Область изобретения
Настоящее изобретение относится к лечению или профилактике заболевания или патологического состояния у субъекта, причем указанные заболевания или патологические состояния ассоциированы с наличием микробного патогена в ткани ротовой полости субъекта, в частности, но не исключительно, к лечению или профилактике заболеваний или патологических состояний, связанных с Р. gingivalis.
Уровень техники
Ротовая полость является одним из основных очагов инфекции. Инфекция может приводить к тяжело протекающему заболеванию тканей ротовой полости, а также была установлена четкая взаимосвязь между инфекцией тканей ротовой полости и патологическими состояниями в других анатомических отделах.
Одним из примеров заболеваний тканей ротовой полсти является хронический периодонтит. Это воспалительное заболевание тканей, окружающих зубы, которое приводит к резорбции альвеолярной кости и в итоге - к выпадению зуба. Указанное заболевание представляет серьезную проблему общественного здравоохранения во всех слоях общества, и по оценкам поражает до 15% взрослого населения, причем тяжелой формой страдают 5-6%.
Была установлена зависимость между развитием и прогрессированием хронического периодонтита и специфической грамотрицательной бактерией в поддесневой бляшке. Была установлена четкая взаимосвязь между наличием Porphyromonas gingivalis в поддесневых бляшках и указанным заболеванием.
Имеются сообщения о том, что сохранение Р. gingivalis в поддесневой бляшке у пациента с периодонтитом после лечения (специальная очистка и полировка поверхности корней) связана с прогрессирующей резорбцией. Кроме того, было показано, что увеличение числа клеток Р. gingivalis в поддесневой бляшке коррелирует с тяжестью заболевания, определяемой по потере прикрепления, глубине зубодесневого кармана и кровотечению при зондировании. Было показано, что инфицирование ротовой полости бактерией Р. gingivalis вызывает резорбцию кости в периодонте у мышей, крыс и низших приматов. Кроме того, была установлена взаимосвязь между заболеваниями периодонта и инфекцией Р. gingivalis, и сердечно-сосудистыми, а также определенными онкологическими заболеваниями.
Была установлена взаимосвязь между присутствием многих других микробных патогенов, включая бактерии, грибы, вирусы и простейшие, и заболеваниями тканей ротовой полости, а также некоторые из указанных патогенов вызывают заболевания в других анатомических отделах посредством инфицирования тканей ротовой полости. К примерам первой группы можно отнести Т. denticola и T. forsythia. Инфицирование стрептококком группы А является этиологическим фактором развития острой ревматической лихорадки и ревмакардита.
Одной из проблем до сих пор являлось то, что было не ясно, как добиться сильной защитной реакции на данный микробный патоген в условиях хронического воспаления слизистой оболочки, либо когда острое воспаление слизистой оболочки вызвано хирургическим или другим стоматологическим вмешательством.
Ссылки на известный уровень техники в настоящем описании не должны восприниматься как признание или предположение в любой его форме того, что указанный известный уровень техники составляет часть общедоступных сведений в Австралии или на любой другой территории, или что указанный известный уровень техники может справедливо считаться установленным, изученным и признаваться значимым специалистами в данной области техники.
Краткое описание изобретения
Согласно определенным вариантам реализации предложен способ снижения частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта, причем указанное заболевание или патологическое состояние ассоциировано с наличием микробного патогена в тканях ротовой полости у субъекта, способ, включающий:
- лечение субъекта, при котором создаются условия для удаления по существу всех микроорганизмов или их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта; после чего
- обеспечение наличия у указанного субъекта антитела, причем указанное антитело обеспечивает защиту указанного субъекта от микробного патогена, наличие которого в тканях ротовой полости ассоциировано с заболеванием или патологическим состоянием;
что приводит к снижению частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта.
Согласно одному варианту реализации предложено антитело, образующееся у указанного субъекта вследствие введения указанному субъекту иммуногена, причем указанный иммуноген обеспечивает защиту указанного субъекта от микробного патогена.
Согласно одному варианту реализации предложен способ снижения частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта, связанного с Р. gingivalis, указанный способ, включает:
- лечение субъекта, при котором удаляют по существу всех микроорганизмов или их фрагменты из тканей ротовой полости указанного субъекта; после чего
- введение химерного или гибридного белка в целях индукции иммунного ответа на Р. gingivalis указанному субъекту, при этом указанный белок, включает первый пептид, напрямую или с помощью линкера соединенный со вторым пептидом, причем:
(А) указанный первый пептид включает:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность, показанной под SEQ ID №1 или гомологична указанной последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность, показанной под SEQ ID №2 или гомологична указанной последовательности; и
(В) указанный второй пептид включает:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Lys-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Arg-Х-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(iii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина HagA Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности.
что приводит к снижению частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта.
Согласно одному варианту реализации в настоящей заявке предложена композиция или набор, включающие:
- противомикробный агент для удаления по существу всех микроорганизмов или их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта;
- иммуноген для иммунизации указанного субъекта против микробного патогена, наличие которого в тканях ротовой полости ассоциировано с заболеванием или патологическим состоянием;
указанную композицию или набор применяют при осуществлении способа, описываемого выше.
Согласно определенным вариантам реализации предложен способ снижения частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта, причем указанное заболевание или патологическое состояние ассоциировано с наличием микробного патогена в тканях ротовой полости у субъекта, указанный способ, включает:
- проведение хирургической процедуры на тканях ротовой полости субъекта; после чего
- осуществление лечения указанного субъекта, в результате чего обеспечиваются условия для удаления по существу всех микроорганизмов или их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта; после чего
- обеспечение наличия у указанного субъекта антитела, причем указанное антитело обеспечивает защиту указанного субъекта от микробного патогена, наличие которого в тканях ротовой полости ассоциировано с заболеванием или патологическим состоянием;
что приводит к снижению частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта.
Согласно одному варианту реализации указанная хирургическая процедура представляет собой стоматологическую процедуру. Примеры стоматологических процедур включают хирургическую обработку полости рта, специальную очистку и полировку поверхности корней.
Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает композицию для снижения частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта, причем указанное заболевание или патологическое состояние ассоциировано с наличием микробного патогена в тканях ротовой полости субъекта, указанная композиция содержит противомикробный агент, описываемый в настоящей заявке, и иммуноген, описываемый в настоящей заявке.
Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения предложено применение композиции согласно настоящему изобретению при приготовлении лекарственного препарата для снижения частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния субъекта, причем указанное заболевание или патологическое состояние ассоциировано с наличием микробного патогена в тканях ротовой полости у субъекта. Неограничивающие примеры заболеваний включают зубной камень, гингивит, периодонтит, хронический периодонтит, кариес зубов, резорбцию кости, потерю альвеолярной кости и ишемическую болезнь сердца.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция для лечения или профилактики заболеваний периодонта (и/или других патологических состояний, указываемых в настоящей заявке как подходящих для лечения), состоящая из активного ингредиента противомикробного агента, описываемого в настоящей заявке, и иммуногена, описываемого в настоящей заявке.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция, содержащая противомикробный агент, описываемый в настоящей заявке, и иммуноген, описываемый в настоящей заявке, для применения в целях снижения частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта, причем указанное заболевание или патологическое состояние - это заболевание или состояние, ассоциированное с наличием микробного патогена в тканях ротовой полости субъекта.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложена композиция, описываемая в настоящей заявке, для применения в качестве лекарственного препарата.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество композиции согласно настоящему изобретению в качестве основного ингредиента.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения предложен способ индукции опосредуемого антителами ответа (гуморального иммунного ответа) или получения иммунного ответа, опосредуемого Th2, на патоген в ротовой полости у субъекта, включающий следующие этапы:
- выявление субъекта, у которого требуется вызвать гуморальный иммунный ответ, или иммунный ответ, опосредуемый Th2, на патоген ротовой полости;
- оценку состояния указанного субъекта с целью определить, есть ли у него воспаление тканей ротовой полости;
- иммунизацию указанного субъекта патогеном ротовой полости, при условии, что указанная оценка выявила, что у указанного субъекта нет воспаления тканей ротовой полости, вследствие чего у указанного субъекта развивается гуморальный иммунный ответ или иммунный ответ, опосредуемый Th2, на патоген ротовой полости.
Согласно одному варианту реализации, в рамках режима иммунизации с целью получения гуморального иммунного ответа или иммунного ответа, опосредуемого Th2, на патоген в ротовой полости у субъекта, страдающего воспалением тканей ротовой полости, предложен этап введения указанному субъекту противовоспалительного агента, вследствие чего минимизируется или устраняется воспаление тканей ротовой полости, перед этапом иммунизации указанного субъекта с целью получения гуморального иммунного ответа или иммунного ответа, опосредуемого Th2, на патоген ротовой полости.
Согласно еще одному варианту реализации предложен способ подготовки субъекта, страдающего воспалением тканей ротовой полости, для получения гуморального иммунного ответа или иммунного ответа, опосредуемого Th2, на патоген ротовой полости, при иммунизации указанным патогеном, указанный способ включает этап введения указанному субъекту противовоспалительного агента, вследствие чего минимизируется или устраняется воспаление тканей ротовой полости, перед этапом иммунизации указанного субъекта с целью получения гуморального иммунного ответа или иммунного ответа, опосредуемого Th2, на патоген в ротовой полости.
Согласно другому варианту реализации предложен способ индукции гуморального иммунного ответа или получения иммунного ответа, опосредуемого Th2, на патоген ротовой полости у субъекта, страдающего воспалением тканей ротовой полости, включающий следующие этапы:
- выявление субъекта, страдающего воспалением тканей ротовой полости;
- проведение лечения указанного субъекта, в результате которого устраняют воспаление тканей ротовой полости; затем;
- иммунизацию указанного субъекта патогеном ротовой полости, вследствие чего у указанного субъекта развивается гуморальный иммунный ответ или иммунный ответ, опосредуемый Th2, на указанный патоген ротовой полости.
Согласно описанным выше вариантам реализации вакцинацию проводят в то время, когда ткани ротовой полости не воспалены, или когда воспаление является субклиническим или бессимптомным.
Обычно иммунный ответ, развивающийся при иммунизации, представляет собой преимущественно иммунный ответ, опосредуемый Th2, хотя он может включать детектируемый компонент ответа, опосредуемого Th1.
Обычно указанное воспаление представляет собой хронический периодонтит, особенно периодонтит, ассоциированный с инфекцией Р. gingivalis.
Когда периодонтит ассоциирован с инфекцией Р. Gingivalis, обычно в роли иммуногена для иммунизации выступает клетка, фрагмент, метаболит Р. gingivalis или рекомбинантный продукт, полученный из указанной бактерии, такой как химерные пептиды (особенно KAS1-KsA1, KAS2-KLA1).
Обычно противовоспалительный агент или противомикробный агент в контексте настоящей заявки включает или состоит из одного или более из противовоспалительного соединения, антибиотика и агент против образование биопленки, примеры которых более подробно описаны в настоящей заявке.
Применяемый в настоящей заявке термин «содержать/включать» и варианты данного термина, такие как «содержащий», «содержит» и «содержащийся» не должны исключать дополнительных вспомогательных веществ, компонентов, чисел или этапов, если контекст не требует другого.
Краткое описание рисунков
На Фигуре 1 показан окрашенный Кумасси синим SDS-PAGE гель (после электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) с рекомбинантными белками Kgp. Дорожка 1 = KAS2-KLA1, дорожка 2 = KLA1, дорожка 3 = KsA1, дорожка 4 = KAS1-KsA1. Маркеры молекулярной массы выражены в кДа.
На Фигуре 2 показано распознавание антителом пептида KAS2 и убитых формалином клеток Р. gingivalis W50. (А) пептид KAS2 зондировали с применением антисыворотки, полученной против убитых формалином клеток Р. gingivalis W50 (FK-W50), рекомбинантные белки KAS1-KsA1, KAS2-KLA1, синтетический конъюгат KAS2-DT и ФСБ (фосфатно-солевой буфер) при проведении ELISA (твердофазного иммуноферментного анализа). (В) убитые формалином клетки Р. gingivalis W50 зондировали с применением антисыворотки, образованной на убитые формалином клетки Р. gingivalis W50 (FK-W50), рекомбинантные белки KAS1-KsA1, KAS2-KLA1, KLA1 и ФСБ при проведении ELISA. Гуморальный ответ выражали как титр ELISA, определяемый как оптическая плотность OD415 минус двукратный фоновой уровень, причем каждый титр приведен как среднее ± стандартное отклонение из трех измерений.
