningitidis. Группа А включает патоген, который в основном связан с эпидемиологическими формами заболевания в присахарских областях Африки. Серогруппы В и С связаны с подавляющим большинством случаев менингита в США и большинстве развитых стран. Серогруппы W135 и Y связаны с остальными случаями в США и развитых странах. Применяемая в настоящее время менингококковая вакцина является тетравалентной полисахаридной вакциной, содержащей факторы серогрупп А, С, Y и W135. Будучи эффективной в приложении к подросткам и взрослым, эта вакцина обусловливает слабый иммунный ответ и кратковременную защиту, а также не может быть применена для маленьких детей (см., например, еженедельный доклад "Morbidity and Mortality weekly report, Vol. 46, N RR-5, 1997). Это обусловливается тем, что полисахариды являются независимыми от Т-клеток антигенами, которые обусловливают весьма слабый иммунный ответ, который не может быть усилен (подвергнут «бустингу») путем повторной иммунизации. После достижения успеха в вакцинации против Н.influenzae были разработаны комбинированные вакцины против серогрупп А и С - в настоящее время заканчиваются их клинические испытания (W.D.Zollinger, "New and Improved Vaccines Against Meningococcal Disease", In "New Generation Vaccines", цит. выше, pp. 469-488; Lieberman et al., 1996, цит. выше; Constantino et al., 1992, "Development and phase I clinical testing of a conjugate vaccine against meningococcus A and C", Vaccine, 10, 691-698).
Однако проблемным остается серотип В менингококка. В настоящее время этот серотип обусловливает примерно 50% общего количества случаев менингита в США, Европе и Южной Америке. «Полисахаридный подход» не может быть использован, потому что капсулярный полисахарид menB является полимером связанных по α(2-8) N-ацетилнейраминовых кислот, которые также присутствуют в тканях млекопитающих. Это обусловливает толерантность к данному антигену: действительно, если предположить проявление иммунного ответа, то он будет направлен и на собственный организм, т.е. такой ответ является нежелательным. С целью исключения индукции аутоиммунного ответа и индукции защитного иммунного ответа входящий в состав капсулы полисахарид был, например, химически модифицирован путем замещения N-ацетильных групп на N-пропионильные группы, вследствие чего специфичная антигенность остается неизмененной (Romero & Outschoorn, 1994, "Current Status of Meningococcal group В vaccine candidates: capsular or non-capsular?", Clin. Microbiol. Rev., 7 [4], 559-575).
В альтернативных подходах к созданию вакцин против менингита-В использовали комплексные смеси белков внешней мембраны (ОМР), включая сами по себе белки ОМР или ОМР, обогащенные поринами, или делетированные варианты ОМР 4-го класса, которые, как считается, индуцируют выработку антител, блокирующих бактерицидную активность. В этом подходе получают вакцины, полной характеристики которых пока не получено. Эти вакцины способны обеспечивать защиту от гомологичного штамма, но при этом оказываются по сути неэффективными в тех случаях, когда имеются многочисленные антигенные варианты белков внешней мембраны. Для преодоления фактора антигенной изменчивости были получены мультивалентные вакцины, содержащие вплоть до 9 различных поринов (см., например, J.Т.Poolman, 1992, "Development of a meningococcal vaccine", Infect. Agents Dis., 4, 13-28). Другими белками, которые используются при создании «внешнемембранных вакцин», являются белки ора и орс, однако ни один из применяемых подходов не обеспечивает преодоления фактора антигенной изменчивости (см., например, Ala'Aldeen & Borriello, 1996, "The meningococcal transferrin-binding proteins 1 and 2 are both surface exposed and generate bactericidal antibodies capable of killing homologous and heterologous strains", Vaccine, 14, 49-53).
Доступными являются некоторые данные по последовательностям менингококковых и гонококковых генов и белков (например, по патентным заявкам ЕР А-0467714 и WO 96/29412), однако, безусловно, они неполны. Получение дополнительных данных по последовательностям предоставит хорошие перспективы для идентификации секретируемых или располагающихся на поверхности клеток белков, которые являются перспективными мишенями для иммунной системы и которые не характеризуются антигенной изменчивостью. Например, некоторые из идентифицированных белков могли бы быть компонентами эффективных вакцин против менингококка-В, некоторые из них могли бы быть компонентами вакцин против всех менингококковых серотипов и другие могли бы быть компонентами вакцин против всех патогенных форм рода Neisseriae.
Изобретение
Настоящее изобретение представляет белки, включающие аминокислотные последовательности, принадлежащие нейссериям, описанные в нижеследующих примерах. Эти последовательности относятся к N.meningitidis или N. gonorrhoeae.
Также представляются белки, включающие последовательности, гомологичные (т.е. характеризующиеся идентичностью последовательностей) аминокислотным последовательностям нейссерий, показанных в примерах. В зависимости от конкретной последовательности уровень идентичности предпочтительно превышает 50% (например, 65%, 80%, 90% или больше). Эти гомологичные белки включают мутантные и аллельные варианты последовательностей, описанных в примерах. Обычно 50%-ная или более высокая идентичность двух белков рассматривается как свидетельство функциональной эквивалентности. Уровень идентичности двух белков предпочтительно определяют по методу Смита-Уотермана, алгоритм которого заложен в компьютерную программу MPSRCH (Oxford Molecular): используется поиск «аффинных гэпов» (т.е. несовпадающих в двух последовательностях участков) с установлением параметров «gap open penalty=12» и «gap extension penalty=l».
Далее настоящее изобретение представляет белки, включающие фрагменты аминокислотных последовательностей нейссерий, описанных в нижеследующих примерах. Эти фрагменты должны включать по крайней мере n непрерывных аминокислот из базовой последовательности, а в зависимости от конкретной последовательности n равно 7 или больше (например, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 или больше). Предпочтительно такие фрагменты включают эпитоп из последовательности.
Белки по настоящему изобретению могут быть получены, конечно, с использованием различных подходов (например, методами рекомбинантной экспрессии, очистки из клеточных культур, химического синтеза и т.п.) и в различных формах (например, нативной, химерной и т.п.). Предпочтительно их получают в существенно чистой или выделенной форме (т.е. в существенной степени свободной от других белков нейссерий или клеточных белков организма-хозяина).
В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляются антитела, которые связываются с такими белками. Это могут быть поликлональные или моноклональные антитела, которые могут быть получены с применением подходящих способов.
В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляются нуклеиновые кислоты, включающие нуклеотидные последовательности нейссерий, описанные в примерах. Кроме того, настоящее изобретение представляет нуклеиновые кислоты, включающие гомологичные последовательности (т.е. характеризующиеся идентичностью последовательностей) по отношению к нуклеотидным последовательностям нейссерий, описанным в примерах.
Далее, настоящее изобретение представляет нуклеиновые кислоты, которые могут гибридизовать с нуклеиновыми кислотами нейссерий, описанными в примерах, причем предпочтительно в жестких условиях гибридизации (например, при 65°С в растворе 0,1xSSC, 0,5% SDS).
Также представляются нуклеиновые кислоты, включающие фрагменты таких последовательностей. Они должны включать по крайней мере n расположенных подряд нуклеотидов из состава последовательностей нейссерий, а в зависимости от конкретной последовательности n равно 10 или больше (например, 12, 14, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40 или больше).
В соответствии со следующим аспектом настоящее изобретение представляет нуклеиновые кислоты, кодирующие белки и фрагменты белков по настоящему изобретению.
Также должно быть понятно, что настоящее изобретение представляет нуклеиновые кислоты, включающие последовательности, комплементарные тем последовательностям, которые были описаны выше (например, для целей получения антисмысловых последовательностей или зондов).
Нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением могут быть, конечно, получены многими способами (например, с помощью химического синтеза, из библиотек геномной ДНК или кДНК, непосредственно из организма и т.п.) и могут принимать различные формы (например, одноцепочечную, двухцепочечную, векторную формы, форму зондов и т.п.).
Дополнительно следует сказать, что термин «нуклеиновая кислота» включает ДНК и РНК, а также их аналоги, такие как те, которые включают модифицированные молекулярные скелеты, а также нуклеопротеины (PNA) и т.п.
В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляются векторы, включающие нуклеотидные последовательности по настоящему изобретению (например, экспрессирующие векторы) и клетки-хозяева, трансформированные такими векторами.
В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения представляются композиции, содержащие белок, антитело и (или) нуклеиновую кислоту в соответствии с настоящим изобретением. Эти композиции могут быть использованы в качестве, например, вакцин, или в качестве диагностических реагентов, или в качестве иммуногенных композиций.
Настоящее изобретение также представляет нуклеиновую кислоту, белок или антитело, соответствующие настоящему изобретению, для использования в качестве лекарственных средств (например, в качестве вакцин) или в качестве диагностических реагентов. Также представляется использование нуклеиновой кислоты, белка или антител в соответствии с настоящим изобретением в производстве: (1) лекарственного средства, предназначенного для лечения или профилактики инфицирования бактериями рода Neisseria; (2) диагностического реагента, предназначенного для детекции присутствия бактерий Neisseria или антител, специфичных в их отношении; и (или) (3) реагента, который может обусловливать выработку антител против нейссерий. Упомянутые бактерии рода Neisseria могут быть представлены любым видом или штаммом (таким как N.gonorrhoeae или любой штамм N.meningitidis, такие как штамм А, штамм В или штамм С).
Также настоящее изобретение представляет способ лечения пациента, включающий введение этому пациенту терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, белка и (или) антитела, соответствующих настоящему изобретению.
В соответствии с другими аспектами настоящего изобретения представляются различные способы.
Представляется способ получения белков по настоящему изобретению, включающий этап культивирования клетки-хозяина в соответствии с настоящим изобретением в условиях, которые стимулируют экспрессию белка.
Представляется способ получения белка или нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, при том что такой белок или такая нуклеиновая кислота синтезируются полностью или частично с использованием химических методик.
Представляется способ детекции полинуклеотидов по настоящему изобретению, включающий следующие этапы: (1) контакт нуклеотидного зонда по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях, пригодных для молекулярной гибридизации с образованием дуплексов; и (2) детекция упомянутых дуплексов.
Представляется способ детекции белков по настоящему изобретению, включающий следующие этапы: (1) контакт антитела по настоящему изобретению с биологическим образцом в условиях, пригодных для образования комплекса «антиген-антитело»; и (2) детекция упомянутых комплексов.
Далее следует обзор стандартных методологий и процедур, которые могут быть использованы с целью осуществления настоящего изобретения (например, с целью использования заявляемых последовательностей для вакцинации или в диагностических целях). Этот обзор не является ограничением для настоящего изобретения, но при этом является примером такого его осуществления, которое не является строго обязательным.
Общие положения
Практическая реализация настоящего изобретения основывается, за исключением отдельно оговариваемых случаев, на стандартных методиках молекулярной биологии, микробиологии, рекомбинантной ДНК и иммунологии, которые известны специалистам в данной области техники. Такие методики подробно описаны в научной литературе: например, Sambrook, 1989, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d Ed.; "DNA Cloning", Vol. I & II, ed. D.N.Glover, 1985; "Oligonucleotide Synthesis", ed. M.J.Gait, 1984; "Nucleic Acid Hybridization", eds. B.D.Hames & S.J.Higgins, 1984; "Transcription and Translation", eds. B.D.Hames & S.J.Higgins, 1984; "Animal Cell Culture", ed. R.I.Freshney, 1986; "Immobilized Cells and Enzymes", IRL Press, 1986; B.Perbal, 1984, "A Practical Guide to Molecular Cloning"; серия руководств "Methods in Enzymology" (издано Academic Press Inc.), особенно тома 154 и 155; "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells", eds. J.H.Miller & M.P.Calos, Cold Spring Harbor Lab., 1987; "Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology", eds. Mayer & Walker, Acad. Press, London, 1987; Scopes, 1987, "Protein Purification: Principles and Practice", 2d ed., Springer-Verlag, NY; и "Handbook of Experimental Immunology", Vol. I-IV. eds. D.M.Weir & C.C.Blackwell, 1986).
В настоящем описании используются стандартные аббревиатуры для обозначения аминокислот и нуклеотидов.
Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в данном тексте, включены в полном своем объеме в виде библиографических ссылок. В частности, в данный текст включены для сведения британские патентные заявки №№ 9723516.2, 9724190.5, 9724386.9, 9725158.1, 9726147.3, 9800759.4 и 9819016.8.
Определения
Композиция, содержащая X, «в существенной степени свободна от Y» тогда, когда по крайней мере 85% по весу от суммы X+Y приходится на долю компонента X. Предпочтительно X составляет по крайней мере примерно 90% по весу от общего количества X+Y в данной композиции, более предпочтительно, по крайней мере примерно 95% или даже 99% по весу.
Термин «включающий» означает «состоящий», равно как и «содержащий». Например, композиция, «включающая» X, может состоять исключительно из компонента X или может включать нечто дополнительное к X, например сочетание X+Y.
Термин «гетерологичный» относится к двум биологическим компонентам, которые не встречаются вместе в природе. Такими компонентами могут быть клетки-хозяева, гены или регуляторные сегменты, такие как промоторы. Хотя гетерологичные компоненты в природе вместе не обнаруживаются, они могут обладать совместной функциональностью, например, когда промотор, гетерологичный по отношению к гену, функционально с ним соединен. Другим примером является такая ситуация, в которой последовательность нейссерии является гетерологичной в отношении мышиной клетки-хозяина. Дополнительными примерами могут быть два эпитопа из состава одного и того же или разных белков, которые компонуются в едином белке в таком сочетании, которое никогда не обнаруживается в природе.
«Точка начала репликации» обозначает полинуклеотидную последовательность, которая инициирует и регулирует репликацию полинуклеотидов, таких как экспрессирующий вектор. Точка (или сайт) начала репликации ведет себя как автономная единица полинуклеотидной репликации в клетке, обеспечивая способность к репликации под ее контролем. Присутствие точки начала репликации может быть необходимым для обеспечения репликации вектора в конкретной клетке-хозяине. При наличии нескольких точек начала репликации экспрессирующий вектор может воспроизводиться в большом числе копий в присутствии подходящих белков внутри клетки. Примерами точек начала репликации являются автономно реплицирующиеся последовательности, которые эффективны в клетках дрожжей, а также вирусные Т-антигены, эффективные в клетках линии COS-7.
Термин «мутантная последовательность» определяет ДНК, РНК или аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной или заявленной последовательности, но при этом имеющую сходство с ней. В зависимости от конкретной последовательности уровень идентичности последовательностей при сравнении нативной или заявленной последовательности и мутантной последовательности предпочтительно превышает 50% (составляя, например, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или больше: расчет проводится с помощью алгоритма Смита-Уотермана, описанного выше). По использованию в данном тексте термин «аллельный вариант» молекулы нуклеиновой кислоты или участка, для которого представляется нуклеотидная последовательность, является молекулой нуклеиновой кислоты или сегментом, который по сути находится в том же локусе конкретного генома другого или второго изолята, при том что ввиду естественной изменчивости, обусловливаемой, например, мутационным или рекомбинационным процессами, характеризуется сходной, но не идентичной нуклеотидной последовательностью. Кодирующий сегмент аллельного варианта обычно кодирует белок, обладающий сходным уровнем активности по сравнению с таковым у белка, кодируемого тем геном, с которым проводится данное сравнение. Аллельный вариант также может включать чередование 5'- или 3'-нетранслируемых участков конкретного гена, таких как регуляторные контрольные сегменты (см., например, патент США № 5753235).
Экспрессионные системы
Нуклеотидные последовательности нейссерий могут быть экспрессированы с использованием различных экспрессионных систем: например, для этой цели используются клетки млекопитающих, бакуловирусы, растения, бактерии и дрожжи.
I. Системы млекопитающих
Экспрессионные системы млекопитающих известны в данной области техники. Промотором млекопитающих может являться любая последовательность ДНК, способная связывать РНК-полимеразу млекопитающих, инициируя тем самым транскрипцию нижерасположенной (т.е. по 3'-концу) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор должен включать сайт инициации транскрипции, который обычно располагается проксимально по отношению к 5'-концу кодирующей последовательности, а также бокс ТАТА, обычно расположенный в 25-30 нуклеотидах выше сайта инициации транскрипции. Считается, что бокс ТАТА обеспечивает контролируемое РНК-полимеразой II начало синтеза РНК в правильном сайте. Промотор млекопитающих также должен включать расположенный выше промоторный элемент, обычно находящийся в 100-200 нуклеотидах выше бокса ТАТА. Верхний промоторный элемент определяет скорость, с которой инициируется транскрипция, и может быть активен в любой ориентации (Sambrook et al., 1989, "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells", In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2d ed.).
Гены вирусов млекопитающих обычно характеризуются интенсивной экспрессируемостью и характеризуются широким кругом хозяев: следовательно, последовательности, кодирующие гены вирусов млекопитающих, являются особенно перспективными для применения в качестве промоторных последовательностей. Примерами являются промотор ранних генов вируса SV40, промотор LTR вируса опухоли молочной железы мыши, промотор главного позднего гена аденовируса (AdMLP) и промотор простого герпес-вируса. Кроме того, последовательности, производные от невирусных генов, таких как ген металлотионеина мыши, также представляют применимые промоторные последовательности. Экспрессия может быть как конститутивной, так и регулируемой (индуцибельной), что зависит от возможности индукции промотора глюкокортикоидами в клетках, контролируемых такими гормонами.
Присутствие энхансерного элемента (энхансера) совместно с промоторными элементами, описанными выше, обычно приводит к усилению уровней экспрессии. Энхансер - это регуляторная последовательность ДНК, которая способна стимулировать транскрипцию до тысячекратного уровня в случае ее связывания с гомологичными или гетерологичными промоторами, при том что синтез начинается в нормальном инициирующем сайте РНК. Энхансеры также активны тогда, когда они помещаются или выше, или ниже сайта инициации транскрипции, как в нормальной, так и в инвертированной по механизму переключения фаз ориентации, или на расстоянии даже больше 1000 нуклеотидов от промотора (Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237; Alberts et al., 1989, "Molecular Biology of the Cell", 2d ed.). В частности, могут быть использованы энхансерные элементы, происходящие от вирусных геномов, поскольку они обычно характеризуются широким кругом потенциальных хозяев. Примерами являются энхансер раннего гена вируса SV40 (Dijkema et al., 1985, EMBO J., 4, 761) и энхансер + промотор, производные от участка длинных концевых повторов (LTR) вируса саркомы Рауса (Gorman et al., 1982b, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777) и цитомегаловируса человека (Boshart et al., 1985, Cell, 41, 521). Кроме того, некоторые энхансеры являются регулируемыми и становятся активными только в присутствии индуктора, такого как гормон или ион металла (Sassone-Corsi & Borelli, 1986, Trends Genet., 2, 215; Maniatis et al., 1987, Science, 236, 1237).
Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клеток млекопитающих. Промоторная последовательность может быть напрямую присоединена к молекуле ДНК с учетом того, что первая с N-конца аминокислота в составе рекомбинантного белка всегда должна быть метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если желательно, N-концевая часть может быть отщеплена от белка путем инкубации in vitro с цианогенбромидом.
С другой стороны, чужеродные белки также могут секретироваться из клетки непосредственно в питательную среду в результате создания химерных молекул ДНК, которые бы кодировали химерный белок, включающий лидерную последовательность сегмента, обеспечивающего секрецию чужеродного белка в клетках млекопитающих. Предпочтительным является наличие сайтов процессинга, кодируемых между лидерным сегментом и чужеродным геном, который бы мог быть расщеплен либо in vivo, либо in vitro. Лидерный сегмент обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые обеспечивают секрецию белка из клетки. Аденовирусный трипартитный лидерный сегмент является примером лидерной последовательности, обеспечивающей секрецию чужеродного белка клетками млекопитающих.
Обычно терминация транскрипции и полиадениловые последовательности, распознаваемые клетками млекопитающих, являются регуляторными сегментами, расположенными с 3'-конца от стоп-кодона, т.е. вместе с промоторными элементами, они являются мотивами, фланкирующими кодирующую последовательность. 3'-конец зрелой мРНК образуется в результате сайт-специфичного посттранскрипционного расщепления и полиаденилирования (Birnstiel et al., 1985, Cell, 41, 349; Proudfoot & Whitelaw, 1988, "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA", In "Transcription and splicing", ed. B.D.Hames & D.M.Glover; Proudfoot, 1989, Trends Biochem. Sci., 14, 105). Эти последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая затем может быть транслирована в полипептид, кодируемый исходной ДНК. Примерами сигналов терминации транскрипции и полиаденилирования являются те мотивы, которые происходят из генома вируса SV40 (Sambrook et al., 1989, "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells", In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual").
Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, полиадениловый сигнал и сайт терминации транскрипции включают одновременно в состав экспрессирующих конструкций. Энхансеры, интроны, включающие функциональные донорные и акцепторные сайты сплайсинга, и лидерные последовательности могут быть также включены в экспрессирующую конструкцию, если это является желательным. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в виде репликона, такого как внехромосомный элемент (например, плазмиды), способный стабильно сохраняться в организме хозяина, таком как клетка млекопитающего или бактерия. Репликационные системы млекопитающих включают те системы, которые являются производными от вирусов животных, для реплицирования которых необходимо участие трансрегулирующих факторов. Например, плазмиды, включающие репликационные системы паповавирусов, таких как вирус обезьян SV40 (Gluzman, 1981, Cell, 23, 175), или полиомавирусов, реплицируются в исключительно большом числе копий в присутствии подходящего вирусного Т-антигена. Дополнительными примерами репликонов для клеток млекопитающих являются те, которые происходят от бычьего папилломавируса и вируса Эпштейна-Барра. Кроме того, такой репликон может нести две репликационные системы, что тем самым обеспечивает возможность поддержания их, например, в клетках млекопитающих с целью экспрессии и в прокариотических клетках с целью клонирования и амплифицирования. Примеры таких бифункциональных векторов для млекопитающих/бактерий включают конструкции рМТ2 (Kaufman et al., 1989, Mol. Cell. Biol., 9, 946) и pHEBO (Shimizu et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 1074).
Выбор используемых процедур трансформации зависит от вида организма-хозяина, который будет трансформироваться. Способы внесения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в данной области техники: они включают опосредуемую декстраном трансфекцию, преципитацию фосфатом кальция, опосредуемую полибреном трансфекцию, слияние протопластов, электропорацию, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и прямое микроинъецирование ДНК в ядра клеток-мишеней.
Линии клеток млекопитающих, пригодные в качестве хозяев для целей экспрессии, хорошо известны и включают большое число иммортализованных клеточных линий, доступных из Американской коллекции типовых культур (АТСС), включая, но тем самым не исчерпываясь, клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки HeLa человека, клетки почек новорожденных хомячков (ВНК), клетки почки зеленой мартышки (COS), клетки гепатоклеточной карциномы человека (например, HepG2) и множество других клеточных линий.
2. Бакуловирусные системы
Полинуклеотид, кодирующий белок, также может быть встроен в подходящий экспрессирующий вектор для клеток насекомых: его функциональным образом соединяют с регуляторными элементами в составе такого вектора. При конструировании вектора используются методики, хорошо известные в данной области техники. В целом, компоненты экспрессионной системы включают собственно вектор для переноса, обычно являющийся бактериальной плазмидой, который включает и фрагмент бакуловирусного генома, и стандартный рестрикционный сайт, предназначенный для встраивания гетерологичного гена или генов, которые будут экспрессироваться; бакуловирус дикого типа, характеризующийся сходством последовательности с бакуловирусоспецифичным фрагментом вектора для переноса (это обеспечивает гомологичную рекомбинацию гетерологичного гена в бакуловирусном геноме); и подходящие клетки-хозяева насекомого и культуральную среду.
После внесения последовательности ДНК, кодирующей конкретный белок, в состав вектора для переноса этот вектор и вирусный геном дикого типа используют для трансфекции в клетку-хозяина насекомого, в которой вектор и вирусный геном могут рекомбинировать. Упакованный рекомбинантный вирус экспрессируется, а рекомбинантные бляшки могут быть идентифицированы и очищены. Материалы и методы формирования экспрессионных систем «бакуловирус/клетки насекомых» доступны в виде специальных наборов на коммерческой основе, например, помимо прочего, от фирмы Invitrogen (Сан-Диего, США): набор реактивов "МахВас". Эти методики в целом известны специалистам в данной области техники и полно охарактеризованы в руководстве Саммерса и Смита (Summers & Smith, 1987, Texas Agricult. Exper. Stat. Bull., N 1555) (здесь и далее цитируется как "Summers & Smith").
Перед встраиванием последовательности ДНК, кодирующей белок, в состав бакуловирусного генома описанные выше компоненты, включая промотор, лидерный сегмент (если он является желательным), представляющую интерес кодирующую последовательность и сайт терминации транскрипции, обычно компонуют в промежуточную конструкцию (вектор для переноса). Такая конструкция может включать в своем составе единственный ген и функционально присоединенные к нему регуляторные элементы; или множественные гены, каждый из которых имеет «собственный» набор функционально присоединенных регуляторных элементов; или множественные гены, находящиеся под контролем одних и тех же регуляторных элементов. Промежуточные перемежающиеся конструкции часто поддерживаются в виде репликона, такого как внехромосомный элемент (например, плазмида), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком как бактерия. Такой репликон должен включать репликационную систему, что тем самым обеспечит поддержание репликации в подходящем организме-хозяине с целью клонирования и амплифицирования.
В настоящее время наиболее распространенным вектором для переноса с целью внесения чужеродных генов в AcNPV является рАс373. Также могут быть сформированы и многие другие векторы, известные специалистам в данной области техники. Они включают, например, pVL985 (в котором изменяется старт-кодон гена полигедрина с ATG на АТТ и который вносит клонирующий BamHI-сайт в 32 парах нуклеотидов ниже кодона АТТ: см. Luckow & Summers, 1989, Virology, 17, 31.
Обычно используемая плазмида также включает сигнал полиаденилирования гена полигедрина (Miller et al., 1988, Ann. Rev. Microbiol., 42, 177) и прокариотический ген резистентности к ампициллину (amp) и точку начала репликации, необходимые для отбора и воспроизведения в клетках E.coli.
Бакуловирусные трансфекционные векторы обычно включают бакуловирусный промотор. Бакуловирусный промотор - это любая последовательность ДНК, способная связываться с бакуловирусной РНК-полимеразой и инициировать транскрипцию кодирующей последовательности (например, структурного гена) в направлении 5'-3' с образованием мРНК. Промотор должен включать сайт инициации транскрипции, который обычно помещают проксимально по отношению к 5'-концу кодирующей последовательности. Этот участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы и собственно сайт инициации транскрипции. Бакуловирусный трансфекционный вектор также может включать второй домен, определяемый как «энхансер», который, если присутствует, обычно находится дистальнее структурного гена. Экспрессия может быть либо индуцибельной, либо конститутивной.
Структурные гены, интенсивно транскрибируемые на поздних этапах вирусного инфекционного цикла, позволяют выделить конкретно применимые промоторные последовательности. Примерами являются последовательности, производные от гена, кодирующего вирусный белок - полигедрин (Friesen et al., 1986, "The Regulation of Baculovirus Gene Expression", In "The Molecular Biology of Baculoviruses", ed. W.Doerfler; европейские патентные публикации №№ 127839 и 155476), и гена, кодирующего белок p10 (Vlak et al., 1988, J. Gen. Virol., 69, 765).
ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может быть производной от генов, кодирующих секретируемые белки насекомых или бакуловирусов, такие как ген полигедрина бакуловируса (Carbonell et al., 1988, Gene, 73, 409). С другой стороны, при том, что сигналы посттрансляционных модификаций в клетках млекопитающих (таких как отщепление сигнального сегмента, протеолитическое расщепление и фосфорилирование), по-видимому, распознаются и клетками насекомых, а сигналы, необходимые для секреции и ядерной аккумуляции, также, по-видимому, консервативны в клетках позвоночных и беспозвоночных животных, для обеспечения секреции у насекомых также могут быть использованы лидерные сегменты, не связанные происхождением с насекомыми, такие как те, которые являются производными от генов, кодирующих α-интерферон человека (Maeda et al., 1985, Nature, 315, 592), рилизинг-фактор гастрина человека (Lebacq-Verheyden et al., 1988, Mol. Cell. Biol., 8, 3129), интерлейкин-2 человека (Smith et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 8404), интерлейкин-3 мыши (Miyajima et al., 1987, Gene, 58, 273) и глюкоцереброзидаза человека (Martin et al., 1988, ДНК, 7, 99).
Рекомбинантный полипептид или полипротеин может быть экспрессирован внутриклеточно или, если он экспрессируется с участием специальных регуляторных последовательностей, он может секретироваться. Эффективная внутриклеточная экспрессия нехимерных углеродных белков обычно требует наличия гетерологичных генов, которые в идеале включают короткую лидерную последовательность, включающую подходящие сигналы инициации трансляции, предшествующие старт-кодону ATG. Если желательно, остаток метионина с N-конца может быть отщеплен от зрелого белка путем инкубации in vitro с цианогенбромидом.
С другой стороны, рекомбинантные полипротеины или белки, которые нативно не являются секретируемыми, могут быть секретированы из клеток насекомых путем создания химерных молекул ДНК, которые бы кодировали химерный белок, включающий лидерный сегмент, который обеспечивает секрецию белка, чужеродного для насекомых. Сегмент лидерной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, который контролирует перемещение белка в эндоплазматический ретикулюм.
После встраивания последовательности ДНК и (или) гена, кодирующего экспрессионный продукт, являющийся предшественником конкретного белка, клетку-хозяина насекомого одновременно трансформируют гетерологичной ДНК вектора для переноса и геномной ДНК бакуловируса дикого типа - обычно применяются котрансфекционные методы. Промотор и последовательность терминации транскрипции данной конструкции обычно должны включать сегмент бакуловирусного генома длиной 2-5 тысяч пар нуклеотидов. Способы внесения гетерологичной ДНК по желаемому сайту в состав бакуловируса известны в данной области техники (см. Summers & Smith, цит. выше; Ju et al., 1987; Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156; Luckow & Summers, 1989). Например, встраивание может быть произведено внутрь гена, такого как ген полигедрина, для чего используется гомологичная двойная рекомбинация; также встраивание может быть осуществлено по рестрикционному ферментному сайту, искусственно созданному в пределах желательного бакуловирусного гена (Miller et al., 1989, BioEssays, 4, 91). Последовательность ДНК в случае, когда она клонируется в участок гена полигедрина экспрессирующего вектора, фланкируется с обеих сторон (5' и 3') последовательностями, характерными для гена полигедрина, и помещается ниже полигедринового промотора.
Заново сформированный бакуловирусный экспрессирующий вектор последовательно упаковывается в инфекционный рекомбинантный бакуловирус. Гомологичная рекомбинация происходит с низкой частотой (от примерно 1% до примерно 5%), следовательно, подавляющее большинство продуцируемых котрансгрануляцией вирусов представляет вирус дикого типа. Это означает, что необходим специальный подход для идентификации рекомбинантных вирусов. Преимуществом данной экспрессирующей системы является возможность визуального скрининга, позволяющего выявлять рекомбинантные вирусы. Белок полигедрин, характерный для природных вирусов, вырабатывается в очень большом количестве в ядрах инфицированных клеток на поздних этапах цикла вирусной инфекции. Накапливаемый белок полигедрин образует включенные тельца, которые также содержат встроенные в них частицы. Эти включенные тельца размером до 15 мкм обусловливают значительное преломление света: это придает им яркое свечение, которое может быть легко визуализовано в обычном световом микроскопе. В клетках, инфицированных рекомбинантным вирусом, включенные тельца отсутствуют. Для выявления рекомбинантных вирусов и вирусов дикого типа трансфекционный надосадочный слой вносят на монослойную культуру клеток насекомых с применением методик, хорошо известных специалистам в данной области техники. А именно бляшки подвергают анализу под световым микроскопом с целью выявления присутствия (как признака вируса дикого типа) или отсутствия (как признака рекомбинантного вируса) включенных телец ("Current Protocols in Microbiology", Vol. 2, eds. Ausubel et al., раздел 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers & Smith, цит. выше; Miller et al., 1989).
Рекомбинантные бакуловирусные экспрессирующие векторы были сконструированы с целью инфицирования в различные типы клеток насекомых. Например, помимо прочего, рекомбинантные бакуловирусы были сформированы для комара Aedes aegypti, совки Autographa californica, тутового шелкопряда Bombyx mori, дрозофилы Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda и совки Trichoplusia ni (патентная заявка WO 89/046699; Carbonell et al., 1985, J. Virol., 56, 153; Wright, 1986, Nature, 321, 718; Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol., 3, 2156; как обзор см. Fraser et al., 1989, In Vitro Cell. Develop. Biol., 25, 225).
Клетки и культуральные среды доступны на коммерческой основе как для прямой, так и химерной экспрессии гетерологичных полипептидов в бакуловирусной экспрессирующей системе; технология культивирования клеток в целом хорошо известна специалистам в данной области техники (см., например, Summers & Smith, цит. выше).
Модифицированные клетки насекомых затем могут быть выращены в подходящей питательной среде, которая обеспечит стабильное поддержание плазмиды, присутствующей в модифицированном насекомом-хозяине. В случае, когда экспрессирующий продукт находится под контролем индуцибельных регуляторов, организм-хозяин может быть выращен при очень высоких плотностях с индукцией экспрессии. С другой стороны, когда экспрессия является конститутивной, искомый продукт будет постоянно экспрессироваться в культуральную среду, а питательная среда при этом может непрерывно циркулировать - это позволяет выделять искомый представляющий интерес продукт и пополнять истощаемую питательную среду. Этот продукт может быть очищен с помощью таких методик, как хроматография, например ВЭЖХ, аффинная хроматография, ионобменная хроматография и т.п.; электрофорез; центрифугирование в градиенте плотности; экстракция из раствора или подобное. Если необходимо, этот продукт может быть подвергнут дополнительной очистке, чтобы обеспечить существенное удаление любых белков насекомого, которые также являются секретируемыми в культуральную среду или образуются в результате лизиса клеток насекомого, в результате чего обеспечивается получение продукта, который по сути является свободным от дебриса хозяев, например белков, липидов и полисахаридов.
С целью обеспечения экспрессии белка рекомбинантные клетки-хозяева, производные от полученных трансформантов, инкубируют в условиях, которые обеспечивают экспрессию последовательности, кодирующей рекомбинантный белок. Эти условия могут варьироваться в зависимости от выбранной клетки-хозяина. Однако такие условия легко могут быть подобраны специалистом в данной области техники на основе известных научных данных.
3. Растительные системы
В данной области техники известны многочисленные генетические экспрессионные системы, основанные на растительных клетках и цельных растениях. Примеры таких генетических экспрессионных растительных систем можно найти в патентах США №№ 5693506, 5659122 и 5608143. Дополнительные примеры генетической экспрессии в культивируемых растительных клетках описаны Ценком (Zenk, 1991, Phytochemistry, 30, 3861-3863). Описания сигнальных пептидов растительных белков можно найти, в дополнение к указанным выше источникам, в работах Vaulcombe et al., 1987, Mol. Gen. Genet., 209, 33-40; Chandler et al., 1984, Plant Mol. Biol., 3, 407-418; Rogers, 1985, J. Biol. Chem., 260, 3731-3738; Rothstein et al., 1987, Gene, 55, 353-356; Whittier et al., 1987, Nucl. Acids Res., 15, 2515-2535; Wirsel et al., 1989, Mol. Microbiol., 3, 3-14; Yu et al., 1992, Gene, 122, 247-253. Описание параметров регуляции экспрессии растительных генов с участием фитогормонов, гибберелловой кислоты и секретируемых ферментов, индуцируемых гибберелловой кислотой, можно найти в монографии R.L.Jones & J.MacMillin, 1984, "Gibberellins", In "Advanced Plant Physiology", ed. M.B. Wilkins, Pitman Publ. Ltd, London, pp. 21-52. Материалы, описывающие другие гены, регулируемые с участием метаболических механизмов: Sheen, 1990, Plant Cell, 2, 1027-1038; Maas et al., 1990, EMBO J. 9, 3447-3452; Benkel & Hickey, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1337-1339.