На Фигуре 3 показана вызванная Р. gingivalis горизонтальная резорбция кости верхних коренных зубов у мышей, вакцинированных рекомбинантными белками и рекомбинантными химерными белками, убитыми формалином клетками Р. gingivalis и одним адъювантом (ФСБ, ИФА), или мышей, инфицированных не оральным путем (не вакцинированных). На данной фигуре KAS2-KLA1 обозначен как AS2-LA1, KAS1-KsA1 обозначен как AS1-SA1, KsA1 обозначен как sA1. Резорбцию кости измеряли как среднюю площадь, измеренную в квадратных миллиметрах (мм2), от эмалево-дентинной границы (ЭДГ) до гребня альвеолярного отростка (ГАО) щечной поверхности каждого коренного зуба на левой и правой верхней челюсти. Данные подчинялись нормальному распределению, что было определено по однородности дисперсии Левена, и на фигуре они приведены как среднее (n=12) в мм2; указанные данные анализировали посредством однофакторного дисперсионного анализа и критерия Даннета T3. «*» указывает на группу, у которой резорбция кости была значительно ниже (P<0,001), чем в контрольной (инфицированной) группе. <†> указывает на группу, у которой резорбция кости была значительно выше (P<0,001), чем в группе AS2-LA1.
На Фигуре 4 показаны ответы, опосредуемые подклассами сывороточных антител, у вакцинированных мышей в модели периодонтита. Сыворотку мышей, А (преоральная прививка) и В (посторальная прививка), вакцинированных рекомбинантными белками KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1, а также убитым формалином штаммом Р. gingivalis W50 применяли для проведения ELISA, при котором убитый формалином штамм Р. gingivalis W50 применяли в качестве адсорбированного антигена. Гуморальный ответ, опосредуемый IgG (черные столбцы), lgG1 (серые столбцы), lgG2a (белые столбцы), lgG2b (столбцы с горизонтальной штриховкой), lgG3 (столбцы с диагональной штриховкой), выражен как титр ELISA (log 2), полученный при вычитании фонового уровня, причем каждый титр приведен как среднее ± стандартное отклонение из трех измерений.
На Фигуре 5 показан результат анализа методом PEPSCAN в отношении реактивности пептид-специфичных антител на пептиды с перекрывающимися последовательностями, соответствующими последовательности пептида KAS2 433-468. (А) Пептиды с перекрывающимися последовательностями с KAS2 (смещение 1, перекрытие 7) зондировали при помощи антисывороток KAS1-KsA1 (белые столбцы), KAS2-KLA1 (черные столбцы). (В) Пептиды с перекрывающимися последовательностями с KAS2 (смещение, перекрытие 7) зондировали при помощи антисыворотки конъюгата KAS2-DT. Каждый столбец показывает реактивность антитела (оптическая плотность [OD] на 415 нм).
Фигура 6. Химера AS2-LA1 вызывает гуморальный ответ у аутбредных мышей, при котором распознаются целые клетки Р. gingivalis и комплекс RgpA-Kgp. Аутбредных мышей CD1 вакцинировали химерой AS2-LA1 (50 мг/мышь), и отобранную сыворотку применяли при ELISA с применением AS2-LA1 (А), убитого формалином штамма Р. gingivalis W50 (В) и комплекса RgpA-Kgp (С) в качестве адсорбированного антигена. На данной фигуре KAS2-KLA1 обозначен как AS2-LA1. Определяли титр каждого изотипа иммуноглобулина на каждый антиген, и данные выражали как титр ELISA (‘000), полученный при вычитании двукратного фонового уровня; каждый титр приведен как среднее ± стандартное отклонение из трех измерений.
Фигура 7. Модель структуры протеиназы Kgp KAS2 [Asn433-Lys468]. (A) KAS4 [Asp388-Val395] (В), KAS5 [Asn510-Asp516] (С) и KAS6 [lle570-Tyr580] (D).
Подробное описание вариантов реализации
Далее будет дана подробная справка об определенных вариантах реализации настоящего изобретения. Хотя настоящее изобретение будет описано вместе с описанием вариантов реализации, следует понимать, что настоящее изобретение не должно ограничиваться данными вариантами реализации. Напротив, предполагается, что настоящее изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые можно включить в область настоящего изобретения, определяемую пунктами формулы изобретения.
Специалист в данной области техники знает множество способов и материалов, сходных или эквивалентных способам и материалам, описанным в настоящей заявке, которые можно применять для реализации настоящего изобретения. Настоящее изобретение никоим образом не должно ограничиваться описанными способами и материалами.
Следует понимать, что настоящее изобретение, раскрытое и определяемое в данном описании, распространяется на все альтернативные сочетания двух или более отдельных характеристик, упоминаемых или явствующих из текста или рисунков. Все из указанных разных сочетаний представляют собой разные альтернативные аспекты настоящего изобретения.
Применяемый в настоящей заявке термин «содержать/включать» и варианты данного термина, такие как «содержащий», «содержит» и «содержал» не должны исключать дополнительных вспомогательных веществ, компонентов, чисел или этапов, если контекст не требует другого.
Авторы настоящего изобретения показали, что повышенного ответа на инфекцию, особенно повышенного опосредуемого антителами (гуморального) ответа, можно достичь путем устранения по существу всех воспалительных стимулов из тканей ротовой полости, перед проведением адоптивного переноса иммунитета в ткань, или во время инициирования иммунного ответа в указанной ткани. Данный факт особенно ценен, поскольку он позволяет проводить профилактику и/или лечение заболевания в тканях ротовой полости, и, соответственно, профилактику и/или лечение заболевания, возникающего в других анатомических отделах как следствие инфицирования тканей ротовой полости микробным патогенном.
Так, согласно определенным вариантам реализации предложен способ снижения частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта, причем указанное заболевание или патологическое состояние ассоциировано с наличием микробного патогена в тканях ротовой полости у субъекта, указанный способ, включает:
проведение лечения субъекта, в результате которого создаются условия для удаления по существу всех микроорганизмов или их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта; после чего
обеспечение наличия у указанного субъекта антитела, причем указанное антитело обеспечивает защиту указанного субъекта от микробного патогена, наличие которого в тканях ротовой полости ассоциировано с заболеванием или патологическим состоянием;
что приводит к снижению частоты возникновения или тяжести заболевания или патологического состояния у субъекта.
Согласно одному варианту реализации предложено антитело, образующееся у указанного субъекта вследствие введения ему иммуногена, причем указанный иммуноген обеспечивает защиту указанного субъекта от микробного патогена.
Согласно одному варианту реализации предложены противомикробная композиция для лечения субъекта, в результате котрого создаются условия для удаления по существу всех микроорганизмов и их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта, и иммуноген в количествах, эффективных для синергистичного действия.
Обычно под субъектом в настоящей заявке понимают животное, особенно млекопитающее. Согласно одному варианту реализации указанным млекопитающим является человек. Согласно определенным вариантам реализации указанным млекопитающим может быть домашнее или сельскохозяйственное животное. Примеры домашних или сельскохозяйственных животных включают лошадей, коз, свиней и домашний скот, такой как коровы и овцы. Согласно определенным вариантам реализации указанным домашним животным может быть животное-компаньон, такое как собака, кошка, кролик или морская свинка.
1. Определения
Фраза «удаление по существу всех микроорганизмов и их фрагментов из тканей ротовой полости» обычно относится к созданию условий, при которых в ткани сокращается количество микроорганизмов, их фрагментов или метаболитов до такого уровня, который достаточен, чтобы уменьшить воспалительные стимулу, поступающие из указанной ткани, вследствие чего существенно снижается или минимизируется один или боле симптомов воспаления в указанной ткани. Особенно это справедливо, когда рассматриваемый субъект страдает хроническим воспалением ткани, которое является следствием хронической инфекции. Обычно основной акцент делают на минимизации воспаления в ткани. Соответственно, следует понимать, что некоторые микроорганизмы, их фрагменты и метаболиты после рассматриваемого этапа лечения могут сохраняться.
Согласно другим вариантам реализации, когда у субъекта нет воспаления в тканях, фраза «удаление по существу всех микроорганизмов и их фрагментов из тканей ротовой полости» относится к созданию условий, при которых в ткани по существу предотвращается накопление микроорганизмов, их фрагментов или метаболитов в таких количествах, которые могли бы вызвать воспаление. Особенно это справедливо, когда субъект, нуждающийся в лечении, здоров или в остальном не испытывает симптомов заболевания или патологического состояния. То же применимо, когда микроорганизмы были удалены посредством хирургического или стоматологического вмешательства, и задача состоит в том, чтобы гарантировано создать условия, при которых в ткани по существу предотвращается накопление микроорганизмов, их фрагментов или метаболитов в таких количествах, которые могли бы вызвать воспаление. Согласно указанным вариантам реализации, когда акцент делают на предотвращение накопления микроорганизмов, способных вызвать воспаление, следует понимать, что некоторые микроорганизмы, их фрагменты или метаболиты могут накапливаться после соответствующего этапа лечения.
Фраза «снижение частоты возникновения заболевания или патологического состояния» обычно относится к минимизации вероятности того, что у субъекта - будь он здоровым или с бессимптомным заболеванием, или страдающим ранней формой заболевания или патологического состояния - будет прогрессирование до полной активной формы указанного заболевания или патологического состояния. Согласно определенным вариантам реализации указанная фраза относится к предотвращению у указанного субъекта прогрессирования до полной активной формы указанного заболевания или патологического состояния.
Фраза «снижение тяжести заболевания или патологического состояния» обычно относится к минимизации одного или более симптомов или проявлений заболевания или патологического состояния. Согласно определенным вариантам реализации указанная фраза относится к лечению субъекта, страдающего заболеванием или патологическим состоянием.
Термин «иммуноген» обычно относится к молекуле, которая способна индуцировать или вызывать иммунный ответ на антиген, предпочтительно гуморальный или антительный ответ, например, ответ, опосредуемый Th2. Примеры иммуногенов включают пептиды и родственные белки.
Фраза «количества, эффективные для синергистичного действия» обычно относится к количествам противомикробной композиции и иммуногена, которые обеспечивают лечение, профилактическое или защитное действие, превышающие действие, которое можно было бы достигнуть при применении указанной композиции или иммуногена по отдельности. Согласно одному варианту реализации количества, эффективные для синергистичного действия противомикробной композиции и иммуногена указывают на новую действующую взаимосвязь между указанной композицией и иммуногеном, вследствие чего защитная или терапевтическая эффективность указанного иммуногена становится гораздо выше, чем могла быть достигнута при введении одного только указанного иммуногена в воспаленную ткань. Обычно количества, эффективные для синергистичного действия противомикробной композиции и иммуногена позволяют достичь более высокого титра и/или более высокой аффинности гуморального ответа на микробные патогенны, чем те, которых можно достичь при применении одного только иммуногена.
Фраза «терапевтически эффективное количество» обычно относится к количеству соединения согласно настоящему изобретению, которое (i) позволяет лечить конкретное заболевание, патологическое состояние или расстройство, (ii) ослабляет, облегчает или устраняет один или более симптомов конкретного заболевания, патологического состояния или расстройства, или (iii) замедляет появление одного или более симптомов конкретного заболевания, патологического состояния или расстройства, описываемых в настоящей заявке.
Слова «лечить» или «лечение» относятся к терапевтическому воздействию, при котором у субъекта замедляется (уменьшается) нежелательное физиологическое изменение или расстройство. Применительно к настоящему изобретению полезные или желаемые клинические результаты включают смягчение симптомов, снижение выраженности заболевания, стабилизацию (т.е. отсутствие ухудшения) состояния заболевания, отсрочивание или замедление прогрессирования заболевания, облегчение или ослабление состояния заболевания и ремиссию (частичную либо полную), определяемую или скрытую. Также термин «лечение» может относиться к продлению выживания по сравнению с ожидаемым выживанием в отсутствии лечения. Лечение не обязательно может приводить к полному уничтожению инфекции, а может приводить к снижению или минимизации осложнений и побочных эффектов инфекции, а также прогрессирования инфекции. Успех лечения или что-то иное можно отслеживать посредством врачебных осмотров субъекта, цитопатологического исследования, серологического исследования ДНК или способов детекции мРНК.
Слова «предотвращать» или «профилактика» относятся к профилактическим или превентивным мерам, направленным на защиту или предупреждение развития у субъекта осложнений, связанных с данной инфекцией, от прогрессирования до указанного осложнения. Субъекты, нуждающиеся в профилактике, включают субъектов, у которых имеет место инфекция.
Фраза «фармацевтически приемлемый» указывает на то, что указанное вещество или композиция должны быть совместимы химически и/или токсикологически с другими ингредиентами, входящими в состав композиции, и/или с млекопитающим, которого ею лечат.
Термин «инструкция по применению» относится к инструкциям, традиционно вкладываемым в коммерческие упаковки лекарственных препаратов, в которых содержится информация о показаниях, применении, дозировке, введении, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, относящихся к применению таких лекарственных препаратов.
Ответ, опосредуемый Th1, обычно относится к ответу с участием цитокинов, таких как интерферон гамма и ФНО (фактор некроза опухоли).
Ответ, опосредуемый Th2, обычно относится к ответу с участием цитокинов, таких как интерлейкин-4, интерлейкин-5, интерлейкин-6, интерлейкин-10, интерлейкин-13 и др.
2. Способы лечения
Способы согласно настоящему изобретению применимы к широкому спектру субъектов, включая субъектов, не испытывающих симптомов указанного заболевания или патологического состояния. У указанных субъектов может не быть симптомов заболевания тканей ротовой полости или других тканей. В частности, у указанных субъектов может не быть воспаления слизистой оболочки или тканей ротовой полости. Согласно одному варианту реализации у указанных лиц в контексте случайным образом отобранной когорты субъектов может быть нормальная относительная распространенность микробных патогенов в ротовой полости. Согласно другим вариантам реализации у субъекта проявляются субклинические или клинические симптомы заболевания или патологического состояния тканей ротовой полости или другого анатомического отдела.
Симптомы указанного заболевания или патологического состояния могут проявляться в тканях ротовой полости указанного субъекта. Могут присутствовать признаки острого воспаления, включая повышенный выход плазмы и лейкоцитов из кровяного русла в пораженные ткани. Также могут присутствовать клинические признаки острой инфекции десен, включая покраснение, повышение температуры, отек, боль и утрату функции. Хроническое воспаление может характеризоваться инфильтрацией лейкоцитов (моноцитов, макрофагов, лимфоцитов, плазматических клеток). Может наблюдаться рассасывание ткани и резорбция кости. Примеры воспаления включают хейлит, гингивит, глоссит и стоматит.
Согласно одному варианту реализации у указанного субъекта может быть воспалена слизистая оболочка или другие ткани ротовой полости. Примеры таких субъектов включают субъектов, которые подверглись стоматологической операции или операции на полости рта, включая санацию ротовой полости, специальную очистку и полировку поверхности корней.
Согласно дополнительным вариантам реализации у указанного субъекта может быть хроническое воспаление тканей ротовой полости. Согласно одному примеру у указанного субъекта может быть гингивит, резорбция альвеолярной кости и итоговое выпадение зубов, которые являются следствием прогрессивной утраты коллагенового прикрепления зубов к альвеолярной кости. Возможны и другие поражения слизистой оболочки или близких к ней тканей ротовой полости.
Согласно одному варианту реализации указанным заболеванием или патологическим состоянием является заболевание или патологическое состояние тканей ротовой полости. Особенно важным примером является хронический периодонтит. Другие примеры включают заболевания и патологические состояния, характеризующиеся повреждениями слизистой оболочки, как при скарлатине, афтозном стоматите, пиогенной гранулеме, дифтерии, туберкулезе, сифилисе, актиномикозе, кандидозе и герпетическом стоматите.
Следует понимать, что указанным заболеванием или патологическим состоянием может быть заболевание или патологическое состояние тканей, отличных от тканей ротовой полости, таких как ткани некоторых систем и органов, например, заболевание сердечно-сосудистой системы. Согласно одному варианту реализации указанным заболеванием или патологическим состоянием является сердечно-сосудистое заболевание.
Настоящее изобретение применимо к целому спектру микробных патогенов, особенно к патогенам, инфицирующим ткани ротовой полости. Согласно одному варианту реализации, указанный патоген выбирают из группы, состоящей из бактерий, вирусов и грибов.
Наиболее предпочтительно бактерии выбирают из группы, состоящей из: Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia.
Другие примеры патогенов приведены в Таблице А ниже.
Согласно одному варианту реализации композицию, образующую противомикробный агент, вводят указанному субъекту, вследствие чего происходит удаление по существу всех микроорганизмов или их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта. Далее обсуждаются примеры.
Согласно одному варианту реализации получение антитела у указанного субъекта, например, посредством введения иммуногена указанному субъекту, происходит через одну-две недели после лечения очага инфекции посредством механической санации и/или нанесения одного или более противомикробных агентов, описываемых в настоящей заявке.
Уровень присутствия микроорганизмов, их фрагментов или метаболитов можно оценивать путем определения или измерения количества белка, или его фрагмента, из клетки микроорганизма.
Согласно еще одному варианту реализации уровень присутствия микроорганизмов, их фрагментов или метаболитов в тканях ротовой полости можно оценивать путем отбора проб у субъекта и определения присутствия конкретного белка, или уровня экспрессии конкретного белка в указанной пробе. Присутствие или уровень белка можно оценивать при помощи многих типов анализа. Примеры включают иммунологический анализ, хроматографию и масс-спектрометрию. Один из примеров иммунологического анализа, который особенно предпочтителен, - это FACS (сортировка флуоресцентно-активированных клеток).
Разные типы анализа, которые можно применять для оценки присутствия целевого белка в пробе, включают:
Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA): Указанный способ основан на фиксации пробы, например, слюны или образца ткани ротовой полости, на такой поверхности, как лунка микропланшета. Наносят антитело, специфичное в отношении целевого белка, соединенное с ферментом, и дают ему связаться с указанным целевым белком, пептидом или его фрагментом. Затем присутствие указанного антитела определяют и количественно оценивают по колориметрической реакции, в которой участвует связанный с указанным антителом фермент. К ферментам, часто применяемым при осуществлении данного способа, можно отнести пероксидазу хрена и щелочную фосфатазу. Если сделана хорошая калибровка, и измерение проводят в линейном диапазоне отклика, количество целевого белка, пептида или его фрагмента в пробе пропорционально образующемуся окрашиванию. Для повышения точности измерения обычно применяют стандарт целевого белка, пептида или его фрагмента.
Вестерн-блоттинг: Указанный способ основан на отделении целевого белка, пептида или его фрагмента от другого белка при помощи электрофореза в акриламидном геле и последующего переноса указанного белка, пептида или его фрагмента на мембрану (например, из нейлона или ПВДФ /поливинилиденфторида/). Затем присутствие целевого белка, пептида или его фрагмента оценивают при помощи антитела, специфичного для указанного целевого белка, пептида или его фрагмента. В качестве антитело-связывающих реагентов могут, например, выступать белок А или другие антитела. Антитело-связывающие реагенты могут содержать радиоактивную метку или могут быть связаны с ферментом, как было описано выше. Определение можно проводить посредством авторадиографии, колориметрической реакции или хемилюминесценции. Указанный способ позволяет проводить и количественное определение целевого белка, пептида или его фрагмента, и определение его природы по относительному положению на мембране, которое является показателем расстояния продвижения в акриламидном геле при электрофорезе.
Радиоиммунный анализ (РИА): согласно одной из версий указанный способ основан на осаждении желаемого целевого белка, пептида или его фрагмента при помощи специфического антитела и антитело-связывающего белка с радиоактивной меткой (например, белок А, меченный I125), иммобилизованного на осаждаемом носителе, таком как гранулы из агарозы. Количество импульсов в осажденной грануле пропорционально количеству целевого белка, пептида или его фрагмента.
Согласно альтернативной версии РИА способ основан на связывании меченного целевого белка, пептида или его фрагмента и немеченого антитела. Пробу, содержащую неизвестное количество целевого белка, пептида или его фрагмента добавляют в изменяющихся количествах. Снижение откликов от осажденного меченного целевого белка, пептида или его фрагмента пропорционально количеству целевого белка, пептида или его фрагмента в добавляемой пробе.
Сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS): указанный способ основан на определении целевого белка, пептида или его фрагмента in situ в клетках при помощи антител, специфичных в отношении целевого белка, пептида или его фрагмента. Указанный целевой белок, пептид или его фрагмент соединяют с флуорофором. Определение проводят посредством аппарата для сортировки клеток, который считывает длину волны света, испускаемого каждой клеткой, по мере того как он проходит через луч света. При указанном способе можно применять одновременно два или более антител.
Иммуногистохимический анализ: Указанный способ основан на определении целевого белка, пептида или его фрагмента in situ в фиксированных клетках при помощи антител, специфичных в отношении целевого белка, пептида или его фрагмента. Указанный целевой белок, пептид или его фрагмент соединяют с флуорофором. Определение проводят посредством микроскопии и субъективной или автоматической оценки. Если применяют антитело, связанное с ферментом, может потребоваться колориметрическая реакция. Следует понимать, что после иммуногистохимии часто применяют докрашивание ядер клеток, например, при помощи красителя гематоксилин или гимза.
Анализ активности in situ: согласно указанному способу на клетки, содержащие активный фермент, наносят хромогенный субстрат, и указанный фермент катализирует реакцию, при которой указанный субстрат распадается, образуя хромогенный продукт, видимый через световой или флуоресцентный микроскоп.
Анализ активности in vitro: согласно указанным способам активность конкретного фермента измеряют в смеси белков, экстрагированной из указанных клеток. Указанную активность можно измерять в спектрофотометрических лунках при помощи колориметрических способов, или можно измерять в неденатурирующем акриламидном геле (т.е., гель для измерения активности). После электрофореза гель замачивают в растворе, содержащем субстрат и колориметрические реагенты. Полученная окрашенная полоса соответствует ферментной активности рассматриваемого белка. Если сделана хорошая калибровка, и измерение проводят в линейном диапазоне отклика, количество фермента, присутствующее в пробе, пропорционально интенсивности образующегося окрашивания. Для повышения точности количественного определения обычно применяют стандарт фермента.
Кроме того, в качестве показателя присутствия или для определения уровня микроорганизмов в тканях ротовой полости можно определять количество бактериальной ДНК посредством количественного ПЦР.
Присутствие или уровень белка или ДНК из клеток Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola, Tannerella forsythia можно определять, и показывать, что по существу все микроорганизмы или их фрагменты были удалены из тканей ротовой полости субъекта.
Противомикробный агент и/или иммуноген можно вводить системно или непосредственно в ткани ротовой полости, в частности, непосредственно в слизистую оболочку рта.
Согласно одному варианту реализации лечение субъекта приводит к удалению по существу всех микроорганизмов или их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта, вследствие чего минимизирует воспаление в тканях ротовой полости указанного субъекта. Согласно еще одному варианту реализации лечение субъекта приводит к удалению по существу всех микроорганизмов или их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта, вследствие чего минимизирует иммунный ответ в тканях ротовой полости указанного субъекта.
Указанный иммуноген можно вводить указанному субъекту после лечения указанного субъекта с целью удаления по существу всех микроорганизмов и их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта.
Обычно, согласно настоящему изобретению, соответствующая ткань ротовой полости не воспалена, или воспаление, если оно присутствует, протекает бессимптомно или субклинически в момент иммунизации.
3. Композиции
Согласно определенным вариантам реализации предложена композиция, которая содержит:
- противомикробный агент для удаления по существу всех микроорганизмов и их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта;
- иммуноген для иммунизации указанного субъекта от микробного патогена, наличие которого в тканях ротовой полости ассоциировано с заболеванием или патологическим состоянием;
указанную композицию можно применять при осуществлении способа, описываемого выше.
3. (а) Противомикробные агенты
Противомикробным агентом может быть любой агент, действие которого при введении состоит в том, что он устраняет воспалительные стимулы. Указанные агенты, применяемые отдельно или в комбинации, эффективны в отношении краткосрочного подавления воспаления, при повторном размножении патогенов в периодонте, например, при образовании биопленки, и/или резорбции кости периодонта. Указанные агенты отдельно или в комбинации можно наносить, например, местно в лекарственной форме периодонтального геля с медленным высвобождением на периодонтальный очаг, который может подвергнуться хирургическому вмешательству, для подготовки иммунной системы пациента к иммунизации против патогенов в периодонте.
Не вдаваясь в теорию или описание механизма действия, считается, что применение противомикробного агента, описываемого в настоящей заявке, например, в форме периодонтального геля, в момент механической санации и очистки очага инфекции в периодонте, помогает подготовить иммунную систему, чтобы она была способна к формированию иммунного ответа, опосредуемого Th2. Такой иммунный ответ, опосредуемый Th2, приводит к образованию защитных антител и предотвращению повторного размножения патогенов в периодонте и к предотвращению прогрессирования заболевания.