Обычно с использованием методологий, известных в данной области техники, желательная полинуклеотидная последовательность встраивается в состав экспрессионной кассеты, включающей генетические регуляторные элементы, сконструированные для функционирования в растениях. Экспрессионную кассету встраивали в желательный экспрессирующий вектор вместе с последовательностями, расположенными выше и ниже экспрессионной кассеты, подходящими для экспрессии в растении-хозяине. Сопутствующие последовательности могут иметь плазмидное или вирусное происхождение и обеспечивать необходимые характеристики вектору, которые обеспечат векторам способность переносить ДНК из исходного организма-хозяина, используемого для клонирования, такого как бактерия, в желательное растение-хозяин. Базовая бифункциональная («бактериально-растительная») векторная конструкция предпочтительно должна обеспечивать широкий круг хозяев, включать прокариотическую точку начала репликации, прокариотический селективный маркер и, в варианте с трансформацией бактерий Agrobacterium, последовательности Т-ДНК, что позволит осуществлять перенос генов на основе трансформации с помощью Agrobacterium. Когда идентификация гетерологичного гена затруднена, данная конструкция должна предпочтительно также включать селективный маркер, пригодный для выявления того, была ли трансформирована растительная клетка. Обзор по селективным маркерам, например, членам семейства grass, можно найти в статье Wilmink & Dons, 1993, Plant Mol. Biol. Reptr., 11(2):65-185.
Последовательности, пригодные для обеспечения интеграции гетерологичной последовательности в геном растения, также рекомендованы. Они могут включать транспозонные последовательности и подобное, которые связаны с процессами гомологичной рекомбинации, равно как и Ti-последовательности, которые обусловливают случайное встраивание гетерологичной экспрессионной кассеты в растительный геном. Подходящие прокариотические селективные маркеры включают признаки резистентности к антибиотикам, таким как ампициллин или тетрациклин. Другие последовательности ДНК, кодирующие дополнительные функции, также могут входить в состав вектора, будучи известными в данной области техники.
Молекулы нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть включены в состав экспрессионной кассеты, предназначенной для обеспечения экспрессии представляющего интерес белка (белков). Обычно используется единственная экспрессионная кассета, хотя возможно использование двух или большего числа таких кассет. Рекомбинантная экспрессионная кассета должна включать в дополнение к последовательности, кодирующей гетерологичный белок, следующие элементы: промоторный сегмент, 5'-нетранслируемые последовательности растительного генома, инициирующий кодон, присутствие или отсутствие которого зависит от того, имеется ли он в составе анализируемого структурного гена, и сайты терминации транскрипции и трансляции. Уникальные сайты узнавания рестриктазами по 5'- и 3'-концам данной кассеты обеспечивают удобное встраивание в состав предварительно действующего вектора.
Гетерологичная кодирующая последовательность может быть связана с любым белком по настоящему изобретению. Последовательность, кодирующая интересующий белок, будет кодировать сигнальный сегмент, который обеспечит процессинг и перемещение белка, если это необходимо, и, как правило, должна быть лишена любой последовательности, которая могла бы обусловливать связывание желательного белка по настоящему изобретению с мембраной. При том, что в большинстве случаев участок инициации транскрипции будет предназначен для гена, который экспрессируется и транслоцируется в процессе прорастания, путем использования сигнального сегмента, обеспечивающего перемещение, можно также обеспечить перемещение желательного белка. В этом случае представляющий интерес белок (белки) будет перенесен из клеток, в которых он был экспрессирован, следовательно, он может быть эффективно собран. Обычно секреция в семенах обеспечивается из алейроновой области или щиткового эпителия в эндосперм семени. Хотя нет конкретной необходимости в секреции белка из клеток, в которых он вырабатывался, такой подход облегчает выделение и очистку рекомбинантного белка.
Поскольку окончательная экспрессия желательного генного продукта должна происходить в эукариотической клетке, желательным является определить, не содержит ли любой из участков клонированного гена последовательности, которые могли быть утрачены в виде интронов под действием механизма сплайсинга, свойственного организму-хозяину. Если они есть, то с применением метода направленного (сайт-специфичного) мутагенеза такой «интронный» участок может быть изменен таким образом, чтобы исключить утрату части генетического материала из-за наличия ложноинтронных сигналов (Reed & Maniatis, 1985, Cell, 41, 95-105).
Вектор может быть микроинъецирован в клетки растений с использованием микропипеток, что обеспечит механический перенос рекомбинантной ДНК (Crossway, 1985, Mol. Gen. Genet., 202, 179-185). Генетический материал может быть также перенесен в растительные клетки с использованием полиэтиленгликоля (Krens et al., 1982, Nature, 296, 72-74). Другим способом внесения сегментов нуклеиновых кислот является высокоскоростное баллистическое внесение мелких частиц («снарядов»), внутри которых или на поверхности которых находится нуклеиновая кислота (Klein et al., 1987, Nature, 327, 70-73; Knudsen & Muller, 1991, Planta, 185, 330-336 - в этих работах описывается применение метода бомбардировки частицами эндосперма ячменя с целью получения трансгенных растений ячменя). Еще одним способом внесения может быть слияние протопластов с другими компонентами, такими как мини-клетки, клетки, лизосомы или иные способные участвовать в слиянии с протопластами тельца, имеющие липидную поверхность (Fraley et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 1859-1863).
Вектор также может быть внесен в растительные клетки с применением электропорации (Fromm et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 5824). В этой методике протопласты растений подвергают электропорации в присутствии плазмид, включающих генную конструкцию. Электрические импульсы, характеризующиеся высоким значением напряженности электрического поля, обратимо «продырявливают» биологические мембраны, обеспечивая тем самым проникновение плазмид внутрь. Электропорированные растительные протопласты восстанавливают свою клеточную стенку, делятся и образуют каллюсы.
Все растения, из которых могут быть выделены протопласты с последующим культивированием и получением цельных регенерированных растений, могут быть трансформированы в соответствии с настоящим изобретением таким образом, чтобы были получены цельные растения, несущие перенесенный ген. Известно, что практически все растения могут быть регенерированы из культивируемых клеток или тканей, включая, но тем самым не ограничиваясь, все основные виды сахарного тростника, сахарной свеклы, хлопчатника, фруктовых и других деревьев, бобовых растений и овощных культур. Некоторыми подходящими растениями, например, являются виды родов Fragaria (земляника), Lotus (лядвенец), Medicago (люцерна), Onobrychis (эспарцет), Trifolium (клевер), Trigonella (пажитник), Vigna (вигна), Citrus (цитрусы), Linum (лен), Geranium (герань), Manihot (маниок), Daucus (морковь), Arabidopsis (резуховидка), Brassica (капуста, брюква, репа), Raphanus (редька), Sinapis (горчица), Atropa (красавка-беладонна), Capsicum (овощной перец), Datura (дурман), Hyoscyamus (белена), Lycopersion (помидор), Nicotiana (табак), Solanum (паслен), Petunia (петуния), Digitalis (росичка), Majorana (майоран), Cichorium (цикорий), Helianthus (подсолнечник), Lactuca (латук), Bromus (костер), Asparagus (спаржа), Antirrhinum (львиный зев), Hererocallis, Nemesia, Pelargonium (пеларгония), Panicum (просо), Pennisetum (американское просо), Ranunculus (лютик), Senecio (крестовник), Salpiglossis, Cucumis (огурец, дыня), Browaalia, Glycine (соя), Lolium (плевел), Zea (кукуруза), Triticum (пшеница), Sorghum (сорго) и Datura.
Способы регенерации варьируются в зависимости от вида растения, но в целом всегда вначале получают суспензию трансформированных протопластов, несущих копии гетерологичного гена. Потом формируют каллюсные ткани, в которых побеги могут быть индуцированы с последующим формированием корешков. С другой стороны, в суспензии протопластов может быть индуцировано образование эмбрионов. Эти эмбрионы прорастают, как и обычные эмбрионы, образуя растения. Культуральные среды обычно должны содержать различные аминокислоты и гормоны, такие как ауксин и цитокины. Также предпочтительным является добавление глутаминовой кислоты и пролина в культуральную среду, особенно для таких видов, как кукуруза и люцерна. Побеги и корешки в норме развиваются одновременно. Эффективность регенерации будет зависеть от культуральной среды, генотипа растения и от параметров конкретной культуры. Если эти три переменных находятся под контролем, то регенерация оказывается воспроизводимой и повторяемой.
В некоторых системах культивирования растительных клеток желательный белок по настоящему изобретению может выделяться сам или, с другой стороны, такой белок может быть экстрагирован из цельного растения. В тех случаях, когда желательный белок по настоящему изобретению секретируется в культуральную среду, он может быть собран. С другой стороны, эмбрионы и «полусемена» с удаленной эмбриональной частью или другие растительные ткани могут быть механически измельчены с целью выделения секретируемого белка из клеток и тканей. Полученная смесь может быть суспендирована в буферном растворе с целью повторного выделения растворимых белков. Стандартные методы выделения и очистки белков могут быть использованы для очистки рекомбинантного белка. Параметры времени, температуры, рН, содержания кислорода и объема могут быть доведены с помощью рутинных процедур с целью оптимизации экспрессии и выделения гетерологичного белка.
4. Бактериальные системы
Методики экспрессии в бактериальных клетках хорошо известны. Бактериальным промотором является любая последовательность ДНК, способная обеспечивать связывание бактериальной РНК-полимеразы и инициирование транскрипции нижерасположенной (в направлении 3') кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. В промоторе должен присутствовать сайт инициации транскрипции, который обычно располагают проксимально по отношению к 5'-концу кодирующей последовательности. Этот сайт инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы и собственно сайт инициации транскрипции. Бактериальный промотор также может включать второй домен, называемый «оператором», который может перекрываться с соседним сайтом связывания РНК-полимеразы, с которого начинается синтез РНК. Оператор обеспечивает негативно регулируемую (т.е. индуцибельную) транскрипцию: ген-репрессорный белок может связываться на этом операторе, тем самым подавляя транскрипцию конкретного гена. Конститутивная экспрессия может иметь место в отсутствие негативных регуляторных элементов, таких как оператор. Кроме того, позитивная регуляция может обеспечиваться последовательностью связывания ген-активирующего белка, который: если присутствует, находится проксимально (с 5'-конца) по отношению к сайту связывания РНК-полимеразы. Примером ген-активирующего белка является катаболический активатор (САР), который является помощником инициации транскрипции lac-оперона в геноме кишечной палочки Escherichia coli (E.coli) (Raibaud et al., 1984, Annu. Rev. Genet., 18, 173). Таким образом, регуляция экспрессии может быть негативной или позитивной, тем самым усиливая или ослабляя транскрипцию.
Последовательности, кодирующие ферменты метаболического пути, представляют конкретно применимые промоторные последовательности. Примерами являются промоторные последовательности, производные от генов, кодирующих ферменты, участвующие в метаболизме сахаров, таких как галактоза, лактоза (lac) (Chang et al., 1977, Nature 198, 1056) и мальтоза. Дополнительными примерами являются промоторные последовательности, производные от биосинтетических ферментов, таких как ферменты биосинтеза триптофана (trp) (Goeddel et al., 1980, Nucl. Acids Res., 8, 4057; Yelverton et al., 1981, Nucl. Acids Res., 9, 731; патент США № 4738921; европейские патентные заявки ЕР А-0036776 и ЕР А-0121775). Промоторная система g-лаотамазы (bla) (Weissmann, 1981, "The cloning of interferon and other mistakes", In "Interferon 3", ed. I.Gresser) и промоторные системы PL λ-бактериофага (Shimatake et al., 1981, Nature, 292, 128) и фага Т5 (патент США № 4689406) также могут использоваться в качестве промоторных последовательностей.
Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также могут функционировать в качестве бактериальных промоторов. Например, последовательности активации транскрипции одного из бактериальных или бактериофаговых промоторов могут быть соединены с оперонными последовательностями другого бактериального или бактериофагового промотора, в результате чего образуется синтетический гибридный промотор (патент США № 4551433). Например, промотор tac является гибридным промотором trp-lac, состоящим из последовательностей промотора trp и промотора lac, которые находятся под контролем репрессора lac (Amann et al., 1983, Gene, 25, 167; de Boer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 21).
Далее, бактериальный промотор может включать естественно встречающиеся промоторы небактериального происхождения, которые обладают способностью связывать бактериальную РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Естественно встречающийся промотор небактериального происхождения также может быть соединен с совместимой РНК-полимеразой с обеспечением высокого уровня экспрессии некоторых генов в прокариотических клетках. Система «РНК-полимераза/промотор» бактериофага Т7 является примером объединенной промоторной системы (Studier et al., 1986, J. Mol. Biol., 189, 113; Tabor et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 1074). Кроме того, гибридный промотор также может состоять из бактериофагового промотора и операторного сегмента E.coli (ЕРО-А-0267851).
В дополнение к функциональной промоторной последовательности сайт эффективного связывания на рибосоме также применим для обеспечения экспрессии чужеродных генов в прокариотических клетках. У E.coli сайт связывания на рибосоме называют последовательностью Шайна-Дальгарно (SD): она включает старт-кодон ATG и последовательность из 3-9 нуклеотидов, расположенную в 3-11 нуклеотидах выше от старт-кодона (Shine et al., 1975, Nature, 254, 34). Последовательность SD, как считается, способствует связыванию мРНК на рибосоме за счет спаривания оснований в составе последовательности SD и 3'-конце 16S-pPHK E.coli (Steitz et al., 1979, "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA", In "Biological Regulation and Development: Gene Expression", ed. R.F.Goldberger). Для экспрессии эукариотических генов и прокариотических генов используется «слабый» сайт связывания на рибосоме (Sambrook et al., 1989, "Expression of cloned genes in Escherichia coli", In "Molecular Cloning: A Laboratory Manual").
Молекула ДНК может быть экспрессирована внутриклеточно. Промоторная последовательность может быть напрямую присоединена к этой молекуле ДНК: в этом случае первая аминокислота с N-конца всегда должна быть метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если желательно, метионин с N-конца может быть отщеплен от белка путем инкубации in vitro с цианогенбромидом или путем инкубации in vivo или in vitro с бактериальным ферментом - N-терминальной метионинпептидазой (европейская патентная заявка ЕРО-А-0219237).
Химерные белки являются альтернативным способом контроля экспрессии. Обычно последовательность ДНК, кодирующая N-концевой участок эндогенного бактериального белка или другого стабильного белка, сливают с 5'-концом гетерологичных кодирующих последовательностей. В результате экспрессии такая конструкция приводит к образованию химеры (гибрида) двух аминокислотных последовательностей. Например, клеточный ген бактериофага λ может быть соединен по своему 5'-концу с чужеродным геном с последующей экспрессией в бактериях. Получаемый в результате химерный белок предпочтительно сохраняет в своем составе сайт для процессинга с участием фермента (фактор Ха), в результате чего происходит отщепление фагового белка от продукта чужеродного гена (Nagai et al., 1984, Nature, 309, 810). Химерные белки также могут быть сформированы с использованием последовательностей генов lacZ (Jia et al., 1987, Gene, 60, 197), trpE (Allen et al., 1987, J. Biotechnol., 5, 93; Makoff et al., 1989, J. Gen. Microbiol., 135, 11) и Chey (европейская патентная заявка EP-A-0324647). Последовательность ДНК в районе соединения двух аминокислотных последовательностей может кодировать сайт расщепления, а может и не кодировать его. Другим примером является химерный белок убихитин. Такой химерный белок формируется таким образом, что в пределах собственно убихитинового сегмента предпочтительно сохранялся сайт-мишень для фермента процессинга (например, специфичной по процессингу убихитина протеазы), необходимый для отщепления убихитина от чужеродного белка. С применением такого подхода могут быть выделены нативные чужеродные белки (Miller et al., 1989, Bio/Technol., 7, 698).
С другой стороны, чужеродные белки также могут быть секретированы клетками вследствие создания химерных молекул ДНК, которые бы кодировали химерный белок, включающий пептидный фрагмент сигнальной последовательности, обеспечивающий секрецию чужеродного белка бактериальными клетками (патент США № 4336336). Фрагмент сигнальной последовательности обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, которые обеспечивают секрецию белка из клетки. Этот белок секретируется либо в культуральную среду (в вариантах с грам-положительными бактериями), либо в периплазматическое пространство, расположенное между внутренней и внешней мембранами клетки (грамотрицательной бактерии). Предпочтительно присутствуют сайты процессинга, которые могут быть расщеплены либо in vivo, либо in vitro на участке между фрагментом сигнального пептида и продукта чужеродного гена.
ДНК, кодирующая подходящие сигнальные последовательности, может являться производной от генов, кодирующих секретируемые бактериальные белки, таких как ген белка внешней мембраны E.coli (ompA) (Masui et al., 1983, In "Experimental Manipulation of Gene Expression"; Ghrayeb et al., 1984, EMBO J., 3, 2437) и сигнальная последовательность гена phoA, кодирующего щелочную фосфатазу E.coli (Oka et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7212). В качестве дополнительного примера можно привести сигнальную последовательность гена α-амилазы различных штаммов палочек рода Bacillus, которая может быть использована для обеспечения секреции гетерологичных белков из клеток сенной палочки B.subtilis (Palva et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582; европейская патентная заявка ЕР-А-0244042).
Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые бактериями, представлены регуляторными сегментами, находящимися с 3'-конца от стоп-кодона: соответственно, наряду с промотором они фланкируют конкретную кодирующую последовательность. Эти последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая затем может быть транслирована в полипептид, кодируемый этим участком ДНК. Последовательности терминации транскрипции нередко включают последовательности ДНК, состоящие примерно из 50 нуклеотидов, способных образовывать выпетленные структуры, которые и обеспечивают терминацию транскрипции. Примерами являются последовательности терминации транскрипции, производные от генов, имеющих сильные промоторы, таких как ген trp E.coli, равно как и другие биосинтетические гены.
Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, сигнальную последовательность (при желании), рассматриваемая кодирующая последовательность и последовательность терминации транскрипции встраиваются вместе в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в составе репликона, такого как внехромосомный элемент (например, плазмида), способного стабильно сохраняться в организме-хозяине, таком как бактерия. Такой репликон должен включать репликационную систему, которая бы обеспечивала ему способность сохраняться в прокариотическом организме, предназначенном либо для экспрессии, либо для клонирования и амплификации. Кроме того, репликон может быть либо высококопийной, либо низкокопийной плазмидой. Высококопийная плазмида должна в принципе характеризоваться числом копий от примерно 5 до примерно 200, а обычно от примерно 10 до примерно 150. Организм-хозяин, несущий высококопийную плазмиду, предпочтительно должен нести по крайней мере примерно 10 плазмид, а более предпочтительно, по крайней мере примерно 20 плазмид. И высококопийные, и низкокопийные плазмиды могут быть отобраны на основе того влияния, которое оказывает вектор и чужеродный белок на организм-хозяин.
С другой стороны, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в состав бактериального генома с использованием интеграционного вектора. Интеграционные векторы обычно включают в своем составе по крайней мере одну последовательность, являющуюся гомологичной участку бактериальной хромосомы: это обеспечивает вектору возможность интегрироваться. Как считается, интеграция обусловливается рекомбинацией между гомологичными ДНК в составе вектора и бактериальной хромосомы. Например, интеграционные векторы, сконструированные на основе ДНК различных штаммов Bacillus, интегрируются в хромосому Bacillus (европейская патентная заявка ЕР-А-0127328). Интеграционные векторы также могут включать фаговые или транспозонные последовательности.
Обычно внехромосомные и интеграционные экспрессирующие конструкции могут включать в себя селективные маркеры, обеспечивающие отбор трансформированных бактериальных штаммов. Селективные маркеры могут быть экспрессированы в бактериальном организме-хозяине и могут включать гены, которые делают бактерии резистентными к лекарственным препаратам, таким как ампициллин, хлорамфеникол, эритромицин, канамицин (неомицин) и тетрациклин (Davies et al., 1978, Annu. Rev. Microbiol., 32, 469). Селективные маркеры также могут включать биосинтетические гены, такие как гены ферментов, вовлеченных в биосинтез гистидина, триптофана и лейцина.
С другой стороны, некоторые из описанных выше компонентов могут быть включены вместе друг с другом в трансформационные векторы. Трансформационные векторы обычно включают селективный маркер, который либо сохраняется в репликоне, либо преобразуется в интегрирующий вектор в соответствии с описанным выше.
Экспрессирующие и трансформирующие векторы (либо внехромосомные или интегрирующие векторы) были сконструированы с целью трансформации многих видов бактерий. Например, экспрессирующие векторы были созданы, помимо прочего, для следующих видов бактерий: сенная палочка Bacillus subtilis (Palva et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582; европейские патентные заявки ЕР-А-0036259 и EP-A-0063953; международная патентная заявка WO 84/04541), кишечная палочка Escherichia coli (Shimatake et al., 1981, Nature, 292, 128; Amann et al., 1985, Gene, 40, 183; Studier et al., 1986, J. Mol. Biol., 189, 113; европейские патентные заявки ЕР-А-0036776, ЕР-А-0136829 и ЕР-А-0136907), стрептококки Streptococcus cremoris (Powell et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 655), Streptococcus lividans (Powell et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 655), стрептомицет Streptomyces lividans (патент США № 4745056).
Способы внесения экзогенной ДНК в бактериальные организмы-хозяева хорошо известны в науке и обычно включают трансформацию бактерий, обработанных хлористым кальцием или другими агентами, такими как двухвалентные катионы и диметилсульфоксид. ДНК также может быть внесена в бактериальные клетки методом электропорации. Трансформационные процедуры обычно варьируются в зависимости от вида бактерии, который предстоит трансформировать: см., например, Masson et al., 1989, FEMS Microbiol. Lett., 60, 273; Palva et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 5582; европейские патентные заявки ЕР-А-0036259 и ЕР-А-0063953; международная патентная заявка WO 84/04541 (бактерии рода Bacillus), Miller et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 856; Wang et al., 1990, J. Bacteriol., 172, 949 (бактерии рода Campylobacter), Cohen et al., 1973, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110; Dower et al., 1988, Nucl. Acids Res., 16, 6127; Kushner, 1978, "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids", In "Genetic Engineering: Proc. Intern. Symp. on Genet. Engineering", eds. H.W.Boyer & S.Nicosia; Mandel et al., 1970, J. Mol. Biol., 53. 159; Taketo, 1988, Biochim. Biophys. Acta, 949, 318 (Escherichia), Chassy et al., 1987, FEMS Microbiol. Lett., 44, 173 (молочные бактерии рода Lactobacillus), Fiedler et al., 1988, Anal. Biochem., 170, 38 (псевдомонады рода Pseudomonas), Augustin et al., 1990, FEMS Microbiol. Lett., 66, 203 (бактерии рода Staphylococcus), Barany et al., 1980, J. Bacteriol., 144, 698; Harlander, 1987, "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation", In "Streptococcal Genetics", eds. J.Ferretti & R.Curtiss III; Perry et al., 1981, Infect. Immunol., 32, 1295; Powell et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol., 54, 655; Somkuti et al., 1987, Proc. 4th European Congr. Biotechnol., 1, 412 (бактерии рода Streptococcus).
5. Экспрессия в дрожжах
Дрожжевые экспрессирующие системы также хорошо известны специалистам в данной области техники. Дрожжевым промотором является любая последовательность ДНК, способная связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию нижерасположенной (по 3'-концу) кодирующей последовательности (например, структурного гена) с образованием мРНК. Промотор должен включать участок инициации транскрипции, который обычно помещают проксимально по отношению к 5'-концу кодирующей последовательности. Этот участок инициации транскрипции обычно включает сайт связывания РНК-полимеразы (т.е. «бокс ТАТА») и собственно сайт инициации транскрипции. Дрожжевой промотор также может включать второй домен, называемый «верхней активаторной последовательностью» (UAS), которая, когда присутствует, обычно располагается дистально по отношению к структурному гену. Сегмент UAS обеспечивает регулируемую (индуцибельную) экспрессию. Конститутивная экспрессия имеет место в случае отсутствия сегмента UAS. Регулируемая экспрессия может быть либо позитивной, либо негативной, что тем самым либо усиливает, либо ослабляет транскрипцию.
Дрожжи - это организм-ферментер, характеризующийся активным метаболизмом: поэтому последовательности, кодирующие ферменты метаболических путей, представляют собой особенно перспективные промоторные последовательности. Примерами являются алкогольдегидрогеназа (ADH) (европейская патентная заявка ЕР-А-0284044), енолаза, глюкокиназа, глюкозо-6-фосфатизомераза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (GAP или GAPDH), гексокиназа, фосфофруктокиназа, 3-фосфоглицератмутаза и пируваткиназа (РуК) (европейская патентная заявка ЕРО-А-0329203). Дрожжевой ген РНО5, кодирующий кислую фосфатазу, также представляет применимые промоторные последовательности (Myanohara et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1).
Кроме того, синтетические промоторы, которые не встречаются в природе, также могут функционировать в качестве дрожжевых промоторов. Например, последовательности UAS одного дрожжевого промотора могут быть соединены с участком активации транскрипции другого дрожжевого промотора, в результате чего получают синтетический гибридный промотор. Примерами таких гибридных промоторов являются регуляторная последовательность гена ADH, соединенная с участком активации транскрипции гена GAP (патенты США №№ 4876197 и 4880734). Другие примеры гибридных промоторов включают промоторы, которые включают регуляторные последовательности из состава генов ADH2, GAL4, GAL10 или РНО5, сочетанные с участками активации транскрипции генов, кодирующих гликолитические ферменты, такие как гены GAP или РуК (европейская патентная заявка ЕР-А-0164556). Далее, дрожжевой промотор может включать естественно встречающиеся промоторы недрожжевого происхождения, характеризующиеся способностью связывать дрожжевую РНК-полимеразу и инициировать транскрипцию. Примерами таких промоторов являются, помимо прочего, элементы, описанные у Cohen et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1078; Henikoff et al., 1981, Nature, 283, 835; Hollenberg et al., 1981, Curr. Topics Microbiol. Immunol., 96, 119; Hollenberg et al., 1979, "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", In "Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance", eds. K.N.Timmis & A.Puhler; Mercerau-Puigalon et al., 1980, Gene, 11, 163; Panthier et al., 1980, Curr. Genet., 2, 109.
Молекула ДНК может быть экспрессирована внутри клеток дрожжей. Промоторная последовательность может быть напрямую присоединена к молекуле ДНК: в этом случае первая аминокислота с N-конца рекомбинантного белка всегда должна быть метионином, который кодируется старт-кодоном ATG. Если желательно, метионин с N-конца белка может быть отщеплен in vitro путем инкубации с цианогенбромидом.
Химерные белки представляют альтернативный подход для дрожжевых экспрессирующих систем в той же степени, что и для экспрессионных систем клеток млекопитающих, бакуловирусов и бактерий. Обычно последовательность ДНК, кодирующую N-концевую часть эндогенного дрожжевого белка или другого стабильного белка, сливают с 5'-концом гетерологичной кодирующей последовательности. После экспрессии такая конструкция будет обусловливать образование химеры (гибрида) двух аминокислотных последовательностей. Например, гены дрожжевой или человеческой супероксиддисмутазы (SOD) могут быть соединены с 5'-концом чужеродного гена с последующей экспрессией в дрожжах. Последовательность ДНК в области соединения двух аминокислотных последовательностей может кодировать расщепляемый сайт, а может и не кодировать его: см., например, европейскую патентную заявку ЕР-А-0196056. Другим примером является химерный убихитиновый белок. Такой химерный белок конструируют таким образом, чтобы предпочтительно убихитиновый сегмент сохранял сайт-мишень для фермента процессинга (например, специфичной для процессинга убихитина протеазы), обусловливающего отщепление убихитина от чужеродного белка. С применением данного метода, следовательно, могут быть выделены нативные чужеродные белки (см., например, международную патентную заявку WO 88/024066).
С другой стороны, чужеродные белки могут также быть секретированы из клетки в питательную среду путем создания химерных молекул ДНК, которые бы кодировали химерный белок, включающий последовательность лидерного сегмента, который обеспечивает секрецию чужеродного белка из дрожжевой клетки. Предпочтительно должны присутствовать кодируемые сайты процессинга, расположенные между лидерным сегментом и чужеродным геном, которые бы могли быть расщеплены in vivo или in vitro. Лидерный сегмент обычно кодирует сигнальный пептид, состоящий из гидрофобных аминокислот, который обеспечивает секрецию данного белка из клетки.
ДНК, кодирующие подходящие сигнальные последовательности, могут быть производными от генов, кодирующих секретируемые дрожжевые белки, таких как ген инвертазы дрожжей (европейская патентная заявка ЕР-А-0012873; JPO 62096086) и ген А-фактора (патент США № 4588684). С другой стороны, существуют лидерные сегменты недрожжевого происхождения, такие как лидерный сегмент гена интерферона, которые также обеспечивают секрецию в дрожжах (европейская патентная заявка ЕР-А-0060057).
Предпочтительным классом обеспечивающих секрецию лидерных сегментов являются те лидеры, которые используют фрагменты гена α-фактора, в составе которого имеется и «пре» сигнальная последовательность и «про» сегмент. Такими вариантами фрагментов α-фактора, которые могут быть использованы, являются полноразмерный препролидер α-фактора (примерно 83 аминокислотных остатка), равно как и укороченные варианты сигнальных сегментов α-фактора (обычно от примерно 25 до примерно 50 аминокислотных остатков) (патенты США №№ 4546083 и 4870008; европейская патентная заявка ЕР-А-0324274). Дополнительными лидерными сегментами, основывающимися на лидере α-фактора, которые обеспечивают секрецию, являются гибридные α-факторные лидерные сегменты, собранные таким образом, что препоследовательности происходят от первого дрожжевого α-фактора, а пропоследовательности - от второго дрожжевого α-фактора (см., например, международную патентную заявку WO 89/02463).
Обычно последовательности терминации транскрипции, распознаваемые дрожжами, представлены регуляторными сегментами, расположенными с 3'-конца по отношению к трансляционному стоп-кодону, т.е. они наряду с промотором фланкируют кодирующую последовательность. Эти последовательности обеспечивают транскрипцию мРНК, которая может быть затем транслирована в полипептид, кодируемый данной ДНК. Примерами последовательности терминации транскрипции и других распознаваемых дрожжами терминирующих последовательностей являются те элементы, которые входят в состав генов, кодирующих гликолитические ферменты.
Обычно описанные выше компоненты, включая промотор, лидер (если он желателен), интересующую кодирующую последовательность и последовательность терминации транскрипции, вносят друг с другом в экспрессирующие конструкции. Экспрессирующие конструкции часто поддерживаются в виде репликона, такого как внехромосомный элемент (например, плазмида), способный стабильно существовать в организме-хозяине, таком как дрожжи или бактерия. Такой репликон может включать две репликационные системы, это обеспечит поддержание, например, в дрожжах с целью экспрессии и в прокариотическом хозяине с целью клонирования и амплификации. Примерами таких бифункциональных бактериально-дрожжевых векторов являются YEp24 (Botstein et al., 1979, Gene 8, 17-24), pCl/1 (Brake et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 4642-4646) и YRp17 (Stinchcomb et al., 1982, J. Mol. Biol., 158, 157). Кроме того, репликон может являться либо высококопийной, либо низкокопийной плазмидой. Высококопийная плазмида в принципе будет характеризоваться наличием числа копий от примерно 5 до примерно 200, а обычно от примерно 10 до примерно 150. Клетка-хозяин, несущая высококопийную плазмиду, предпочтительно должна нести по крайней мере примерно 10 и более предпочтительно по крайней мере примерно 20 копий. Присутствие высококопийного или низкокопийного вектора может быть отселектировано исходя из того влияния, которое оказывает такой вектор и чужеродный белок на организм-хозяин (см., например, Brake et al., цит. выше).
С другой стороны, экспрессирующие конструкции могут быть интегрированы в состав дрожжевого генома с использованием интегрирующего вектора. Обычно интегрирующие векторы включают по крайней мере одну последовательность, гомологичную участку дрожжевой хромосомы, который и обеспечивает интеграцию этого вектора, а предпочтительно включает две гомологичные последовательности, фланкирующие экспрессирующую конструкцию. Предположительно интеграция является следствием рекомбинации между гомологичными ДНК вектора и дрожжевой хромосомы (Orr-Weaver et al., 1983, Meth. Enzymol., 101, 228-245). Интегрирующий вектор может быть направлен в конкретный локус дрожжей путем выбора соответствующей гомологичной последовательности, включаемой в состав этого вектора (см. Orr-Weaver et al., цит. выше). Одна или большее число экспрессирующих конструкций могут интегрироваться так, что, возможно, обусловят снижение уровня выработки рекомбинантного белка (Rine et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 6750). Хромосомные последовательности, включаемые в состав данного вектора, могут находиться в нем либо в виде единственного сегмента вектора, который обусловливает интеграцию всего вектора, или в виде двух сегментов, которые гомологичны соседним сегментам хромосомы и фланкируют экспрессирующую конструкцию вектора, приводя к стабильной интеграции только экспрессирующей конструкции.
Обычно внехромосомные и интегрирующие экспрессирующие конструкции могут нести селективные маркеры, обеспечивающие отбор дрожжевых штаммов, которые были трансформированы. Селективными маркерами могут являться биосинтетические гены, которые будут экспрессироваться в клетках-хозяевах дрожжей, такие как ADE2, HIS4, LEU2, TRP1, а также гены резистентности ALG7 и G418, которые обеспечивают резистентность клеток дрожжей, соответственно, к туникамицину и G418. Кроме того, подходящий селективный маркер также может придавать дрожжам способность расти в присутствии токсичных веществ, таких как ионы металлов. Например, присутствие гена CUP1 обеспечивает дрожжам рост в присутствии ионов меди (Butt et al., 1987, Microbiol. Rev., 51, 351).
С другой стороны, некоторые из описанных выше компонентов могут быть включены вместе друг с другом в состав трансформирующих векторов. Трансформирующие векторы обычно включают селективный маркер, который либо поддерживается в виде репликона, либо преобразуется в интегрирующий вектор в соответствии с описанным выше.
Экспрессирующие и трансформирующие векторы (в виде либо внехромосомных репликонов, либо интегрирующих векторов) были сконструированы для трансформации многих видов дрожжей. Например, экспрессирующие векторы были сконструированы, помимо прочего, для следующих видов дрожжей: Candida albicans (Kurtz et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 142), Candida maltosa (Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141), Hansenula polymorpha (Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol., 132, 3459; Roggenkamp et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 202, 302), Kluyveromyces fragilis (Das et al., 1984, J. Bacteriol., 158, 1165), Kluyveromyces lactis (De Louvencourt et al., 1983, J. Bacteriol., 154, 737; Van den Berg et al., 1990, Bio/Technol., 8, 135), Pichia guillerimondii (Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141), Pichia pastoris (Gregg et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 3376; патенты США №№ 4837148 и 4929555), Saccharomyces cerevisiae (Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929; Ito et al., 1983, J. Bacteriol., 153, 163), Schizosaccharomyces pombe (Beach & Nurse, 1981, Nature, 300, 706) и Yarrowia lipolytica (Davidow et al., 1985, Curr. Genet., 10, 380-471; Gaillardin et al., 1985, Curr. Genet., 10, 49).
Способы внесения экзогенной ДНК в дрожжевые клетки-хозяева хорошо известны в науке и обычно включают трансформацию либо сферопластов, либо интактных дрожжевых клеток, обработанных щелочными катионами. Процедуры трансформации обычно варьируются в зависимости от вида дрожжей, трансформация которого осуществляется: см., например, Kurtz et al., 1986, Mol. Cell. Biol., 6, 142; Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141 (Candida); Gleeson et al., 1986, J. Gen. Microbiol., 132, 3459; Roggenkamp et al., 1986, Mol. Gen. Genet., 202, 302 (Hansenula); Das et al., 1984, J. Bacteriol., 158, 1165; De Louvencourt et al., 1983, J. Bacteriol., 154, 1165; Van den Berg et al., 1990, Bio/Technol., 8, 135 (Kluyveromyces); Gregg et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5, 3376; Kunze et al., 1985, J. Basic Microbiol., 25, 141; патенты США №№ 4837148 и 4929555 (Pichia); Hinnen et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929; Ito et al., 1983, J. Bacteriol., 153, 163 (Saccharomyces); Beach & Nurse, 1981, Nature, 300, 706 (Schizosaccharomyces); Davidow et al., 1985, Curr. Genet., 10, 39; Gaillardin et al., 1985, Curr. Genet., 10, 49 (Yarrowia).
Антитела
По использованию в данном тексте термин «антитело» обозначает полипептид или группу полипептидов, включающие по крайней мере один антиген-связывающий сайт. Понятие «антиген-связывающий сайт» обозначает пространственную структуру, параметры поверхности и распределение заряда у которой комплементарны параметрам эпитопа антигена: это обеспечивает процесс связывания антитела с соответствующим антигеном. Под понятием «антитело» понимаются, например, антитела позвоночных животных, химерные антитела, гибридные антитела, гуманизованные антитела, измененные антитела, моновалентные антитела, белки Fab и монодоменные антитела.
Антитела, специфичные в отношении белков по настоящему изобретению, используются для проведения аффинной хроматографии, иммунологических тестов и выявления и идентификации белков нейссерий.
Антитела, специфичные в отношении белков по настоящему изобретению, как поликлональные, так и моноклональные, могут быть получены с применением стандартных методов. В целом, белок, во-первых, используется для иммунизации подходящего животного, предпочтительно мыши, крысы, кролика или козы. Кролики и козы являются предпочтительными объектами для получения поликлональных сывороток благодаря получаемому значительному объему сыворотки крови, а также доступности антикроличьих и антикозьих антител. Иммунизацию обычно проводят путем перемешивания или эмульгирования конкретного белка в солевом (физиологическом) растворе, предпочтительно с адъювантом, таким как полный адъювант Фройнда, с последующим инъецированием полученной смеси или эмульсии парентеральным путем (обычно путем подкожной или внутримышечной инъекции). Обычно достаточными дозами являются 50-200 мкг за одну инъекцию. Иммунизацию обычно бустируют (т.е. повторяют) через 2-6 недель путем одной или нескольких дополнительных инъекций белка в солевом растворе, предпочтительно с включением неполного адъюванта Фройнда. Также антитела могут быть получены альтернативным путем с помощью иммунизации in vitro с применением известных в данной области техники методов, которые с точки зрения целей настоящего изобретения могут быть эквивалентными методам иммунизации in vivo. Поликлональные антисыворотки получают путем отбора крови у иммунизованных животных в стеклянную или пластиковую емкость с последующей инкубацией крови при 25°С в течение 1 часа и затем инкубацией при 4°С в течение 2-18 часов. Сыворотку затем выделяют центрифугированием (например, при 1000g в течение 10 минут). У кроликов за один отбор проб может быть взято 20-50 кубиков крови.
Моноклональные антитела получают с использованием стандартного метода Колера-Мильштейна (Kohler & Milstein, 1975, Nature, 256, 495-496) или его модификаций. Обычно в соответствии с описанным выше иммунизуют мышей или крыс. Однако в отличие от отбора крови у животных с целью получения сыворотки удаляют селезенку (и необязательно несколько крупных лимфатических узлов) и растворяют до единой клетки. Если это является желательным, клетки селезенки могут быть подвергнуты скринингу (после удаления неспецифических адгезивных клеток) путем нанесения клеточной суспензии на планшет или в отдельную планшетную лунку, покрытые белком-антигеном. В-лимфоциты, экспрессирующие связанный с мембраной иммуноглобулин, специфичный в отношении тестируемого антигена, связываются на планшете таким образом, что с остатком суспензии не смываются с планшета. Затем проводят слияние полученных в результате В-лимфоцитов или же всех растворенных спленоцитов с миеломными клетками, в результате чего образуются гибридомы, которые затем культивируют в селективной среде (например, в среде HAT, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Полученные в результате гибридомы высевают в ограниченном разведении и тестируют на выработку антител, которые специфическим образом связываются с использовавшимся для иммунизации антигеном (и которые не связываются с посторонними антигенами). Отобранные гибридомы, секретирующие моноклональные антитела (mAb), затем культивируют либо in vitro (например, в ферментерах для полых волокон или стеклянных емкостей для тканевых культур), либо in vivo (в асцитной жидкости у мышей).
Если желательно, антитела (как поликлональные, так и моноклональные) могут быть помечены с применением стандартных методов. Подходящими метками являются флуорофоры, хромофоры, радиоактивные атомы (в частности, 32Р и 125I), электронно-плотные реагенты, ферменты и лиганды, для которых известны партнеры по связыванию. Ферменты обычно выявляют по их активности. Например, пероксидазу хрена обычно выявляют по ее способности превращать 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) в синий пигмент, количественно оцениваемый на спектрофотометре. Термин «специфичные партнеры по связыванию» обозначает белок, способный связывать молекулу-лиганд, проявляя при этом высокий уровень специфичности, как, например, в случае с антигеном и специфичным в отношении него моноклональным антителом. Другими примерами специфичных партнеров по связыванию являются биотин и авидин (или стрептавидин), иммуноглобулин-G и А-белок, а также многочисленные пары рецепторов и их лигандов, известных в данной области техники. Должно быть понятно, что приведенное выше описание не претендует на классификацию различных маркеров с разделением их на какие-либо классы, поскольку одна и та же метка может быть использована в различных режимах. Например, изотоп 125I может служить в качестве радиоактивной метки или в качестве электронно-плотного агента. Пероксидаза хрена может являться или ферментом, или антигеном для моноклонального антитела. Кроме того, можно для достижения желаемого эффекта сочетать различные метки. Например, mAb и авидин в одинаковой степени нуждаются в мечении в связи с настоящим изобретением, следовательно, можно пометить mAb биотином и выявлять его присутствие с использованием авидина, помеченного, в свою очередь, изотопом 125I, или с помощью антибиотинового моноклонального антитела, помеченного пероксидазой хрена. Другие варианты и возможности будут очевидны специалистам в данной области техники и в масштабе настоящего изобретения рассматриваются как эквивалентные.
Фармацевтические композиции
Фармацевтические композиции могут содержать полипептиды, антитела или нуклеиновые кислоты по настоящему изобретению. Эти фармацевтические композиции должны содержать терапевтически эффективное количество полипептидов, антител или полинуклеотидов, заявленных настоящим изобретением.
Термин «терапевтически эффективное количество» по использованию в данном тексте обозначает количество терапевтического средства, предназначенного для лечения, облегчения симптомов или профилактики конкретного заболевания или состояния или обеспечения проявления выявляемого лечебного или профилактического эффекта. Такой эффект может быть выявлен, например, по уровням химических маркеров или антигенов. Лечебные эффекты также включают снижение физических симптомов, таких как понижение температуры тела. Точное эффективное количество в отношении конкретного индивидуума будет зависеть от веса тела и состояния здоровья, от природы и степени выраженности болезненного состояния, а также от типов лекарственных средств или их сочетаний, выбранных для лечения. Следовательно, отсутствует необходимость в изначальном точном определении эффективного количества. Однако эффективное количество для конкретной ситуации может быть определено с помощью рутинных экспериментов, такой подход находится в области компетенции лечащего врача.
Для целей настоящего изобретения эффективная доза должна находиться в пределах от примерно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг конструкции ДНК в приложении к конкретному индивидууму, которому она будет введена.
Фармацевтическая композиция также может содержать фармацевтически приемлемый носитель. Термин «фармацевтически приемлемый носитель» обозначает носитель, используемый для введения лекарственного средства, такого как антитела или полипептид, гены или другие лекарственные средства. Данный термин обозначает любой фармацевтический носитель, который сам по себе не индуцирует выработки антител, опасных для индивидуума, получающего фармацевтическую композицию, т.е. который может быть введен без обусловливания токсичности. Подходящими носителями могут быть крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры и инактивированные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники.
Могут быть использованы фармацевтически приемлемые соли, например соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, фосфаты, сульфаты и подобное, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты, бензоаты и подобное. Детальное обсуждение фармацевтически приемлемых наполнителей доступно в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publ. Co., N.J, 1991).
Фармацевтически приемлемые носители в составе терапевтических композиций могут содержать жидкости, такие как вода, солевой раствор, глицерин и этиловый спирт. Кроме того, в таких составах могут присутствовать вспомогательные наполнители, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты, буферные компоненты, используемые для регуляции рН, и подобное. Обычно терапевтические композиции приготавливают в виде составов для инъекций в виде либо растворов, либо суспензий; твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования с получением жидких наполнителей перед проведением инъекций, также могут быть приготовлены. Также в определение фармацевтически приемлемого носителя включается липосома.
Способы доставки
После приготовления фармацевтических композиций по настоящему изобретению они могут быть введены напрямую пациенту. Пациентами, лечение которых проводится, могут быть животные; в частности, лечение может проводиться в отношении человека.
Прямая доставка композиций в принципе должна осуществляться с помощью инъекций - подкожных, внутрибрюшинных, внутривенных или внутримышечных, или путем доставки во внутритканевые области. Также композиции могут быть введены через повреждение (рану). Другие пути введения включают пероральное и внутрилегочное, в виде суппозиториев и трансдермальное или чрескожное введение (см., например, международную патентную заявку WO 98/20734), с помощью игл, «генных ружей» или гипоспреев. Дозировки могут включать в себя введения однократными или многократными дозами.
Вакцины
Вакцины в соответствии с настоящим изобретением могут быть либо профилактическими (т.е. для предотвращения заражения), либо лечебными (т.е. лечить уже имеющее место заболевание).
Такие вакцины включают иммунизующий антиген (антигены), иммуноген (иммуногены), полипептид (полипептиды), белок (белки) или нуклеиновую кислоту, обычно в сочетании с «фармацевтически приемлемыми носителями», которыми являются любые носители, которые сами по себе не индуцируют выработку антител, опасных для индивидуума, получающего данную композицию. Подходящими носителями обычно являются крупные, медленно метаболизируемые макромолекулы, такие как белки, полисахариды, полимолочные кислоты, полигликолевые кислоты, полимерные аминокислоты, аминокислотные сополимеры, липидные агрегации (такие как масляные капли или липосомы) и инактивированные вирусные частицы. Такие носители хорошо известны специалистам в данной области техники. Кроме того, эти носители могут функционировать в качестве иммуностимуляторов («адъювантов»). Более того, антиген или иммуноген может быть соединен с бактериальным анатоксином, таким как дифтерийный анатоксин, столбнячный анатоксин, холерный анатоксин, анатоксин Н.pylori и других патогенов.
Предпочтительными адъювантами, предназначенными для усиления эффективности конкретной композиции, являются, тем самым не ограничиваясь, (1) соли алюминия, такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и т.п.; (2) эмульсионные водомасляные препараты (вместе с другими специфичными иммуностимуляторами, такими как мурамиловые пептиды [см. ниже], или компоненты бактериальных клеточных стенок, или без них), такие как, например, (а) препарат MF59™ (заявка WO 90/14837; глава 10 в книге "Vaccine design: the subunit and adjuvant approach", eds. Powell & Newman, Plenum Press, 1995), содержащий 5% сквалена, 0,5% Твин-80 и 0,5% Span-85 (необязательно включающие различные количества МТР-РЕ [см. ниже], хотя это и не является необходимым), приготавливаемый в виде субмикронных частиц с использованием микродиспергатора, такого как микродиспергатор модели 110 (Microfluidics, Newton, MA); (b) препарат SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% Твин-80, 5% заблокированного полимера L121 и треонил-MDP (см. ниже) либо микродиспергированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный с получением эмульсии с более крупными частицами, и (с) адъювантная система Ribi™ (RAS) (Ribi Immunochem, Hamilton, MT), содержащая 2% сквалена, 0,2% Твин-80 и один или более компонентов бактериальных клеточных стенок, представленных группой, включающей монофосфориллипид-А (MPL), димиколат-трегалозу (TDM) и препарат скелета клеточных стенок (CWS), предпочтительно MPL+CWS (Detox™); (3) сапониновые адъюванты, такие как Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA), могут быть использованы, равно как и сформированные на их основе частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы); (4) полный адъювант Фройнда (CFA) и неполный адъювант Фройнда (IFA); (5) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 и др.), интерфероны (например, γ-интерферон), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор некроза опухолей TNF и др.; и (6) другие вещества и соединения, которые действуют как иммуностимуляторы, обеспечивающие усиление эффективности данной композиции. Предпочтительными являются соли алюминия и препарат MF59™.
Как указывалось выше, мурамиловые пептиды включают, тем самым не исчерпываясь, N-ацетилмурамил-L-треонил-D-изоглутамин (треонил-MDP), N-ацетилнормурамил-L-аланил-D-изоглутамин (нор-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутаминил-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (МТР-РЕ) и т.п.
Иммуногенные композиции (например, иммунизующий антиген, или иммуноген, или полипептид, или белок, или нуклеиновая кислота вместе с фармацевтически приемлемым носителем и адъювантом) обычно должны содержать растворители, такие как вода, солевой раствор, глицерин, этанол и т.п. Кроме того, в такие наполнители могут включаться вспомогательные компоненты, такие как смачивающие или эмульгирующие компоненты, буферные компоненты, используемые для контроля рН, и подобное.
Обычно иммуногенные композиции приготавливают в виде препаратов для инъекций либо в виде жидких растворов или суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы или суспензии в жидких наполнителях непосредственно перед проведением инъекций. Также препарат может быть эмульгирован или инкапсулирован в липосомах с целью усиления адъювантного эффекта, что обсуждалось выше при рассмотрении фармацевтически приемлемых носителей.
Иммуногенные композиции, используемые в качестве вакцины, содержат иммунологически эффективное количество антигенных или иммуногенных полипептидов, равно как и любые другие из отмечавшихся выше компонентов, если в этом есть необходимость. Под «иммунологически эффективным количеством» понимается введение такого количества субъекту либо в виде единственной дозы, либо в виде серии доз, что достигается эффективное лечение или профилактика. Это количество варьируется в зависимости от здоровья и физического состояния конкретного субъекта, лечение которого проводится, таксономической группы, к которой субъект относится (например, нечеловекообразные обезьяны, приматы в целом и т.п.), способности индивидуальной иммунной системы синтезировать антитела, желательный уровень защиты, состав вакцины, оценки конкретной ситуации лечащим врачом и других связанных факторов. Предполагается, что анализируемое количество должно попадать в достаточно широкий диапазон, который может быть количественно определен с помощью рутинных способов.
Иммуногенные композиции стандартно вводятся по парентеральному пути, например, с помощью инъекций - подкожных, внутримышечных или трансдермальных («через кожу») (например, международная патентная заявка WO 98/20734). Дополнительные препараты, пригодные для других путей введения, представляют препараты для перорального и внутрилегочного введения, суппозитории и трансдермальные препараты. Дозировки могут быть составлены одинарными дозами или множественными дозами. Вакцина может быть введена вместе с другими иммунорегуляторными агентами.
В качестве альтернативы вакцине, основанной на белковом компоненте, может быть применена ДНК-вакцинация (см., например, Robinson & Torres, 1997, Seminars in Immunol., 9, 271-283; Donnelly et al., 1997, Annu. Rev. Immunol., 15, 617-648; см. ниже в данном тексте).
Приспособления для доставки генов
Генотерапевтические приспособления, предназначенные для доставки конструкций, несущих кодирующую последовательность терапевтического значения по настоящему изобретению, которая предназначена для доставки млекопитающему, в организме которого должна происходить ее экспрессия, могут быть введены либо локально, либо системно. Эти конструкции могут основываться на вирусных или невирусных векторных подходах, осуществляемых в моделях in vivo или ex vivo. Экспрессия такой кодирующей последовательности может быть индуцирована с использованием эндогенных промоторов млекопитающих или гетерологичных промоторов. Экспрессия кодирующей последовательности in vivo может носить как конститутивный, так и индуцибельный (регулируемый) характер.
В настоящее изобретение включены ген-доставочные системы, способные экспрессировать представляемые нуклеотидные последовательности. Такая ген-доставочная система предпочтительно основывается на вирусном векторе и, что более предпочтительно, на ретровирусном, аденовирусном, аденородственном (AAV) вирусном, герпесвирусном и альфавирусном векторе. Вирусный вектор также может быть астровирусом, корона-вирусом, ортомиксовирусом, паповавирусом, парамиксовирусом, парвовирусом, пикорнавирусом, поксвирусом или тогавирусом: как обзоры, см. Jolly, 1994, Cancer Gene Therapy, 1, 51-64; Kimura, 1994, Hum. Gene Therapy, 5, 845-852; Connelly, 1995, Hum. Gene Therapy, 6, 185-193; Kaplitt, 1994, Nature Genet., 6, 148-153.
Ретровирусные векторы хорошо известны в данной области техники, и заявители считают, что любой ретровирусный генотерапевтический вектор применим в связи с настоящим изобретением, включая ретровирусы типов В, С и D, ксенотропные ретровирусы (например, штаммы NZB-X1, NZB-X2 и NZB9-1 [см. O'Neill, 1985, J. Virol., 53, 160]), политропные ретровирусы, например MCF и MCF-MLV (см. Kelly, 1983, J. Virol., 45, 291), спумавирусы и лентивирусы; см. "RNA Tumor Viruses", 2d ed., Cold Spring Harbor Lab., 1985.
Фрагменты ретровирусного генотерапевтического вектора могут происходить от различных ретровирусов. Например, входящие в состав ретровирусного вектора длинные концевые повторы (LTR) могут происходить от вируса саркомы мышей, сайт связывания тРНК - от вируса саркомы Рауса, «упаковочный сигнал» - от вируса лейкоза мышей, а сайт начала репликации второй цепи - от вируса лейкоза птиц.
Эти рекомбинантные ретровирусные векторы могут быть использованы для создания компетентных по трансдукции ретровирусных векторных частиц, что достигается путем внесения их в подходящую «упаковочную клеточную линию» (см. патент США № 5591624). Ретровирусные векторы могут быть сконструированы с целью обеспечения сайт-специфичной интеграции в пределах ДНК клетки-хозяина, что достигается включением химерного интегразного фермента в состав вирусной частицы (см. международную патентную заявку WO 96/37626). Предпочтительно, чтобы такой рекомбинантный вирусный вектор являлся рекомбинантным вирусом, дефектным по репликации.
«Упаковочные клеточные линии», пригодные для использования для описанных выше ретровирусных векторов, хорошо известны в данной области техники, они могут быть легко созданы (см. международные патентные заявки WO 95/30763 и WO 92/05266) и могут быть использованы для создания продукционных клеточных линий (также называемых «векторными клеточными линиями», или «VCL»), необходимых для выработки рекомбинантных векторных частиц. Предпочтительно упаковочные клеточные линии формируют из родительских человеческих клеток (например, клеток линии НТ1080) или родительских клеточных линий норки, в которых исключена инактивация сыворотки человека.
Предпочтительными ретровирусами, пригодными для конструирования ретровирусных генотерапевтических векторов, являются вирус лейкоза птиц, вирус лейкоза крупного рогатого скота, вирус лейкоза мышей, вирус индукции фокусов в клетках норки, вирус саркомы мыши, вирус ретикулоэндотелиоза и вирус саркомы Рауса. Конкретно предпочтительными вирусами лейкоза мышей являются штаммы 4070А и 1504А (Hartley & Rowe, 1976, J. Virol., 19, 19-25), вирус саркомы Абельсона (АТСС № VR-999), вирус саркомы Фройнда (АТСС № VR-245), вирусы сарком Грэффи и Гросса (АТСС № VR-590), вирусы сарком Кирстена, Харви и Раушера (АТСС № VR-998) и вирус лейкоза мышей Молони (АТСС № VR-190). Эти ретровирусы могут быть получены из депозитариев или коллекций, таких как Американская коллекция типовых культур ("АТСС"), находящаяся в Роквилле (штат Мэриленд), или выделены из известных источников с применением стандартных методик.
Примерами известных ретровирусных генотерапевтических векторов, применимыми в объеме настоящего изобретения, являются те векторы, которые описаны в патентных заявках - британской GB 2200651, европейских ЕР 0415731, ЕР 0345242, ЕР 0334301, международных WO 89/02468, WO 89/05349, WO 89/09271, WO 90/02806, WO 90/07936, WO 94/03622, WO 93/25698, WO 93/25234, WO 93/11230, WO 93/10218, WO 91/02805, WO 91/02825, WO 95/07994, патентах США №№ 5219740, 4405712, 4861719, 4980289, 4777127, 5591624; см. также Vile, 1993, Cancer Res., 53, 3860-3864; Vile, 1993, Cancer Res., 53, 962-967; Ram, 1993, Cancer Res., 53, 83-88; Takamiya, 1992, J. Neurosci. Res., 33, 493-503; Baba, 1993, J. Neurosurgery, 79, 729-735; Mann, 1983, Cell, 33, 153; Cane, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6349; Miller, 1990, Hum. Gene Therapy, 1.
Вирусы для генотерапии, основанные на аденовирусах человека, также хорошо известны в науке и применимы в связи с настоящим изобретением: см., например, Berkner, 1988, Biotechniques, 6, 616 и Rosenfeld, 1991, Science, 252, 431, а также международные патентные заявки WO 93/07283, WO 93/06223 и WO 93/07282. Примерами известных аденовирусных генотерапевтических векторов, применимых для целей осуществления настоящего изобретения, являются те векторы, которые описаны в цитировавшихся выше источниках и в международных патентных заявках WO 94/12649, WO 93/03769, WO 93/19191, WO 94/28938, WO 95/11984, WO 95/00655, WO 95/27071, WO 95/29993, WO 95/34671, WO 96/05320, WO 94/08026, WO 94/11506, WO 93/06223, WO 94/24299, WO 95/14102, WO 95/24297, WO 95/02697, WO 94/28152, WO 94/24299, WO 95/09241, WO 95/25807, WO 95/05835, WO 94/18922 и WO 95/09654. С другой стороны, может быть применено внесение ДНК, соединенной с убитым аденовирусом, описанное у Curiel, 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154. Ген-доставочные системы по настоящему изобретению также могут основываться на аденоассоциированных вирусах (AAV). Предпочтительными примерами таких векторов в связи с их использованием по настоящему изобретению являются векторы, основанные на штамме AAV-2, заявленные Сриваставой (Srivastava) в международной патентной заявке WO 93/09239. Наиболее предпочтительные AAV-векторы включают два инвертированных концевых повтора из генома AAV, в которых нативные D-последовательности модифицированы путем нуклеотидных замен таким образом, чтобы по крайней мере пять нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, а предпочтительно по крайней мере 10 нативных нуклеотидов и вплоть до 18 нативных нуклеотидов, а наиболее предпочтительно 10 нативных нуклеотидов сохраняются, а остальные нуклеотиды из состава D-последовательности делетируют или заменяют на ненативные нуклеотиды. Нативные D-последовательности из состава инвертированных концевых повторов AAV являются 20-нуклеотидными мотивами, имеющимися в каждом терминальном концевом повторе AAV (т.е. имеется один такой мотив в каждом концевом участке), которые не участвуют в образовании HP. Ненативный заменяющий нуклеотид может быть любым нуклеотидом, помимо нуклеотида, имеющегося в составе нативной D-последовательности в том же положении. Другими применимыми примерами векторов на основе вирусов AAV являются штаммы pWP-19 и pWN-1, оба они описаны у Nahreini, 1993, Gene, 124, 257-262. Другим примером такого AAV-вектора является вектор psub201 (см. Samulski, 1987, J. Virol., 61, 3096). Другим примером AAV-вектора является вектор Double-D-ITR. Конструирование вектора Double-D-ITR описано в патенте США № 5478745. Другими векторами являются векторы, заявленные Carter в патенте США № 4797368 и Muzyczka в патенте США № 5139941, а также Chartejee в патенте США № 5474935 и Kotin в международной заявке WO 94/288157. Еще одним примером AAV-вектора, применимого в связи с настоящим изобретением, является конструкция SSV9AFABTKneo, она включает энхансер AFP и промотор гена альбумина и обеспечивает экспрессию преимущественно в печени. Ее структура и конструирование описаны у Su, 1996, Hum. Gene Therapy, 7, 463-470. Еще ряд AAV-векторов для генотерапии описан в патентах США №№ 5354678, 5173414, 5139941 и 5252479.
Векторы для генотерапии в соответствии с настоящим изобретением также включают векторы на основе герпесвируса. Наиболее приемлемыми и предпочтительными примерами являются векторы на основе простого герпесвируса, включающие последовательность, которая кодирует полипептид тимидинкиназу, такие как те векторы, которые описаны в патенте США № 5288641 и европейской заявке ЕР 0176170 (Roizman). Дополнительными примерами векторов на основе простого герпесвируса являются HFEM/ICP6-LacZ, раскрытые в WO 95/04139 (Wistar Institute), pHSVlac, описанный у Geller, 1988, Science, 241, 1667-1669 и в международных патентных завяках WO 90/09441 и WO 92/07945; вектор HSV Us3::pgC-lacZ, описанный у Fink, 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 11-19, и вектор HSV 7134, 2-RH-105 и GAL4, описанные в европейской заявке ЕР 0453242 (Breakefield), а также те, которые внесены в коллекцию АТСС под депозитарными №№ АТСС VR-977 и АТСС VR-260.
Также представляются генотерапевтические векторы на основе альфавирусов, которые могут быть использованы в связи с настоящим изобретением. Предпочтительными являются векторы на основе альфавируса Sindbis. Тогавирусы, вирус Semliki Forest (АТСС VR-67; АТСС VR-1247), вирус Миддлберга (АТСС VR-370), вирус реки Росс (АТСС VR-373; АТСС VR-1246), вирус венесуэльского энцефалита лошадей (АТСС VR-923; АТСС VR-1250; АТСС VR-1249; АТСС VR-532) и те тогавирусы, которые описаны в патентах США №№ 5091309 и 5217879 и в международной патентной заявке WO 92/10578. Более конкретно, применимы альфавирусные векторы, которые описаны в заявке на патент США № 08/405627 от 15 марта 1995 г., в международных патентных заявках WO 94/21792, WO 92/10578 и WO 95/07994 и в патентах США №№ 5217879 и 5091309. Такие альфавирусы могут быть доступны из депозитариев или коллекций, таких как коллекция АТСС, находящаяся в Роквилле (штат Мэриленд), или выделены из известных источников с применением стандартных методов. Предпочтительно должны использоваться альфавирусные векторы, характеризующиеся пониженной цитотоксичностью (см. USSN № 08/679640).
ДНК-векторные системы, такие как эукариотические экспрессионные системы, также могут быть использованы для экспрессии нуклеиновых кислот по настоящему изобретению: см. международную патентную заявку WO 95/07994, в которой имеется подробное описание эукариотических экспрессионных систем. Предпочтительно эукариотические экспрессионные системы по настоящему изобретению основываются на альфавирусных векторах, а наиболее предпочтительно - на векторе, в основе которого находится геном вируса Sindbis.
Другие вирусные векторы, пригодные для использования с точки зрения практики настоящего изобретения, включают те векторы, которые являются производными от полиовирусов, например АТСС VR-58 и тех, которые описаны у Evans, 1989, Nature, 339, 385 и Sabin, 1973, J. Biol. Standart., 1, 115; от риновирусов, например АТСС VR-1110 и тех, которые описаны у Arnold, 1990, J. Cell. Biochem., L401; от поксвирусов, таких как канареечный поксивирус и вирус коровьей оспы, например ATCC VR-111 и АТСС VR-2010 и те, которые описаны у Fisher-Hoch, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 317; Flexner, 1989, Ann. N.Y. Acad. Sci., 569, 86; Flexner, 1990, Vaccine, 8, 17; в патентах США №№ 4603112 и 4769330 и международной патентной заявке WO 89/01973; от вируса обезьян SV40, например АТСС VR-305 и те, которые описаны у Mulligan, 1979, Nature, 277, 108 и Madzak, 1992, J. Gen. Virol., 73, 1533; от вируса гриппа, например АТСС VR-797 и рекомбинантных вирусов гриппа, которые использовались в методиках обратной генетики в соответствии с описанием патента США № 5166057 и у Enami, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3802-3805; Enami & Palese, 1991, J. Virol., 65, 2711-2713 и Luytjes, 1989, Cell, 59, 110 (см. также McMichael, 1983, New England J. Med., 309, 13 и Yap, 1978, Nature, 273, 238 и Nature, 1979, 277, 108); от вируса иммунодефицита человека в соответствии с описанным в ЕР 0386882 и у Buchschacher, 1992, J. Virol., 66, 2731; от вируса кори, например АТСС VR-67 и АТСС VR-1247 и тех, которые описаны в ЕР 0440219; от ауравирусов, например АТСС VR-368; от вируса Bebaru, например АТСС VR-600 и АТСС VR-1240; от вируса Cabassou, например АТСС VR-922; от вируса Chikungunya, например АТСС VR-64 и АТСС VR-1241; от вируса Форт-Морган, например АТСС VR-924; от вируса Getah, например АТСС VR-369 и АТСС VR-1243; от кызылгачского вируса, например АТСС VR-927; от вируса Mayaro, например АТСС VR-66; от вируса Mucambo, например АТСС VR-580 и АТСС VR-1244; от вируса Ndumu, например АТСС VR-371; от вируса Pixuna, например АТСС VR-372 и АТСС VR-1245; от вируса Tonate, например АТСС VR-925; от вируса Triniti, например АТСС VR-469; от вируса Una, например АТСС VR-374; от вируса Whataroa, например АТСС VR-926; от вируса Y-62-33, например АТСС VR-375; от вируса O'Nyong (вируса восточного энцефалита), например АТСС VR-65 и АТСС VR-1242; от вируса западного энцефалита, например АТСС VR-70, АТСС VR-1251, АТСС VR-622 и АТСС VR-1252; и от коронавирусов, например АТСС VR-740 и тех, которые описаны у Hamre, 1966, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 121, 190.
Доставка композиций по настоящему изобретению в клетки не ограничивается использованием описанных выше вирусных векторов. Могут быть также применены и другие доставочные методы и среды, такие как, например, нуклеотидные экспрессирующие векторы с поликатионно упакованной ДНК, соединенные или не соединенные с убитым аденовирусом: см., например, заявку на патент США № 08/366787, поданную 30 декабря 1994 года и Curiel, 1992, Hum. Gene Therapy, 3, 147-154; ДНК, соединенная с лигандом: см., например, Wu, 1989, J. Biol. Chem., 264, 16985-16987; доставочные системы-клетки для эукариотических клеток: см., например, патентную заявку США № 08/240030, поданную 9 мая 1994 года, и патентную заявку США № 08/404796; депонирования светополимеризующегося гидрогелевого материала; применение «ручного генного ружья» в соответствии с описанным в патенте США № 5149655; использование ионизирующих излучений в соответствии с описанным в патенте США № 5206152 и международной патентной заявке WO 92/11033; применение «нейтрализации заряда нуклеотида» или слияния с клеточной мембраной. Кроме того, подобные подходы описаны у Philip, 1994, Mol. Cell. Biol., 14, 2411-2418 и у Woffendin, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 1581-1585.
Может быть применен метод доставки генов частицами: см., например, заявку на патент США № 60/023867. Вкратце, последовательность может быть встроена в состав стандартных векторов, в составе которых имеются обычные регуляторные последовательности, обеспечивающие высокоинтенсивную экспрессию; затем проводят инкубацию с синтетической ген-доставочной молекулой, такой как полимерные ДНК-связывающие катионы, например полилизин, протамин и альбумин, связанные с лигандами, маркирующими клетки, такие как асиалооросомукоид, в соответствии с описанным у Wu & Wu, 1987, J. Biol. Chem., 262, 4429-4432, или инсулин в соответствии с описанным у Hucked, 1990, Biochem. Pharmacol., 40, 253-263, или галактоза в соответствии с описанным у Plank, 1992, Bioconjugate Chem., 3, 533-539, или лактоза, или трансферрин.
Также может быть использована открытая («голая») ДНК. Примерами методов внесения открытой ДНК являются те приемы, которые описаны в международной патентной заявке WO 90/11092 и в патенте США № 5580859. Эффективность поглощения может быть повышена с использованием шариков из латекса, которые разрушаются в биологической среде. ДНК, загруженная в шарики из латекса, эффективно доставляется в клетки в результате эндоцитоза, который инициируется этими шариками. Данный способ может быть улучшен путем обработки шариков с целью повышения гидрофобности, что тем самым облегчает разрушение эндосомы и выход данной ДНК в цитоплазму.
Липосомы, которые могут быть использованы в качестве ген-доставочных систем, описаны в патенте США № 5422120, в международных патентных заявках WO 95/13796, WO 94/23697 и WO 91/14445 и ЕР 524968. В соответствии с описанным в американской патентной заявке № 60/023867 невирусным способом доставки, нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид, могут быть встроены в стандартные векторы, которые включают обычные регуляторные последовательности, обеспечивающие интенсивную экспрессию, с последующей инкубацией с синтетической ген-доставочной молекулой, такой как полимерные ДНК-связывающие катионы, например полилизин, протамин и альбумин, связанные с лигандами, маркирующими клетки, такие как асиалооросомукоид, инсулин, галактоза, лактоза или трансферрин. В других доставочных системах липосомы используются с целью инкапсуляции ДНК, несущей конкретный ген под контролем тканеспецифичных или убихитозно активных (т.е. не зависящих от типа ткани) промоторов. Другими невирусными доставочными системами являются механические доставочные системы, такие как те, которые используются в способе, описанном у Woffendin et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, (24), 11581-11585. Более того, кодирующая последовательность и продукт ее экспрессии могут быть доставлены путем депонирования светополимеризующихся гидрогелевых материалов. Могут быть использованы другие стандартные способы доставки генов, включающих кодирующие последовательности, например, которые основываются на применении «ручного генного ружья» в соответствии с описанным в патенте США № 5149655, на применении ионизирующих излучений, обеспечивающих активацию переносимых генов, в соответствии с описанным в патенте США № 5206152 и международной патентной заявке WO 92/11033.
Примерами липосомных и поликатионных ген-доставочных систем являются те системы, которые описаны в патентах США №№ 5422120 и 4762915, в международных патентных заявках WO 95/13796, WO 94/23697 и WO 91/14445, в ЕР 0524968 и у Stryer, 1975, "Biochemistry", ed. W.H.Freeman, San Francisco, pp. 236-240; Szoka, 1980, Biochem. Biophys. Acta, 600, 1; Bayer, 1979, Biochem. Biophys. Acta, 550, 464; Rivnay, 1987, Meth. Enzymol., 149, 119; Wang, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7851; Plant, 1989, Anal. Biochem., 176, 420.
Полинуклеотидная композиция может включать терапевтически эффективное количество генотерапевтической системы в соответствии с термином, определенным выше. Для целей настоящего изобретения эффективная доза должна находиться в пределах от примерно 0,01 мг/кг до 50 мг/кг или от 0,05 мг/кг до примерно 10 мг/кг ДНК-конструкций в приложении к индивидууму, которому они вводятся.
Способы доставки
После включения в фармацевтическую композицию такие полинуклеотидные композиции по настоящему изобретению могут быть (1) напрямую введены пациенту; (2) доставлены ex vivo в клетки, производные от этого пациента; или (3) использованы для экспрессии рекомбинантных белков in vitro. Субъектами, которым будут вводиться такие композиции, могут быть млекопитающие или птицы. Также лечение может быть проведено в отношении людей.
Прямое введение композиций в принципе должно осуществляться путем инъекций - подкожных, внутрибрюшинных, внутривенных или внутримышечных, или же они должны вводиться во внутритканевые пространства. Также эти композиции могут быть введены в повреждения (раны). Другими путями введения являются пероральное и внутрилегочное введение, использование суппозиториев, а также трансдермальное введение или введение «через кожу» (см., например, международную патентную заявку WO 98/20734), или введение с использованием игл, «генных ружей» или гипоспреев. Дозировки могут быть составлены однократными или многократными дозами.
Способы введения ex vivo с последующей реимплантацией трансформированных клеток субъекту хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в международной патентной заявке WO 93/14778. Примерами клеток, применимых для введения в варианте ex vivo, являются, например, стволовые клетки, в частности кроветворные клетки, лимфатические клетки, макрофаги, дендритные клетки или опухолевые клетки.