В данном контексте следующие агенты могут выступать в роли противомикробных агентов: антибиотик, иммунодепрессант и антисептик. Согласно определенным вариантам реализации указанным агентом может быть противовоспалительный агент. Противовоспалительные агенты включают нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП). Примеры НПВП включают соединения, которые ингибируют циклооксигеназу. Специфические примеры НПВП включают аспирин, ибупрофен и напроксен. Другие примеры противовоспалительных агентов включают антагонисты активируемого протеазами рецептора-2 (PAR-2), которые включают, без ограничений, антитела и фрагменты антител, которые связываются с PAR-2, другие полипептиды. Которые связываются с PAR-2 и ингибируют его активность, другие соединения, которые ингибируют активность или экспрессию PAR-2, включая низкомолекулярные органические соединения и ингибирующие нуклеиновые кислоты, которые взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами, кодирующими PAR-2. Примеры антагонистов, которые могут блокировать или замещать эндогенный лиганд при связывании с PAR-2 и/или передаче сигнала через PAR-2 включают вещества, описанные в заявках WO 2004/002418 и WO 2006/023844 (например, пептиды, которые имею последовательность аминокислот LIGK или LIGKV). В заявке WO 2007/092640 приведены примеры антагонистов, которые связываются с PAR-2 и препятствуют протеолитическому расщеплению той области PAR-2, которая действует как связанный лиганд.
Антагонисты, которые ингибируют, уменьшают или блокируют экспрессию PAR-2, включают ингибирующие нуклеиновые кислоты, включая без ограничений рибозимы, образующие триплекс олигонуклеотиды (TFO), внешние вспомогательные последовательности (EGS), которые способствуют расщеплению РНКазой Р, пептидные нуклеиновые кислоты, антисмысловые ДНК, малые интерферирующие РНК и микроРНК, специфичные к нуклеиновым кислотам, кодирующим PAR-2.
PAR-2 можно ингибировать косвенно «непрямыми антагонистами», которые антагонизируют активности протеаз, при нормальных условиях расщепляющих PAR-2, приводя к его активации. Протеазы, которые способны расщеплять PAR-2, включают гингипаины, трипсины, триптазу и протеиназу нейтрофилов-3. Примеры непрямых антагонистов, которые применимы для осуществления способов согласно настоящему изобретению, или которые можно применять в составе композиции согласно настоящему изобретению, включают ингибиторы трипсина, раскрываемые в заявке WO 93/14779, и ингибиторы триптазы, раскрываемые в заявке WO 02/47762.
Согласно одному особенно предпочтительному варианту реализации указанным противомикробным агентом является антибиотик. Примеры включают антибиотики, выбранные из группы, состоящей из макролидов, тетрациклинов, ингибиторов фумаратредуктазы и противомикробных пептидов, как указано в ТАБЛИЦЕ В ниже.
Согласно одному варианту реализации указанный противомикробный агент выбирают из одного или более агентов, ингибирующих фумаратредуктазу. Подходящие ингибирующие агенты включают натуральные продукты, которые включают без ограничений декурсин, вертиципирон, пециламинол, 5-алкенил-3,3(2H)-фураноны из видов Streptomyces, нафуредин, мезаконовую кислоту, ротенон и их природные, полусинтетические и синтетические аналоги. Согласно еще одному аспекту ингибирующими агентами могут быть синтетические соединения, которые включают без ограничений: 2-замещенные 4,6-динитрофенолы, меркаптопуридин-N-оксид; L-092 201 (Merck Sharpe and Dohme); нитроимидазолы, такие как фексиндазол, мегазол, бензнидазол, MK-436, L-634 549, мисонидазол; или бензимидазолы, такие как албендазол, камбендазол, мебендазол, оксфендазол, паребендазол и тиабендазол. Особенно предпочтительным ингибирующим агентом является оксантел.
Опытный специалист должен понимать, что выбор ингибирующего агента будет зависеть от ряда клинических факторов, которые определяют, подходит ли конкретный ингибирующий агент для применения в определенной клинической ситуации.
Указанный антибиотик может оказывать прямое цитотоксическое действие на указанный микробный патоген. Согласно другим вариантам реализации, например, указанный антибиотик может быть ингибитором образования микробной биопленки или некоторых других процессов метаболизма.
Согласно одному варианту реализации указанным антибиотиком является противомикробный пептид. Примеры приведены в Таблице С ниже.
Согласно одному особенно предпочтительному варианту реализации указанным противомикробным агентом является ингибитор образования микробной биопленки. Другими предпочтительными агентами являются ингибиторы фумаратредуктазы.
Согласно определенным вариантам реализации указанным противомикробным агентом может быть антитело. Указанное антитело может быть поликлональным или моноклональным антителом. Примеры моноклональных антител, которые можно применять, направлены против молекул патогена в периодонте (например, против протеаз и адгезинов) или хозяина с целью подавления воспаления [т.е., антитела, одни или в комбинации, против фактора некроза опухоли (ФНОα), интерлейкина-1 (IL-1), активатора плазминогена урокиназного типа (u-РА), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), колониестимулирующий фактор макрофагов (M-CSF) и лиганд RANK (RANKL)]. Предпочтительно указанным антителом является смесь моноклональных антител, направленных против разных антигенов патогена и медиаторов воспаления в организме хозяина. Предпочтительными моноклональными антителами, которые предполагается применять против Porphyromonas gingivalis, являются антитела, направленные против активного сайта протеиназ Kgp и RgpA, и антитела, направленные против связывающих мотивов в адгезине A1 протеиназ Kgp и RgpA.
Согласно одному варианту реализации указанным противомикробным средством является миметик антител. Указанный миметик антител может обладать или не обладать третичной структурой домена иммуноглобулина (например, Dimitrov, 2009, MAbs 1 26-28). Миметик антител может обладать специфичностью в отношении связывания со специфической молекулой. Одним из примеров миметиков антител является семейство молекул, родственных липокалинам человека, известным под названием антикалины (например, Skerra, 2007 Current Opinions in Biotechnology, 18 295-304). Предпочтительно, антикалин направлен на белок из клетки Porphyromonas gingivalis, или специфические связывается с указанным белком. Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный антикалин направлен против активного сайта Lys-X-протеиназы или Arg-X-протеиназы, таких как протеиназы Kgp и RgpA, или специфически связывается с указанным сайтом. Антикалины можно применять вместо моноклональных антител, но они приблизительно в восемь раз меньше и имеют размер приблизительно 180 аминокислот и массу приблизительно 20 кДа. Антикалины лучше проникают в ткани, чем антитела, и стабильны при температурах до 70°С. В отличие от антител их можно получать в больших количествах в клетках бактерий, таких как E. coli.
Согласно определенным вариантам реализации указанным противомикробным препаратом может быть также агент против биопленок, который может ингибировать, уменьшать или предотвращать образование или развитие бактериальных биопленок. Агент против биопленок может обладать активностью, разрушающей биопленки, и может вызывать рассасывание биопленок. В настоящей заявке термин «активность, разрушающая биопленки» относится к свойству композиции или агента, которое вызывает высвобождение бактерий из биопленки. Указанные композиция или агент могут также, но не обязательно, снижать жизнеспособность бактерий в биопленке. Понятие «высвобождение» бактерий из биопленки включает увеличение количества бактерий, вышедших из биопленки и перешедших в пассивноплавающее состояние, вследствие чего увеличивается чувствительность бактерий из биопленки к бактерицидным агентам. В настоящей заявке термин «бактерицидный агент» относится к свойству композиции, агента, соединения, пептидомиметика или пептида, который непосредственно снижает жизнеспособность бактерий.
Соответственно, не вдаваясь в теорию или описание механизма действия, считается, что композиции или агенты, которые обладают активностью, разрушающей биопленку, не обязательно снижают жизнеспособность бактерий в биопленке, а вместе с тем вызывают или индуцируют высвобождение клеток указанных бактерий из указанной биопленки. Согласно определенным вариантам реализации указанные композиции или агенты могут вызывать или индуцировать переход большего числа бактерий в пассивноплавающее состояние. Согласно другим вариантам реализации указанные композиции или агенты могут ингибировать или уменьшать образование биопленки. Согласно определенным вариантам реализации указанные композиции или агенты могут ингибировать или уменьшать рост биопленки. Согласно другим вариантам реализации противомикробные агенты согласно настоящему изобретению могут ингибировать или уменьшать любые характеристики, которые проявляет биопленки, и которые провоцируют или способствуют заболеванию или патологическому состоянию у субъекта. Согласно определенным вариантам реализации указанные пептиды или композиции могут ингибировать или уменьшать любые характеристики, которые проявляет биопленки, и которые провоцируют или способствуют заболеванию или патологическому состоянию у субъекта, без уничтожения бактерий в указанной биопленке.
Согласно определенным вариантам реализации понятие «противомикробная композиция или агент» относится к способности к предотвращению, ингибированию или уменьшению измеримых параметров биопленки. Неограничивающие примеры измеримых параметров биопленки могут включать общую биомассу, среднюю толщину, отношение поверхности к биообъему, коэффициент шероховатости или бактериальный состав и их жизнеспособность в биопленке.
3. (b) Иммуногены
Указанный иммуноген выбирают так, чтобы вызвать иммунный ответ, предпочтительно защитный гуморальный ответ на рассматриваемый микробный патоген.
Согласно одному варианту реализации, предложен иммуноген в форме пептида, например, рекомбинантного пептида.
Согласно одному варианту реализации, в частности связанному с инфицированием Р. gingivalis и ассоциированными заболеваниями и патологическими состояниями, указанным рекомбинантным пептидом может быть химерный или гибридный белок для индукции иммунного ответа на Р. gingivalis, белок, включающий первый пептид, напрямую или с помощью линкера соединенный со вторым пептидом, причем:
(A) указанный первый пептид включает:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность SEQ ID №1 или гомологична указанной последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность SEQ ID №2 или гомологична указанной последовательности; и
(B) указанный второй пептид включает:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Lys-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Arg-Х-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(iii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина HagA Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности.
Применяемый в настоящей заявке термин «пептид» относится к последовательности аминокислот, включающей до 40 остатков аминокислот, предпочтительно от 5 до 40 остатков аминокислот.
Согласно одному варианту реализации, вместо «второго пептида» применяют полипептид. Применяемый в настоящей заявке термин «полипептид» относится к последовательности аминокислот, включающей по меньшей мере приблизительно 40 остатков аминокислот.
Так, согласно еще одному аспекту предложен химерный или гибридный белок для индукции иммунного ответа на Р. gingivalis, белок, включающий пептид, напрямую или с помощью линкера соединенный с полипептидом, причем:
(A) указанный пептид включает:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность SEQ ID №1 или гомологична указанной последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность SEQ ID №2 или гомологична указанной последовательности; и
(B) указанный полипептид включает:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Lys-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Arg-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(iii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина HagA Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности.
Согласно еще одному аспекту предложен пептид для индукции иммунного ответа на Р. gingivalis, выбираемый из группы, состоящей из:
(i) последовательность, которая представляет собой SEQ ID №64-66 или гомологична указанной последовательности; и
(ii) последовательность, которая представляет собой SEQ ID №67 или 68 или гомологична указанной последовательности.
Согласно одному аспекту настоящего изобретения, в котором указанный пептид соответствует последовательности SEQ ID №64-68, указанный пептид может быть предложен в форме химерного или гибридного белка, в котором указанный пептид напрямую или с помощью линкера соединен со вторым пептидом. Согласно одному варианту реализации указанный второй пептид в указанном химерном или гибридном белке включает:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Lys-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Arg-Х-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(iii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина HagA Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности.
Согласно описанному выше варианту реализации вместо второго пептида применяют полипептид. Так, согласно еще одному аспекту предложен химерный или гибридный белок для индукции иммунного ответа против Р. gingivalis, белок, включающий пептид, напрямую или с помощью линкера соединенный с полипептидом, причем:
(A) указанный пептид включает:
(i) последовательность, которая представляет собой SEQ ID №64 - 66 или гомологична указанной последовательности; и
(ii) последовательности, которая представляет собой SEQ ID №67 или 68 или гомологична указанной последовательности.
(B) указанный полипептид включает:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Lys-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Arg-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(iii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина HagA Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности.
Применяемое в настоящей заявке указание на «гомологичный» пептид или полипептид указывает на пептид или полипептид, которые имею последовательность аминокислот, гомологичную последовательности аминокислот в первом упоминаемом пептиде или полипептиде, или идентичной предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95% и даже более предпочтительно по меньшей мере на 98%, когда сравнение проводят при помощи алгоритма BLAST, в котором параметры алгоритма выбирают так, чтобы задать максимальное соответствие между соответствующими последовательности по всей длине соответствующей эталонной последовательности. Термин «идентичность последовательностей» относится к точному соответствию между аминокислотами двух последовательностей, которые сравнивают. Такая гомология может возникать у существующего в природе варианта или изолята Lys-X-протеиназы или Arg-Х-протеиназы Р. gingivalis.
В качестве альтернативы, может быть вариант пептида или полипептида из клеток Р. gingivalis по типу «консервативной замены», в котором один или более остатков аминокислот были заменены без изменения общей конформации и функции указанного пептида или полипептида; включая без ограничений замену аминокислоты на другую, обладающую теми же свойствами. Аминокислоты со сходными свойствами хорошо известны в технике. Например, полярные/гидрофильные аминокислоты, которые могут быть взаимозаменяемы, включают аспарагин, глутамин, серин, цистеин, треонин, лизин, аргинин, гистидин, аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту; неполярные/гидрофильные аминокислоты, которые могут быть взаимозаменяемы, включают глицин, аланин, валин, изолейцин, пролин, тирозин, фенилаланин, триптофан и метионин; кислые аминокислоты, которые могут быть взаимозаменяемы, включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту, а основные аминокислоты, которые могут быть взаимозаменяемы, включают гистидин, лизин и аргинин. Предпочтительно такие варианты с консервативной заменой содержат менее 20, более предпочтительно менее 15, более предпочтительно менее 10 и наиболее предпочтительно менее 5 замен аминокислот.
Область трипсин-подобного фермента Р. gingivalis - особенно Lys-X-протеиназы (Rgp) или Arg-Х-протеиназы (RgpA) - которая образует сайт в ферменте для расщепления пептидной связи, можно определять после изучения настоящего описания, в частности, в соответствии с Фигурой 7 и Примером 9, в которых приведен пример способа прогнозирования трехмерной конформации каталитического сайта, как это видно для Lys-X-протеиназы Р. Gingivalis. В Примере 10 приведена методология моделирования трехмерной конформации Arg-Х-протеиназы.
Согласно определенным вариантам реализации указанный химерный или гибридный белок, или первый или второй пептид, или их компоненты могутт быть образованы пептидомиметиком. Пептидомиметик представляет собой молекулу, которая имитирует одну или более характеристик конкретного пептида, например, конформацию, и который состоит из остатков аминокислот, некоторые из которых могут быть неприродного происхождения.
Идентифицировав иммуногенные области указанного каталитического сайта, авторы настоящего изобретения определили последовательность разных пептидных иммуонгенов, на которые возникает гуморальный ответ. В частности, были идентифицированы следующие «шесть» областей, которые фланкируют или другим образом ограничивают указанный каталитический сайт: KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 и KAS6 (см. Таблицу 1). Располагая указанной информацией, авторы настоящего изобретения смогли сделать запрос о последовательности белка в базах данных, чтобы определить пептиды, гомологичные по последовательностям аминокислот, которые образуют области, фланкирующие каталитический сайт и, следовательно, представляющие собой иммуногенные эпитопы, обнаруживаемые в Р. gingivalis. Последовательность указанных пептидов идентифицировали следующей структурной формулой:
Авторы настоящего изобретения показали, что химерные белки, включая указанные пептиды, обладают рядом полезных свойств. Например, как описано в настоящей заявке, некоторые из них вызывают гуморальный ответ, который обеспечивает высокий уровень защиты, применяемый при лечении или профилактики резорбции кости, которая наблюдается при хроническом периодонтите. Также указанные пептиды можно применять для диагностических проб, в которых они позволяют определять или отслеживать специфичность в сыворотке субъекта, на основании чего можно судить, инфицирован ли указанный субъект, и если инфицирован, требуются ли ему лечебные средства, или, если лечебные средства вводятся, эффективны ли они.
Следует понимать, что указанная область трипсин-подобного фермента Р. gingivalis, которая образует сайт в указанном ферменте для расщепления пептидной связи, расположенной между С-концом и Lys или Arg, не содержит полной последовательности Lys-X-протеиназы или Arg-X-протеиназы. Применяемые в настоящей заявке термины «гетерологичный белок» или «химерный или гибридный белок» относятся к белку, который состоит из функциональных единиц, доменов, последовательностей или областей из аминокислот, полученных из разных источников, или которые получены из одного и того же источника, и которые были собраны так, что приобрели организацию, отличную от той, что наблюдается в молекуле, из которой получены или с которой связаны указанные единица, домен, последовательность или область. Общим свойством химерных или гибридных белков согласно настоящему изобретению является то, что они содержат по меньшей мере один пептид, которые имею последовательность, представляющую собой последовательности трипсин-подобного фермента Р. gingivalis или гомологичную указанной последовательности, которая образует сайт в указанном ферменте для расщепления пептидной связи.
Согласно одному предпочтительному варианту реализации, при котором указанный первый пептид содержит пептид из области Rgp[432-468], он предпочтительно (i) является пептидом, который содержит последовательность, выбираемую из VSFANYT и VGFANYT, более предпочтительно последовательность, выбираемую из GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA и VGFANYTA; или (ii) пептидом, который содержит последовательность, выбираемую из ETAWAD, ETSWAD, TAWADP и TSWADP, предпочтительно - последовательность, выбираемую из SETAWAD, SETSWAD, ETAWADP, ETSWADP, TAWADPL и TSWADPL, более предпочтительно - последовательность, выбираемую из GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP, SETSWADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TAWADPLL и TSWADPLL. Более предпочтительно указанный пептид выбирают из KAS1[432-454], KAS2[433-468] и KAS3[436-455] - пептидов, которые показаны в Таблице 1. В качестве альтернативы указанным первым пептидом может быть пептид PAS1K[432-453], также называемый PAS1(K48) и раскрываемый в Заявке на Международный патент №PCT/AU98/00311 (WO 98/049192). Кодовые обозначения последовательностей, соответствующие указанным пептидам, приведены в Таблице 3.
Аналогично, согласно еще одному предпочтительному варианту реализации, при котором указанный первый пептид содержит пептид из области RgpA[426-462], указанный пептид предпочтительно выбирают из пептидов RAS1 [426-448], RAS2[427-462] и RAS3[430-449], показанных в Таблице 1. В качестве альтернативы указанным первым пептидом может быть пептид PAS1R[426-446], также называемый PAS1(R45) и раскрываемый в Заявке на Международный патент №PCT/AU98/00311 (WO 98/049192).
В составе химерного или гибридного белка согласно настоящему изобретению указанным вторым пептидом может быть пептид из домена адгезина трипсин-подобного фермента Р. gingivalis, такого как Lys-X-протеиназа (Kgp), Arg-Х-протеиназа (RgpA) или HagA (См. Таблицу 2). Указанные домены иногда также называют гемагглютининами. В Lys-X-протеиназе предпочтительными доменами являются KA1, KA2, KA3, KA4, KA5, как указано в Таблице 2. В Arg-X-протеиназе предпочтительными доменами являются RA1, RA2, RA3 и RA4 как указано в Таблице 2. В HagA предпочтительными доменами являются HagA1, HagA1* и HagA1**.
Помимо усиления гуморального ответа на пептид согласно настоящему изобретению, такой как KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 и KAS6, или RAS1, RAS2 и RAS3, RAS4 и RAS5, домен адгезина, когда включен с таким пептидом в состав химерного или гибридного белка, также содержит иммуногенные эпитопы, тем самым приводя к образованию разных типов специфичности, индуцируя защитный иммуногенный ответ. Неожиданным оказался тот факт, что указанные иммуногенные эпитопы домена адгезина сохраняют в форму, близкую к форме домена адгезина в трипсин-подобном ферменте Р. gingivalis, когда они представлены в составе химерного или гибридного белка согласно настоящему изобретению.
Следует понимать, что согласно указанным вариантам реализации настоящего изобретения указанный химерный или гибридный белок может содержать один или более пептидов, выбранных из KAS1/RAS1, KAS2/RAS2, KAS3/RAS3, KAS4/RAS4, KAS5/RAS5 и KAS6/RAS6 наряду с одним или более доменами адгезина трипсин-подобного фермента Р. gingivalis, в частности с любым одним или более доменами адгезина Lys-X-протеиназы (KA1, KA2, KA3, KA4 и KA5) или доменами адгезина Arg-X-протеиназы (RA1, RA2, RA3 и RA4) или доменами HagA-HagA1, HagA1* и HagA1**.
Также следует понимать, что домен адгезина необязательно должен быть полным доменом, как обнаруживается в трипсин-подобном ферменте Р. gingivalis. Например, указанным доменом адгезина может быть фрагмент такого домена, в частности, предпочтительные фрагменты включают фрагменты KsA1 и KLA1 домена A1 Lys-X-протеиназы (см. Таблицу 2).
Когда указанным доменом является фрагмент домена адгезина, обычно он содержит один или более специфичных эпитопов домена адгезина.
Кодовые обозначения последовательностей, соответствующие родственным адгезину пептидам, приведены в Таблице 3.
Согласно одному варианту реализации указанный второй пептид или полипептид включает последовательность, показанную в одной или более последовательностей, выбранных из SEQ ID №: 69-79, или в одной или более последовательностей, выбранных из №83-85.
Также химерный или гибридный белок согласно настоящему изобретению может включать один или более дополнительных пептидов, выбранных из области Kgp[432-468] Lys-X-протеиназы и/или один или более дополнительных пептидов, выбранных из области RgpA[426-462] Arg-X-протеиназы.
Согласно предпочтительным вариантам реализации настоящего изобретения указанный химерный или гибридный белок включает один или более из KAS1, KAS2, KAS3, KAS4, KAS5 и KAS6, или один или более из RAS1, RAS2, RAS3, RAS4 и RAS5, наряду с KsA1 или KLA1.
Таким образом, согласно определенным вариантам реализации указанный химерный или гибридный белок может включать по меньшей мере один дополнительный пептид, причем указанный дополнительный пептид включает:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность SEQ ID №:1 или гомологична последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность SEQ ID №:2 или гомологична последовательности; или
(iii) часть или целую последовательность, которая аналогична или гомологична последовательности домена адгезина Lys-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична последовательности; или
(iv) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Arg-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична последовательности; или
(v) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина HagA Р. gingivalis или гомологична последовательности.
Другие примеры доменов, единиц, последовательностей или областей, которые можно включать в химерный или гибридный белок, описываемый в настоящей заявке, включают домены для ингибирования рецепторов или лигандов, таких как Fc-связывающие области иди Fc-рецепторы, домены для увеличения времени полувыведения, такие как альбумин, или домены для облегчения экспрессии или очистки указанного химерного или гибридного белка.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложен пептид для индукции иммунного ответа на Р. gingivalis, включающий последовательность, приведенную под одним из номеров: SEQ ID №: 17, 18, 25 и 26. Согласно одному варианту реализации, указанный пептид имеет последовательность, которая гомологична одной из последовательностей SEQ ID №: 17, 18, 25 и 26. Указанный пептид может иметь длину от 5 до 40 аминокислот.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота, кодирующая пептид, который имеет последовательность, приведенную под одним из номером SEQ ID №: 17, 18, 25 и 26.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложено применение пептида, который имеет последовательность, приведенную под одним из номеров SEQ ID №: 17, 18, 25 и 26, или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, который имеет последовательность, приведенную под одним из номеров SEQ ID №: 17, 18, 25 и 26, для получения химерного или гибридного белка для индукции иммунного ответа на Р. gingivalis.
Согласно еще одному варианту реализации настоящего изобретения предложено применение пептида, который имеет последовательность, приведенную под одним из номеров SEQ ID №: 17, 18, 25 и 26, или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, который имеет последовательность одной из последовательностей, приведенную под одним из номеров SEQ ID №: 17, 18, 25 и 26, для индукции иммунного ответа на Р. gingivalis.
Согласно одному варианту реализации, указанный пептид вводят одновременно или последовательно со вторым пептидом, включающим:
(i) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Lys-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(ii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина Arg-X-протеиназы Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности; или
(iii) частично или полностью последовательность, которая представляет собой последовательность домена адгезина HagA Р. gingivalis или гомологична указанной последовательности.