В целом, доставка нуклеиновых кислот в вариантах применения ex vivo и in vitro может быть осуществлена с помощью, например, таких процедур: трансфекция, опосредуемая декстраном, преципитация с фосфатом кальция, трансфекция с полибреном, слияние протопластов, электропорация, инкапсуляция полинуклеотида (полинуклеотидов) в липосомы и прямое микроинъецирование ДНК в ядра - все эти способы хорошо известны в науке.
Фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотиды иполипептиды
В дополнение к фармацевтически приемлемым носителям и солям, которые были описаны выше, могут быть использованы следующие вспомогательные компоненты, включаемые в композиции, содержащие полинуклеотид и (или) полипептид.
А. Полипептиды
Одним из примеров являются полипептиды, которые, тем самым не ограничиваясь, включают асиалооросомукоид (ASOR); трансферрин; асиалогликопротеины; антитела; фрагменты антител; ферритин; интерлейкины; интерфероны; колониестимулирующий фактор гранулоцитов и макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF), фактор стволовых клеток и эритропоэтин. Также могут быть использованы вирусные антигены, такие как оболочечные белки. Также могут быть использованы белки других патогенных организмов, такие как 17-аминокислотный пептид малярийного плазмодия стадии круглого спорозоита, известный в качестве RII.
B. Гормоны, витамины и т.п.
Другие группы соединений, которые могут быть включены в состав, включают, например, гормоны, стероиды, андрогены, эстрогены, тироидный гормон или витамины, например фолиевую кислоту.
C. Полиалкилены, полисахариды и т.п.
Также полиалкиленгликоль может быть включен вместе с желаемыми полинуклеотидами или полипептидами. В предпочтительном варианте полиалкиленгликолем является полиэтиленгликоль. Кроме того, в состав могут быть включены моно-, ди- или полисахариды. В предпочтительном варианте этого аспекта полисахаридом является декстран или DEAE-декстран. Также могут быть использованы хитозан и поли(лактид-когликолид).
D. Липиды и липосомы
Желательные полинуклеотиды или полипептиды могут быть инкапсулированы в липиды или запакованы в липосомы перед доставкой их субъекту или производные от него клетки.
Липидную инкапсуляцию обычно осуществляют с использованием липосом, которые способны стабильно связывать или включать внутрь себя нуклеиновую кислоту. Соотношение упакованного полинуклеотида и липидного материала может варьироваться, но в принципе близко к 1:1 (мг ДНК к мкмоль липида), или же количество липида несколько выше. По использованию липосом для целей доставки нуклеиновых кислот в качестве обзора см. Hug & Sleight, 1991, Biochim. Biophys. Acta, 1097, 1-17; Straubinger, 1983, Meth. Enzymol., 101, 512-527.
Липосомные препараты для применения по настоящему изобретению включают катионные (т.е. положительно заряженные), анионные (т.е. отрицательно заряженные) и нейтральные препараты. Катионные липосомы, как было показано, обеспечивают внутриклеточную доставку плазмидной ДНК (Felgner, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413-7416), мРНК (Malone, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 6077-6081) и очищенные транскрипционные факторы (Debs, 1990, J. Biol. Chem., 265, 10189-10192), сохраняющие свою функциональность.
Катионные липосомы являются легкодоступными. Например, N-[(1,2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триэтиламмонийные (DOTMA) липосомы доступны под торговой маркой «Липофектин» от фирмы Gibco BRL (Grand Island, NY) (см. также Felgner, цит. выше). Другими доступными на коммерческой основе липосомами являются трансфектаты (DDAB/DOPE) и DOTAP/DOPE (Boehringer). Другие катионные липосомы могут быть приготовлены из легкодоступных материалов с использованием методик, хорошо известных в данной области техники: см., например, Szoka, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194-4198; а синтез DOTAP (1,2-бис(олеоилокси)-3-(триметиламмоний)пропановых) липосом описан в международной патентной заявке WO 90/11092.
Сходным образом легкодоступными являются анионные и нейтральные липосомы, такие как получаемые от фирмы Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL), или могут быть легко получены с использованием легкодоступных материалов. Такие материалы включают, помимо прочего, фосфатидилхолин, холестерин, фосфатидилэтаноламин, диолеилфосфатидилхолин (DOPC), диолеилфосфатидилглицерин (DOPG), диолеилфосфатидилэтаноламин (DOPE). Эти материалы также могут быть смешаны с исходными материалами DOTMA и DOTAP в подходящих отношениях. Способы приготовления липосом с использованием этих материалов хорошо известны в науке.
Липосомы могут включать многослойные пузырьки (MLV), маленькие однослойные пузырьки (SUV) или крупные однослойные пузырьки (LUV). Различные комплексы липосом и нуклеиновых кислот формируют с применением методов, хорошо известных в данной области техники: см., например, Straubinger, 1983, Meth. Immunol., 101, 512-527; Szoka, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 4194-4198; Papahadjopoulos, 1975, Biochim. Biophys. Acta, 394, 483; Wilson, 1979, Cell, 17, 77; Deamer & Bangham, 1976, Biochim. Biophys. Acta, 443, 629; Ostro, 1977, Biochem. Biophys. Res. Commun., 76, 836; Fraley, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 3348; Enoch & Strittmatter, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76, 145; Fraley, 1980, J. Biol. Chem., 255, 10431; Szoka & Papahadjopoulos, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 145; Schaefer-Ridder, 1982, Science, 215, 166.
E. Липопротеины
Кроме того, липопротеины могут сочетаться с полинуклеотидом или полипептидом, предназначенным к доставке. Примерами липопротеинов, которые могут быть использованы, являются: хиломикроны, HDL, IDL, LDL и VLDL. Также могут быть использованы мутанты, фрагменты и химеры этих белков. Также могут быть использованы модификации встречающихся в природе липопротеинов, такие как ацетилированные LDL. Эти липопротеины могут обеспечивать доставку полинуклеотидов к конкретным клеткам, экспрессирующим рецепторы липопротеинов. Предпочтительно, чтобы в случае включения в композицию липопротеинов наряду с предназначенным для доставки полинуклеотидом другие лиганды, обеспечивающие направленную доставку к мишеням, не включались в состав такой композиции.
Встречающиеся в природе липопротеины состоят из липидной и белковой составляющих. Белковый компонент известен под названием «апопротеина». В настоящее время были выделены и идентифицированы апопротеины А, В, С, D и Е. По крайней мере в двух из этих классов имеются по несколько белков, которые обозначаются римскими цифрами: AI, AII, AIV; CI, CII, CIII.
В составе липопротеина может присутствовать более одного апопротеина. Например, встречающиеся в естественных условиях хиломикроны включают апопротеины А, В, С и Е, причем с течением времени они утрачивают апопротеин-А и приобретают апопротеины С и Е. В состав VLDL входят апопротеины А, В, С и Е, в состав LDL - апопротеин В, а в состав HDL входят апопротеины А, С и Е.
Аминокислотный состав этих апопротеинов известен и описан, например, у Breslow, 1985, Annu. Rev. Biochem., 54, 699; Law, 1986, Adv. Exp. Med. Biol., 151, 162; Chen, 1986, J. Biol. Chem., 261, 12918; Kane, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 2465; Utermann, 1984, Hum. Genet., 65, 232.
В состав липопротеинов входят различные липиды, включая триглицериды, холестерин (свободный или в виде эфиров) и фосфолипиды. Состав липидов варьируется во встречающихся в естественных условиях липопротеинах. Например, хиломикроны в основном включают триглицериды. Более подробное описание липидного состава встречающихся в естественных условиях липопротеинов можно найти, например, в 128-м томе журнала "Methods in Enzymology" (1986). Состав липидов подбирается таким образом, чтобы соответствовать конформации апопротеина, обеспечивая тем самым активность по связыванию на соответствующем рецепторе. Состав липидов также может быть подобран так, чтобы облегчить гидрофобное взаимодействие и связывание с молекулой, связывающей полинуклеотид.
Встречающиеся в естественных условиях липопротеины могут, например, быть выделены из сыворотки крови путем ультрацентрифугирования. Некоторые способы описаны в "Methods in Enzymology (цит. выше) и у Pitas, 1980, J. Biochem., 255, 5454-5460 и Mahey, 1979, J. Clin. Invest., 64, 743-750. Липопротеины также могут быть получены in vitro или с помощью рекомбинантных технологий путем экспрессии генов апопротеинов в желательной клетке-хозяине: см., например, Atkinson, 1986, Annu. Rev. Biophys. Chem., 15, 403 и Radding, 1958, Biochim. Biophys. Acta, 30, 443. Также липопротеины могут быть приобретены у коммерческих дистрибьюторов, таких как Biomedical Technologies Inc. (Stoughton, MA, США). Дополнительное описание липопротеинов может быть найдено у Zuckermann et al. в заявке PCT/US 97/14465.
F. Поликатионные компоненты
В состав композиции, включающей желательный полинуклеотид или полипептид, доставка которого предполагается, могут быть включены поликатионные агенты, с липопротеином или без него.
Обычно поликатионные компоненты характеризуются общим положительным зарядом при физиологических значениях рН и способны нейтрализовывать электрический заряд нуклеиновых кислот, что должно облегчить доставку к желательному месту. Эти компоненты могут применяться как in vitro и ex vivo, так и in vivo. Поликатионные компоненты могут быть использованы для доставки нуклеиновых кислот прижизненно пациентам путем внутримышечного, подкожного введения и т.п.
Следующие полипептиды являются примерами применимых поликатионных компонентов: полилизин, полиаргинин, полиорнитин и протамин. Другими примерами являются гистоны, протамины, сывороточный человеческий альбумин, ДНК-связывающие белки, негистоновые хромосомные белки, капсидные белки ДНК-вирусов, таких как вирус Х174; транскрипционные факторы также включают участки связывания ДНК, и поэтому они также могут быть использованы в качестве агентов, конденсирующих нуклеиновую кислоту. Вкратце, базовый домен, на котором связывается ДНК, входит в состав таких транскрипционных факторов, как С/СЕВР, c-jun, c-fos, АР-1, АР-2, АР-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP и TFIID.
Органическими поликатионными компонентами являются спермин, спермидин и путресцин.
Размеры и физические свойства поликатионного компонента могут быть экстраполированы, исходя из приведенного выше перечня, с целью конструирования других поликатионных компонентов полипептидной природы или с целью создания синтетических поликатионных компонентов.
Синтетические поликатионные компоненты, которые являются применимыми, включают, например, DEAE-декстран и полибрен. Липофектин™ и липофектамин™ являются мономерами, которые образуют поликатионные комплексы в случае их комбинирования с полинуклеотидами/полипептидами.
Иммунологические диагностические тесты
Антигены нейссерий по настоящему изобретению могут быть использованы в иммунологических тестах, нацеленных на определение уровней антител (или, с другой стороны, антитела к антигенам нейссерий могут быть использованы для определения уровней антигенов). Иммунологические тесты, базирующиеся на точно определенных рекомбинантных антигенах, могут быть разработаны с целью замены инвазивных диагностических тестов. Антитела к белкам нейссерий могут быть выявлены в составе биологических образцов, таких как, например, кровь или сыворотка крови. Разработка подобных иммунологических тестов является объектом многочисленных модификаций, и широкий их круг известен в данной области техники. Прописи этих иммунологических тестов могут быть основаны, например, на тестах с конкурентным связыванием, или прямой реакции, или принципе «сэндвича». В этих протоколах также, например, могут быть использованы твердые подложки или иммунопреципитация. Во многих тестах используются меченые антитело или полипептид; метки могут быть, например, флуоресцентными, хемилюминесцентными, радиоактивными молекулами или молекулами красителя. Также известны тесты, в которых применяется амплификация сигналов на основе соответствующего зонда, примерами в этом случае являются тесты, в которых используются биотин и авидин, а также ферментно-меченные и опосредованные иммунологические тесты, такие как ТИФА (твердофазный иммуноферментный анализ).
Наборы реактивов, применимые для иммунодиагностики, включающие подходящие помеченные реагенты, формируют путем упаковки подходящих материалов, включая композиции по настоящему изобретению, в пригодные контейнеры, наряду с другими материалами и реагентами (например, подходящими буферами, растворами солей и т.п.), необходимыми для проведения конкурентного теста, равно как и необходимый набор информативных инструкций.
Гибридизация нуклеиновых кислот
Термин «гибридизация» обозначает связывание двух нуклеотидных последовательностей друг с другом с помощью водородных связей. Обычно одну из этих последовательностей фиксируют на твердой подложке, а другая находится в растворе в свободном состоянии. Затем обеспечивают контакт между этими двумя последовательностями в таких условиях, которые благоприятствуют образованию водородных связей. Факторами, которые влияют на образование таких связей, являются тип и количество растворителя; температура реакции; продолжительность гибридизации; перемешивание; присутствие компонентов, которые бы предотвращали неспецифическое связывание находящейся в жидкой фазе последовательности с твердой подложкой (раствор Денхардта или реактив BLOTTO); концентрация последовательностей; применение соединений, которые способны увеличивать скорость связывания последовательностей (декстрансульфат или полиэтиленгликоль); и жесткость условий промывки после гибридизации (см. Sambrook et al., цит. выше, том 2, глава 9, стр. 9.47-9.57).
Под «жесткостью» понимаются условия проведения гибридизации, которые благоприятствуют связыванию очень сходных последовательностей в отличие от различающихся последовательностей. Например, сочетание температуры и концентрации солей должно выбираться таким образом, чтобы оно было на 120-200°С ниже расчетной температуры диссоциации (Тm) анализируемого гибрида. Параметры температуры и концентрации солей могут быть, как правило, определены эмпирическим путем в предварительных экспериментах, в которых образцы геномной ДНК, иммобилизованной на фильтрах, гибридизуют с анализируемой последовательностью и затем промывают в условиях различной степени жесткости (см. Sambrook et al., стр. 9.50).
Переменные, которые необходимо учитывать при осуществлении, например, Саузерн-блоттинга, это (1) сложность структуры ДНК, которая будет подвергнута блоттингу, и (2) уровень гомологии зонда и выявляемых последовательностей. Общее количество исследуемого фрагмента (фрагментов) может варьироваться на порядок - от 0,1 до 1 мкг для плазмиды или фага или от 10-9 до 10-8 г для однокопийного гена из состава сложноорганизованного эукариотического генома. Для менее сложных полинуклеотидов могут быть использованы существенно менее продолжительные периоды времени блоттинга, гибридизации и экспозиции, меньшие количества исходных полинуклеотидов и меньшие специфические активности зондов. Например, однокопийный дрожжевой ген может быть выявлен при времени экспозиции всего 1 час при количестве исходной дрожжевой ДНК 1 мкг, блоттинге в течение 2 часов и гибридизации в течение 4-8 часов с зондом, имеющим активность 100 млн. имп./мин на 1 мкг. Для однокопийного гена млекопитающего консервативный подход будет начинаться с 10 мкг ДНК, блоттинга в течение ночи и гибридизации в течение ночи в присутствии 10% декстрансульфата с использованием зонда со специфической активностью свыше 100 млн. имп./мин на 1 мкг, в результате чего время экспозиции составит примерно 24 часа.
Некоторые факторы могут влиять на температуру плавления (Тm) гибрида ДНК/ДНК, образующегося между зондом и анализируемым фрагментом, а следовательно, и на подходящие условия проведения гибридизации и промывки. Во многих случаях зонд не является на 100% гомологичным данному фрагменту. Другие обычно учитываемые переменные - это длина и общее содержание пары GC в гибридизующих последовательностях, а также ионная сила и содержание формамида в гибридизационном буфере. Влияние всех этих факторов может быть учтено с помощью единственного уравнения:
Tm = 81 + 16,6·(log10Ci) + 0,4·(% пары GC) - 0,6·(% формамида)-600/n - 1,5·(% ошибок),
где Ci - концентрация солей (одновалентных ионов), а n - длина данного гибрида, выраженная в числе пар нуклеотидов (формула незначительно модифицирована по сравнению с опубликованным у Meinkoth & Wahl, 1984, Anal. Biochem., 138, 267-284).
При конструировании схемы гибридизационного эксперимента стандартным образом могут быть изменены некоторые факторы, влияющие на гибридизацию нуклеиновых кислот. Наиболее просты с точки зрения доведения до оптимума температура гибридизации и промывки и концентрация солей, используемая при промывке. При увеличении температуры, при которой проводится реакция гибридизации (т.е. жесткость реакции), становится менее вероятным то, что гибридизация произойдет между нуклеотидными цепями, которые негомологичны, приводя к снижению фонового «шума». Если радиоактивно помеченный зонд не является полностью гомологичным иммобилизованному фрагменту (ситуация, обычная в анализе генных семейств и проведении экспериментов по межвидовой гибридизации), то температура гибридизации должна быть снижена, тогда фоновый «шум» возрастет. Температура промывки сходным образом влияет на интенсивность гибридизационного бэнда и уровень фона. Жесткость условий промывки также возрастает при снижении концентраций солей.
В целом, стандартными температурами гибридизации в присутствии 50% формамида являются 42°С для зонда, гомологичного фрагменту-мишени на 95-100%, 37°С при гомологии на уровне 90-95% и 32°С при уровне гомологии 85-90%. Для более низких уровней гомологии содержание формамида должно быть снижено с последующим соответствующим доведением температуры на основе вышеприведенного уравнения. Если уровень гомологии между зондом и фрагментом-мишенью неизвестен, то наиболее простым подходом является проведение эксперимента изначально с нежесткими условиями гибридизации и промывки. Если после авторадиографического анализа оказываются интенсивными бэнды неспецифического связывания и уровень фонового «шума», то фильтр может быть промыт при высоком уровне жесткости и протестирован повторно. Если время, необходимое для экспозиции, делает данный подход непрактичным, то по несколько вариантов жесткости гибридизации и (или) промывки могут быть протестированы одновременно («параллельно»).
Тесты с нуклеотидными зондами
В таких методах, как ПЦР, анализ с разветвленными ДНК-зондами и методики блоттинга, основанных на использовании нуклеотидных зондов в соответствии с настоящим изобретением, можно выявить кДНК или мРНК. Говорят, что зонд «гибридизует» с последовательностью по настоящему изобретению тогда, когда он образует дуплекс или двухцепочечный комплекс, который достаточно стабилен для того, чтобы быть выявленным.
Соответствующие нуклеотидные зонды должны гибридизовать и нуклеотидными последовательностями нейссерий по настоящему изобретению (включая и смысловую и несмысловую цепи). Хотя конкретную аминокислотную последовательность может кодировать множество различных нуклеотидных последовательностей, нативные последовательности нейссерий являются предпочтительными потому, что именно они действительно присутствуют в клетках этих организмов. мРНК представляет кодирующую последовательность, поэтому зонд должен быть комплементарен соответствующей кодирующей последовательности; одноцепочечная кДНК комплементарна мРНК, поэтому кДНК-зонд должен быть комплементарен некодирующей последовательности.
Нет необходимости в том, чтобы нуклеотидная последовательность зонда была идентична последовательности нейссерии (или ее комплементу), некоторый уровень изменчивости последовательности и длины нуклеотидной последовательности может обусловить повышение чувствительности теста тогда, когда нуклеотидный зонд может образовывать дуплекс с нуклеотидами-мишенями, который может быть выявлен. Также нуклеотидный зонд может включать дополнительные нуклеотиды, которые призваны стабилизировать образующийся дуплекс. Дополнительная последовательность нейссерии может также выполнять вспомогательную роль метки, необходимой для выявления образовавшегося дуплекса. Например, некомплементарная нуклеотидная последовательность может быть присоединена к 5'-концу зонда, при том что остальная последовательность данного зонда комплементарна последовательности нейссерии. С другой стороны, некомплементарные нуклеотиды или удлиняющие последовательности могут быть диспергированы по длине этого зонда с учетом того, что нуклеотидная последовательность данного зонда характеризуется существенным уровнем комплементарности по отношению к последовательности нейссерии, в результате чего будут обеспечены их гибридизация и образование ими дуплекса, который может быть выявлен.
Точные длина и нуклеотидная последовательность зонда будут зависеть от условий проведения гибридизации, таких как температура, солевые условия и подобное. Например, для диагностического применения в зависимости от сложности анализируемой нуклеотидной последовательности нуклеотидный зонд обычно состоит по крайней мере из 10-20 нуклеотидов, предпочтительно из 15-25, а наиболее предпочтительно по крайней мере из 30 нуклеотидов, хотя он может быть короче. Короткие затравки, как правило, требуют более низких температур для образования достаточно стабильных гибридных комплексов с матрицей.
Зонды могут быть сформированы с помощью процедур синтеза, например с помощью триэфирного метода Маттеуччи с соавт. (Matteucci et al., 1981, J. Amer. Chem. Soc., 103, 3185), или в соответствии с Urdea et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7461, или с использованием доступных на коммерческой основе автоматических синтезаторов олигонуклеотидов.
Химическая природа зонда может быть выбрана, исходя из конкретных предпочтений. Для некоторых путей применения предпочтительными являются ДНК или РНК. Для других вариантов применения могут быть внесены различные модификации: например, модификации осевой структуры, такие как фосфотиоаты или метилфосфонаты, могут быть использованы для увеличения времени полужизни in vivo, изменения уровня аффинности РНК, повышения резистентности к действию нуклеаз и т.п. (см., например, Agrawal & Iyer, 1995, Curr. Opinion Biotechnol., 6, 12-19; Agrawal, 1996, TIBTECH, 14, 376-387); также могут быть использованы такие аналоги, как пептиды неклеиновых кислот (см., например, Corey, 1997, TIBTECH, 15, 224-229; Buchardt et al., 1993, TIBTECH, 11, 384-386).
С другой стороны, полимеразная цепная реакция (ПЦР) является другим хорошо известным способом выявления небольших количеств нуклеиновых кислот-мишеней. Этот тест описан Муллисом с соавт. (Mullis et al., 1987, Meth. Enzymol., 155, 335-350) и в патентах США №№ 4683195 и 4683202. Два нуклеотида-«затравки» гибридизуют с нуклеиновыми кислотами-мишенями и используют для затравки реакции. Такие затравки могут включать последовательность, которая не гибридизует с последовательностью, предназначенной к амплификации мишени (или ее комплемента) с целью придания стабильности дуплексу или, например, с целью внесения стандартного рестрикционного сайта. Обычно такая последовательность должна фланкировать желаемую последовательность нейссерии.
Термостабильная полимераза создает копии нуклеотидных кислот-мишеней с затравок, используя при этом исходные нуклеиновые кислоты-мишени в качестве матрицы. После того как такая полимераза обеспечивает появление некоего порогового количества нуклеиновых кислот-мишеней, они могут быть выявлены с применением более традиционных методов, таких как Саузерн-блоттинг. При использовании метода Саузерн-блоттинга помеченный зонд должен гибридизовать с последовательностью нейссерии (или с ее комплементом).
Также мРНК или кДНК могут быть выявлены с помощью традиционных методик блоттинга, описанных у Sambrook et al. (цит. выше). мРНК или кДНК, сформированные на матрице мРНК с помощью фермента полимеразы, могут быть очищены и разделены с помощью метода гель-электрофореза. Нуклеиновые кислоты в геле затем подвергают блоттингу на твердой подложке, такой как нитроцеллюлоза. Твердую подложку обрабатывают помеченным зондом и затем промывают с целью удаления любых негибридизовавших зондов. Далее выявляют полученные дуплексы, включающие помеченный зонд. Обычно такой зонд помечают с использованием радиоактивной составляющей.
Краткое описание фигур
На фиг.1-20 показаны данные биохимического анализа, полученные в нижеследующих примерах, а также данные секвенирования для кодирующих рамок ORF 37, 5, 2, 15, 22, 28, 32, 4, 61, 76, 89, 97, 106, 138, 23, 25, 27, 79, 85 и 132. M1 и М2 соответствуют маркерам молекулярной массы. Стрелки указывают на положение основного рекомбинантного продукта или (в методе Вестерн-блоттинга) положение основного иммунореактивного бэнда N.meningitidis. ТР обозначает общий белковый экстракт N.meningitidis; OMV обозначает препарат внешней мембраны пузырька N.meningitidis. В описании теста на бактерицидность: знак ромба 
показывает преиммунные данные; знак треугольника (▴) обозначает контрольные данные GST; кружок (●) показывает данные, полученные с рекомбинантным белком N.meningitidis. Компьютерный анализ показывает кривую гидрофильности (вверху), кривую антигенного индекса (в середине) и данные анализа AMPHI (внизу). Компьютерная программа AMPHI используется для предсказания расположения Т-клеточных эпитопов (Gao et al., 1989, J. Immunol., 143, 3007; Roberts et al., 1996, AIDS Res. Hum. Retroviruses, 12, 593; Quakyi et al., 1992, Scand. J. Immunol., suppl. 11, 9), и она доступна из пакета программ Protean фирмы DNASTAR Inc. (1228 S. Park str., Madison, WI 53715, США).
Примеры
Нижеследующие примеры описывают нуклеотидные последовательности, которые были идентифицированы у N.meningitidis параллельно с предположительно кодируемыми ими продуктами трансляции, а также такие же последовательности N.gonorrhoeae. He все из приведенных нуклеотидных последовательностей являются полными: т.е. они кодируют меньше, чем полноразмерный белок дикого типа.
Приведенные примеры в целом сформированы таким образом:
- нуклеотидная последовательность, которая была идентифицирована у N.meningitidis (штамм В);
- продукт, предсказательно транслируемый с этой нуклеотидной последовательности;
- данные компьютерного анализа продукта трансляции на основе сравнения имеющихся баз данных;
- указания на соответствующие генные и белковые последовательности, идентифицированные у N.meningitidis (штамм А) и у N.gonorrhoeae;
- описание характеристик белков, которые указывают на то, что они могут обладать пригодной антигенностью;
- результаты биохимического анализа (экспрессия, очистка, ТИФА, FACS и т.п.).
Примеры обычно включают подробности, описывающие уровень идентичности между видами и штаммами. Белки, сходные по своей аминокислотной последовательности, сходны и по своим структуре и функциям, т.е. идентичность последовательностей зачастую указывает на единство происхождения в филогенезе. Сравнение аминокислотных последовательностей белков с известной функцией широко используется в качестве способа оценки предполагаемых функций белков с новой последовательностью, а также, как было подтверждено, оказывалось применимым для анализа полных геномов.
Сравнение последовательностей проводили в системе NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) с использованием алгоритмов BLAST, BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx & tBLASTx (также см., например, Altschul et al., 1997, "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucl. Acids Res., 25, 2289-3402). Поиски проводились по следующим программам полипептидных баз данных: неизбыточные последовательности GenBank+EMBL+DDBJ+PDB и GenBank+трансляции CDS+PDB+SwissProt+SPupdate+PIR.
Для сравнения последовательностей менингококка и гонококка использовали алгоритм tBLASTx, http://www.genome.ou.edu/gono_blast.html. Также алгоритм FASTA использовали для сравнения открытых кодирующих рамок ORF (из GCG Wisconsin Package, версия 9.0).
Пометки точками в составе нуклеотидных последовательностей (например, в положении 495 в последовательности SEQ ID NO: 11) определяют нуклеотиды, которые были случайным образом внесены с целью поддержания кодирующей рамки. Таким же образом двойное подчеркивание соответствует удаленным нуклеотидам. Строчные буквы (например, в 496-м положении в SEQ ID NO: 11) соответствуют неопределенностям, которые возникают при сопоставлении независимо проведенных реакций секвенирования (некоторые из нуклеотидных последовательностей в нижеследующих примерах являются результатом обобщения двух или большего числа экспериментов).
Нуклеотидные последовательности были просканированы во всех шести кодирующих рамках с целью предсказания присутствия гидрофобных доменов, для чего использовали алгоритм, основывающийся на статистических подходах Esposti et al., 1990, "Critical evaluation of the hydropathy of membrane proteins", Eur. J. Biochem., 190, 207-219). Эти домены представляют потенциальные трансмембранные участки или гидрофобные сигнальные (лидерные) сегменты.
Открытые кодирующие рамки были предсказаны, исходя из фрагментированных нуклеотидных последовательностей, для чего использовали программу ORFFINDER (NCBI).
Подчеркивание аминокислотных последовательностей указывает на наличие вероятных трансмембранных доменов или сигнальных сегментов в составе кодирующей рамки ORF в соответствии с предсказаниями алгоритма PSORT (http://www.psort.nibb.ac.jp). Функциональные домены также были предсказаны с помощью программы MOTIFS (GCG Wisconsin & PROSITE).
Различные тесты были использованы для оценки in vivo иммуногенности белков, идентифицированных в примерах. Например, белки могут быть экспрессированы рекомбинантным путем и затем использованы для скрининга сыворотки пациента методом иммуноблоттинга. Наличие позитивной реакции между белком и сывороткой пациента указывает на то, что у этого пациента ранее уже формировался иммунный ответ на анализируемый белок, т.е. данный белок является иммуногеном. Данный способ может быть использован для идентификации иммунодоминантных белков.
Рекомбинантный белок также может быть стандартным образом использован для приготовления антител, например, у мышей. Они могут быть использованы для прямого подтверждения того, что белок локализован на поверхности клеток. Помеченное антитело (например помеченное флуоресцентной меткой для использования в методе FACS) может быть проинкубировано с интактными бактериями - при этом присутствие метки на поверхности бактериальных клеток подтверждает такую локализацию соответствующего белка.
В частности, следующие методы (от А до S) были использованы для экспрессии, очистки и биохимического анализа белков по настоящему изобретению.
A) Получение хромосомной ДНК
Менингококков N.meningitidis штамма 2996 выращивали до экспоненциальной стадии роста в 100 мл культуральной среды GC, собирали с помощью центрифугирования и ресуспендировали в 5 мл буфера (20% сахарозы, 50 мМ Трис-HCl, 50 мМ EDTA - рН 8). Через 10 минут инкубации на льду бактерий лизировали добавлением 10 мл лизирующего раствора (50 мМ NaCl, 2% саркозила натрия, 50 мкг/мл протеиназы-К) и полученную суспензию инкубировали при 37°С в течение 2 часов. Проводили двукратную экстракцию фенолом (при уравновешивании в рН 8) и однократную экстракцию смесью хлороформа и изоамилового спирта (24:1). ДНК осаждали добавлением 0,3М ацетата натрия и 2 объемов этилового спирта и затем собирали центрифугированием. Полученный сгусток промывали один раз 70%-ным этанолом и вновь растворяли в 4 мл буфера (10 мМ Трис-HCl, 1 мМ EDTA, рН 8). Концентрацию полученного препарата ДНК определяли по оптической плотности при 260 нм.
B) Конструирование олигонуклеотида
Синтетические олигонуклеотидные затравки были сконструированы на основе кодирующей последовательности каждой кодирующей рамки ORF с использованием (а) В-последовательности менингококка (если она доступна) или (b) А-последовательности гонококка/менингококка, адаптированной к предпочтению кодонов у менингококка (если это являлось необходимым). Любые предполагаемые сигнальные сегменты отбрасывались, для чего формируемые 5'-концевые амплификационные затравки соответствовали участку, расположенному сразу вслед за предполагаемым лидерным сегментом.
Для большинства рамок ORF прямые затравки (5') включали два сайта узнавания рестриктазами (BamHI/NdeI, BamHI/NheI или EcoRI/NheI, в зависимости от собственных рестрикционных параметров конкретного гена); обратные (3') затравки включали рестрикционный XhoI-сайт. Эта процедура была предпринята с целью направления клонирования каждого амплификационного продукта (соответствующего каждой кодирующей рамке ORF) в двух различных экспрессионных системах: pGEX-KG (с использованием рестрикционных сайтов либо BamHI/XhoI, либо EcoRI/XhoI) и рЕТ21Ь+ (с использованием рестрикционных сайтов либо NdeI/XhoI, либо NheI/XhoI).
Конец 5'-концевой затравки:
Конец 3'-концевой затравки:
Для рамок ORF 5, 15, 17, 19, 20, 22, 27, 28, 65 и 89 были проведены по две независимые реакции амплификации с целью клонирования каждой из ORE в каждой из двух экспрессионных систем. По две различные 5'-концевые затравки были использованы для каждой ORF, при том что обратной затравкой была та же 3'- XhoI затравка, которая названа выше:
Конец 5'-концевой затравки:
Конец 5'-концевой затравки:
Кодирующая рамка 76 была клонирована с использованием экспрессирующего вектора pTRC и экспрессирована в виде химеры с присоединенным по N-концу полигистидиновым «хвостом». В этом конкретном случае предполагаемый сигнальный сегмент включался в состав конечного продукта. Рестрикционные сайты NheI/BamHI были внесены с использованием таких затравок:
Конец 5'-концевой затравки:
Конец 3'-концевой затравки:
Равно как включаются последовательности, узнаваемые рестриктазами, в состав затравок включаются и нуклеотиды, которые гибридизуют с последовательностью, которая должна быть амплифицирована. Число гибридизующих нуклеотидов зависело от температуры плавления полной затравки и определялось для каждой затравки с использованием таких формул:
Tm = 4·(G+C) + 2·(А+Т) (хвостовой сегмент исключен),
Tm = 64,9 + 0,41·(% GC) - 600/N (полная затравка).
Средняя температура плавления выбранных олигонуклеотидов составляла 65-70°С для полных олигонуклеотидов и 50-55°С для отдельных участков гибридизации.
В таблице 1 показаны прямые и обратные затравки, использовавшиеся для каждой реакции амплификации. В некоторых случаях необходимо отметить, что последовательность конкретной затравки не соответствует полностью последовательности кодирующей рамки. Когда проводили исходные реакции амплификации, полные 5'- и (или) 3'-последовательности не были известны для некоторых менингококковых ORF, хотя соответствующие последовательности были идентифицированы у гонококка. Для амплификации последовательности гонококков могли, следовательно, быть использованы в качестве основы для конструирования затравок, проводя в последовательности изменения, исходя из параметров предпочтения кодонов. В частности, были проведены такие изменения кодонов: АТА → АТТ; TCG → ТСТ; CAG → САА; AAG → ААА; GAG → GAA; CGA → CGC; CGG → CGC; GGG → GGC. Такие изменения отражены в таблице 1 путем выделения нуклеотидов курсивом. Должно быть понятно, что как только полная последовательность идентифицирована, данный описанный подход становится далее не нужным.
Олигонуклеотиды были синтезированы с использованием синтезатора ДНК/РНК модели 394 фирмы Perkin-Elmer, элюированы из колонок в 2 мл NH4OH и освобождены от защиты путем 5-часовой инкубации при 56°С. Эти олигонуклеотиды осаждали добавлением 0,3 М ацетата натрия и 2 объемов этанола. Образцы затем центрифугировали и сгустки ресуспендировали либо в 100 мкл, либо в 1 мл воды. Определяли оптическую плотность OD260 с использованием спектрофотометра Lambda-Bio (Perkin-Elmer), оценивая тем самым концентрацию, которую затем доводили до 2-10 пкмоль/мкл.
С) Амплификация
Стандартный протокол ПЦР был следующим: 50-200 нг геномной ДНК использовали в качестве матрицы в присутствии 20-40 мкМ каждого олигонуклеотида, 400-800 мкМ раствора смеси дезоксирибонуклеотидов (dNTP), l × ПЦР-буфера (включая 1,5 мМ MgCl2), 2,5 ед. ДНК-полимеразы TaqI (с использованием амплификатора AmpliTaQ Perkin-Elmer, Gibco Platinum; ДНК-полимеразы Pwo или Taq-полимеразы Tahara Shuzo).
В некоторых случаях параметры ПЦР оптимизировали добавлением 10 мкл ДМСО или 50 мкл 2М бетаина.
После «горячего старта» (добавление полимеразы в смесь, преинкубируемую в течение 3 минут при температуре 95°С) каждый образец подвергался 2-этапной амплификации: первые 5 циклов проводили с использованием температуры гибридизации, определенной для олигонуклеотидов с исключенным из расчета «хвостом с рестрикционными сайтами», с последующими 30 циклами, проводившимися при температуре гибридизации, определенной для полноразмерных олигонуклеотидов. Все циклы завершали конечным 10-минутным этапом достройки цепи при 72°С.
Стандартные циклы были следующими:
95°С
50-55°С
72°С
95°С
65-70°С
72°С
Продолжительность этапа достройки варьировалась в зависимости от длины кодирующей рамки ORF, амплификация которой осуществляется.
Реакции амплификации проводили с использованием ген-амплификатора моделей 9600 либо 2400 (Perkin-Elmer). Для проверки результатов десятую часть амплификационного объема загружали в 1-1,5%-ный агарозный гель и размер каждого из продуктов амплификации сравнивали с молекулярной массой ДНК-маркера.
Амплифицированную ДНК либо загружали напрямую в 1%-ный гель, либо сначала осаждали этиловым спиртом и ресуспендировали в подходящем объеме, который должен быть загружен в 1%-ный гель. Фрагмент ДНК, соответствующий правильному размеру бэнда, затем элюировали и очищали из геля с использованием набора реактивов Qiagen Gel Extraction Kit в соответствии с инструкциями производителя. Конечный объем фрагмента ДНК составлял 30 мкл или 50 мкл в воде или 10 мМ Трис, рН 8,5.
D) Расщепление ПЦР-фрагментов
Очищенную ДНК, соответствующую амплифицированному фрагменту, разделяли на две аликвоты и подвергали двойному расщеплению рестриктазами:
- NdeI/XhoI или Nhel/XhoI для клонирования в состав рЕТ21b+ и дальнейшей экспрессии белка в виде С-концевой части химеры, включающей полигистидиновый «хвост»;
- BamHI/XhoI или EcoRI/XhoI для клонирования в состав pGEX-KG и дальнейшей экспрессии белка в виде N-концевой части химеры GST;
- в варианте с кодирующей рамкой ORF76 NheI/BamHI для клонирования в состав вектора pTRC-HisA и дальнейшей экспрессии белка в виде N-концевой части химеры, включающей полигистидиновый «хвост»;
- EcoRI/PstI, EcoRI/SalI, SalI/PstI для клонирования в состав pGex-His и дальнейшей экспрессии белка в виде N-концевой части химеры, включающей полигистидиновый «хвост».
Каждый очищенный ДНК-фрагмент инкубировали (при 37°С в течение 3 часов или в течение ночи) с 20 ед. каждой из рестриктаз (производства New England Biolabs) при конечном объеме либо 30 мкл, либо 40 мкл в присутствии подходящего буфера. Расщепленный продукт затем очищали с использованием набора реактивов QIAquick PCR purification kit в соответствии с инструкциями производителя и элюировали в конечный объем 30 мкл или 50 мкл либо в воде, либо в 10 мМ Трис-HCl (рН 8,5). Окончательная концентрация ДНК была определена с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле в присутствии титрированного маркера молекулярной массы.
E) Обработка клонирующих векторов (рЕТ22В, pGEX-KG, pTRC-HisA, pGex-His)
Двойной рестрикции подвергали 10 мкг плазмиды, используя по 50 ед. каждой рестриктазы в 200 мкл реакционного объема в присутствии подходящего буфера в течение ночи при инкубации при 37°С. После загрузки полной обработанного объема в 1%-ный агарозный гель бэнд, соответствующий расщепленному рестриктазами вектору, очищали из геля с использованием набора реактивов QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen) и ДНК элюировали в 50 мкл в 10 мМ Трис-HCl (рН 8,5). Концентрацию ДНК оценивали путем измерения OD260 каждого образца и доводили ее до 50 мкг/мл. По 1 мкл каждой плазмиды использовали в каждой процедуре клонирования.
Вектор pGEX-His является модифицированным вектором pGEX-2T, несущим участок, который кодирует шесть остатков гистидина, расположенный выше тромбинового сайта расщепления и включающий множественные сайты клонирования из состава вектора pTRC99 (Pharmacia).
F) Клонирование
Фрагменты, соответствующие каждой кодирующей рамке, предварительно обработанные рестриктазами и очищенные, были лигированы и в состав рЕТ22b, и в состав pGEX-KG. При конечном объеме 20 мкл молярное отношение 3:1 фрагмента и вектора лигировали с использованием 0,5 мкл NEB ДНК-лигазы фага Т4 (400 ед./мкл) в присутствии буфера, предлагаемого производителем. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 3 часов. В некоторых экспериментах лигирование осуществляли с использованием набора реактивов Rapid Ligation Kit (Boehringer) в соответствии с инструкциями производителя.
С целью внесения рекомбинантной плазмиды в подходящий штамм 100 мкл компетентных клеток E.coli (штамм DH5) инкубировали с лигазной реакцией в течение 40 минут на льду, затем при 37°С в течение 3 минут, затем, после добавления 800 мкл бульона LB, снова инкубировали при 37°С в течение 20 минут. Клетки затем центрифугировали при максимальной скорости вращения эппендорфовской микроцентрифуги и ресуспендировали приблизительно в 200 мкл надосадочной фракции. Полученную суспензию затем высевали на среду LB, содержащую ампициллин (100 мг/мл).
Скрининг рекомбинантных колоний осуществляли путем выращивания пяти случайным образом отобранных колоний в течение ночи при 37°С либо в 2 мл (клоны pGEX или рТС), либо 5 мл (клоны рЕТ) бульона LB + 100 мкг/мл ампициллина. Клетки затем пеллетировали и ДНК экстрагировали с использованием набора реактивов QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя до конечного объема 30 мкл. По 5 мкл каждого отдельного минипрепарата (приблизительно 1 г) обрабатывали рестриктазами либо NdeI/XhoI, либо BamHI/XhoI и полный обработанный объем загружали в 1-1,5%-ный агарозный гель (в зависимости от ожидаемого размера вставки) наряду с маркером молекулярной массы (1Kb DNA Ladder, Gibco). Скрининг позитивных клонов был осуществлен по параметрам правильного размера искомой вставки.
Для клонирования кодирующих рамок ORF 110, 111, 113, 115, 119, 122, 125 и 130 дважды обработанный рестриктазами ПЦР-продукт лигировали в состав дважды обработанного рестриктазами вектора с использованием клонирующих EcoRI/PstI-сайтов, в случае с рамками ORF 115 и 127 - EcoRI/SalI-сайтов, а в случае с рамкой 122 - SalI/PstI-сайтов. После клонирования рекомбинантные плазмиды были внесены в клетки E.coli штамма W3110. Отдельные клоны культивировали в течение ночи при 37°С в L-бульоне с добавлением 50 мкл/мл ампициллина.
G) Экспрессия
Каждую кодирующую рамку ORF, клонированную в состав экспрессирующего вектора, использовали для трансформации штамма, пригодного для экспрессии рекомбинантного белкового продукта. По 1 мкл каждой конструкции использовали для трансформации 30 мкл E.coli штамма BL21 (вектор pGEX), E.coli штамма ТОР10 (вектор pTRC) или E.coli штамма BL21-DE3 (вектор рЕТ) в соответствии с описанным выше. В случае с вектором pGEX-His тот же штамм кишечной палочки E.coli (W3110) использовали для исходного клонирования и экспрессии. Отдельные рекомбинантные колонии высевали в 2 мл культурального бульона LB с ампициллином (100 мкг/мл), инкубировали в течение ночи при 37°С, затем разводили в соотношении 1:30 в 20 мл LB с ампициллином (100 мкг/мл) в 100-мл колбах, проверяя при этом оптическую плотность OD600, которая должна составлять 0,1-0,15. Эти колбы инкубировали при 30°С в ротационном шейкере с водяной баней до тех пор, когда параметр оптической плотности укажет на выход культуры на экспоненциальную стадию роста, пригодную для индукции экспрессии (0,4-0,8 OD для векторов рЕТ и pTRC; 0,8-l OD для векторов pGEX и pGEX-His). Для векторов рЕТ, pTRC и pGEX-His экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ IPTG, в то время как в случае с вектором pGEX конечная концентрация IPTG составляла 0,2 мМ. Через 3 часа инкубации при 30°С конечную концентрацию образца проверяли по величине OD. С целью контроля экспрессии по 1 мл каждого образца удаляли, центрифугировали в микроцентрифуге, полученный сгусток ресуспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и анализировали методом SDS-электрофореза в 12%-ном ПААГ с окрашиванием кумасси голубым. Полный объем образца центрифугировали при 6000g и полученный сгусток ресуспендировали в ФСБ для дальнейшего использования.
Н) Крупномасштабная очистка химерных GST-белков
Отдельную колонию культивировали в течение ночи при 37°С в среде LB с ампициллином на агаровой пластине. Бактерии высевали в 20 мл LB с ампициллином в жидкой культуре в шейкере, содержащем водяную баню, и культивировали в течение ночи. Бактерии разводили 1:30 в объеме 600 мл (свежая культуральная среда) и оставляли расти при оптимальной температуре (20-37°С) до достижения оптической плотности OD550 0,8-1. Экспрессию белка индуцировали добавлением 0,2 мМ IPTG с последующей 3-часовой инкубацией. Культуру центрифугировали при 8000 об/мин при 4°С. Надосадочную фракцию удаляли и сгусток бактериальных клеток ресуспендировали в 7,5 мл холодного фосфатно-солевого буфера. Клетки разрушали ультразвуком на льду в течение 30 секунд при мощности 40 Вт с использованием аппарата В-15 (Branson), дважды замораживали и растаивали и снова центрифугировали. Надосадочную фракцию собирали и перемешивали в 150 мкл глутатионсефарозной-4В смолы (Pharmacia) (предварительно промытой в ФСБ) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Образец центрифугировали при 700g в течение 5 минут при 4°С. Смолу промывали 2 раза в 10 мл холодного ФСБ в течение 10 минут, ресуспендировали в 1 мл холодного ФСБ и загружали на свободную колонку. Смолу промывали дважды в 2 мл холодного ФСБ до тех пор, как проточный материал достигал оптической плотности OD280 0,02-0,06. Химерный GST-белок элюировали добавлением 700 мкл холодного глутатион-элюционного буфера (10 мМ восстановленного глутатиона, 50 мМ Трис-HCl) и фракции собирали до достижения OD280 величины 0,1. По 21 мкл каждой фракции загружали в 12%-ный SDS-гель с использованием либо молекулярных стандартов для SDS-ПААГ от Biorad (M1) (200, 116,25, 97,4, 66,2, 45, 31, 21,5, 14,4, 6,5 кД), либо набора стандартов от Amersham (M2) (220, 66, 46, 30, 21,5, 14,3 кД). При том, что молекулярная масса GST составляет 26 кД, это значение следует прибавлять к значению молекулярной массы, определяемой для каждого химерного GST-включающего белка.
I) Анализ растворимости His-химер (кодирующие рамки 111-129)
Для анализа растворимости His-химерных продуктов экспрессии сгустки 3-мл культур ресуспендировали в буфере M1 (500 мкл ФСБ - рН 7,2). Добавляли 25 мкл лизоцима и бактерии инкубировали в течение 15 минут при 4°С. Полученные сгустки облучали ультразвуком в течение 30 секунд при мощности 40 Вт с использованием ультразвуковой установки Branson B-15, дважды замораживали и растаивали и затем вновь разделяли на сгусток и надосадочную фракцию с помощью центрифугирования. Надосадочную фракцию отбирали и оставшийся сгусток ресуспендировали в буфере М2 (8 М мочевины, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазола и 0,1 М NaH2PO4) и инкубировали в течение 3-4 часов при 4°С. После центрифугирования надосадочную фракцию отбирали и сгусток ресуспендировали в буфере М3 (6 М гуанидин-HCl, 0,5 М NaCl, 20 мМ имидазола и 0,1 М NaH2PO4) в течение ночи при 4°С. Надосадочные фракции на каждом из этих этапов анализировали методом электрофореза в SDS-ПААГ.
Белки, экспрессируемые рамками ORF 113, 119 и 120, как было установлено, растворимы в фосфатно-солевом буфере, в то время как продукты рамок ORF 111, 122, 126 и 129 требуют для растворения мочевину, а продукты рамок ORF 125 и 127 - гуанидинхлорида.
J) Крупномасштабная очистка His-химер
Отдельную колонию культивировали на протяжении ночи при 37°С в среде LB с ампициллином на агаровой пластине. Бактерии высевали в жидкую культуру по 20 мл в среде LB с ампициллином и инкубировали в течение ночи в шейкере с водяной баней. Бактерии разводили 1:30 в 600 мл свежей среды и оставляли расти при оптимальной температуре (20-37°С) до плотности OD550 0,6-0,8. Экспрессию белка индуцировали добавлением 1 мМ IPTG и культуру далее инкубировали в течение трех часов. Затем культуру центрифугировали при 8000 об/мин при 4°С, удаляли надосадочный слой и бактериальный сгусток ресуспендировали в 7,5 мл либо (1) холодного буфера А (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатного буфера, 10 мМ имидазола - рН 8) для растворимых белков, либо (2) буфера В (8 М мочевины, 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатного буфера - рН 8,8) для нерастворимых белков.
Клетки разрушали ультразвуком на льду в течение 30 секунд при мощности 40 Вт с использованием ультразвуковой установки Branson B-15, дважды замораживали, растаивали и вновь центрифугировали.
В случае с нерастворимыми белками надосадочный слой хранили при -20°С, в то время как сгустки ресуспендировали в 2 мл буфера С (6 М гуанидингидрохлорида, 100 мМ фосфатного буфера, 10 мМ Трис-НС1 - рН 7,5) и обрабатывали в гомогенизаторе в течение 10 циклов. Полученный продукт центрифугировали при 13000 об/мин в течение 40 минут.
Надосадочные фракции отбирали и смешивали с 150 мкл никель-содержащей (Ni2+) смолы (Pharmacia) (предварительно промытой буфером А или буфером В) и инкубировали при комнатной температуре при тщательном перемешивании в течение 30 минут. Образец центрифугировали при 700g в течение 5 минут при 4°С. Смолу дважды промывали в 10 мл буфера А или В в течение 10 минут, ресуспендировали в 1 мл буфера А или В и загружали на свободную колонку. Смолу промывали либо (1) в 2 мл холодного буфера А при 4°С, либо (2) при комнатной температуре в 2 мл буфера В до тех пор, пока протекающий материал не достигнет оптической плотности OD280 0,02-0,06.
Смолу промывали либо в (1) 2 мл холодного буфера с 20 мМ имидазола (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатного буфера, 20 мМ имидазола - рН 8), либо в (2) буфере D (8 М мочевины, 10 мМ Трис-НС1, 100 мМ фосфатного буфера - рН 6,3) до тех пор, пока протекающий материал не достигнет оптической плотности OD280 0,02-0,06. Химерный His-белок элюировали добавлением 700 мкл либо (1) холодного элюционного буфера А (300 мМ NaCl, 50 мМ фосфатного буфера, 250 мМ имидазола - рН 8), либо (2) элюционного буфера В (8 М мочевины, 10 мМ Трис-HCl, 100 мМ фосфатного буфера - рН 4,5) и полученные фракции отбирали до плотности OD280=0,1. По 21 мкл каждой фракции загружали в 12%-ный SDS-гель.
К) Ренатурация His-химерных белков
К денатурированными белкам добавляли 10% глицерина. Белки затем разбавляли до концентрации 20 мкг/мл с использованием диализного буфера I (10% глицерина, 0,5 М аргинина, 50 мМ фосфатного буфера, 5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона, 2 М мочевины - рН 8,8) и диализовали против того же самого буфера при 4°С в течение 12-14 часов. Далее этот белок диализовали против диализного буфера II (10% глицерина, 0,5 М аргинина, 50 мМ фосфатного буфера, 5 мМ восстановленного глутатиона, 0,5 мМ окисленного глутатиона - рН 8,8) в течение 12-14 часов при 4°С. Концентрацию белка определяли с использованием следующей формулы:
Белок (мг/мл) = (1,55 × OD280) - (0,76 × OD260)
L) Крупномасштабная очистка His-химеры (кодирующие рамки ORF 111-129)
По 500 мл бактериальных культур инкубировали и химерные белки получали растворимыми в буферах M1, M2 или М3, для чего использовали описанные выше протоколы. Неочищенный экстракт бактерий загружали на суперскоростную колонку Ni-NTA (Quiagen), уравновешенную буфером M1, M2 или М3, в зависимости от того, в каком из этих буферов растворяется химерный белок. Несвязанный материал элюировали промывкой колонки тем же самым буфером. Конкретный белок элюировали с использованием соответствующего буфера, содержащего 500 мМ имидазола и диализовали против соответствующего буфера, в котором отсутствовал имидазол. После каждого протока колонки восстанавливали промывкой по крайней мере двумя объемами колонки 0,5 М едкого натра и повторным уравновешиванием перед следующим использованием.
М) Иммунизация мышей
Для иммунизации мышей путем внутрибрюшинных инъекций использовали по 20 мкг каждого из очищенных белков. В случаях кодирующих рамок ORF 2, 4, 15, 22, 27, 28, 37, 76, 89 и 97, при иммунизации мышей линии Balb/C на 1-й, 21-й и 42-й дни в качестве адъюванта использовали гидроксид алюминия, а иммунный ответ контролировали в образцах на 56-й день. В случае с кодирующими рамками ORF 44, 106 и 132 мышей линии CD1 иммунизовали в таком же протоколе. В случае с кодирующими рамками ORF 25 и 40 мышей CD1 иммунизовали в том же протоколе, заменив в качестве адъюванта гидроксид алюминия на адъювант Фройнда; также отличием было то, что иммунный ответ контролировали на 42-й, а не на 56-й день. Сходным образом, в случаях кодирующих рамок ORF 23, 32, 38 и 79 мышей линии CD1 иммунизовали с адъювантом Фройнда, но иммунный ответ определяли на 49-й день.
N) Тест ТИФА (анализ сыворотки)
Декапсулированный штамм MenB M7 высевали на шоколадно-агаровые пластины и инкубировали в течение ночи при 37°С. Бактериальные колонии отбирали с агаровых пластин с использованием стерильной щетки и высевали в 7 мл культурального бульона Mueller-Hinton (Difco), содержащего 0,25% глюкозы. Рост бактерий контролировали каждые 30 минут по величине OD620. Бактерии оставляли расти до достижения оптической плотности OD 0,3-0,4. Культуры центрифугировали в течение 10 минут при 10000 об/мин. Надосадочную фракцию удаляли и бактерии промывали один раз фосфатно-солевым буфером, ресуспендировали в ФСБ, содержащем 0,025% формальдегида, и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре и затем, помешивая, в течение ночи при 4°С. По 100 мкл бактериальных клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного грейнерского планшета и инкубировали в течение ночи при 4°С. Затем лунки трижды промывали промывочным фосфатным Твин-буфером (0,1% Твин-20 в фосфатно-солевом буфере). В каждую лунку добавляли по 200 мкл насыщающего буфера (2,7% поливинилпирролидона-10 в воде) и планшеты инкубировали в течение 2 часов при 37°С. Лунки промывали три раза в ФСБ. В каждую лунку добавляли по 200 мкл разведенной сыворотки (дилюционный буфер: 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Твин-20, 0,1% NaN3 в ФСБ) и планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°С. Затем лунки трижды промывали в ФСБ. В каждую лунку добавляли по 100 мкл конъюгированной с пероксидазой хрена кроличьей антимышиной сыворотки (Dako), разведенной 1:2000 в дилюционном буфере, и планшеты инкубировали в течение 90 минут при 37°С. В каждую лунку добавляли по 100 мкл субстратного для пероксидазы хрена буфера (25 мл цитратного буфера - рН 5; 10 мг O-фенилдиамина и 10 мкл воды) и планшеты оставляли при комнатной температуре на 20 минут. В каждую лунку добавляли по 100 мкл серной кислоты и определяли OD490. Тест ТИФА оказывался позитивным тогда, когда величина OD490 в 2,5 раза превышала соответствующий параметр преиммунной сыворотки.
О) Процедура теста FACScan на связывание бактерий
Декапсулированный штамм MenB M7 высевали на шоколадно-агаровые пластины и инкубировали в течение ночи при 37°С. Бактериальные колонии собирали с агаровых пластин с помощью стерильной щетки и высевали в 4 пробирки, содержащие каждая по 8 мл культурального бульона Mueller-Hinton (Difco), содержащего 0,25% глюкозы. Рост бактерии контролировали каждые 30 минут по OD620. Бактерий оставляли расти до достижения оптической плотности величины 0,35-0,5. Культуры центрифугировали в течение 10 минут при 4000 об/мин. Надосадочную фракцию удаляли и сгусток ресуспендировали в блокировочном буфере (1% бычьего сывороточного альбумина, 0,4% NaN3) и центрифугировали в течение 5 минут при 4000 об/мин. Клетки ресуспендировали в блокировочном буфере до достижения OD620 величины 0,07. В каждую лунку 96-луночного планшета Costar добавляли по 100 мкл бактериальных клеток. В каждую лунку добавляли по 100 мкл разведенной (1:200) сыворотки (в блокирующем буфере) и планшеты инкубировали в течение 2 часов при 4°С. Клетки центрифугировали в течение 5 минут при 4000 об/мин, отсасывали надосадочный слой и клетки промывали добавлением в каждую лунку по 200 мкл блокирующего буфера. В каждую лунку добавляли по 100 мкл козьего антимышиного антитела F(ab)2, конъюгированного с R-фикоэритрином и разведенного 1:100, и планшеты инкубировали в течение 1 часа при 4°С. Клетки осаждали центрифугированием при 4000 об/мин в течение 5 минут и промывали добавлением в каждую лунку по 200 мкл блокирующего буфера. Отсасывали надосадочный слой и клетки ресуспендировали в 200 мкл ФСБ на каждую лунку + 0,25% формальдегида. Образцы переносили в пробирки для FACScan (сортировка клеток с возбуждаемой флуоресценцией) и считывали их. Условия проведения FACS-сканирования были следующими: FL1 - включен; FL2 и FL3 - выключены; FSC-H - пороговое значение 92; FSC РМТ - вольтаж Е-02; SSC РМТ - 474; прирост амплитуды - 7,1; FL-2 РМТ - 539; компенсационное значение - 0.
Р) Получение OMV
Бактерии культивировали в течение ночи на пяти пластинах GC, собирали петлей и ресуспендировали в 10 мл 20 мМ Трис-HCl. Инактивацию нагреванием проводили в течение получаса при 56°С и бактериальные клетки разрушали ультразвуком в течение 10 минут на льду (50% нагрузки в цикле облучения, 50% выходной мощности). Неразрушенные клетки удаляли центрифугированием при 5000g в течение 10 минут и полную фракцию клеточных оболочек выделяли центрифугированием при 50000g в течение 75 минут при 4°С. Для экстрагирования цитоплазматических мембранных белков из неочищенной фракции внешних мембран полную фракцию ресуспендировали в 2%-ном саркозиле (Sigma) и инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. Суспензию центрифугировали при 10000g в течение 10 минут с целью удаления агрегатов и надосадочную фракцию далее подвергали ультрацентрифугированию при 50000g в течение 75 минут с получением сгустка внешних мембран. Внешние мембраны ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl (рН 8) и концентрацию белка определяли в тесте Bio-Rad Protein с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина.
Q) Получение полных экстрактов
Бактерии культивировали в течение ночи на пластинке GC, собирали петлей и ресуспендировали в 1 мл 20 мМ Трис-HCl. Инактивацию нагреванием осуществляли в течение 30 минут при 56°С.
R) Вестерн-блоттинг
Очищенные белки (500 нг на дорожку), пузырьки внешней мембраны (5 мкг) и общие клеточные экстракты (25 мкг), производные от клеток штамма MenB-2996, загружали в 15%-й полиакриламидный гель для SDS-электрофореза и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Перенос осуществляли в течение 2 часов при 150 мА при 4°С в специальном буфере (0,3% основного Трис, 1,44% глицина, 20% метанола). Мембраны насыщали путем инкубации в течение ночи при 4°С в насыщающем буфере (10% снятого молока, 0,1% Тритон Х-100 в ФСБ). Мембраны промывали дважды в промывочном буфере (3% снятого молока, 0,1% Тритон Х-100 в ФСБ) и инкубировали в течение 2 часов при 37°С с мышиной сывороткой, разведенной до 1:200 промывочным буфером. Мембраны промывали дважды и инкубировали в течение 90 минут с помеченным пероксидазой хрена антимышиным иммуноглобулином, разведенным до 1:2000. Мембраны промывали дважды 0,1% Тритона Х-100 в ФСБ и обрабатывали с использованием субстрата из набора реактивов Opti-4CN Substrate Kit (Bio-Rad). Реакцию останавливали добавлением воды.
S) Тест на бактерицидность
Клетки штамма МС58 культивировали в течение ночи при 37°С на шоколадно-агаровых пластинах. По 5-7 колоний отбирали и использовали для высева в культуральный бульон Mueller-Hinton (7 мл). Суспензии инкубировали при 37°С в нутаторе и оставляли культивироваться до достижения OD620 величины 0,5-0,8. Каждую культуру разделяли на аликвоты в стерильных 1,5-мл эппендорфовских пробирках и центрифугировали в течение 20 минут при максимальной скорости микроцентрифуги. Полученный сгусток промывали один раз в буфере Гея (Gibco) и ресуспендировали в том же самом буфере до величины OD620 0,5, разводили в буфере Гея до 1:20000 и хранили при 25°С.
В каждую лунку 96-луночного планшета для культур тканей добавляли по 50 мкл буфера Гея в + 1% бычьего сывороточного альбумина. В каждую лунку добавляли по 25 мкл разведенной мышиной сыворотки (1:100 буфера Гея + 0,2% бычьего сывороточного альбумина) и планшет инкубировали при 4°С. В каждую лунку добавляли по 25 мкл охарактеризованной выше суспензии бактериальных клеток. В каждую лунку добавляли по 25 мкл либо инактивированного нагреванием (до 56°С на водяной бане в течение 30 минут), либо нормального комплемента крольчат. Немедленно вслед за добавлением комплемента крольчат по 22 мкл каждого образца (лунки) высевали на агаровые пластины Meuller-Hinton (время 0). 96-луночные планшеты инкубировали в течение 1 часа при 37°С при вращении и затем по 22 мкл каждого образца (лунки) высевали на агаровые пластины Mueller-Hinton (время 1). После инкубации в течение ночи подсчитывали колонии, соответствующие отрезкам времени 0 и 1 (часов).
В таблице II обобщены данные по клонированию, экспрессии и очистке.
Пример 1
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 1):
Это соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 2; ORF37):
Дальнейшая работа позволила определить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 3):
Это соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 4; ORF37-1):
Дальнейшая работа позволила идентифицировать соответствующий ген у штамма N.meningitidis (SEQ ID NO: 5):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 6; ORF37a):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF37) идентична на 68,0% на 75-аминокислотном участке перекрывания с ORF37a:
Дальнейшая работа позволила идентифицировать соответствующий ген N.gonorrhoeae (SEQ ID NO: 7):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 8; ORF37ng):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF37) на 64,9% идентична ORF37ng по 111-аминокислотному перекрывающемуся участку:
Полные последовательности штамма В (ORF37-1) и ORF37ng идентичны на 51,5% на участке перекрывающихся 198 аминокислот:
Компьютерный анализ этих аминокислотных последовательностей указывает на наличие предполагаемой лидерной последовательности, а также было предсказано, что эти белки менингококка и гонококка, равно как имеющиеся в их составе эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
Кодирующая рамка ORF37-1 (11 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белка были протестированы с применением электрофореза в SDS-ПААГ. На фиг. 1А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка, а на фиг. 1В показаны результаты экспрессии His-химеры в клетках E.coli. Очищенный GST-химерный белок был использован для иммунизации мышей, чья сыворотка была использована в ТИФА (получены позитивные данные], в сортировке FACS (фиг. 1C) и в тесте на бактерицидность (фиг. 1D). В этих экспериментах подтверждается, что ORF37-1 является поверхностно-клеточным белком, а также то, что он применим в качестве иммуногена.
На фиг. 1E показаны кривые гидрофильности, антигенный индекс и параметры AMPHI в участке ORF37-1.
Пример 2
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 9):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 10):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим белком H.influenzae (ybrd, haein: депозитарный № р45029)
SEQ ID NO: 9 и ybrd.haein идентичны на 48,4% на 122-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предсказанной ORF N. gonorrhoeae
SEQ ID NO: 9 идентична на 99,2% на 118-аминокислотном перекрывающемся участке с предсказанной ORF N. gonorrhoeae:
Полная последовательность yrbd H.influenzae имеет лидерную последовательность, предполагается, что полноразмерный гомологичный белок N.meningitidis также его имеет в своем составе. Это предполагает, что он является либо мембранным белком, либо секретируемым белком, либо поверхностным белком и что белок или один из его эпитопов может быть использован в качестве антигена для приготовления вакцин или для диагностических целей.
Пример 3
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 11):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 12; ORF3):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 13):
Она соответствует следующей аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 14; ORF3-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предсказанной ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF3 на 93,0% идентична ORF (ORF3a) штамма A N.meningitidis на 286-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF3a (SEQ ID NO: 15) такова:
Предсказывается, что она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 16):
Два трансмембранных домена подчеркнуты.
ORF3-1 на 94,6% идентична ORF3a на 410-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемым белком, кодируемым геном yvfc (депозитарный № Z71928) B.subtilis
Белки ORF3 и YVFC идентичны на 55% на 170-аминокислотном перекрывающемся участке (данные BLASTp):
Гомология с предсказанной ORF N.gonorrhoeae
ORF3 на 86,3% идентична предсказанной ORF (ORF3.ng) N.gonorrhoeae на 286-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF3ng (SEQ ID NO: 17) представляет собой:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 18):
Этот белок на 86,9% идентичен ORF3-1 на 413-аминокислотном участке перекрывания:
Кроме того, ORF3ng проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком B.subtilis:
gnl|PID|e238668 (Z71928) гипотетический белок (Bacillus subtilis)
>gi|1945702|gnl|PID|e313004 (Z94043) гипотетический белок (Bacillus subtilis)
>gi|2635938|gnl|PID|e1186113 (Z99121) сходный с фактором биосинтеза капсулярного полисахарида (Bacillus subtilis); длина = 202
Счет = 235 бит (594). Ожидаемое = 3е-61.
Идентичность = 114/195 (58%). Позитивные = 142/195 (72%).
Предполагаемый продукт гена yvfc проявляет сходство с белком EXOY R.meliloti - белком, продуцирующим экзополисахарид. Основываясь на этом заключении и на параметрах двух предполагаемых трансмембранных участков в гомологичной последовательности N.gonorrhoeae, предполагается, что эти белки или эпитопы в их составе могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или в диагностических целях, или для получения антител.
Пример 4
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 19):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 20; ORF5):
Дальнейший анализ позволил определить полную последовательность ДНК (SEQ ID NO: 21):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 22; ORF5-1):
Дальнейшая работа позволила идентифицировать соответствующий ген у штамма N.meningitidis (SEQ ID NO: 23):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 24; ORF5a):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF5) на 54,7% идентична ORF5a на 124-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полная последовательность штамма В (ORF5-1) и ORF5a идентичны на 92,7% на 300-аминокислотном участке перекрывания:
Дальнейший анализ позволил идентифицировать частичную последовательность ДНК N. gonorrhoeae (SEQ ID NO: 25), которая кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 26; ORF5ng):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность гонококка (SEQ ID NO: 27), представляющую собой:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 28; ORF5ng-l):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF5) на 83,1% идентична частичной последовательности гонококка (ORF5ng) на 135-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полная последовательность штамма В и последовательность гонококка (ORF5-1 и ORF5ng-l) идентичны на 92,4% на 304-аминокислотном перекрывающемся участке:
Компьютерный анализ этих аминокислотных последовательностей указывает на присутствие предполагаемой лидерной последовательности: были идентифицированы следующие параметры гомологии.
Гомология с гомологом гемолизина TlyC (депозитарный № U32716) Н.influenzae
Белки ORF5 и TlyC идентичны на 58% на 77-аминокислотном перекрывающемся участке (BLASTp):
ORF5ng-l также проявляет существенный уровень гомологии с TlyC:
Счет: Initl - 301; Initn - 419; Opt - 668
Счет по Смиту-Уотерману: 668; идентичность 45,9% на 242-аминокислотном перекрывающемся участке
Гомология с гипотетическим секретируемым белком E.coli
ORF5a проявляет гомологию с гипотетическим секретируемым белком E.coli:
sp|p77392| YBEX_ECOLI гипотетический белок 33,3-кД, кодируемый участком между генами Cute-Asnb
>gi|1778577 (U82598) сходный с H.influenzae (Escherichia coli)
>gi|l786879 (AE000170) f292
Этот 292-аминокислотный белок ORF на 23% идентичен (9 гэпов) с 272 остатками приблизительно 440-аминокислотного белка YTFL_HAEIN SW: P44717 (Escherichia coli). Длина = 292
Счет = 212 бит (533). Ожидаемое = 3е-54.
Идентичность = 112/230 (48%). Позитивные = 149/230 (64%). Гэпы = 3/230 (1%).
Основываясь на этом анализе, включая данные по гомологии аминокислотных последовательностей с гомологом гемолизина TlyC H.influenzae (гемолизины секретируются белками), было предположено, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae гонококка являются секретируемыми и, следовательно, могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей.
Ген ORF5-1 (30,7 кД) был клонирован в состав вектора pGex и экспрессирован в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белка анализировали методом электрофореза в SDS-ПААГ. На фиг. 2А показаны данные аффинной очистки GST-химерного белка. Очищенный GST-химерный белок был использован для иммунизации мышей, чья сыворотка была использована в методе Вестерн-блоттинге (фиг. 1В). Эти эксперименты подтверждают, что белок ORF5-1 является поверхностно-клеточным белком и, следовательно, он применим в качестве иммуногена.
Пример 5
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 29):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 30; ORF7):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК (SEQ ID NO: 31):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 32; ORF7-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим белком, кодируемым геном yceg (депозитарный № Р44270) H.influenzae
Белки ORF7 и yceg идентичны на 44% на 192-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерный белок YCEG характеризуется следующей последовательностью:
Гомология с предсказанной ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF7 на 95,2% идентична ORF (ORF7a) штамма N.meningitidis на 187-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полная нуклеотидная последовательность ORF7a (SEQ ID NO: 33):
Как предсказывается, она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 34):
Лидерный пептид подчеркнут.
ORF7a и ORF7-1 идентичны на 98,8% на 331-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предсказанным ORF N.gonorrhoeae
ORF7 на 94,7% идентична предполагаемой ORF (ORF7.ng) N.gonorrhoeae на 187-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF7ng (SEQ ID NO: 35) предположительно кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 36):
Дальнейший анализ позволил установить частичную последовательность ДНК ORF7ng (SEQ ID NO: 37):
Она соответствует следующей аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 38; ORF7ng-l):
ORF7ng-l и ORF7-1 идентичны на 98% на 298-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORFng-1 проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком E.coli:
sp|Р28306|YCEG_ECOLI гипотетический белок 38,2 кД, кодируемый участком между генами Pabc-Holb
gi|1787339 (АЕ000210) о340; 100%-ная идентичность фрагменту YCEG_ECOLI SW; однако в составе Р28306 имеются 97 дополнительных С-концевых остатков (Escherichia coli); длина = 340
Счет = 79 (36,2 бит). Ожидаемое = 5.0е-57. Сумма Р(2) = 5.0е-57.
Идентичность = 20/87 (22%). Позитивные = 40/87 (45%).
Счет = 438 (200,7 бит). Ожидаемое = 5.0е-57. Сумма Р(2) = 5.0е-57.
Идентичность = 84/155 (54%). Позитивные = 111/155 (71%).
Основываясь на проведенном анализе, включая тот факт, что белок YCEG H.influenzae, по-видимому, включает лидерную последовательность, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител
Пример 6
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 39):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 40; ORF9):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК (SEQ ID NO: 41):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 42; ORF9-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемым ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF9 на 89,8% идентична ORF (ORF9a) N.meningitidis штамма А на 166-аминокислотном перекрывающемся сегменте:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF9a (SEQ ID NO: 43) представляет собой:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 44):
ORF9a и ORF9-1 идентичны на 95,3% на 614-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N. gonorrhoeae
ORF9 на 82,8% идентична предполагаемой ORF (ORF9.ng) N.gonorrhoeae на 163-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF9ng (SEQ ID NO: 45), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 46):
Аминокислоты 1-28 предположительно являются лидерной последовательностью, а аминокислоты 173-189 предположительно являются трансмембранным доменом.