В указанных химерных или гибридных белках согласно настоящему изобретению, C-концевой остаток первого пептида может быть ковалентно связан с N-концевым остатком полипептида домена адгезина, или N-концевой остаток первого пептида может быть ковалентно связан с C-концевым остатком полипептида домена адгезина. При такой конфигурации говорят, что указанный первый пептид и домен адгезина в полипептиде «связаны напрямую» или «соседствуют».
Согласно другим вариантам реализации указанный химерный или гибридный белок включает линкер для соединения первого пептида с полипептидом домена адгезина. Указанным линкером может быть линкер, способный соединить пептид с полипептидом, включая линкеры на основе аминокислот и не содержащие аминокислоты. Предпочтительно линкер является не иммуногенным. Подходящие линкеры могут иметь длину до 15 аминокислот, хотя предпочтительно - менее пяти аминокислот. Указанный линкер может функционировать путем переведения первого пептида и домена адгезина в полипептиде в более близкое пространственное расположение, чем в норме наблюдается в трипсин-подобном ферменте Р. gingivalis. В качестве альтернативы он может разъединяить в пространстве первый пептид и домен адгезина в полипептиде.
Химерные или гибридные белки согласно настоящему изобретению можно получать при помощи рекомбинантных систем экспрессии (таких как технология рекомбинантных ДНК) или путем химического синтеза (такого как твердофазный синтез пептидов). Указанные способы хорошо известны в технике.
Указанный гетерологичный или химерный белок обладает значительными преимуществами, поскольку он усиливает гуморальный ответ по сравнению с гуморальным ответом, получаемым при применении указанного первого или второго пептида из указанного химерного или гибридного белка по отдельности.
Авторы настоящего изобретения показали, что химерные белки, включающие указанные пептиды, обладают целым рядом полезных свойств. Например, как описано в настоящей заявке, некоторые из них вызывают гуморальный ответ, который обеспечивает высокий уровень защиты, применяемый при лечении или профилактике резорбции кости, которая наблюдается при хроническом периодонтите. Также указанные пептиды можно применять для диагностических проб, в которых они позволяют определять или отслеживать специфичность в сыворотке субъекта, на основании чего можно судить, инфицирован ли указанный субъект, и если инфицирован, требуются ли ему лечебные средства, или, если лечебные средства вводятся, эффективны ли они.
Согласно одному варианту реализации, указанный химерный или гибридный белок вызывает защитный иммунный ответ, как правило, ответ, который по меньшей мере минимизирует или ограничивает повреждение соединительной ткани, к которые в противном случае ассоциированы с инфекцией Р. gingivalis. Согласно одному варианту реализации указанный защитный ответ по меньшей мере минимизирует или ограничивает вызываемую P.gingivalis резорбцию кости. Модельная система для измерения резорбции кости, опосредованной инфекцией Р. Gingivalis, обсуждается в настоящей заявке. Обычно указанный защитный иммунный ответ преимущественно представляет собой гуморальный ответ. Согласно определенным вариантам реализации указанный защитный иммунный ответ также включает клеточный ответ.
Также согласно настоящему изобретению предложена композиция, которая содержит химерный или гибридный белок, широко описываемый в настоящей заявке. Обычно указанная композиция является антигенной или иммуногенной. Более конкретно, согласно настоящему изобретению предложена композиция, подходящая для индукции защитного или терапевтического иммунного ответа на инфекцию Р. gingivalis, содержащая указанный химерный или гибридный белок, который возможно ассоциирован с адъювантом. Такая композиция может также включать другой компонент для модулирования или потенцирования указанного иммунного ответа. Согласно одному варианту реализации, указанная композиция имеет форму вакцины.
Предпочтительная композиция включает иммуногены, которые генерируют иммунный ответ на патогены Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola и Tannerella forsythia в периодонте. Иммуногены могут представлять собой вакцину из ослабленных цельных клеток или вакцину из очищенного антигена, или, более предпочтительно, вакцину из рекомбинантного антигена, причем указанная композиция содержит антигены против одного или более из трех указанных патогенов периодонта. Другие примеры подходящих пептидов, способных к образованию иммуногенов, значимых для инфекции Р. gingivalis, Т. denticola и Т. forsythia, приведены в Таблицах D - F.
1. Номера доступа и определения из TIGR /институт геномных исследований/ (сейчас JCVI, www.tigr.orq). Автоматическая аннотация генома TIGR.
Для применения в сочетании с композициями-вакцинами известны разные адъюванты. Указанные адъюванты способствуют модулированию иммунного ответа и достижению более длительного и более высокого уровня иммунитета при применении меньших количеств антигена, лежащего в основе вакцины, или более низких доз, чем при введении одной только вакцины. Примеры адъювантов включают неполный адъювант Фрейнда (IFA), Адъювант 65 (содержащий арахисовое масло, маннит моноолеат и алюминия моностеарат), масляные эмульсии, адъювант Риби, плюроновые полиолы, полиамины, Авридин, Quil A, сапонин, MPL, QS-21, неорганические гели, такие как соли алюминия и соли кальция, наночастицы, такие как гидроксиапатит, фосфат кальция, соли алюминия, олигомеры и полимеры Сахаров, такие как маннан, хитозан. Другие примеры включают эмульсии типа «масло-в-воде», такие как SAF-1, SAF-0, MF59, Seppic ISA720 и другие дисперсные адъюванты, такие как ISCOMs™ и ISCOM matrix™. Обширный, но не исчерпывающий список других примеров адъювантов приведен у Сох and Coulter 1992 [In: Wong WK (ed.) Animals parasite control utilising technology. Bocca Raton; CRC press, 1992; 49-112]. Помимо адъювантов композиции вакцины могут включать традиционные фармацевтически приемлемые основы, вспомогательные вещества, наполнители, буферы или растворители, при необходимости. Одну или более доз композиций вакцин, содержащих адъювант, можно вводить профилактически для предупреждения периодонтита или терапевтически для лечения уже существующего периодонтита. Согласно одному варианту реализации, применяемый адъювант можно выбрать для облегчения выработки основанного на Th-2 ответа. Примером могут служить квасцы.
Согласно предпочтительным вариантам реализации указанный химерный или гибридные белок сочетают с мукозным адъювантом и вводят оральным, буккальным или назальным путем. Примеры мукозных адъювантов включают наночастицы, холерный экзотоксин и термолабильный токсин Е. coli, нетоксические В-субъединицы указанных токсинов, генетические мутанты указанных токсинов, которые обладают пониженной токсичностью.
Другие способы, которые можно применять для доставки антигенного белка перорально/буккально/назально включают заключение или абсорбцию указанного белка в частицы или на частицы из биоразлагаемого полимера (такого как акрилы или полиэфиры) или наночастицы (такие как гидроксиапатит) посредством микрокапсуляции, чтобы облегчить поглощение указанных микросфер из желудочно-кишечного тракта или на других слизистых оболочках и защитить указанные белки от распада. Липосомы, ISCOMs™, гидрогели представляют собой примеры других потенциальных способов, которые также можно усовершенствовать путем включения направляющих молекул, таких как LTB (лейкотриен В), СТВ (субъединица В холерного эндотоксина) или лектины для доставки указанного антигенного белка к иммунной системе в слизистой оболочке. Помимо указанного антигенного белка и мукозного адъюванта или системы доставки композиции вакцин могут включать традиционные фармацевтически приемлемые основы, вспомогательные вещества, наполнители, оболочки, диспергенты, противобактериальные и противогрибковые агенты, а также буферы или растворители, при необходимости.
Известно множество способов введения композиции вакцины субъекту, включая без ограничений внутрикожный, внутримышечный, внутриперитонеальный, внутривенный, подкожный, внутриназальный, сублингвальный, буккальный и оральный способ введения. Указанные пути введения особенно применимы при иммунизации.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую химерный или гибридный белок, в широком смысле описанный выше, который может быть функционально связан с по меньшей мере с одним регуляторным элементом. Согласно одному варианту реализации указанная нуклеиновая кислота представлена в изолированной или по существу в очищенной форме.
Указанную молекулу нуклеиновой кислоты можно, например, вводить в подходящий вектор экспрессии для получения указанного химерного белка в качестве рекомбинантного белка путем введения указанного вектора экспрессии в клетку-хозяина прокариот или эукариот. Для успешной экспрессии указанного рекомбинантного белка требуется, чтобы указанный вектор экспрессии содержал необходимые регуляторные элементы для транскрипции и трансляции, которые совместимы с конкретной системой клетки-хозяина, применяемой для экспрессии, и распознаются указанной клеткой. Для экспрессии указанного рекомбинантного белка можно применять разнообразные системы клеток-хозяев, которые включают без ограничений бактерии, трансформированные вектором на основе бактериофага, вектором-плазмидой или ДНК-космидой; дрожжи, содержащие векторы для дрожжей; грибы, содержащие векторы для грибов; линии клеток насекомых, инфицированных вирусом (например, бакуловирусом); и линии клеток млекопитающих, трансфецированных векторами экспрессии на основе вирусов или плазмид, или инфицированных рекомбинантным вирусом (например, вирусом коровьей оспы, аденовирусом, аденоассоциированным вирусом, ретровирусом и др.).
При помощи способов, известных в молекулярной биологии, в указанный вектор экспрессии можно включить разные промоторы и энхансеры, чтобы повысить уровень экспрессии рекомбинантного белка, при условии что повышенная экспрессия указанных последовательностей аминокислот совместима с конкретной системой применяемой клетки-хозяина (например, не токсична для данной клетки).
Выбор промотора будет зависеть от применяемой системы экспрессии. Промоторы варьируют по силе, т.е. по способности облегчать транскрипцию. Обычно желательно применять сильный промотор, чтобы получить высокий уровень экспрессии кодирующей последовательности нуклеотидов и экспрессии с получением рекомбинантного белка. Например, известные в технике промоторы бактерий, фагов или плазмид, с которых наблюдался высокий уровень транскрипции в системах клеток-хозяев, таких как E. coli, включают lac промотор, trp промотор, recA промотор, промотор рибосомальной РНК, промоторы PR и PL, lacUV5, ompF, bla, lpp, и подобные, которые можно применять для обеспечения транскрипции рассматриваемой нуклеотидной последовательности, кодирующей последовательности аминокислот.
Другие контрольные элементы для эффективной транскрипции или трансляции включают энхансеры и регуляторные сигналы. Последовательности энхансеров представляют собой элементы ДНК, которые, по-видимому, повышают эффективность транскрипции относительно независимо от их положения и ориентации относительно соседней кодирующей последовательности нуклеотидов. Таким образом, в зависимости от системы экспрессии применяемой клетки-хозяина энхансер можно поместить выше либо ниже вводимых кодирующих последовательностей для повышения эффективности транскрипции. Для регуляции экспрессии указанной кодирующей последовательности можно применять другие регуляторные участки, такие как сигналы инициации транскрипции или трансляции.
Согласно еще одному варианту реализации указанный вектор может быть на основе вируса или бактериальной вакцины, и его можно применять для получения рекомбинантной вирусной вакцины, рекомбинантной бактериальной вакцины рекомбинантной ослабленной бактериальной вакцины или инактивированной рекомбинантной вирусной вакцины. Вирус коровьей оспы является наилучшим из примеров, известных в технике, инфекционных вирусов, которые разработаны для экспрессии антигена вакцины, получаемого из других организмов. Для иммунизации хозяина применяют живой рекомбинантный вирус коровьей оспы, который ослаблен или другим образом обработан, чтобы не вызывать заболевание. Последующая репликация указанного рекомбинантного вируса в организме хозяина обеспечивает постоянную стимуляцию иммунной системы антигенами вакцины, что обеспечивает долгосрочный иммунитет.