Дальнейший анализ последовательности позволил установить полную последовательность ДНК ORF9ng (SEQ ID NO: 47):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 48):
ORF9ng и ORF9-1 идентичны на 88,1% на 614-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF9ng проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком Р.aeruginosa:
sp|P42810|YHE3_PSEAE гипотетический белок 64,8-кД в межгенном интервале Hemm-Hema (ORF3)
>gi|1072999|pir|S49376 гипотетический белок 3 псевдомонады Pseudomonas aeruginosa
>gi|557259 (X82071) orf3 (Pseudomonas aeruginosa); длина = 576
Счет = 128 бит (318). Ожидаемое = le-28.
Идентичность = 138/587 (23%). Позитивные = 228/587 (38%). Гэпы = 125/587 (21%).
gi|2983399 (AE00710) гипотетический белок (Aquifex aeolicus); длина = 545
Счет = 81,5 бит (198). Ожидаемое = 1е-14.
Идентичность = 61/198 (30%). Позитивные = 98/198 (48%). Гэпы = 19/198 (9%).
Основываясь на проведенном анализе предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, равно как и их эпитопы, применимы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
Пример 7
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 49):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 50; ORF11):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК (SEO ID 51):
Она соответствует следующей аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 52; ORF11-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с белком внутренней мембраны 60-кД (депозитарный № Р25754) Pseudomonas putida
ORF11 и белок 60-кД идентичны на 58% на 229-аминокислотном перекрывающемся участке (BLASTp):
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF11 на 97,9% идентична ORF (ORF11a) штамма А N.meningitidis на 240-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полная нуклеотидная последовательность ORF11a (SEQ ID NO: 53) представляет собой:
Она кодирует белок, имеющий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 54):
ORF11a и ORF11-1 идентичны на 95,2% на 544-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF11 на 96,3% идентична предполагаемой ORF (ORF11.ng) N.gonorrhoeae на 240-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF11ng (SEQ ID NO: 55) кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 56):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 57):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 58; ORF11ng-1):
ORF11ng-1 и ORF11-1 идентичны на 95,1% на 546-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF11ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с белком внутренней мембраны, описанным в базе данных (депозитарный № р25754):
ID 60IM_PSEPU STANDARD; PRT; 560 аминокислот
Депозитарный № Р25754;
дата - 1 мая 1992 г. (rel. 22: создан)
дата - 1 мая 1992 г. (rel. 22: последнее изменение последовательности);
дата - 1 ноября 1995 г. (rel. 32: последнее изменение аннотации);
DE 60 кД: белок внутренней мембраны.
Счет: Initl - 1074; Initn - 1293; Opt - 1103
По Смиту-Уотерману - 1406. Идентичны на 41,5%, область перекрывания - 574 аминокислоты
Основываясь на проведенном анализе, с учетом данных об уровне гомологии белка внутренней мембраны P.putida и предполагаемых трансмембранных доменов (выявляемых в белках и менингококка, и гонококка), предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 8
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 59):
Соответствующая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 60; ORF13) представляет собой:
Дальнейший анализ последовательности привел лишь к небольшому изменению последовательности ДНК (SEQ ID NO: 61):
Это соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 62; ORF 13-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF13 на 92,9% идентична ORF (ORF13a) N.meningitidis штамма А на 126-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF13a (SEQ ID NO: 63) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 64):
ORF13a и ORF13-1 идентичны на 94,4% на 126-аминокислотном перекрывающемся участке.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF13 на 89,7% идентична предполагаемой ORF (ORF13.ng) N.gonorrhoeae на 126-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF13ng (SEQ ID NO: 65) такова:
Она кодирует такую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 66):
ORF13ng на 91,3% идентична ORF13-1 на 126-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о наличии отчетливой лидерной последовательности в составе этого белка, предполагается, что белки ORF13 и ORF13ng, по-видимому, являются белками внешней мембраны. Следовательно, можно предсказать, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или получения антител.
ПРИМЕР 9
Следующая последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 67):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 68; ORF2):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 69):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 70; ORF2-1):
Дальнейший анализ позволил идентифицировать соответствующий ген у N.meningitidis штамма A (SEQ ID NO: 71):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 72; ORF2a):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF2) на 97,5% идентична ORF2a на 118-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полная последовательность штамма В (ORF2-1) и ORF2a идентичны на 98,2% на 228-аминокислотнсм перекрывающемся участке:
В дальнейшем анализе была идентифицирована частичная последовательность ДНК (SEQ ID NO: 73) N.gonorrhoeae, кодирующая следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 74; ORF2ng):
Дальнейший анализ позволил идентифицировать полную последовательность гена гонококка (SEQ ID NO: 75):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 76; ORF2ng-1):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF2) на 87,5% идентична ORF2ng на 136-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полные последовательности штамма В и гонококка (ORF2-1 и ORF2ng-1) идентичны на 91,7% на 229-аминокислотном перекрывающемся участке:
Компьютерный анализ этих аминокислотных последовательностей указывает на присутствие трансмембранного участка (подчеркнут), а также подтверждает гомологичность (уровень идентичности 59%) между последовательностью гонококка и белком TatB E.coli:
gnl|PID|e1292181 (AJ005830) белок TatB (Escherichia coli); длина = 171
Счет = 56,6 бит (134). Ожидаемое = le-07.
Идентичность = 30/88 (34%). Позитивные = 52/88 (59%). Гэпы = 1/88 (1%).
Основываясь на проведенном анализе было предсказано, что ORF2, ORF2a и ORF2ng, по-видимому, являются мембранными белками, т.е. белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF2-1 (16 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы электрофоретически в SDS-ПААГ. На фиг. 3А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка, а на фиг. 3В - данные экспрессии His-химеры в клетках E.coli. Очищенный GST-химерный белок использовали для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в методе Вестерн-блоттинга (фиг. 3С), ТИФА (получен позитивный результат) и сортировке FACS (фиг. 3D). Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORF37-1 является поверхностно-клеточным белком и, следовательно, может быть использована в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 10
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 77):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 78; ORF 15):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 79):
Она соответствует следующей аминокислотной последовательности (SED ID 80; ORF15-1):
В дальнейшем анализе был идентифицирован соответствующий ген у N.meningitidis штамма A (SEQ ID NO: 81):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 82; ORF15a):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF15) на 98,1% идентична ORF15a на 213-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полная последовательность штамма В (ORF15-1) и ORF15a идентичны на 98,8% на 320-аминокислотном перекрывающемся участке:
310 320
Дальнейший анализ позволил идентифицировать соответствующий ген у N.gonorrhoeae (SEQ ID NO: 83):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 84; ORF15ng):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF15) на 97,2% идентична ORF15ng на 213-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полная последовательность штамма В (ORF15-1) и ORF15ng идентичны на 98,8% на 320-аминокислотном перекрывающемся участке:
Компьютерный анализ этих аминокислотных последовательностей позволил выявить мотив ILSAC (потенциальный сайт прикрепления к липидным составляющим мембранных липопротеинов: по данным программы MOTIFS), а также указывает на наличие лидерной последовательности; было предположено, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF15-1 (31,7 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы электрофоретически в SDS-ПААГ. На фиг. 4А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка, а на фиг. 4В - результаты экспрессии His-химеры в клетках E.coli. Очищенный GST-химерный белок использовали для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в методе Вестерн-блоттинга (фиг. 4С) и ТИФА (получен позитивный результат). Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORFX-1 является поверхностно-клеточным белком и, следовательно, может быть использована в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 11
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 85):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 86; ORF17):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 87):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 88; ORF 17-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим трансмембранным белком НI0902 H.influenzae (депозитарный № Р44070)
Белки ORF17 и НI0902 идентичны на 28% на 192-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF17 на 96,9% идентична ORF (ORF17a) штамма A N.meningitidis на 196-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF17а (SEQ ID NO: 89):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 90):
ORF17a и ORF17-1 идентичны на 98,9% на 268-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF17 на 93,9% идентична предполагаемой ORF (ORF17.ng) N.gonorrhoeae на 196-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF17ng (SEQ ID NO: 91) как предсказывается, кодирует белок, имеющий аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 92):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 93):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 94; ORF17ng-1):
ORF17ng-1 и ORF17-1 идентичны на 96,6% на 268-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF17ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком H.influenzae:
sp|P44070|Y902_HAEIN гипотетический белок НI0902
pir||G64015 гипотетический белок НI0902 - Haemophilus influenzae (штамм Rd KW20)
gi|1573922 (U32772) H.influenzae предсказываемый кодирующий сегмент НI0902 (Haemophilus influenzae); длина = 264
Счет = 74 (34,9 бит). Ожидаемое = 1,6е-23. Сумма Р(2) = 1,6е-23.
Идентичны = 15/43 (34%). Позитивные = 23/43 (53%).
Счет = 195(91,9 бит). Ожидаемое = 1,6е-23. Сумма Р(2)= 1,6е-23.
Идентичны = 44/114 (38%) Позитивные = 65/114 (57%).
Проведенный анализ, включая данные по уровню гомологии с гипотетическим трансмембранным белком H.infiuenzae, подтверждает, что данные белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, a также их эпитопы могут быть использованы для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 12
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 95):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 96; ORF18):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 97):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 98; ORF18-1):
Компьютерный анализ данной аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF18 на 98,3% идентична ORF (ORF18a) штамма A N.meningitidis на 116-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF18a (SEQ ID NO: 99):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 100):
ORF18a и ORF18-1 идентичны на 99,0% на 201-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF18 на 93,1% идентична предполагаемой ORF (ORF18.ng) N.gonorrhoeae на 116-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF18ng (SEQ ID NO: 101):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 102):
Эта белковая последовательность ORF18ng на 94,0% идентична ORF18-1 на 201-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о наличии нескольких предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предполагается, что данные белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 13
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 103):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 104; ORF19):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 105):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 106; ORF19-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемым трансмембранным белком YHFK Н.influenzae (депозитарный № Р44289)
Белки ORF19 и YHFK идентичны на 45% на 97-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF19 на 92,2% идентична ORF (ORF19a) штамма A N.meningitidis на 102-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF19a (SEQ ID NO: 107) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 108):
ORF19a и ORF19-1 идентичны на 98,3% на 716-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF19 на 95,1% идентична предполагаемой ORF (ORF19.ng) N.gonorrhoeae на 102-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF19ng (SEQ ID NO: 109), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 110):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 111):
Она соответствует следующей аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 112; ORF19ng-1):
ORF19ng-1 и ORF19-1 идентичны на 95,5% на 716- аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF19ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком гонококка, ранее внесенным в базу данных:
sp|033369|YOR2_NEIGO гипотетический белок 45,4-кД (ORF2)
gnl|PID|e1154438 (AJ002423) гипотетический белок (Neisseria gonorrhoeae); длина = 417
Счет = 1512 (705,6 бит). Ожидаемое = 5.3е-203. Р = 5.3е-203.
Идентичные = 301/326 (92%). Позитивные = 306/326 (93%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии нескольких предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка (первый из которых также выявляется и в белке менингококка) и о гомологии с белком YHFK, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae и их эпитопы могут быть приемлемыми антигенами для приготовления вакцин или диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 14
Следующая последовательность ДНК, как предполагается, полноразмерная, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 113):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 114; ORF20):
После обработки была определена полная последовательность ДНК (SEQ ID NO: 115):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 116; ORF20-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с фактором вирулентности MviN S.typhimurium (депозитарный № Р37169)
Белки ORF20 и MviN идентичны на 63% на 440-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF20 на 93,5% идентична ORF (ORF20a) штамма A N.meninqitidis на 447-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF20a(SEQ ID NO: 117):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 118):
ORF20a и ORF20-1 идентичны на 96,5% на 512-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF20 на 92,1% идентична предполагаемой ORF (ORF20ng) N.gonorrhoeae на 454-аминокислотном участке:
Нуклеотидная последовательность ORF20ng (SEQ ID NO: 119), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 120):
Дальнейший анализ ДНК позволил установить следующую последовательность ДНК (SEQ ID NO: 121):
Она кодирует следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 122; ORF20ng-1):
ORF20ng-1 и ORF20-1 идентичны на 95,7% на 512-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, последовательность ORF20ng-1 проявляет существенный уровень гомологии фактором вирулентности S.typhimurium:
sp|P37169|MVIN_SALTY фактор вирулентности MVIN
pir||S40271 белок mviN - Salmonella typhimurium
gi|438252 (Z26133) продукт гена mviB (Salmonella typhimurium)
gnl|PID|d1005521 (D25292) ORF2 Salmonella typhimurium; длина = 524
Счет = 1573 (750,1 бит). Ожидаемое = 1.1е-220. Сумма Р(2) = 1.1е-220
Идентичные = 309/467 (66%). Позитивные = 368/467 (78%).
Счет = 70 (33,4 бит). Ожидаемое = 1,1е-220. Сумма Р (2) =1,1е-220
Идентичность =14/41 (34%) Позитивные = 23/41 (56%)
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о гомологии с фактором вирулентности S.typhimurium, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae и их эпитопы могут быть приемлемыми антигенами для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 15
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 123):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 124; ORF22):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 125):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 126; ORF 22-1):
Дальнейший анализ позволил идентифицировать соответствующий ген штамма A N.meningitidis (SEQ ID NO: 127):
Она соответствует белку, характеризующемуся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 128; ORF22a):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF22) на 94,2% идентична ORF22a на 158-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полная последовательность штамма В (ORF22-1) и ORF22a идентичны на 94,9% на 447-аминокислотном перекрывающемся участке:
Дальнейшая работа позволила идентифицировать частичную генную последовательность (SEQ ID NO: 129) N. gonorrhoeae, которая кодирует следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 130; ORF22ng):
Дальнейший анализ позволил идентифицировать полную последовательность гена гонококка (SEQ ID NO: 131):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 132; ORF22ng-1):
Исходно идентифицированная частичная последовательность штамма В (ORF22) на 93,7% идентична ORF22ng на 158-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полные последовательности штамма В (ORF22-1) и гонококка (ORF22ng) идентичны на 96,2% на 447-аминокислотнсм перекрывающемся участке:
Компьютерный анализ этих последовательностей дал следующие результаты.
Гомология с белком внешней мембраны 48-кД Actinobacillus pleuropneumoniae (депозитарный № U24492)
ORF22 и белок 48-кД идентичны на 72% на 158-аминокислотном перекрывающемся участке:
ORF22a также проявляет существенный уровень гомологии с белком 48-кД Actinobacillus pleuropneumoniae:
gi|1185395 (U24492) белок внешней мембраны 48-кД (Actinobacillus pleuropneumoniae); длина = 449
Счет = 530 бит (1351). Ожидаемое = е-150.
Идентичные = 274/450 (60%). Позитивные = 323/450 (70%). Гэпы = 4/450 (0%).
ORF2ng-1 также проявляет гомологичность с белком внешней мембраны A.pleuropneumoniae:
gi|1185395 (U24492) белок внешней мембраны 48-кД (Actinobacillus pleuropneumoniae); длина = 449
Счет = 555 бит (1414). Ожидаемое = е-157.
Идентичные = 284/450 (63%). Позитивные = 337/450 (74%). Гэпы = 4/450 (0%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о гомологии с белком внешней мембраны Actinobacillus pleuropneumoniae, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть приемлемыми антигенами для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF22-1 (35,4 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков анализировали электрофоретически в SDS-ПААГ. На фиг. 5А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка, а на фиг. 5В - данные экспрессии His-химеры в клетках E.coii. Очищенный GST-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотка которых была использована в ТИФА (получены позитивные данные) и при сортировке FACS (фиг. 5С). Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORF22-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 16
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 133):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEO ID 134; ORF12):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК (SEQ ID NO: 135):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 136; ORF12-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF12 на 96,3% идентична ORF (ORF12a) штамма A N.meningitidis на 320-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF12a (SEQ ID NO: 137):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 138):
ORF12a и ORF12-1 идентичны на 99,0% на 522-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF12 на 92,5% идентична ORF (ORF12.ng) N.gonorrhoeae на 320-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF12ng (SEQ ID NO: 139):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 140):
ORF12ng на 97,1% идентична ORF12-1 на 522-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF12ng проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком E.coli:
sp|P46133|YDAH_ECOLI гипотетический белок 55,1-кД на межгенном участке Ogt-Dbpa
>gi|1787597 (АЕ000231) гипотетический белок в 5'-сегменте ogt (Escherichia coli); длина = 510
Счет = 329 бит (835). Ожидаемое = 2е-89.
Идентичные = 178/507 (35%). Позитивные = 281/507 (55%). Гэпы = 15/507 (2%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о наличии нескольких предполагаемых трансмембранных доменов и предполагаемого актинино-подобного актин-связывающего доменного мотива (показан жирным шрифтом) в составе белка гонококка, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 17
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 141):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 142; ORF14):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF14 на 94,0% идентична ORF (ORF14a) штамма A N.meningitidis на 167-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF14a (SEQ ID NO: 143) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 144):
Необходимо отметить, что в составе этой последовательности имеется стоп-кодон в 118-м положении.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF14 на 89,8% гомологична ORF (ORF14.ng) N.gonorrhoeae на 167-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF14ng (SEQ ID NO: 145), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 146):
Основываясь на присутствии предполагаемого трансмембранного домена в белке гонококка, предполагается, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 18
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 147):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 148; ORF16):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 149):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 150; ORF16-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF16 на 96,7% идентична ORF (ORF16a) штамма A N.meningitidis на 181-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF16a (SEQ ID NO: 151):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 152):
ORF16a и ORF16-1 идентичны на 99,6% на 451-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF16 на 93,9% идентична ORF (ORF16.ng) N.gonorrhoeae на 181-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF16ng (SEQ ID NO: 153):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 154):
ORF16ng и ORF16-1 идентичны на 89,3% на 261-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о предполагаемом присутствии нескольких трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 19
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 155):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 156; ORF28):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 157):
Это соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 158; ORF28-1):
Компьютерный анализ данной аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF28 на 79,2% идентична ORF (ORF28a) штамма A N.meningitidis на 120-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF28a (SEQ ID NO: 159):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 160):
ORF28a и ORF28-1 идентичны на 86,1% на 238-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF28 на 84,2% идентична предполагаемой ORF (ORF28.ng) N.gonorrhoeae на 120-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF28ng (SEQ ID NO: 161):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 162):
ORF28ng и ORF28-1 на 90,0% идентичны на 231-аминокислотном участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого трансмембранного домена в составе белка гонококка, предполагается, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF28-1 (24 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков анализировали электрофоретически в SDS-ПААГ. На фиг. 6А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка, а на фиг. 6В - результаты экспрессии His-химеры в клетках E.coli. Очищенный GST-химерный белок был использован для иммунизации мышей, чья сыворотка использовалась в ТИФА, в котором получен позитивный результат. Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORF28-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 20
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 163):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 164; ORF29):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 165):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 166; ORF29-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF29 на 88,0% идентична предполагаемой ORF (ORF29a) штамма A N.meningitidis на 125-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF29a (SEQ ID NO: 167) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 168):
ORF29a и ORF29-1 идентичны на 90,1% на 385-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF29 на 88,8% идентична предполагаемой ORF (ORF29.ng) N.gonorrhoeae на 125-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF29ng (SEQ ID NO: 169), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 170):
Во втором эксперименте была идентифицирована следующая последовательность ДНК (SEQ ID NO: 171):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 172; ORF29ng-1):
ORF29ng-1 и ORF29-1 на 86,0% идентичны на 401-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности в составе белка гонококка, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 21
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 173):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 174; ORF30):
В дальнейшем анализе была установлена полная нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO: 175):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 176; ORF30-1);
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF30 на 97,6% идентична ORF (ORF30a) штамма А N.meningitidis на 42-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF30 (SEQ ID NO: 177):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 178):
ORF30a и ORF30-1 на 97,8% идентичны на 181-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF30 на 97,6% идентична ORF (ORF30.ng) N.gonorrhoeae на 42-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF30ng (SEQ ID NO: 179) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 180):
ORF30ng и ORF30-1 на 98,3% идентичны на 181-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого сигнального сегмента в составе белка гонококка, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N. gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 22
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 181):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 182; ORF31):
Дальнейший анализ позволил установить еще одну частичную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 183):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 184; ORF31-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF31 на 76,2% идентична ORF (ORF31.ng) N.gonorrhoeae на 84-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF31ng (SEQ ID NO: 185) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся такой аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 186):
Этот белок гонококка на 50% идентичен по 149-аминокислотному перекрывающемуся участку порыформирующему гемолизиноподобному белку НесА Erwinia chrysanthemi (депозитарный № L39897):
Более того, ORF31ng и ORF31-1 идентичны на 79,5% на 83-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на полученных данных, в частности, гомологии с гемолизинами, а также с адгезинами, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 23
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 187):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 188; ORF32):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 189):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 190; ORF32-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF32 на 93,8% идентична ORF (ORF32a) штамма А N.meningitidis на 81-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF32 (SEQ ID NO: 191):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 192):
ORF32a и ORF32-1 идентичны на 93,2% на 382-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF32 на 95,1% идентична ORF (ORF32.ng) N.gonorrhoeae на 82-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF32ng (SEQ ID NO: 193), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 194):
Дальнейшее секвенирование позволило установить следующую последовательность ДНК (SEQ ID NO: 195):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 196; ORF32ng-1):
ORF32ng-1 и ORF32-1 идентичны на 93,5% на 383-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на полученных данных, включая данные о наличии характерной для адгезинов последовательности RGD в составе белка гонококка, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF32-1 (42 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков анализировали электрофоретически в SDS-ПААГ. На фиг. 7А показаны результаты аффинной очистки HIS-химерного белка, а на фиг. 7В - результаты экспрессии GST-химеры в клетках E.coli. Очищенный HIS-слитый белок был использован для иммунизации мышей, чья сыворотка использовалась в ТИФА, в котором получен позитивный результат. Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORF32-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 24
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 197):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 198; ORF33):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 199):
Это соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 200; ORF33-1):
Компьютерный анализ данной аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF33 на 90,9% идентична ORF (ORF33a) штамма A N.meningitidis на 143-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF33A (SEQ ID NO: 201):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 202):
ORF33a и ORF33-1 на 94,1% идентичны на 444-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF33 на 91,6% идентична ORF (ORF33.ng) N.gonorrhoeae на 143-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF33ng (SEQ ID NO: 203), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 204):
Дальнейший анализ последовательности позволил установить следующую последовательность ДНК (SEQ ID NO: 205):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 206; ORF33ng-1):
ORF33ng-1 на 94,6% идентична ORF33-1 на 446-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на присутствии нескольких предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предполагается, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
Пример 25
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 207):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 208; ORF34):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 209):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 210; ORF34-1):
Компьютерный анализ данной аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF34 на 73,3% идентична ORF (ORF34a) штамма A N.meningitidis на 161-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF34a (SEQ ID NO: 211):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 212):
ORF34a и ORF34-1 на 91,3% идентичны на 459-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF34 на 77,6% идентична предполагаемой ORF (ORF34.ng) N.gonorrhoeae на 161-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF34ng (SEQ ID NO: 213) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 214):
ORF34ng и ORF34-1 идентичны на 90,0% на 459-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (двойное подчеркивание) и нескольких предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонококка, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
Пример 26
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 215):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 216; ORF4):
Дальнейший анализ последовательности позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 217):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 218; ORF4-1):
Компьютерный анализ данной аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF4 на 93,5% идентична ORF (ORF4a) штамма A N.meningitidis на 93-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF4a (SEQ ID NO: 219) такова:
Предсказывается, что кодируемый белок характеризуется аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 220):
Лидерный пептид подчеркнут.
Дальнейший анализ данных последовательностей штамма А позволил установить полную последовательность ДНК (SEQ ID NO: 221):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 222; ORF4a-1):
ORF4a-1 и ORF4-1 идентичны на 99,7% на 287-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с белком внешней мембраны Pasteurella haemolitica (депозитарный № q08869)
ORF4 и данный белок внешней мембраны идентичны на 33% на 91-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF4 на 93,6% идентична ORF (ORF4.ng) N.gonorrhoeae на 94-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF4ng (SEQ ID NO: 223), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 224):
Дальнейший анализ позволил установить полноразмерную последовательность ДНК ORF4ng (SEQ ID NO: 225):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 226; ORF4ng-1):
Она на 97,6% идентична ORF4-1 на 288-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF4ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с белком внешней мембраны из базы данных:
ID LIP2_PASHA STANDARD; PRT; 276 аминокислот
Депозитарный № Q08869
дата - 1 ноября 1995 г. (rel. 32: создан)
дата - 1 ноября 1995 г. (rel. 32: последнее изменение последовательности);
дата - 1 ноября 1995 г. (rel. 32: последнее изменение аннотации);
DE 28,2 кД: предшественник белка внешней мембраны...
Счет: Initl - 279; Initn - 416; Opt - 494
По Смиту-Уотерману - 494. Идентичны на 36,0%, область перекрывания - 275 аминокислот
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о гомологии с белком внешней мембраны Pasteurella haemolitica и о присутствии в составе белка гонококка предполагаемого сайта прикрепления к липидной составляющей прокариотической липопротеиновой мембраны, предсказывается, что эти белки, N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF4-1 (30 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы электрофоретически в SDS-ПААГ. На фиг.8А и 8В соответственно показаны результаты аффинной очистки His-химерных и CST-химерных белков. Очищенный His-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в ТИФА (получены позитивные результаты), в Вестерн-блоттинге (фиг. 8С), сортировке FACS (фиг. 8D) и тесте на бактерицидность (фиг. 8Е). Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORF4-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
На фиг. 8F показаны кривые гидрофильности, антигенного индекса и параметры AMPHI последовательности ORF4-1.
ПРИМЕР 27
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 227):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 228; ORF8):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Мотивы последовательности
ORF8 является богатой пролином последовательностью и характеризуется таким распределением остатков пролина, которое характерно для поверхностной локализации белка. Кроме того, присутствие мотива RGD может указывать на возможную роль в процессе адгезии на бактериальных клетках.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF8 на 86,5% идентична ORF (ORF8.ng) N.gonorrhoeae на 312-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF8ng (SEQ ID NO: 229), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 230):
Основываясь на параметрах мотивов в составе этих последовательностей, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 28
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 231):
Она соответствует следующей аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 232; ORF61):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 233):
Она соответствует следующей аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 234; ORF61-1):
На фиг. 9 показаны кривые гидрофильности, антигенного индекса и параметры AMPHI для последовательности ORF61-1. Дальнейший компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с белком baf В.pertussis (депозитарный № U12020)
ORF61 и белок baf на 33% идентичны на 166-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF61 на 97,4% идентична ORF (ORF61a) штамма A N.meningitidis на 189-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF61a (SEQ ID NO: 235):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 236):
ORF61a и ORF61-1 на 98,5% идентичны на 591-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF61 на 94,2% идентична предполагаемой ORF (ORF61.ng) N.gonorrhoeae на 189-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF61ng (SEQ ID NO: 237), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 238):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 239):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 240; ORF61ng-1):
ORF61ng-1 и ORF61-1 на 93,9% идентичны на 591-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о гомологии с белком baf В.pertussis и присутствии предполагаемого сайта прикрепления к липидной составляющей прокариотического мембранного липопротеина, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 29
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 241):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 242; ORF62):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 243):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 244; ORF62-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим трансмембранным белком НI0976 H.influenzae (депозитарный № Q57147)
ORF62 и НI0976 идентичны на 50% на 114-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF62 на 99,5% идентична ORF (ORF62a) штамма A N.meningitidis на 216-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF62a (SEQ ID NO: 245):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 246):
ORF62a и ORF62-1 на 98,9% идентичны на 284-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF62 на 99,5% идентична предполагаемой ORF (ORF62.ng) N.gonorrhoeae на 216-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF62ng (SEQ ID NO: 247):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 248):
ORF62ng и ORF62-1 идентичны на 97,9% на 283-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF62ng проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком Н.influenzae:
sp|Q57147|Y976_HAEIN гипотетический белок НI0976
>gi|1074589|pir||B64163 гипотетический белок НI0976 -Haemophilus influenzae (штамм Rd KW20)
>gi|1574004 (U32778) гипотетический белок (Haemophilus influenzae); длина = 128
Счет = 106 бит (262). Ожидаемое = 2е-22.
Идентичны = 56/114 (49%). Позитивные = 68/114 (59%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о гомологии с трансмембранным белком Н.influenzae и присутствии предполагаемой лидерной последовательности и нескольких трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предполагается, что данные белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, a также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 30
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 249):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 250; ORF64):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 251):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 252; ORF 64-1):
Компьютерный анализ данной аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF64 на 92,6% идентична ORF (ORF64a) штамма A N.meningitidis на 392-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF64a (SEQ ID NO: 253):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 254):
ORF64а и ORF64-1 на 96,6% идентичны на 706-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF64 на 86,6% идентична предполагаемой ORF (ORF64.ng) N.gonorrhoeae на 387-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF64ng (SEQ ID NO: 255), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 256):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 257):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 258; ORF64ng-1):
ORF64ng-1 и ORF64-1 на 93,8% идентичны на 706-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF64ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с белком A.caulinodans:
sp|Q04850|NTRY_AZOCA азот-регулирующий белок NTRY
>gi|77479|pir||S18624 белок ntrY (Azorhizobium caulinodans)
>gi|38737 (X63841) продукт гена NtrY (Azorhizobium caulinodans); длина = 771
Счет = 218 бит (550). Ожидаемое = 7е-56.
Идентичность = 195/720 (27%). Позитивные = 320/720 (44%). Гэпы = 58/720 (8%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (двойное подчеркивание) и нескольких предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонокка, предполагается, что данные белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 31
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 259):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 260; ORF 66):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 261):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 262; ORF66-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим белком о221 E.coli (депозитарный № Р37619)
ORF66 и белок о221 на 67% идентичны на 155-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF66 на 96,1% идентична ORF (ORF66a) штамма A N.meningitidis на 155-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF66a (SEQ ID NO: 263):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 264):
ORF66a и ORF66-1 на 97,8% идентичны на 228-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF66 на 94,2% идентична предполагаемой ORF (ORF66.ng) N.gonorrhoeae на 155-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF66ng (SEQ ID NO: 265) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 266):
Альтернативная предлагаемая последовательность такова:
ORF66ng и ORF66-1 на 96,1% идентичны на 228-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF66ng проявляет существенный уровень гомологии с ORF E.coli:
sp|P37619|YHHQ_ECOLI гипотетический белок 25,3 кД, кодируется на межгенном интервале FtsY-NikA (0221)
>gi|1073495|pir||S47690 гипотетический белок о221 Escherichia coli
>gi|466607|U00039| конкретная линия - (Escherichia coli) не определена
>gi|1789882 (АЕ000423) гипотетический белок 25,3 кД на межгенном участке ftsY-nikA (Escherichia coli); длина = 221
Счет = 273 бит (692). Ожидаемое = 5е-73.
Идентичность = 132/203 (65%). Позитивные = 155/203 (76%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о гомологии с белком E.coli и присутствии нескольких предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 32
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 267):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 268; ORF72):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 269):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 270; ORF72-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF72 на 98% идентична ORF (ORF72a) штамма A N.meningitidis на 147-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF72a (SEQ ID NO: 271):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 272):
ORF72a и ORF72-1 на 100,0% идентичны на 150-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF72 на 89% идентична предполагаемой ORF (ORF72.nq) N.gonorrhoeae на 173-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF72ng (SEQ ID NO: 273), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 274):
Дальнейший анализ позволил идентифицировать следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 275):
Она соответствует такой аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 276; ORF72ng-1):
ORF72ng-1 и ORF72-1 на 89,7% идентичны на 145-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о наличии предполагаемой лидерной последовательности и трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, a также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 33
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 277):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 278; ORF73):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 279):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 280; ORF73-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF73 на 90,8% идентична ORF (ORF73a) штамма А N.meningitidis на 76-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF73a (SEQ ID NO: 281):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 282):
ORF73a и ORF73-1 на 91,3% идентичны на 161-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF73 на 92,1% идентична предполагаемой ORF (ORF73.ng) N.gonorrhoeae на 76-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF73ng (SEQ ID NO: 283) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 284) :
ORF73ng и ORF73-1 на 93,8% идентичны на 161-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о наличии предполагаемой лидерной последовательности и предполагаемого трансмембранного домена в составе белка гонококка, предсказывается, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 34
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 285):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 286; ORF75):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 287):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 288; ORF75-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF75 на 95,8% идентична ORF (ORF75a) штамма А N.meningitidis на 283-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF75a (SEQ ID NO: 289):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 290):
ORF75a и ORF75-1 на 98,3% идентичны на 291-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF75 на 93,2% идентична предполагаемой ORF (ORF75.ng) N.gonorrhoeae на 292-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF75ng (SEQ ID NO: 291), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 292):
Дальнейший анализ позволил идентифицировать следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 293):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 294; ORF75ng-1):
ORF75ng-1 и ORF75-1 на 96,2% идентичны на 291-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF75ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком E.coli:
sp|P45528|YRAL_ECOLI гипотетический белок 31,3 кД, кодируется на межгенном интервале AgaI-MTR (F286)
>gi|606086 (U18997) ORF_f286 (Escherichia coli)
>gi|1789535 (AE000395) гипотетический белок 31,3 кД на межгенном участке agai-mtr (Escherichia coli); длина = 286
Счет = 218 бит (550). Ожидаемое = 3е-56.
Идентичность = 128/284 (45%). Позитивные = 171/284 (60%). Гэпы = 4/284 (1%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого трансмембранного домена в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 35
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 295):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 296; ORF76):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 297):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 298; ORF76-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF76 на 96,7% и на 96,8% идентична ORF (ORF76a) штамма A N.meningitidis соответственно на 30- и 31-аминокислотных перекрывающихся участках:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF76a (SEQ ID NO: 299):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 300):
ORF76a и ORF76-1 на 97,6% идентичны на 252-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
Сопоставленные аминокислотные последовательности ORF76 и предполагаемой ORF (ORF76.ng) N.gonorrhoeae по N- и С-концам идентичны на 96,7% и на 100% на участках перекрывания, состоящих соответственно из 30 и 31 аминокислот:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF76ng (SEQ ID NO: 301):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 302):
ORF76ng и ORF76-1 на 96,0% идентичны на 252-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF76ng проявляет существенный уровень гомологии с предшественником экспортирующего белка В.subtilis:
sp|Р24327|RPSA_BACSU предшественник экспортирующего белка PRSA
>gi|98227|pir|S15269 липопротеин 33 кД (Bacillus subtilis)
>gi|39782 (Х57271) липопротеин 33 кД (Bacillus subtilis)
>gi|2226124|gnl|PID|e325181 (Y14077) липопротеин 33 кД (Bacillus subtilis)
>gi|2633331|gnl|PID|el182997 (Z99109) молекулярный шаперонин (Bacillus subtilis); длина = 292
Счет = 50,4 бит (118). Ожидаемое = le-05.
Идентичность = 48/199 (24%). Позитивные = 82/199 (41%). Гэпы = 32/199 (16%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности и мотива RGD в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF76-1 (27,8 кД) была клонирована в вектор рЕТ и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы электрофоретически в SDS-ПААГ. На фиг. 10А показаны результаты аффинной очистки His-химерного белка. Очищенный His-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в Вестерн-блоттинге (фиг. 10В), в ТИФА (получены позитивные результаты) и сортировке FACS (фиг. 10С). Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORF76-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 36
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 303):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 304; ORF81):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 305):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 306; ORF81-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF81 на 84,7% и на 99,2% идентична ORF (ORF81a) штамма A N.meningitidis соответственно на 85- и 121-аминокислотных перекрывающихся участках:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF81a (SEQ ID NO: 307) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 308):
ORF81a и ORF81-1 на 77,9% идентичны на 524-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
Сопоставленные аминокислотные последовательности ORF81 и предполагаемой ORF (ORF81.ng) N.gonorrhoeae по N- и С-концам идентичны на 82,4% и на 97,5% на участках перекрывания, состоящих соответственно из 85 и 121 аминокислот:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF81ng
(SEQ ID NO: 309):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 310):
ORF81ng и ORF81-1 на 96,4% идентичны на 524-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF81ng проявляет существенный уровень гомологии с ОМР E.coli:
gi|1256380 (U50906) белок, ассоциированный c адгезионным белком внешней мембраны (E.coli); длина = 547
Счет = 87,4 бит (213). Ожидаемое = 2е-16.
Идентичность = 122/468 (26%). Позитивные = 198/468 (42%). Гэпы = 70/468 (14%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (подчеркнута дважды) и нескольких предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 37
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 311):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 312; ORF83):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 313):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 314; ORF83-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF83 на 96,4% идентична ORF (ORF83a) штамма А N.meningitidis на 197-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF83a (SEQ ID NO: 315):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 316):
ORF83a и ORF83-1 на 98,4% идентичны на 313-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF83 на 94,9% идентична предполагаемой ORF (ORF83.ng) N.gonorrhoeae на 197-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF83ng (SEQ ID NO: 317):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 318):
ORF83ng и ORF83-1 на 97,1% идентичны на 313-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого мотива А (Р-петли) сайта связывания АТФ/ГТФ в составе белка гонококка (подчеркнуты дважды) и предполагаемого сайта присоединения к липидной составляющей прокариотической липопротеиновой мембраны (подчеркнута одной линией), предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonоrrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 38
Следующая последовательность ДНК, которая, как предполагается, полная, была идентифицирована у N.meningitidis (SEO ID 319):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 320; ORF84):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 321):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 322; ORF84-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF84 на 93,9% идентична ORF (ORF84a) штамма A N.meningitidis на 395-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF84a (SEQ ID NO: 323):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 324):
ORF84a и ORF84-1 на 95,2% идентичны на 395-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF84 на 94,2% идентична предполагаемой ORF (ORF84.ng) N.gonorrhoeae на 395-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF84ng (SEQ ID NO: 325):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 326):
ORF84ng и ORF84-1 на 95,4% идентичны на 395-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого трансмембранного домена (подчеркнут одной линией) в составе белка гонококка и предполагаемого мотива А (Р-петли) сайта связывания АТФ/ГТФ (подчеркнуты дважды), предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 39
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 327):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 328; ORF88):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 329):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 330; ORF88-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF88 на 95,7% идентична ORF (ORF88a) штамма А N.meningitidis на 371-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF88a (SEQ ID NO: 331):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 332):
ORF88a и ORF88-1 на 100,0% идентичны на 671-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF88 на 93,8% идентична предполагаемой ORF (ORF88.ng) N.gonorrhoeae на 371-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF88ng (SEQ ID NO: 333), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 334):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 335):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 336; ORF88ng-1):
ORF88ng-1 и ORF88-1 на 97,0% идентичны на 671-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF88ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком Aquifex aeolicus:
gi|2984296 (АЕ000771) гипотетический белок (Aquifex aeolicus); длина = 537
Счет = 94,4 бит (231). Ожидаемое = 2е-18.
Идентичность = 91/334 (27%). Позитивные = 159/334 (47%). Гэпы = 59/334 (17%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого трансмембранного домена в составе белка гонококка, предсказывается, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 40
Следующая последовательность ДНК, рассматривавшаяся как полная, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 337):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 338; ORF89):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 339):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 340; ORF89-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с PilE N.gonorrhoeae (депозитарный № Z69260)
ORF89 и белок PilE на 30% идентичны на 120-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF89 на 83,3% идентична ORF (ORF89a) штамма А N.meningitidis на 162-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF89a (SEQ ID NO: 341):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 342):
ORF89a и ORF89-1 на 83,3% идентичны на 162-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF89 на 84,6% идентична предполагаемой ORF (ORF89.ng) N.gonorrhoeae на 162-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF89ng (SEQ ID NO: 343):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 344):
Этот белок гонококка включает предполагаемую лидерную последовательность (подчеркнута) и N-концевой сайт метилирования (NMePhe или пили 4-го типа: подчеркнут дважды). Кроме того, ORF89ng и ORF89-1 на 88,3% идентичны на 162-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о параметрах мотивов в белке гонококка и гомологии с известным белком PilE, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF89-1 (13,6 кД) была клонирована в вектор pGex и зкспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы в SDS-ПААГ. На фиг. 11А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка. Очищенный GST-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в ТИФА, позитивные результаты которого подтверждают, что ORF89-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, могут применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 41
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 345):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 346; ORF91):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 347):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 348; ORF91-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF91 на 92,4% идентична ORF (ORF91a) штамма А N.meningitidis на 92-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF91a (SEQ ID NO: 349):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 350):
ORF91a и ORF91-1 на 98,0% идентичны на 196-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF91 на 84,8% идентична предполагаемой ORF (ORF91.ng) N. gonorrhoeae на 92-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF91ng (SEQ ID NO: 351), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 352):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 353):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 354; ORF91ng-1):
ORF91ng-1 и ORF91-1 на 92,3% идентичны на 196-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF91ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком E.coli:
sp|P45390|YRBC_ECOLI гипотетический белок 24,0 кД, кодируется на межгенном интервале MurA-RpoN (F211)
>gi|606130 (U18997) ORF_f211 (Escherichia coli)
>gi|1789583 (AE000399) гипотетический белок 24,0 кД на межгенном участке murZ-rpoN (Escherichia coli); длина = 211
Счет = 70,6 бит (170). Ожидаемое = 6е-12.
Идентичность = 42/137 (30%). Позитивные = 76/137 (54%). Гэпы = 6/137 (4%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 42
Следующая последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 355):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 356; ORF97):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 357):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 358; ORF97-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF97 на 88,7% идентична ORF (ORF97a) штамма А N.meningitidis на 159-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF97a (SEQ ID NO: 359):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 360):
ORF97a и ORF97-1 на 95,6% идентичны на 159-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF97 на 88,1% идентична предполагаемой ORF (ORF97.ng) N.gonorrhoeae на 159-аминокислотном перекрывающем участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF97ng (SEQ ID NO: 361), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся такой аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 362):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 363):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 364; ORF97ng-1):
ORF97ng-1 и ORF97-1 на 96,2% идентичны на 159-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности в составе белка гонококка, предсказывается, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF97-1 (15,3 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы в SDS-ПААГ. На фиг. 12А и 12В показаны результаты аффинной очистки соответственно GST-химерного и His-химерного белков. Очищенный GST-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в Вестерн-блоттинге (фиг. 12С), в ТИФА (получены позитивные результаты) и в сортировке FACS (фиг. 12D). Эти экспериментальные результаты подтверждают, что ORF97-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
На фиг. 12Е показаны кривые гидрофильности, антигенного индекса и параметры AMPHI для последовательности ORF97-1.
ПРИМЕР 43
Следующая последовательность ДНК, как предполагается, полная, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 365):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 366; ORF106):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК (SEQ ID NO: 367):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 368; ORF106-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF106 на 87,4% идентична ORF (ORF106a) штамма А N.meningitidis на 199-аминокислотном перекрывающемся участке:
В результате замены К→N (лизина на глутамин) в 111-м положении уровень гомологии ORF106a и ORF106-1 составляет 87,9% на том же самом 199-аминокислотном перекрывающемся участке.
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF106a (SEQ ID NO: 369):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 370):
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF106 на 90,5% идентична предполагаемой ORF (ORF106.ng) N.gonorrhoeae на 199-аминокислотном перекрывающемся участке:
В результате замены К→N в 111-м положении уровень гомологии ORFl06ng и ORF106-1 составляет 91,0% на том же самом 199-аминокислотном перекрывающемся участке.
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF106ng (SEQ ID NO: 371):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 372):
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF106-1 (18 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы в SDS-ПААГ. На фиг. 13А показаны результаты аффинной очистки His-химерного белка, а на фиг. 13В результаты экспрессии GST-химерного белка в клетках E.coli. Очищенный His-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в сортировке FACS (фиг. 13С). Полученные экспериментальные результаты подтверждают, что ORF106-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 44
Следующая последовательность ДНК, как предполагается, полная, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 373):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 374; ORF10):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК (SEQ ID NO: 375):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 376; ORF10-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
ПРЕДПОЛОЖЕНИЕ
Предполагается, что ORF10-1 является предшественником интегрального мембранного белка, поскольку она включает несколько (12-13) потенциальных трансмембранных сегментов, а также вероятный отщепляемый сигнальный пептид.
Гомология с EpsM Streptococcus thermophilus (депозитарный № U40830)
ORF10 проявляет гомологию с геном epsM S.thermophilus, который кодирует белок, имеющий сходный с ORF10 размер и вовлечен в синтез экзополисахаридов. Имеются и другие случаи гомологии с прокариотическими мембранными белками:
Идентичность = (25%)
Идентичность = 15/57 (26%). Позитивные = 31/57 (54%).
Идентичность = 16/96 (16%). Позитивные = 36/96 (37%).
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF10 на 95,4% идентична ORF (ORF10a) штамма А N.meningitidis на 475-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF10a (SEQ ID NO: 377):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 378):
ORF10a и ORF10-1 на 95,4% идентичны на 475-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae ORF10 на 94,1% идентична ORF (ORF10.ng) N.gonorrhoeae на 475-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF10ng (SEQ ID NO: 379):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 380):
ORF10ng и ORF10-1 на 96,4% идентичны на 473-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого лидерного пептида и нескольких трансмембранных сегментов, а также присутствии мотива «лейциновая молния» (4 остатка лейцина, разделенные 6 аминокислотами: показаны полужирным шрифтом), предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 45
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 381):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 382; ORF65):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 383):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 384; ORF65-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF65 на 92,0% идентична ORF (ORF65a) штамма А N.meningitidis на 150-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF65a (SEQ ID NO: 385):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 386):
ORF65a и ORF65-1 на 96,5% идентичны на 289-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF65 на 89,6% идентична предполагаемой ORF (ORF65.ng) N.gonorrhoeae на 212-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF65ng (SEQ ID NO: 387), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 388):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 389):
Она кодирует следующую аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 390):
ORF65ng-1 и ORF65-1 на 89,0% идентичны на 290-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого трансмембранного домена в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 46
Следующая последовательность ДНК, предположительно являющаяся полной, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 391):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 392; ORF103):
Дальнейший анализ позволил установить последовательность ДНК (SEQ ID NO: 393):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 394; ORF103-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF103 на 93,8% идентична ORF (ORF103a) штамма А N.meningitidis на 222-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF103a (SEQ ID NO: 395):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 396):
ORF103a и ORF103-1 на 97,7% идентичны на 222-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF103 на 95,5% идентична предполагаемой ORF (ORF103.ng) N.gonorrhoeae на 222-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF103ng (SEQ ID NO: 397):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 398):
Кроме того, ORF103ng и ORF103-1 на 97,3% идентичны на 222-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (двойное подчеркивание) и нескольких предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 47
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 399):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 400; ORF104):
Дальнейший анализ позволил установить еще одну частичную нуклеотидную последовательность ДНК (SEQ ID NO: 401):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 402; ORF104-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим белком НI0878 H.influenzae (депозитарный № U32769)
ORF104 и НI0878 идентичны на 40% на 277-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF104 на 95,3% идентична ORF (ORF104a) штамма А N.meningitidis на 277-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF104a (SEQ ID NO: 403):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 404):
ORF104a и ORF104-1 на 98,2% идентичны на 277-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF104 на 93,9% идентична предполагаемой ORF (ORF104.ng) N.gonorrhoeae на 277-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF104ng (SEQ ID NO: 405), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 406):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность гонококка (SEQ ID NO: 407):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 408; ORF104ng-1):
ORF104ng-1 и ORF104-1 на 97,5% идентичны на 277-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF104ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком H.influenzae:
gi|1573895 (U32769) гипотетический (Haemophilus influenzae); длина = 306
Счет = 237 бит (598). Ожидаемое = 8е-62.
Идентичность = 114/280 (40%). Позитивные = 168/280 (59%). Гэпы = 8/280 (2%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности и нескольких трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 48
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 409):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 410; ORF105):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 411):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 412; ORF105-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF105 на 89,4% идентична ORF (ORF105a) штамма А N.meningitidis на 226-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF105a (SEQ ID NO: 413):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 414):
ORF105a и ORF105-1 на 93,8% идентичны на 291-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF105 на 87,5% идентична предполагаемой ORF (ORF105.ng) N.gonorrhoeae на 312-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF105ng (SEQ ID NO: 415), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 416):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 417):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 418; ORF105ng-1):
ORF105ng-1 и ORF105-1 на 93,5% идентичны на 291-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF105ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с ферментом дрожжей:
sp|P41888|TNR3_SCHPO тиаминпирофосфокиназа (ТРК) (тиаминкиназа)
>gi|1076928|pir||S52350 тиаминпирофосфокиназа (КФ 2.7.6.2) - пивные дрожжи (Schizosaccharomyces pombe)
>gi|666111 (X84417) тиаминпирофосфокиназа (Schizosaccharomyces pombe)
>gi|2330852|gnl|PID|e334056 (Z98533) тиаминпирофосфокиназа (Schizosaccharomyces pombe); длина = 569
Счет = 105 бит (259). Ожидаемое = 4е-22.
Идентичность = 64/192 (33%). Позитивные = 94/192 (48%). Гэпы = 3/192 (1%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого трансмембранного домена в составе белка гонококка, предсказывается, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 49
Следующая частичная последовательность ДНК, которая предположительно является полной, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 419):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 420; ORF107):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF107 на 97,8% идентична ORF (ORFl07a) штамма А N.meningitidis на 186-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF107a (SEQ ID NO: 421):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 422):
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF107 на 95,7% идентична предполагаемой ORF (ORF107.ng) N.gonorrhoeae на 188-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORFl07ng (SEQ ID NO: 423), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 424):
Основываясь на присутствии предполагаемого трансмембранного домена в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 50
Следующая последовательность ДНК, предположительно являющаяся полной, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 425):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 426; ORF108):
Дальнейший анализ позволил установить такую последовательность ДНК (SEQ ID NO: 427):
Она соответствует следующей аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 428; ORF108-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF108 на 88,4% идентична предполагаемой ORF (OR.F108.ng) N.gonorrhoeae на 181-аминокислотном перекрывающемся участке:
ORF108-1 на 92,3% идентична ORF108ng на том же самом 181-аминокислотном перекрывающемся сегменте:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF108ng (SEQ ID NO: 429):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 430):
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого сайта присоединения к липидной составляющей прокариотического мембранного липопротеина (подчеркнут) и предполагаемого мотива А сайта связывания АТФ/ГТФ (Р-петля: двойное подчеркивание) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 51
Следующая последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 431):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 432; ORF109):
Дальнейший анализ позволил установить последовательность ДНК (SEQ ID NO: 433):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 434; ORF109-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF109 на 95,9% идентична ORF (ORFl09a) штамма А N.meningitidis на 147-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF109a (SEQ ID NO: 435):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 436):
ORF109a и ORF109-1 на 99,2% идентичны на 262-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF109 на 98,3% идентична предполагаемой ORF (ORF109.ng) N.gonorrhoeae на 231-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF109ng (SEQ ID NO: 437), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 438):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 439):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 440; ORF109ng-1):
ORF109ng и ORF109-1 на 98,9% идентичны на 262-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF109ng-1 проявляет гомологию с гипотетическим белком Pseudomonas:
sp|P29942|YCB9_PSEDE гипотетический белок 27,4 кД в 3'-сегменте оперона Cobo (ORF9)
>gi|94984|pir||I38164 гипотетический белок 9 - Pseudomonas sp.
>gi|551929 (М62866) ORF9 (Pseudomonas denitrificans); длина = 261
Счет = 175 бит (439). Ожидаемое = 3е-43.
Идентичность = 83/214 (38%). Позитивные = 131/214 (60%). Гэпы = 1/214 (0%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (двойное подчеркивание) и нескольких предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 52
Следующая последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 441):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 442; ORF110):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF88a N.meningitidis (штамм А)
ORF110 на 91,5% идентична (ORF88a) штамма А N.meningitidis на 188-аминокислотном перекрывающемся участке:
Однако последовательности ORF88 и ORF110 не сопоставляются, потому что они представляют два разных фрагмента одного и того же белка.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF110 на 88,6% идентична предполагаемой ORF (ORF110.ng) N.gonorrhoeae на 211-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF110ng (SEQ ID NO: 443), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 444):
Основываясь на присутствии предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, a также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 53
Следующая последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 445):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 446; ORF111):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF111 на 96,9% идентична ORF (ORF111a) штамма А N.meningitidis на 351-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF111a (SEQ ID NO: 447) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 448):
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF111 на 96,6% идентична ORF (ORF111.ng) N.gonorrhoeae на 351-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF111ng (SEQ ID NO: 449):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 450):
Этот белок проявляет гомологию с гипотетическим предшественником липопротеина Н.influenzae:
sp|P44550|YOJL_HAEIN гипотетический предшественник липопротеина НI0172
>gi|1074292|pir|4 гипотетический белок НI0172 Haemophilus influenzae (штамм Rd KW20)
>gi|1573128 (U32702) гипотетический белок (Haemophilus influenzae); длина = 346
Счет = 353 бит (896). Ожидаемое = 9е-97.
Идентичность = 181/344 (52%). Позитивные = 247/344 (71%). Гэпы = 4/344 (1%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 54
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 451):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 452; ORF35):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемым секретируемым VirG-гомологом N.meningitidis (депозитарный № А32247)
ORF и белок virg-h на 51% идентичны на 261-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF35 на 96,9% идентична ORF (ORF35a) штамма А N.meningitidis на 259-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF35a (SEQ ID NO: 453):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 454):
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF35 на 51,7% идентична предполагаемой ORF (ORF35.ngh) N.gonorrhoeae на 261-аминокислотном перекрывающемся участке:
Частичная нуклеотидная последовательность ORF35ngh (SEQ ID NO: 455), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся частичной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 456):
Основываясь на данном предсказании, эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 55
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 457):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 458; ORF46):
Дальнейший анализ позволил установить еще одну частичную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 459):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 460; ORF46-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF46 на 98,2% идентична предполагаемой ORF (ORF46.ng) N.gonorrhoeae на 111-аминокислотном перекрывающемся участке:
Частичная нуклеотидная последовательность ORF46ng (SEQ ID NO: 461), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся частичной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 462):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 463):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 464; ORF46ng-1):
ORF46ng-1 и ORF46-1 на 94,7% идентичны на 227-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF46ng-1 на 87,4% идентична ORF (ORF46a) штамма А N.meningitidis на 486-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная последовательность ДНК ORF46a (SEQ ID NO: 465):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 466):
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии характерной для адгезинов последовательности RGD в белке гонококка, предсказывается, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 56
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 467):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 468; ORF48):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 469):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 470; ORF48-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF48 на 94,1% идентична ORF (ORF48a) штамма А N.meningitidis на 119-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF48a (SEQ ID NO: 471):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 472):
ORF48a и ORF48-1 на 96,8% идентичны на 472-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF48 на 97,5% идентична предполагаемой ORF (ORF48ng) N.gonorrhoeae на 119-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF48ng (SEQ ID NO: 473), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 474):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 475):
Она соответствует белку, имеющему аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 476; ORF48ng-1):
ORF48ng-1 и ORF48-1 на 97,9% идентичны на 472-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (двойное подчеркивание) и двух предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонококка, предсказывается, что белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 57
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 477):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 478; ORF53):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 479):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 480; ORF53-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF53 на 93,5% идентична ORF (ORF53a) штамма A N.meningitidis на 139-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF53a (SEQ ID NO: 481):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 482):
ORF53a и ORF53-1 на 100,0% идентичны на 417-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF53 на 92,1% идентична предполагаемой ORF (ORF53ng) N.gonorrhoeae на 139-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF53ng (SEQ ID NO: 483), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 484):
Дальнейший анализ позволил установить еще одну частичную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 485):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 486; ORF53ng-1):
ORF53ng-1 и ORF53-1 на 94,0% идентичны на 336-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (двойное подчеркивание) и нескольких предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 58
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 487):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 488; ORF58):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 489):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 490; ORF58-1):
На основании компьютерного анализа этой аминокислотной последовательности предсказано присутствие трансмембранного участка, а также получены следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF58 на 96,6% идентична ORF (ORF58a) штамма A N.meningitidis на 89-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF58a (SEQ ID NO: 491) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 492):
ORF58a и ORF58-1 на 96,6% идентичны на 1014-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF58 полностью идентична предполагаемой ORF (ORF58ng) N.gonorrhoeae на 9-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF58ng (SEQ ID NO: 493), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся частичной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 494):
Эта частичная последовательность гонококка включает предполагаемый трансмембранный сегмент и предполагаемый мотив А сайта связывания АТФ/ГТФ (Р-петля: подчеркнута двойной линией). Более того, имеется домен, гомологичный белку FTSK E.coli, ассоциированному с клеточными делениями. Сопоставление ORF58ng и FtsK (депозитарный № р46889) указывает на 65%-ную идентичность на 459-аминокислотном перекрывающемся участке:
Дальнейший анализ ORF58ng позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 495):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 496; ORF58ng-1):
ORF58ng-1 и ORF58-1 на 97,2% идентичны на 1014-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF58ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с белком FtsK E.coii:
sp|P46889|FTSK_ECOLI белок клеточного деления FTSK
>gi|1651412|gnl|PID|d1015290 белок FTSK клеточных делений (Escherichia coli)
>gi|1651412|gnl|PID|d1015296 (D90727) белок FTSK клеточных делений (Escherichia coli)
>gi|1787117 (AE000191) белок FTSK клеточных делений (Escherichia coli); длина = 1329
Счет = 576 бит (1469). Ожидаемое = е-163.
Идентичность = 301/459 (65%). Позитивные = 353/459 (76%). Гэпы = 5/459 (1%)
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 59
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 497):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 498; ORF101):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 499):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 500; ORF101-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF101 на 91,2% и на 95,7% идентична ORF (ORF101а) штамма A N.meningitidis соответственно на 57- и на 69-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF101а (SEQ ID NO: 501):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 502):
ORF101a и ORF101-1 на 95,4% идентичны на 371-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF101 на 96,5% и на 95,1% идентична предполагаемой ORF (ORF101ng) N.gonorrhoeae соответственно на N-концевом 57-аминокислотном и С-концевом 61-аминокислотном перекрывающихся участках:
Нуклеотидная последовательность ORF101ng (SEQ ID NO: 503), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся частичной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 504):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 505):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 506; ORF101ng-1):
ORF101ng-1 и ORF101-1 на 97,6% идентичны на 371-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (двойное подчеркивание) и нескольких предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 60
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 507):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 508; ORF113):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемым секретируемым белком pspA N.meningitidis (депозитарный № AF030941)
ORF и pspA на 44% идентичны на 179-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF113 на 86,5% и на 94,1% идентична предполагаемой ORF (ORF113ng) N.gonorrhoeae, соответственно на N-концевом 52-аминокислотном и С-концевом 17-аминокислотном перекрывающихся участках:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF113ng (SEQ ID NO: 509), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 510):
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 61
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 511):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 512; ORF115):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемым секретируемым белком pspA N.meningitidis (депозитарный № AF030941)
ORF115 и белок pspA на 50% идентичны на 325-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF115 на 91,9% идентична предполагаемой ORF (ORF115.ng) N.gonorrhoeae на 334-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF115ng (SEQ ID NO: 513), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: NO 514):
Дальнейший анализ позволил установить следующую частичную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 515):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 516; ORF115ng-1):
Этот белок гонококка (ORF115ng-1) на 91,9% идентичен ORF115 на 334-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, он проявляет гомологию с секретируемым белком N.meningitidis, внесенным в базу данных:
gi|2623258 (AF030941) предполагаемый секретируемый белок (Neisseria meningitidis); длина = 2273
Счет = 604 бит (1541). Ожидаемое = е-172.
Идентичность = 325/678 (47%). Позитивные = 449/678 (65%). Гэпы = 22/678 (3%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 62
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 517):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 518; ORF117):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемым секретируемым белком pspA N.meningitidis (депозитарный № AF030941)
ORF117 и белок pspA на 45% идентичны на 224-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF117 на 90% идентична ORF (ORF117ng) N.gonorrhoeae на 230-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF117ng (SEQ ID NO: 519), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 520):
Дальнейший анализ позволил установить еще одну частичную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 521):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 522; ORF117ng-1):
ORF117ng-1 на 90% идентична ORF117 на 230-аминокислотном перекрывающемся участке. Кроме того, он проявляет гомологию с секретируемым белком N.meningitidis, внесенным в базу данных:
gi|2623258 (AF030941) предполагаемый секретируемый белок (Neisseria meningitidis); длина = 2273
Счет = 604 бит (1541). Ожидаемое = е-172.
Идентичность = 325/678 (47%). Позитивные = 449/678 (65%). Гэпы = 22/678 (3%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 63
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 523):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 524; ORF119):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 525):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 526; ORF119-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF119 на 93,7% идентична ORF (ORF119a) штамма А N.meningitidis на 175-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF119a (SEQ ID NO: 527) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 528):
ORF119a и ORF119-1 на 98,6% идентичны на 428-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF119 на 93,1% идентична предполагаемой ORF (ORF119ng) N.gonorrhoeae на 175-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF119ng (SEQ ID NO: 529) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 530):
ORF119ng и ORF119-1 на 98,4% идентичны на 428-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 64
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 531):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 532; ORF134):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 533):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 534; ORF134-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим белком о648 E.coli (депозитарный № АЕ000189)
ORF134 и белок о648 на 45% идентичны на 153-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF134 на 98,7% идентична ORF (ORF134a) штамма А N.meningitidis на 154-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF134a (SEQ ID NO: 535):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 536):
ORF134a и ORF134-1 на 100,0% идентичны на 388-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF134 на 96,8% идентична предполагаемой ORF (ORF134.ng) N.gonorrhoeae на 154-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF134ng (SEQ ID NO: 537):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 538):
ORF134ng и ORF134-1 на 97,9% идентичны на 388-аминокислотном перекрывающемся участке:
ORF134ng также проявляет гомологию с транспортером ABC E.coli:
sp|P75831|YBJZ_ECOLI гипотетический ABC-транспортный АТФ-связывающий белок YBJZ
>gi5 (AE000189) о648; сходный с YBBA_HAEIN SW: P45247 (Escherichia coli); длина = 648
Счет = 297 бит (753). Ожидаемое = 6е-80.
Идентичность = 162/389 (41%). Позитивные = 230/389 (58%). Гэпы = 1/389 (0%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии лидерного пептида и трансмембранных сегментов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 65
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 539):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 540; ORF135):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 541):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 542; ORF135-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF135 на 99,0% идентична ORF (ORF135a) штамма A N.meningitidis на 197-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF135a (SEQ ID NO: 543):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 544):
ORF135a и ORF135-1 на 99,3% идентичны на 300-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF135 на 97% идентична предполагаемой ORF (ORF135ng) N.gonorrhoeae на 201-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF135ng (SEQ ID NO: 545), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 546):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность гонококка (SEQ ID NO: 547):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 548; ORF135ng-1):
ORF135ng-1 и ORF135-1 на 97,0% идентичны на 300-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии нескольких предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 66
Следующая последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 549):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 550; ORF136):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 551):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 552; ORF136-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF136 на 71,7% идентична ORF (ORF136a) штамма А N.meningitidis на 237-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF136a (SEQ ID NO: 553):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 554):
ORF136a и ORF136-1 на 73,1% идентичны на 238-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF136 на 92,3% идентична предполагаемой ORF (ORF136ng) N.gonorrhoeae на 234-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF136ng (SEQ ID NO: 555):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 556):
ORF136ng-1 и ORF136-1 на 93,6% идентичны на 235-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на присутствии предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 67
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 557):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 558; ORF137):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 559):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 560; ORF137-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF137 на 93,3% идентична ORF (ORF137a) штамма А N.meningitidis на 149-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF137a (SEQ ID NO: 561):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 562):
ORF137a и ORF137-1 на 97,3% идентичны на 300-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF137 на 89,9% идентична предполагаемой ORF (ORF137ng) N.gonorrhoeae на 149-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF137ng (SEQ ID NO: 563):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 564):
ORF137ng и ORF137-1 на 96,0% идентичны на 300-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на присутствии предполагаемого сайта прикрепления к липидной составляющей прокариотического мембранного липопротеина (подчеркнут) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 68
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 565):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 566; ORF138):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 567):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 568; ORF138-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF138 на 99,2% идентична ORF (ORF138a) штамма А N.meningitidis на 123-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF138a (SEQ ID NO: 569):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 570):
ORF138a и ORF138-1 на 99,7%* идентичны на 298-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF138 на 94,3% идентична ORF (ORF138ng) N.gonorrhoeae на 123-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF138ng (SEQ ID NO: 571):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 572):
ORF138ng и ORF138-1 на 94,3% идентичны на 299-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF138ng гомологична белку htrB Pseudomonas fluorescens:
gnl|PID|e334283 (Y14568) белок htrB (Pseudomonas fluorescens); длина = 253
Счет = 80,8 бит (196). Ожидаемое = 9е-15.
Идентичность = 49/151 (32%). Позитивные = 79/151 (51%). Гэпы = 6/151 (3%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого трансмембранного домена в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF138-1 (57 кД) была клонирована в векторы pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы электрофоретически в SDS-ПААГ. На фиг. 14А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка. Очищенный GST-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в ТИФА (получены позитивные результаты) и в сортировке FACS (фиг. 14В). Эти экспериментальные результаты подтверждают, что ORF138-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 69
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 573):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 574; ORF139):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 575):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 576; ORF139-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF139 на 94,7% идентична ORF (ORF139a) штамма А N.meningitidis на 189-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF139a (SEQ ID NO: 577):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 578):
ORF139a и ORF139-1 на 96,5% гомологичны на 514-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF139 на 95,2% идентична предполагаемой ORF (ORF139ng) N.gonorrhoeae на 189-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF139ng (SEQ ID NO: 579), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 580):
Дальнейший анализ позволил установить вариантную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 581):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 582; ORF139ng-1):
ORF139ng-1 и ORF139-1 на 95,9% идентичны на 513-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на присутствии предполагаемого мотива (подчеркнут), связанного с мембранной транспортной системой, зависимой от связывания с белками, в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 70
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 583):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 584; ORF140):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 585):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 586; ORF140-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF140 на 95,4% идентична ORF (ORF140a) штамма А N.meningitidis на 87-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF140a (SEQ ID NO: 587):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 588):
ORF140a и ORF140-1 на 99,8% идентичны на 461-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF140 на 92% идентична предполагаемой ORF (ORF140ng) N.gonorrhoeae на 87-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF140ng (SEQ ID NO: 589), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 590):
Дальнейший анализ позволил установить вариантную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 591):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 592; ORF140ng-1):
ORF140ng-1 и ORF140-1 на 96,3% идентичны на 461-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF140ng-1 гомологична белку E.coli:
gi|882633 (U29579) ORF_o454 (Escherichia coli)
>gi|1789097 (AE000358) o454;
Эта ORF, состоящая из 454 аминокислот, на 34% идентична (9 гэпов) 444 аминокислотам в составе примерно 456-аминокислотного белка GNTP_ BACLI SW: P46832 (Escherichia coli); длина = 454
Счет = 210 бит (529). Ожидаемое = 1е-53.
Идентичность = 130/384 (33%). Позитивные = 199/384 (49%). Гэпы = 19/384 (4%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (двойное подчеркивание) и нескольких предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 71
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 593):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 594; ORF141):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 595):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 596; ORF141-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF141 на 95,0% идентична ORF (ORF141a) штамма А N.meningitidis на 140-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF141a (SEQ ID NO: 597) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 598):
ORF141a и ORF141-1 на 98,2% идентичны на 553-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF141 на 95% идентична предполагаемой ORF (ORF141ng) N.gonorrhoeae 140-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF141ng (SEQ ID NO: 599), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 600):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 601):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 602; ORF141ng-1):
ORF141ng-1 и ORF141-1 на 97,5% идентичны на 553-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на присутствии нескольких предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, a также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 72
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 603):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 604; ORF142):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 605):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 606; ORF142-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF142 на 88,1% идентична предполагаемой ORF (ORF142ng) N.gonorrhoeae на 59-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF142ng (SEQ ID NO: 607) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 608):
Подчеркнутая последовательность (аминокислотный мотив «ароматическая-Xaa-ароматическая») обычно обнаруживается в С-концевой части белков внешней мембраны.
ORF142ng-1 и ORF142-1 на 95,6% идентичны на 342-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF142ng гомологична белку НесВ E.chrysanthemi:
gi|1772622 (L39897) белок НесВ (Erwinia chrysanthemi);
длина = 558
Счет = 119 бит (295). Ожидаемое = 3е-26.
Идентичность = 88/346 (25%). Позитивные = 151/346 (43%). Гэпы = 22/346 (6%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 73
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 609):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 610; ORF143):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 611):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 612; ORF143-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF143 на 92,4% идентична ORF (ORF143a) штамма А N.meningitidis на 105-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF143a (SEQ ID NO: 613):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 614):
ORF143a и ORF143-1 на 97,1% идентичны на 207-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF143 на 95,5% идентична предполагаемой ORF (ORF143ng) N.gonorrhoeae на 110-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF143ng (SEQ ID NO: 615), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 616):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 617):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 618; ORF143ng-1):
ORF143ng-1 и ORF143-1 на 95,8% идентичны на 214-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на присутствии предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 74
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 619):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 620; ORF144):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 621):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 622; ORF144-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF144 на 96,3% идентична ORF (ORF144a) штамма А N.meningitidis на 136-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF144a (SEQ ID NO: 623):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 624):
ORF144a и ORF144-1 на 97,8% идентичны на 406-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF144 на 91,2% идентична предполагаемой ORF (ORF144ng) N.gonorrhoeae на 136-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF144ng (SEQ ID NO: 625), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 626):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 627):
Она кодирует вариант ORF144ng, характеризующийся такой аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 628; ORF144ng-1):
ORF144ng-1 и ORF144-1 на 94,1% идентичны на 406-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные об идентификации нескольких предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 75
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 629):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 630; ORF146):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 631):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 632; ORF146-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF146 на 98,6% идентична ORF (ORF146a) штамма А N.meningitidis на 74-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF146a (SEQ ID NO: 633):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 634):
ORF146a и ORF146-1 на 99,5% идентичны на 374 аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF146 на 97,3% идентична предполагаемой ORF (ORF146ng) N.gonorrhoeae на 75-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF146ng (SEQ ID NO: 635), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 636):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 637):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 638; ORF146ng-1):
ORF146ng-1 и ORF146-1 на 96,5% идентичны на 375-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF146ng-1 проявляет гомологию с гипотетическим белком E.coli:
sp|P33011|YEEA_ECOLI гипотетический белок 40,0 кД, кодируемый геном межгенного сегмента CobU-SbmC
>gi|1736674|gnl|PID|d1016553 (D90838) ORF_ID: o348#20; сходный с последовательностью швейцарской базы данных, депозитарный № Р33011 (Escherichia coli)
>gi|1736682|gnl|PID|d1016560 (D90839) ORF_ID: o348#20; сходный с последовательностью швейцарской базы данных, депозитарный № Р33011 (Escherichia coli)
>gi|1788318 (АЕ000292) f352; 100%-ная идентичность фрагменту YEEA_ECOLI SW: P33011, но включает дополнительный 203-аминокислотный С-концевой участок (Escherichia coli); длина = 352
Счет = 109 бит (271). Ожидаемое = 2е-23.
Идентичность = 89/347 (25%). Позитивные = 150/347 (42%). Гэпы = 21/347 (6%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные об идентификации нескольких трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 76
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 639):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 640; ORF147):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 641):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 642; ORF147-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим белком ORF286 E.coli (депозитарный № U18997)
ORF147 и последовательность ORF286 E.coli на 36% идентичны на 237-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF147 на 96,6% идентична ORF75a штамма A N.meningitidis на 237-аминокислотном перекрывающемся участке:
ORF147a идентична ORF75a, которая включает аминокислоты 56-292 ORF75.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF147 на 94,1% идентична предполагаемой ORF (ORF147ng) N.gonorrhoeae на 237-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF147ng (SEQ ID NO: 643), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 644):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 645):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 646; ORF147ng-1):
ORF147ng-1 проявляет гомологию с гипотетическим белком E.coli:
sp|P45528|YRAL_ECOLI гипотетический белок 31,3 кД, кодируемый геном межгенного сегмента AgaI-MTR (F286)
>gi|606086 (U18997) ORF_f286 (Escherichia coli)
>gi|1789535 (AE000395) гипотетический белок 31,3 кД, кодируемый геном межгенного сегмента AgaI-MTR (Escherichia coli); длина = 286
Счет = 218 бит (550). Ожидаемое = 3е-56.