Другие векторы для получения живых вакцин включают: аденовирус, цитомегаловирус и, предпочтительно, поксвирусы, такие как вирус коровьей оспы [Paoletti and Panicali, Патент США №4603112], и ослабленные штаммы Salmonella strains [Stocker et al., Патент США №5210035; 4837151; и 4735801; и Curtiss et al., 1988, Vaccine 6: 155-160]. Живые вакцины особенно преимущественны, поскольку они постоянно стимулируют иммунную систему, что может обеспечивать особенно длительный иммунитет. Когда иммунный ответ должен обеспечить защиту от последующего инфицирования Р. gingivalis, можно применять саму по себе живую вакцину в качестве профилактической вакцины против Р. gingivalis. В частности, живая вакцина может быть основана на бактерии, которая является симбиотическим организмом для ротовой полости. Такую бактерию можно трансформировать вектором, содержащим рекомбинантный химерный белок, и затем применить ее для заселения ротовой полости, в частности слизистой оболочки ротовой полости. После заселения слизистой оболочки ротовой полости экспрессия указанного рекомбинантного белка будет стимулировать выработку нейтрализующих антител в ассоциированной со слизистой оболочкой лимфоидной ткани. Чтобы более подробно проиллюстрировать данный вариант реализации, основанный на технологиях молекулярной биологии, хорошо известных в технике, последовательности нуклеотидов, кодирующие химерные белки согласно настоящему изобретению, можно вводить в геномную ДНК вируса коровьей оспы в сайте, который дает возможность экспрессии эпитопов, но не оказывает отрицательного действия на рост или репликацию вектора на основе вируса коровьей оспы. Получаемый рекомбинантный вирус можно применять в качестве иммуногена в препарате вакцины. Такие же способы можно применять для конструирования вакцины на основе инактивированного рекомбинантного вируса, за исключением того, что указанный рекомбинантный вирус инактивируют, например, химическими средствами, известными в технике, перед применением в качестве иммуногена, без существенного влияния на иммуногенность экспрессируемого иммуногена. Инактивированную рекомбинантную вакцину можно составить с включением подходящего адъюванта с целью усиления иммунологического ответа на антигены вакцины.
Также согласно настоящему изобретению предложен способ применения молекулы нуклеиновой кислоты, включая последовательность нуклеотидов, кодирующую химерный или гибридный белок согласно настоящему изобретению напрямую или в составе препарата вакцины. Последовательности нуклеотидов, кодирующие указанные химерные белки, функционально связанные с одним или более регуляторными элементами, можно вводить напрямую, чтобы вакцинировать субъекта («прямой перенос генов») для защиты от патогенных штаммов Р. gingivalis. Было продемонстрировано, что прямой перенос генов в организм вакцинируемого субъекта, приводящий к экспрессии указанного генетического материала клетками вакцинируемого субъекта, такими как клетки эндотелия сосудов, а также ткани основных органов, можно осуществить при помощи технологий, известных в технике, таких как внутривенное введение комплекса экспрессии плазмидажатионная липосома [Zhu et al., 1993, Science 261: 209-211]. В технике известны другие эффективные способы доставки ДНК-вектора в клетку-мишень. Согласно одному примеру для прививки вакцины (парентерально, на слизистую оболочку или иммунизация при помощи генной пушки) с целью индукции защитного иммунного ответа была применена очищенная рекомбинантная ДНК-плазмида, содержащая гены вируса, [Fynan et al. 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90: 11478-11482].
Согласно другому примеру клетки, отобранные у субъекта, можно трансфецировать или электропорировать посредством стандартных процедур, известных в технике, что приводит к введению рекомбинантного ДНК-вектора в клетку-мишень. Клетки, содержащие ДНК-вектор, затем можно подвергать селекции при помощи способов, известных в технике, таких как применение селектируемого маркера, экспрессируемого с указанного вектора, и отобранные при селекции клетки можно затем повторно вводить указанному субъекту с целью экспрессии рекомбинантного белка.
Согласно другим вариантам реализации предложена фармацевтическая композиция, включающая противомикробный агент и иммуноген, описанный выше. Также указанная композиция может включать растворитель, вспомогательное вещество или основу, или химиотерапевтический агент для лечения патологического состояния или заболевания, ассоциированного с инфекцией ротовой полости, и ее можно адаптировать для перорального введения. Композиции согласно настоящему изобретению можно включать в состав пастилок или жевательной резинки, или других продуктов, например, путем замешивания в теплую гуммиоснову или нанесения на внешнюю поверхность гуммиосновы, иллюстрацией чего являются «jelutong», каучуковый латекс, виниловый пластик и др., желательно с традиционными пластификаторами или смягчителями, сахаром или другими подсластителями, такими как глюкоза, сорбитол и подобные.
Композицию для перорального введения согласно настоящему изобретению, которая содержит упоминаемую выше фармацевтическую композицию, можно приготовить и применять в разных формах, применимых для полости рта, таких как средства для чистки зубов, включая зубные пасты, зубные порошки и жидкие средства для чистки зубов, ополаскиватели для рта, лепешки, жевательные резинки, зубные пасты, кремы для массажа десен, таблетки для полоскания, молочные и другие пищевые продукты. Композиция для перорального введения согласно настоящему изобретению также может включать дополнительные хорошо известные ингредиенты в зависимости от типа и формы конкретной композиции для перорального введения.
Согласно определенным предпочтительным формам согласно настоящему изобретению композиция для перорального введения может быть по существу жидкой по своим свойствам, такой как ополаскиватель для рта или раствор для полоскания. В таком препарате основой обычно служит водно-спиртовая смесь, желательно включающая увлажняющий компонент, как описано ниже. Обычно массовое соотношение воды и спирта попадает в диапазон примерно от 1:1 до примерно 20:1. Общее количество водно-спиртовой смеси в препаратах такого типа, как правило, попадает в диапазон примерно от 70 до примерно 99,9% по массе препарата. Указанным спиртом, как правило, является этанол или пропанол. Предпочтителен этанол.
рН каждого жидкого и другого препарата согласно настоящему изобретению обычно попадает в диапазон примерно от 5 до примерно 9, и, как правило, примерно от 5,0 до примерно 7,0. рН можно контролировать при помощи кислоты (например, лимонной или бензойной кислоты) или основания (например, гидроксида натрия) или путем забуферивания (например, цитратом, бензоатом, карбонатом или бикарбонатом натрия, вторичным кислым фосфатом натрия, первичным кислым фосфатом натрия и др.).
Согласно другим желательным формам настоящего изобретения указанная фармацевтическая композиция может быть по существу твердой или пастообразной по своим свойствам, такой как зубной порошок, растворимые таблетки для полости рта, зубная паста (зубной крем) или гель для чистки зубов. В таких твердых или пастообразных препаратах основа обычно содержит стоматологически приемлемый полировальный материал.
В зубной пасте жидкая основа может содержать воду и увлажняющий компонент в количестве, варьирующем от примерно 10% до примерно 80% от массы указанного препарата. Примерами подходящих увлажняющих компонентов/основ служат глицерин, пропиленгликоль, сорбитол и полипропиленгликоль. Также преимущественны водные смеси воды, глицерина и сорбитола. В прозрачных гелях, где коэффициент преломления имеет важное значение, предпочтительно применять примерно 2,5-30% по массе воды, от 0 до примерно 70% по массе глицерина и примерно 20-80% по массе сорбитола.
Зубные пасты, кремы и гели, как правило, содержат природный или синтетический загуститель или желирующий компонент в количестве от примерно 0,1 до примерно 10, предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 5% по массе. Подходящими загустителями являются синтетический гекторин, синтетический коллоидный комплекс магния и щелочного металла, доступный, например, в форме Лапонита (например, СР, SP 2002, D), поставляемого компанией «Laporte Industries Limited». Лапонит D состоит приблизительно на 58,00% из SiO2, 25,40% из MgO, 3,05% из Na2O, 0.98% из Li2O, и некоторого количества воды и металлов, содержащихся в следовых количествах. Его истинная плотность составляет 2,53, кажущаяся объемная плотность 1,0% при влажности 8%.
Другие подходящие загустители включают ирландский мох, йота-каррагенан, трагакантовая камедь, крахмал, поливинилпирролидон, гидроксиэтилпропилцеллюлоза, гидроксибутилметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксигексилцеллюлоза (например, поставляемая в форме Натрозола), натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы и коллоидный диоксид кремния, такой как мелкоразмолотый силлоид (например, 244). Также можно включать солюбилизирующие агенты, такие как увлажняющие полиолы, такие как пропиленгликоль, дипропиленгликоль и гексиленгликоль, целлозольвы, такие как метилцеллозольв и этилцеллозольв, растительные масла и воски, содержащие по меньшей мере 12 атомов углерода в прямой цепи, такие как оливковое масло, касторовое масло и вазелиновое масло, а также эфиры, такие как амилоуксусный эфир, этилацетат и бензибензоат.
Следует понимать, что традиционные оральные препараты должны продаваться или распространяться другим способом в соответствующей упаковке с маркировкой. Так, флакон с раствором для полоскания рта должен содержать маркировку с его описанием, по сути, как полоскание или ополаскиватель для рта, и должен содержать инструкцию по применению; а зубная паста, крем или гель обычно должны быть в деформируемом тюбике, обычно алюминиевом, с оболочкой из пластика или свинца, или других сдавливаемых, насосных или герметичных дозаторах для отмеривания содержимого, с маркировкой, описывающей препарат по существу, как зубную пасту, гель или зубной крем.
В композициях согласно настоящему изобретению можно применять органические поверхностно-активные агенты для достижения усиленного профилактического действия, способствования достижению глубокого и полного распределения указанного активного агента по всей ротовой полости, и для придания быстрорастворимым композициям более приемлемой косметической формы. Органический поверхностно-активный материал предпочтительно анионный, неионный или амфолитический по своей природе и предпочтительно не взаимодействует с указанным активным агентом. Предпочтительно применять в качестве указанного поверхностного агента детергент, который придает указанной композиции детергентные и пенообразующие свойства. Примеры подходящих анионных поверхностно-активных веществ включают водорастворимые соли моноглицеридмоносульфатов высших жирных кислот, такие как натриевая соль моноглицеридмоносульфата высших жирных кислот жирных кислот кокосового масла, сульфаты высших алкилов, такие как лаурилсульфат натрия, алкиларилсульфонаты, такие как додецил бензенсульфонат натрия, высшие алкилсульфоацетаты, эфиры высших жирных кислот и 1,2-гидроксипропансуоната и существенно насыщенные высшие алифатические ациламиды низших алифатических аминокарбоновых кислот, таких как соединения, содержащие от 12 до 16 атомов углерода в жирной кислоте, алкильные или ацильные радикалы и подобные. Примеры последних упоминаемых амидов включают N-лауроил саркозин, а также натриевые, калиевые и этаноламиновые соли N-лауроил, N-миристоил и N-пальмитоил саркозина, которые должны по существу не содержать мыла или сходного материала высших кислот.Примеры водорастворимых неионных поверхностно-активных веществ, подходящих для применения, включают продукты конденсации этиленоксида с разными содержащими активный водород соединениями, реактивные и вместе с тем обладающие длинными гидрофобными цепями (например, алифатические цепи приблизительно из 12-20 атомов углерода), причем продукты конденсации (этоксамеры) содержат гидрофильные полиоксиэтиленовые части, такие как продукты конденсации поли(этиленоксида) с жирными кислотами, жирными спиртами, жирными амидами и другими жирными группами, и с пропиленоксидом и полипропиленоксидами (например, плюроники).
Указанный поверхностно-активный агент, как правило, присутствует в количестве приблизительно 0,1-5% по массе. Примечательно, что указанный поверхностно-активный агент может способствовать растворению активного агента согласно настоящему изобретению и тем самым снижать количество требуемого растворяющего увлажняющего вещества.
В препараты для орального применения согласно настоящему изобретению можно включать разные другие материалы, такие как отбеливающие агенты, консерванты, силиконы, соединения хлорофилла и/или аммонизированный материал, такой как мочевина, диаммоний-фосфат и их смеси. Указанные адъюванты, когда они присутствуют, включают в указанные препараты в количествах, которые по существу не оказывают неблагоприятного действия на желаемые свойства и характеристики.
Также можно применять любой подходящий ароматизатор и подсластитель. Примеры подходящих ароматизирующих компонентов включают ароматические масла, например, масло мяты курчавой, мяты перечной, гаультерии, сассафраса, гвоздики, шалфея, эвкалипта, майорана, корицы, лимона и апельсина, а также метилсалицилат.Подходящие подсластители включают сахарозу, лактозу, мальтозу, сорбитол, ксилитол, натрия цикламат, периллартин, АМФ (аспартилфенилаланин, метиловый эфир), сахарин и подобные. Соответственно, каждый из ароматизаторов или подсластителей или они вместе могут составлять приблизительно от 0,1% до 5% или более от массы указанного препарата.