Идентичность = 128/284 (45%). Позитивные = 171/284 (60%). Гэпы = 4/284 (1%).
Основываясь на проведенном компьютерном анализе и данных о присутствии предполагаемого трансмембранного домена в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 77
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 647):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 648; ORF1):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 649):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 650; ORF1-1):
Компьютерный анализ этих последовательностей дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF1 на 57,8% идентична ORF (ORF1a) штамма А N.meningitidis на 1456-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF1 (SEQ ID NO: 651):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 652):
Трансмембранный участок подчеркнут.
ORF1-1 на 86,3% идентична ORF1a на 1462-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предшественником адгезионного/пенетрационного белка hap H.influenzae (депозитарный № Р45387)
Аминокислоты 23-423 ORF1 на 59% идентичны белку hap на 450-аминокислотном перекрывающемся участке:
Аминокислоты 715-1011 ORF1 на 50% идентичны белку hap на 258-аминокислотном перекрывающемся участке:
Аминокислоты 1192-1450 ORF1 на 41% идентичны белку hap на 259-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
Сегменты ORF1 на 83,5%, 88,3% и 97,7% идентичны предполагаемой ORF (ORF1ng) N.gonorrhoeae соответственно на 467-аминокислотном, 298-аминокислотном и 259-аминокислотном перекрывающихся участках:
Была идентифицирована полнораэмерная нуклеотидная последовательность ORF1ng (SEQ ID NO: 653):
Предсказывается, что она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 654):
Последовательности, подчеркнутые одной и двумя линиями, представляют активный сайт сериновой протеазы (из семейства трипсинов) и мотив А сайта АТФ/ГТФ-связывания («Р-петлю»).
ORF1-1 на 93,7% идентична ORF1ng на 1471-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF1ng на 55,7% идентична белку hap (Р45387) на 1455-аминокислотном перекрывающемся участке:
Счет: Initl - 1104; Initn - 4632; Opt - 2680
Счет по Смиту-Уотерману: 5165. Идентичность - 55,7% на участке перекрывания из 1455 аминокислот
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 78
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 655):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 656; ORF6):
Дальнейший анализ последовательности позволил установить еще одну частичную последовательность ДНК (SEQ ID NO: 657):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 658; ORF6-1):
Компьютерный анализ зтой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF6 на 98,6% идентична ORF (ORF6a) штамма A N.meningitidis на 140-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF6a (SEQ ID NO: 659):
Предсказывается, что она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 660):
ORF6a и ORF6-1 на 100,0% идентичны на 131-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF6 на 95,7% идентична ORF (ORF6ng) N.gonorrhoeae на 140-аминокислотном перекрывающемся участке:
Была идентифицирована такая полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF6ng (SEQ ID NO: 661):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 662):
ORF6ng и ORF6-1 на 96,9% идентичны на 131-аминокислотном перекрывающемся участке:
Предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 79
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 663):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 664; ORF23):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 665):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 666; ORF23-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с рецептором ферропсевдобактина PupB Pseudomonas putida (депозитарный № Р38047)
ORF23 и белок PupB на 32% идентичны на 205-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF23 на 95,7% идентична ORF (ORF23a) штамма A N.meningitidis на 211-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF23a (SEQ ID NO: 667):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 668):
ORF23a и ORF23-1 на 99,2% идентичны на 725-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF23 на 93,4% идентична предполагаемой ORF (ORF23.ng) N.gonorrhoeae на 211-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF23ng (SEQ ID NO: 669), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 670):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 671):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 672; ORF23ng-1):
ORF23ng-1 и ORF23-1 на 95,9% идентичны на 725-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF23ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с ОМР E.coli:
sp|P16869|FHUE_ECOLI предшественник внешнемембранного рецептора Fe(III)-копрогена, Fe(III)-ферриоксамина-В и Fe(III)-родотруловой кислоты
>gi|1651542|gnl|PID|dl015403 (D90745) предшественник белка FhuE внешней мембраны (Escherichia coli)
>gi|1651545|gnl|PID|d1015405 (D90746) предшественник белка FhuE внешней мембраны (Escherichia coli)
>gi|1787344 (AE000210) предшественник внешнемембранного рецептора Fe(III)-копрогена, Fe(III)-ферриоксамина-В и Fe(III)-родотруловой кислоты (Escherichia coli); длина = 729
Счет = 332 бит (843). Ожидаемое = 3е-90.
Идентичность = 228/717 (31%). Позитивные = 350/717 (48%). Гэпы = 60/717 (8%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF23-1 (77,5 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы в SDS-ПААГ. На фиг. 15А показаны результаты аффинной очистки His-химерного белка, а на фиг. 15В - показаны результаты экспрессии GST-химерного белка. Очищенный His-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в Вестерн-блоттинге (фиг. 15C) и в ТИФА (получены позитивные результаты). Эти экспериментальные результаты подтверждают, что ORF23-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 80
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 673):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 674; ORF24):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 675):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 676; ORF24-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF24 на 96,4% идентична ORF (ORF24a) штамма A N.meningitidis на 307-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF24a (SEQ ID NO: 677) такова:
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 678):
Необходимо отметить, что этот белок включает стоп-кодон в 198-м положении.
ORF24a и ORF24-1 на 96,4% идентичны на 307-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF24 на 96,7% идентична предполагаемой ORF (ORF24ng) N.gonorrhoeae на 121-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF24ng (SEQ ID NO: 679):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 680):
ORF24ng и ORF24-1 на 96,1% идентичны на 307-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности (первые 18 аминокислот - подчеркнуты дважды) и предполагаемых трансмембранных доменов (подчеркнуты одной линией) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 81
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 681):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 682; ORF25):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 683):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 684; ORF25-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF25 на 98,3% идентична ORF (ORF25a) штамма А N.meningitidis на 60-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF25a (SEQ ID NO: 685):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 686):
ORF25a и ORF25-1 на 93,5% идентичны на 338-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrnoeae
ORF25 на 100% идентична предполагаемой ORF (ORF25ng) N.gonorrhoeae на 60-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF25ng (SEQ ID NO: 687):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 688):
ORF25ng и ORF25-1 на 95,9% идентичны на 338-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемого сайта прикрепления к липидной составляющей прокариотического мембранного липопротеина (подчеркнут) в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF25-1 (37 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы в SDS-ПААГ. На фиг. 16А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка, а на фиг. 16В показаны результаты экспрессии His-химеры в E.coli. Очищенный His-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в Вестерн-блоттинге (фиг. 16С), в ТИФА (получены позитивные результаты) и в сортировке FACS (фиг. 16D). Эти экспериментальные результаты подтверждают, что ORF25-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она применима в качестве иммуногена.
На фиг. 16Е показаны кривые гидрофильности, антигенного индекса и параметры AMPHI для последовательности ORF25-1.
ПРИМЕР 82
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 689):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 690; ORF26):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 691):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 692; ORF26-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим трансмембранным белком НI1586 H.influenzae (депозитарный № Р44263)
ORF26 и НI1586 идентичны на 53% и на 49% соответственно на 97-аминокислотном N-концевом и 221-аминокислотном С-концевом перекрывающихся участках:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF26 на 58,2% идентична ORF (ORF26a) штамма A N.meningitidis на 502-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF26a (SEQ ID NO: 693):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 694):
ORF26a и ORF26-1 на 97,8% идентичны на 506-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF26 на 94,8% и на 99% идентична предполагаемой ORF (ORF26ng) N.gonorrhoeae соответственно на 97-аминокислотном N-концевом и 206-аминокислотном С-концевом перекрывающихся участках:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF26ng (SEQ ID NO: 695):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 696):
ORF26ng и ORF26-1 на 98,4% идентичны на 505-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF26ng проявляет существенный уровень гомологии с гипотетическим белком H.influenzae:
sp|P44263|YF86_HAEIN гипотетический белок НI1586
>gi|1074850|pir||C64037 гипотетический белок НI1586 (Haemophilus influenzae) (штамм Rd KW20)
>gi|1574427 (U32832) предполагаемый кодирующий участок НI1586 H.influenzae (Haemophilus influenzae); длина = 519
Счет = 538 бит (1370). Ожидаемое = е-152.
Идентичность = 280/507 (55%). Позитивные = 346/507 (68%). Гэпы = 7/507 (1%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 83
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 697):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 698; ORF27):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 699):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 700; ORF27-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF27 на 91,5% идентична ORF (ORF27a) штамма А N.meningitidis на 82-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF27a (SEQ ID NO: 701):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 702):
ORF27a и ORF27-1 на 94,7% идентичны на 245-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF27 на 96,3% идентична предполагаемой ORF (ORF27ng) N.gonorrhoeae на 82-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF27ng (SEQ ID NO: 703):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 704):
ORF27ng и ORF27-1 на 98,8% идентичны на 245-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF27-1 (24,5 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы в SDS-ПААГ. На фиг. 17А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка, а на фиг. 17В - показан результат экспрессии His-химеры E.coli. Очищенный GST-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в ТИФА с получением позитивных результатов: это подтверждает, что ORF27-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 84
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 705):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 706; ORF47):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 707):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 708; ORF47-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности предсказал наличие лидерного пептида, а также дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF47 на 99,4% идентична ORF (ORF47a) штамма A N.meningitidis на 172-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF47a (SEQ ID NO: 709):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 710):
ORF47a и OPF47-1 на 99,2% идентичны на 384-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF47 на 97,1% идентична предполагаемой ORF (ORF47ng) N.gonorrhoeae на 172-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF47ng (SEQ ID NO: 711), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 712):
Предполагаемые лидерный пептид и трансмембранные домены идентичны (за исключением замены «изолейцин/аланин» в 87-положении и «лейцин/изолейцин» в 140-м положении) последовательности белка менингококка (см. также последовательность ORF396 Pseudomonas stutzeri: депозитарный № е246540):
Трансмембранный сегмент в ORF47ng
Интегральная вероятность=-5,63 Трансмембранный сегмент 52-68
Интегральная вероятность=-3,88 Трансмембранный сегмент 169-185
Интегральная вероятность=-3,08 Трансмембранный сегмент 82-98
Интегральная вероятность=-1,91 Трансмембранный сегмент 134-150
Интегральная вероятность=-1,44 Трансмембранный сегмент 107-123
Интегральная вероятность=-1,38 Трансмембранный сегмент 227-243
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 713):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 714; ORF47ng-1):
ORF47ng-1 и ORF47-1 на 97,4% идентичны на 384-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF47ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с ORF Pseudomonas stutzeri:
gnl|PID|e246540 (Z73914) белок ORF396 (Pseudomonas stutzeri); длина = 396
Счет = 155 бит (389). Ожидаемое = 5е-37.
Идентичность = 121/391 (30%). Позитивные = 169/391 (42%). Гэпы = 21/391 (5%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 85
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 715):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 716; ORF67):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF67 на 51,8% идентична предполагаемой ORF (ORF67ng) N.gonorrhoeae на 199-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF67ng (SEQ ID NO: 717), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 718):
Основываясь на присутствии нескольких предполагаемых трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, a также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 86
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 719):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 720; ORF78):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 721):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 722; ORF78-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности предсказывает присутствие нескольких трансмембранных доменов, а также дал следующие результаты.
Гомология с гомологом dedA H.influenzae (депозитарный № Р45280)
ORF78 и гомолог dedA на 58% идентичны на 144-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF78 на 93,8% идентична ORF (ORF78a) штамма A N.meningitidis на 145-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF78a (SEQ ID NO: 723):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 724):
ORF78a и ORF78-1 на 89,0% идентичны на 227-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF78 на 97,4% идентична предполагаемой ORF (ORF78ng) N.gonorrhoeae на 38-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF78ng (SEQ ID NO: 725), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 726):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность гонококка (SEQ ID NO: 727):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 728; ORF78ng-1):
ORF78ng-1 и ORF78-1 на 88,1% идентичны на 227-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF78ng-1 проявляет гомологию с белком dedA H.influenzae:
sp|P45280|YG29_HAEIN гипотетический белок HI1629
>gi|1073983|pir||D64133 гомолог белка dedA (Haemophilus influenzae) (штамм Rd KW20)
>gi|11574476 (U32836) белок dedA (Haemophilus influenzae); длина = 212
Счет = 223 бит (563). Ожидаемое = 7е-58.
Идентичность = 108/182 (59%). Позитивные = 140/182 (76%). Гэпы = 2/182 (1%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемых трансмембранных доменов, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 87
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 729):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 730; ORF79):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 731):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 732; ORF79-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности подтвердил присутствие предполагаемого лидерного пептида, а также дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF79 на 94,6% идентична ORF (ORF79a) штамма А N.meningitidis на 147-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF79a (SEQ ID NO: 733):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 734):
ORF79a и ORF79-1 на 94,9% идентичны на 157-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF79 на 96,1% идентична предполагаемой ORF (ORF79ng) N.gonorrhoeae на 76-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF79ng (SEQ ID NO: 735), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 736):
Дальнейший анализ позволил установить полную последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 737):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 738; ORF79ng-1):
ORF79ng-1 и ORF79-1 на 95,5% идентичны на 157-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF79ng-1 проявляет существенный уровень гомологии с белком Aquifex aeolicus:
gi|2983695 (АЕ000731) предполагаемый белок (Aquifex aeolicus); длина = 151
Счет = 63,6 бит (152). Ожидаемое = 6е-10.
Идентичность = 38/114 (33%). Позитивные = 58/114 (50%).
Гэпы = 1/114 (0%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF79-1 (15,6 кД) была клонирована в вектор рЕТ и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы в SDS-ПААГ. На фиг. 18А показаны результаты аффинной очистки His-химерного белка. Очищенный His-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в ТИФА (получены позитивные результаты) и в сортировке FACS (фиг. 18В). Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORF79-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она применима в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 88
Следующая последовательность ДНК, предположительно являющаяся полной, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 739):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 740; ORF98):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 741):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 742; ORF98-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF98 на 96,1% идентична ORF (ORF98a) штамма A N.meningitidis на 233-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF98a (SEQ ID NO: 743):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 744):
ORF98a и ORF98-1 на 98,7% идентичны на 233-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF98 на 95,3% идентична предполагаемой ORF (ORF98ng) N.gonorrhoeae на 233-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF98ng (SEQ ID NO: 745), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 746):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 747):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 748; ORF98ng-1):
ORF98ng-1 и ORF98-1 на 97,9% идентичны на 233-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о том, что предполагаемые трансмембранные домены в составе белка гонококка идентичны последовательностям белка менингококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 89
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 749):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 750; ORF100):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 751):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 752; ORF100-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF100 на 93,5% идентична ORF (ORF100a) штамма A N.meningitidis на 386-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF100a (SEQ ID NO: 753):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 754):
ORF100a и ORF100-1 на 95,1% идентичны на 406-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF100 на 93,3% идентична предполагаемой ORF (ORF100ng) N.gonorrhoeae на 386-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF100ng (SEQ ID NO: 755):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 756):
ORF100ng и ORF100-1 на 95,3% идентичны на 402-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности, предполагаемого трансмембранного домена и мотива RGD, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 90
Следующая последовательность ДНК, предположительно полная, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 757):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 758; ORF102):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 759):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 760; ORF102-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим интегральным мембранным белком НР1484 Н.pylori (депозитарный № АЕ000647)
ORF102 и НР1484 на 33% идентичны на 143-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF102 на 99,3% идентична ORF (ORF102a) штамма A N.meningitidis на 142-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF102a (SEQ ID NO: 761):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 762):
ORF102a и ORF102-1 полностью идентичны на 142-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF102 на 97,9% идентична предполагаемой ORF (ORF102ng) N.gonorrhoeae на 142-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF102ng (SEQ ID NO: 763):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 764):
ORF102ng и ORF102-1 на 98,6% идентичны на 142-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF102ng проявляет существенный уровень гомологии с мембранным белком Н.pylori:
gi|2314656 (АЕ000647) консервативный гипотетический интегральный мембранный белок (Helicobacter pylori); длина = 148
Счет = 79,2 бит (192). Ожидаемое = 1е-14.
Идентичность = 50/147 (34%). Позитивные = 68/147 (46%). Гэпы = 13/147 (8%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 91
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 765):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 766; ORF85):
Дальнейший анализ позволил установить еще одну частичную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 767):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 768; ORF85-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF85 на 87,8% и на 99,3% идентична ORF (ORF85a) штамма A N.meningitidis соответственно на 41-аминокислотном и 153-аминокислотном перекрывающихся участках:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF85a (SEQ ID NO: 769):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 770):
ORF85a и ORF85-1 на 98,2% идентичны на 334-аминокислотном перекрывающемся участке:
На фиг. 19D показаны кривые гидрофильности, антигенных индексов и участки AMPHI для последовательности ORF85a.
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF85 проявляет высокий уровень идентичности предполагаемой ORF (ORF85ng) N.gonorrhoeae:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF85ng (SEQ ID NO: 771):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 772):
ORF85ng-1 и ORF85-1 на 96,1% идентичны на 334-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF85ng проявляет существенный уровень гомологии с мембранным химерным белком E.coli:
gi|1787104 (АЕ000189) о380; на 27% идентичный (27 гэпов) 332 аминокислотам предшественника мембранного химерного белка, MTRC_NEIGO SW: P43505 (412 аминокислот) (Escherichia coli); длина = 380
Счет = 193 бит (485). Ожидаемое = 2е-48. Идентичность = 120/345 (34%). Позитивные = 182/345 (51%). Гэпы = 13/345 (3%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF85-1 (40,4 кД) была клонирована в вектор pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы в SDS-ПААГ. На фиг. 19А показаны результаты аффинной очистки GST-химерного белка. Очищенный GST-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в Вестерн-блоттинге (фиг. 19В), в сортировке FACS (фиг. 19С) и в ТИФА (получены позитивные результаты). Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORF85-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, она может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 92
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitides (SEQ ID NO: 773):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 774; ORF120):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 775):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 776; ORF120-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF120 на 92,4% идентична ORF (ORF120a) штамма A N.meningitidis на 184-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF120a (SEQ ID NO: 777):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 778):
ORF120a и ORF120-1 на 93,3% идентичны на 223-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF120 на 97,8% идентична предполагаемой ORF (ORF120ng) N.gonorrhoeae на 184-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF120ng (SEQ ID NO: 779):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 780):
При сравнении с ORF120-1 последовательность ORF120ng проявляет 97,8% идентичности на 223-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемой лидерной последовательности в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 93
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 781);
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 782; ORF121):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 783):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 784; ORF121-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF121 на 98,7% идентична ORF (ORF121a) штамма А N.meningitidis на 156-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF121a (SEQ ID NO: 785):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 786):
ORF121a и ORF121-1 на 99,2% идентичны на 356-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF121 на 97,4% идентична предполагаемой ORF (ORF121ng) N.gonorrhoeae на 156-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF121ng (SEQ ID NO: 787), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 788):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 789):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 790; ORF121ng-1):
ORF121ng и ORF121-1 на 97,5% идентичны на 356-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF121ng-1 проявляет гомологию с пермеазой Н.influenzae:
sp|P43969|PERM_HAEIN предполагаемый гомолог пермеазы; длина = 349
Счет = 69,9 бит (168). Ожидаемое = 2е-11.
Идентичность = 67/317 (21%). Позитивные = 120/317 (37%). Гэпы = 7/317 (2%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемых лидерной последовательности и трансмембранных доменов в этих двух белках, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 94
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 791):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 792; ORF122):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 793):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 794; ORF122-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF122 на 94,0% идентична ORF (ORF122a) штамма A N.meningitidis на 182-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF122a (SEQ ID NO: 795):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 796):
ORF122a и ORF122-1 на 96,9% идентичны на 256-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF122 на 89,6% идентична предполагаемой ORF (ORF122ng) N.gonorrhoeae на 182-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF122ng (SEQ ID NO: 797):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 798):
ORF122ng и ORF122-1 на 92,6% идентичны на 256-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 95
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 799):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 800; ORF125):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 801):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 802; ORF125-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF125 на 76,5% идентична ORF (ORF125a) штамма А N.meningitidis на 51-аминокислотном перекрывающемся участке:
Частичная нуклеотидная последовательность ORF125a (SEQ ID NO: 803):
Она кодирует белок, характеризующийся частичной аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 804):
ORF125a и ORF125-1 на 94,5% идентичны на 347-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF125 на 86,2% идентична предполагаемой ORF (ORF125ng) N.gonorrhoeae на 65-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF125ng (SEQ ID NO: 805), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 806):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 807):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 808; ORF125ng-1):
ORF125ng-1 и ORF125-1 на 95,1% идентичны на 408-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о присутствии предполагаемых сигнального сегмента и трансмембранных доменов в составе белка гонококка, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 96
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 809):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 810; ORF126):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID NO: 811):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 812; ORF126-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF126 на 90,0% идентична ORF (ORF126a) штамма A
N.meningitidis на 180-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF126a (SEQ ID NO: 813):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 814):
ORF126a и ORF126-1 на 95,4% идентичны на 366-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF126 на 90% идентична предполагаемой ORF (ORF126ng) N.gonorrhoeae на 180-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF126ng (SEQ ID NO: 815), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 816):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID NO: 817):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 818; ORF126ng-1):
ORF126ng-1 и ORF126-1 на 95,1% идентичны на 366-аминокислотном перекрывающемся участке:
Более того, ORF126ng-1 проявляет гомологию с предполагаемым оксидазным флавопротеином Rhizobium:
gi|2627327 (AF004408) предполагаемый флавопротеин с функциями оксидазы аминокислот (Rhizobium etli); длина = 327
Счет = 169 бит (423). Ожидаемое = 3е-41.
Идентичность = 112/329 (34%). Позитивные = 163/329 (49%). Гэпы = 25/329 (7%).
Проведенный анализ подтверждает, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 97
Следующая последовательность ДНК, предположительно полная, была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID NO: 819):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 820; ORF127):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК (SEQ ID NO: 821):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID NO: 822; ORF127-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF127 на 98,0% идентична ORF (ORF127a) штамма А N.meningitidis на 150-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF127a (SEQ ID NO: 823):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 824):
ORF127a и ORF127-1 на 99,3% идентичны на 149-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF127 на 97,3% идентична предполагаемой ORF (ORF127ng) N.gonorrhoeae на 150-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF127ng (SEQ ID NO: 825):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO: 826):
ORF127ng и ORF127-1 на 100,0% идентичны на 149-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, включая данные о том, что предполагаемый трансмембранный домен является общим для белков менингококка и гонококка, предполагается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 98
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID 827):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 828; ORF128):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID 829):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 830; ORF128-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим интегральным мембранным белком HI0392 H.influenzae (депозитарный № U32723)
ORF128 и HI0392 на 52% идентичны на 180-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF128 на 98% идентична ORF (ORF128a) штамма A N.meningitidis на 244-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF128a (SEQ ID 831):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 832):
ORF128a и ORF128-1 на 99,5% идентичны на 622-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF128 на 93,4% идентична предполагаемой ORF (ORF128ng) N.gonorrhoeae на 244-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF128ng (SEQ ID 833):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 834):
ORF128ng и ORF128-1 на 95,7% идентичны на 622-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF128ng проявляет гомологию с гипотетическим белком Н.influenzae:
sp|P43993|Y392_HAEIN гипотетический белок HI0392
>gi|1074385|pir||B64007 гипотетический белок Н10392 -Haemophilus influenzae (штамм Rd KW20)
>gi|1573364 (U32723) предсказанный кодирующий участок HI0392 (Haemophilus influenzae); длина = 245
Счет = 239 бит (604). Ожидаемое = 3е-62.
Идентичность = 124/225 (55%). Позитивные = 152/225 (67%). Гэпы = 1/225 (0%).
Основываясь на проведенном анализе, включая данные об идентификации нескольких предполагаемых трансмембранных доменов, подтверждается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 99
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID 835):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 836; ORF129):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность гонококка (SEQ ID 837):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 838; ORF129-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF129 на 98,9% идентична ORF (ORF129a) штамма А N.meningitidis на 88-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF129a (SEQ ID 839):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 840):
ORF129a и ORF129-1 на 100% идентичны на 248-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF129 на 98,9% идентична предполагаемой ORF (ORF129ng) N.gonorrhoeae на 88-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF129ng (SEQ ID 841), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 842):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность гонококка (SEQ ID 843):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 844; ORF129ng-l):
ORF129ng-l и ORF129-1 на 99,2% идентичны на 248-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF129ng-l гомологична с АВС-переносчиком A.fulgidus:
2650409 (АЕ001090) ABC-переносчик глутамина, белок с функцией пермеазы (glnP) (Archaeoglobus fulgidus); длина = 224
Счет = 132 бит (329). Ожидаемое = 2е-30.
Идентичность = 86/178 (48%). Позитивные = 103/178 (57%). Гэпы = 18/178 (10%).
Проведенный анализ, включая данные об идентификации трансмембранных доменов в составе этих двух белков, предполагает, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 100
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID 845):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 846; ORF130):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID 847):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 848; ORF130-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF130 на 94,3% идентична ORF (ORF130a) штамма A N.meningitidis на 193-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF130a (SEQ ID 849):
Она кодирует белок, характеризующийся частичной аминокислотной последовательностью (SEQ ID 850):
ORF130a и ORF130-1 на 98,3% идентичны на 357-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF130 на 91,7% идентична предполагаемой ORF (ORF130ng) N.gonorrhoeae на 193-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF130ng (SEQ ID 851), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 852):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID 853):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 854; ORF130ng-l):
ORF130ng-l и ORF130-1 на 92,4% идентичны на 357-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 101
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID 855);
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 856; ORF131):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID 857):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 858; ORF131-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF131 на 95,0% идентична ORF (ORF131a) штамма A N.meningitidis на 121-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF131a (SEQ ID 859):
Она кодирует белок, характеризующийся частичной аминокислотной последовательностью (SEQ ID 860):
ORF131a и ORF131-1 на 97% идентичны на 135-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae ORF131 на 89,3% идентична предполагаемой ORF (ORF131ng) N.gonorrhoeae на 121-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF131ng (SEQ ID 861), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 862):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID 863):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 864; ORF131ng-l):
ORF131ng-l и ORF131-1 на 92,6% идентичны на 135-аминокислотном перекрывающемся участке:
Основываясь на присутствии предполагаемого сайта связывания на липидной составляющей прокариотического мембранного липопротеина, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 102
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID 865):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 866; ORF132):
Дальнейший анализ позволил установить полную нуклеотидную последовательность (SEQ ID 867):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 868; ORF132-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с гипотетическим белком о457 E.coli (депозитарный № U14003)
ORF132 и о457 на 58% идентичны на 140-аминокислотном
перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF132 на 74,6% идентична ORF -(ORF132a) штамма А N.meningitidis на 189-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF132a (SEQ ID 869):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 870):
ORF132a и ORF132-1 на 93,9% идентичны на 458-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF132 на 89,6% идентична предполагаемой ORF (ORF132ng) N.gonorrhoeae на 259-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF132ng (SEQ ID 871), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 872):
Дальнейший анализ позволил установить следующую последовательность ДНК гонококка (SEQ ID 873):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 874; ORF132ng-l):
ORF132ng-l и ORF132-1 на 93,2% идентичны на 458-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF132ng-l гомологична с гипотетическим белком E.coli:
pir||S56459 гипотетический белок о457 - Escherichia coli
>gi|537075 (U14003) ORF o457 (Escherichia coli)
>gi|1790680 (AE000494) гипотетический белок 48,5 кД на межгенном участке fbp-pmbA (Escherichia coli); длина = 457
Счет = 474 бит (1207). Ожидаемое = е-133.
Идентичность = 249/439 (56%). Позитивные = 294/439 (66%). Гэпы = 13/439 (2%).
Основываясь на проведенном анализе, предсказывается, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ORF132-1 (26,4 кД) была клонирована в векторы рЕТ и pGex и экспрессирована в клетках E.coli в соответствии с описанным выше. Продукты экспрессии и очистки белков были проанализированы в SDS-ПААГ. На фиг. 20А показаны результаты аффинной очистки His-химерного белка, а на фиг. 20В показаны результаты экспрессии GST-химеры E.coli. Очищенный His-химерный белок был использован для иммунизации мышей, сыворотку которых использовали в сортировке RACS (фиг. 20С) и в ТИФА (получены позитивные результаты). Эти экспериментальные данные подтверждают, что ORF132-1 является поверхностно-клеточным белком, а следовательно, может применяться в качестве иммуногена.
ПРИМЕР 103
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID 875):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 876; ORF133):
Дальнейший анализ позволил установить еще одну частичную последовательность ДНК (SEQ ID 877):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 878; ORF133-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности дал следующие результаты.
Гомология с вероятным TonB-зависимым рецептором HI121 H.influenzae (депозитарный № U32801)
ORF133 и HI121 на 57% идентичны на 363-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF133 на 90,8% идентична ORF - (ORF133a) штамма А N.meningitidis на 392-аминокислотном перекрывающемся участке:
Частичная нуклеотидная последовательность ORF133a (SEQ ID 879):
Она кодирует белок, характеризующийся (частичной) аминокислотной последовательностью (SEQ ID 880):
ORF133a и ORF133-1 на 94,3% идентичны на 871-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae ORF133 на 92,3% идентична предполагаемой ORF (ORF133ng) N.gonorrhoeae на 392-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF133ng (SEQ ID 881), как предсказывается, кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 882):
Также был идентифицирован вариант, кодируемый последовательностью ДНК гонококка (SEQ ID 883):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 884; ORF133ng-l):
ORF133ng-l и ORF133-1 на 96,2% идентичны на 889-аминокислотном перекрывающемся участке:
Кроме того, ORF133ng-l гомологична ТопВ-зависимому рецептору Н.influenzae:
sp|P45114|YC17_HAEIN вероятный предшественник ТопВ-зависимого рецептора HI1217
>gi|1075372|pir|||G64110 гомолог предшественника транс-феррин-связывающего белка-1 (tbpl) - Haemophilus influenzas (штамм Rd KW20)
>gi|1574147 (U32801) предшественник трансферрин-связывающего белка-1 (tbpl) (Haemophilus influenzae); длина = 913
Счет = 930 бит (2377). Ожидаемое = 0.0.
Идентичность = 476/921 (51%). Позитивные = 619/921 (66%). Гэпы = 72/921 (7%).
Подчеркнутый мотив в составе последовательности гонококка (также присутствующий и в белке менингококка) предположительно является мотивом-А сайта АТФ/ГТФ-связывания (Р-петля); и проведенный анализ предполагает, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
ПРИМЕР 104
Следующая частичная последовательность ДНК была идентифицирована у N.meningitidis (SEQ ID 885):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 886; ORF112):
Дальнейший анализ позволил установить еще одну частичную нуклеотидную последовательность (SEQ ID 887):
Она соответствует аминокислотной последовательности (SEQ ID 888; ORF112-1):
Компьютерный анализ этой аминокислотной последовательности предполагает присутствие двух трансмембранных доменов, а также дал следующие результаты.
Гомология с предполагаемой ORF N.meningitidis (штамм А)
ORF112 на 96,4% идентична ORF (ORF112a) штамма А N.meningitidis на 166-аминокислотном перекрывающемся участке:
Нуклеотидная последовательность ORF112a (SEQ ID 889):
Она кодирует белок, характеризующийся аминокислотной последовательностью (SEQ ID 890):
ORF112a и ORF112-1 на 96,3% идентичны на 326-аминокислотном перекрывающемся участке:
Гомология с предполагаемой ORF N.gonorrhoeae
ORF112 на 95,8% идентична предполагаемой ORF (ORF1l2ng) N.gonorrhoeae на 166-аминокислотном перекрывающемся участке:
Полноразмерная нуклеотидная последовательность ORF112ng (SEQ ID 891):
Она кодирует белок, характеризующийся следующей аминокислотной последовательности (SEQ ID 892):
ORF112ng и ORF112-1 на 94,2% идентичны на 326-аминокислотном перекрывающемся участке:
Проведенный анализ подтверждает, что эти белки N.meningitidis и N.gonorrhoeae, а также их эпитопы могут быть использованы в качестве антигенов для приготовления вакцин или для диагностических целей, или для получения антител.
Должно быть понятно, что настоящее изобретение было описано исключительно в виде примеров, т.е. модификации могут быть внесены без изменения духа и буквы настоящего изобретения.
NB:
рестрикционные сайты подчеркнуты;
для ORF110-130, где ORF сам по себе несет EcoRI-сайт (например, ORF122), в состав прямой затравки вместо него вносили рестрикционный SalI-сайт. Сходным образом в случаях, когда ORF несет PstI-сайт (например, ORF115 и ORF127), в составе обратной затравки использовали SalI-сайт.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ БАКТЕРИЕЙ NEISSERIA | 2000 |
|
RU2244749C2 |
| БЕЛОК, ПОЛУЧЕННЫЙ ИЗ NEISSERIA MENINGITIDIS, ПРОЯВЛЯЮЩИЙ СВОЙСТВА АНТИГЕНА, АНТИТЕЛО, НУКЛЕИНОВАЯ КИСЛОТА (ВАРИАНТЫ) И СОДЕРЖАЩАЯ ИХ КОМПОЗИЦИЯ | 2000 |
|
RU2233328C2 |
| СОЕДИНЕНИЯ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И ДИАГНОСТИКИ ХЛАМИДИЙНОЙ ИНФЕКЦИИ | 2001 |
|
RU2410394C2 |
| ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS ШТАММА В:4:Р1:15, БЕЛОК ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pМ-6, ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI НВМ 64, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА ВНЕШНЕЙ МЕМБРАНЫ NEISSERIA MENINGITIDIS, ВАКЦИННАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 1991 |
|
RU2132383C1 |
| ВЫДЕЛЕННАЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДНАЯ МОЛЕКУЛА, КОДИРУЮЩАЯ ВИРУС Torque teno, МОЛЕКУЛА РНК И ВЕКТОР ЭКСПРЕССИИ | 2009 |
|
RU2502801C2 |
| ГЕНЫ РЕЦЕПТОРА ТРАНСФЕРРИНА MORAXELA | 1997 |
|
RU2235128C2 |
| МНОЖЕСТВЕННЫЕ ВАРИАНТЫ МЕНИНГОКОККОВОГО БЕЛКА NMB 1870 | 2003 |
|
RU2336091C2 |
| ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ СВИНЕЙ ПРОТИВ ЦИРКОВИРУСА ТИПА 3 И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2744193C2 |
| КОМПОЗИЦИИ РЕКОМБИНАНТНОГО CDV И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2011 |
|
RU2567337C2 |
| МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МИМЕТИКИ ЭПИТОПОВ МЕНИНГОКОККА В, КОТОРЫЕ ВЫЗЫВАЮТ ВЫРАБОТКУ ФУНКЦИОНАЛЬНО АКТИВНЫХ АНТИТЕЛ | 2002 |
|
RU2322451C2 |
Изобретение раскрывает белки бактерий менингококка Neisseria meningitidis (преимущественно штамм В), обладающие иммуногенными свойствами. Белки имеют определенные аминокислотные последовательности, представленные в описании, и кодируются соответствующими нуклеотидными последовательностями. Описано также антитело, специфичное в отношении указанных менингококковых белков. Указанные белки, кодирующие их нуклеотидные последовательности, а также специфическое антитело могут быть использованы в качестве активного ингредиента в составе композиции для лечения или профилактики инфекции, вызываемой Neisseria meningitidis. Представленные белки применимы в качестве антигенов для формирования эффективных вакцин, иммуногенных композиций. 8 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 табл., 20 ил.
a) белка по любому из пп.1-3,
b) антитела по п.4, и
c) нуклеотидной последовательности по любому из пп.5-7, и фармацевтически приемлемый носитель.
| WO 9631618 A1, 10.10.1996 | |||
| WO 9306861 A1, 15.04.1993 | |||
| EP 0301992 A3, 01.02.1989 | |||
| ЩЕЛКУНОВ С.Н | |||
| Конструирование гибридных молекул ДНК | |||
| - Новосибирск: Изд | |||
| Наука, 1987, с.205-224. |