Композиции, предназначенные для орального применения, можно приготовить в соответствии с любым из способов, известных в области производства фармацевтических композиций, и такие композиции могут содержать один или более агентов, выбранных из группы, состоящей из подсластителей, ароматизаторов, красителей и консервантов, для получения фармацевтически элегантных и приятных на вкус препаратов. Таблетки содержат указанный активный ингредиент в смеси с нетоксическими фармацевтически приемлемыми вспомогательными веществами, которые подходят для производства таблеток. Указанными вспомогательными веществами могут быть, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат натрия, лактоза, фосфат кальция или фосфат натрия; гранулирующие и распадающиеся агенты, например, кукурузный крахмал или альгиновая кислота; связующие агенты, например, крахмал, желатин или камедь, и лубриканты, например, стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть без оболочки, или их можно покрывать оболочкой при помощи известных технологий, чтобы замедлить распад и всасывание в желудочно-кишечном тракте или зубодесневом кармане, тем самым обеспечивая пролонгированное действие. Например, можно применять материал, приводящий к задержке высвобождения, такой как глицерилмоностеарат или глицерилдистеарат.
Лекарственные формы для орального применения также могут быть представлены в форме твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешивают с инертным твердым разбавителем, например, карбонатом кальция, фосфатом кальция или каолином, или в форме мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешивают с водной или масляной средой, например, с арахисовым маслом, жидким парафином или оливковым маслом.
Водные суспензии содержат указанные активные вещества в смеси с вспомогательными веществами, подходящими для производства водных суспензий. Такие вспомогательные вещества включают суспендирующие агенты, например, карбоксиметилцеллюлозу натрия, метилцеллюлозу, гидропропилметилцеллюлозу, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовую камедь и аравийскую камедь; диспергирующие или смачивающие агенты могут включать природные фосфатиды, например, лецитин, или продукты конденсации алкиленоксидов с жирными кислотами, например, полиэтиленоксидстеарат, или продукты конденсации этиленоксида с длинноцепочечными алифатическими спиртами, например, гептадекаэтиленоксиэтанол, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и гекситола, такие как полиоксиэтиленсорбитол моноолеат, или продукты конденсации этиленоксида с неполными эфирами, полученными из жирных кислот и ангидридов гекситола, например, полиоксиэтиленсорбитан моноолеат.
Также указанные водные суспензии могут содержать один или более консервантов или противомикробных агентов, например, бензоаты, такие как этил или n-пропил p-гидроксибензоат; другой пример включает хлоргексидин глюконат, один или более красителей, один или более ароматизаторов, а также один или более подсластителей, таких как сахароза или сахарин.
Масляные суспензии можно получить путем суспендирования активных ингредиентов в растительном масле, например, арахисовом масле, оливковом масле, кунжутном масле или кокосовом масле, или в минеральном масле, таком как жидкий парафин. Указанные масляные суспензии могут содержать загуститель, например, пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт. Можно добавлять подсластители, которые указаны выше, и ароматизаторы для получения оральных препаратов с приятным вкусом. Можно увеличить срок сохранности указанных композиций путем добавления антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота.
4. Наборы
Согласно определенным вариантам реализации предложен набор, включающий:
- противомикробный агент для удаления по существу всех микроорганизмов или их фрагментов из тканей ротовой полости указанного субъекта;
- иммуноген для иммунизации указанного субъекта от микробного патогена, наличие которого в тканях ротовой полости ассоциировано с заболеванием или патологическим состоянием;
причем указанный набор адаптируют для применения при осуществлении способов, описываемых выше.
Указанный набор может включать:
- контейнер, в котором заключена терапевтическая композиция в форме одного или более противомикробных агентов и иммуноген;
- этикетка или вкладыш с инструкцией по применению.
Согласно определенным вариантам реализации предложен набор, который применяют при осуществлении способа или применения, описанных в настоящей заявке.
Согласно определенным вариантам реализации указанный набор может содержать один или более дополнительных активных компонентов или ингредиентов для лечения заболевания или патологического состояния.
Указанный набор может содержать контейнер и этикетку или вкладыш с инструкцией по применению на указанном контейнере или в ассоциации с контейнером. Подходящие контейнеры, например, включают флаконы, виалы, шприцы, блистерную упаковку и др. Указанные контейнеры могут быть выполнены из разных материалов, таких как стекло или пластик. В указанном контейнере содержится терапевтическая композиция, которая эффективна для лечения указанного патологического состояния, и может иметь стерильный доступ (например, указанным контейнером может быть пакет для внутривенных инфузий или флакон с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций). В указанной этикетке или вкладыше с инструкцией по применению должно быть указано, что указанную терапевтическую композицию применяют для лечения избранного патологического состояния. Согласно одному варианту реализации, указанная этикетка или вкладыш с инструкцией по применению содержит указания по применению, и в них указано, что указанную терапевтическую композицию можно применять для лечения данного заболевания или патологического состояния.
Указанный набор может содержать (а) терапевтическую композицию; и (b) второй контейнер со вторым активным компонентом или ингредиентом, который в нем содержится. Согласно такому варианту реализации указанный набор может также содержать вкладыш с инструкцией по применению, в котором будет указано, что данный и другой активный компонент можно применять для лечения нарушения или профилактики осложнений, возникающих вследствие данной инфекции. В качестве альтернативы, или дополнительно, указанный набор также может содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БСВИ), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Также он может включать другие материалы, желательные с коммерческой и потребительской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами, которые включены с целью пояснения на примерах, но не ограничения области изобретения.
Пример 1. Материалы и способы.
Штаммы бактерий и условия выращивания. Лиофилизированные культуры Porphyromonas gingivalis W50 выращивали в анаэробных условиях при 37°С на чашках с агаром и лизированной кровью лошади с добавлением 5 мкг/мл гемина, 0,5 мкг/мл цистеина (НВ arap, <10 пересевов). Через 3-4 дня колонии применяли для инокуляции на среде для инфузии мозга и сердца, содержащей 5 мкг/мл гемина, 0,5 мкг/мл цистеина (1). Периодические культуры выращивали в анаэробных условиях на Анаэробной станции MK3 («Don Whitley Scientific Ltd.», Аделаида, Австралия). Клетки отбирали во время логарифмической фазы роста посредством центрифугирования (7500 д, 30 мин, 4°С) и промывали дважды буфером PG (50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2 и 5 мМ цистеина-HCl, рН 8,0) на анаэробной станции. Рост периодических культур отслеживали на 650 нм при помощи спектрофотометра (модель 295Е, «Perkin-Elmer»). Чистоту культуры проверяли регулярно путем окрашивания по Граму, микроскопического исследования и с применением разных биохимических тестов по Слотсу (2).
Получение конструкций pЕТ28, содержащих последовательности адгезина и последовательности адгезина с N-концевым добавлением последовательности протеиназы Kgp.
Остатки Kgp, соответствующие пептидам и химерным пептидам активного сайта (AS) и домена адгезина KgpA1 (A1) гиперэкспрессировали в клетке Е. coli в качестве рекомбинантных (r) белков с гекса-His метками при помощи вектора экспрессии pET («Novagen»). Экспрессированные r-белки включали rKAS2 и rKLA1, а r-химерные белки включали rKAS2-KLA1, rKAS1-KsA1 и rKAS4-KAS3-KAS5-KAS6-KLA1 (также называемые мультиKAS-KLA1). Последовательности аминокислот, соответствующие разным доменам A1 и AS, описаны в Таблицах 1 и 2.
Разные домены KAS и KA1 гена kgp амплифицировали с pNS1 (3,5 кб BamHl lys фрагмент в pUC18) или геномной ДНК Р. gingivalis, соответственно, с применением праймеров, перечисленных в Таблице 4, ДНК-полимеразы Taq («Invitrogen») и термоблока PC-960 («Corbett Research Technologies»). Для генерирования ПЦР-фрагментов, кодирующих KAS2 и KLA1, соответственно, применяли пары праймеров KAS2-FOR и KAS2-REV, а также KLA1-FOR и KLA1-REV, при следующих условиях проведения реакции: 94°С, 3 минуты, после чего 28 циклов при 94°С, 45 сек (денатурирование); 62°С, 40 секунд (отжиг) и 72°С, 20 секунд (удлинение), после чего - последний цикл при 72°С, 5 мин.
Химерный продукт ПЦР KAS2-KLA1 получали посердством сплайсинга генов путем удлинения перекрывающихся нитей (SOE) следующим образом: продукты ПЦР получали с применением пар праймеров KAS2-FOR и KAS2-KLA1-химера-REV, а также KAS2-KLA1-химера-FOR и KLA1-REV и при условиях, описанных выше. Затем указанные продукты ПЦР отжигали, и окончательную ПЦР проводили с праймерами KAS2-FOR и KLA1-REV (94°С, 2 минуты, после чего 28 циклов при 94°С, 30 сек и 72°С, 40 секунд, после чего - последний цикл при 72°С, 5 мин).
Для приготовления продукта ПЦР KAS1-KsA1 проводили две последовательные ПЦР с применением праймера KAS1-KsA1-REV с каждым из праймеров KAS1-KsA1-FOR 1 и 2 - друг за другом (условия реакции 94°С в течение 2 минут, после чего 35 циклов по 94°С, 15 секунд; 63°С, 30 секунд и 72°С, 2 минуты) и получали продукт ПЦР KAS1-KsA1. Праймеры KAS1-KsA1-FOR1 и KAS1-KsA1-FOR2 содержали 3’-продолжение, перекрывающее 5’-конец предыдущего продукта ПЦР.
Для приготовления фрагмента ПЦР MynbTnKAS-KLA1 проводили четыре последовательные ПЦР с применением праймера мульти-REV с каждым из праймеров мульти-FOR 1, 2, 3 и 4 - друг за другом (условия реакции включали 95°С, 2 минуты, после чего 35 циклов при 95°С, 20 секунд; 68°С, 1.5 минуты) получали продукт ПЦР мультиKAS-KLA1. Каждый праймер мульти-FOR содержал 3’-продолжение, перекрывающее 5’-конец предыдущего продукта ПЦР.
Все фрагменты ПЦР, кодирующие KAS2, KLA1, KAS2-KLA1, KAS1-KsA1 и MynbTnKAS-KLAI, очищали при помощи колонки очистки для продуктов ПЦР («Qiagen»), вшивали в клонирующий вектор ТА, pGem-T Easy («Promega») и трансформировали им клетки Е. coli JM109 в соответствии со следующим протоколом производителя. Очищенные рекомбинантные конструкции pGemT-Easy разрабатывали с сайтами Ncol и Xhol и клонировали их непосредственно в рЕТ28b («Novagen»), расщепленный рестриктазами Ncol/Xhol, затем трансформировали в неэкспрессирующую клетку-хозяин E. coli JM109 [DH5α]. Рекомбинантные конструкции pЕТ28 очищали и трансформировали в экспрессирующую клетку-хозяин Е. coli, BL21 (DE3) [HMS174(DE3)] («Novagen»), после чего проводили селекцию на среде LB, содержащей 50 мкг канамицина, в соответствии с инструкциями производителя. Целостность каждой вставки подтверждали посредством секвенирования ДНК.
Олигонуклеотидные праймеры (Таблица 4) разрабатывали так, чтобы они включали сайты рестрикции, терминирующие кодоны и гекса-His-метки, где это необходимо. Праймеры, применяемые для rKAS2, rKLA1 и rKAS2-KLA1, разрабатывали так, чтобы ограничить включение инородной кодирующей последовательности размером не более трех аминокислот плюс гекса-His и r-белки. rKAS1 и rKLA1 разрабатывали так, чтобы они содержали гекса-His-метку на N-конце и С-конце, соответственно, чтобы можно было проводить прямое сравнение с rKAS2-KLA1, у которого гекса-His-метка присутствовала и на N-конце, и на С-конце. В rKAS1-KsA1 и r-мультиKAS-KLA1 гекса-His-метка присутствовала на С-конце.
Экспрессия и очистка рекомбинантных белков. Рекомбинантные белки экспрессировали с конструкций pET28:KLA1(KAS2, KAS2-LA1, KAS1-SA1, мульти-KAS-KLA1) путем индукции изопропил-β-D-тиогалактозидазы (IPTG). Все рекомбинантные белки получали в форме гибридных белков с меткой 6-His и очищали при помощи системы очистки NI-NTA («Invitrogen») при денатурирующих условиях. Если кратко, трансформанты Е. coli (DE3) одиночной колонии применяли для прививки на 20 мл среды Лурия-Бертани (LB), содержащей 50 мкг/мл канамицина, и инкубировали в течение ночи при 37°С на орбитальной мешалке. Указанную посевную культуру затем применяли для прививки 1 л LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина. Дожидались, пока OD600 указанной культуры достигнет 0,5-0,7 (середина логарифмического роста), после чего индуцировали экспрессию белка путем добавления IPTG в количестве 0,1 мМ и инкубации в течение 2 часов при 37°С и встряхивании на 200 об/мин. Клетки отбирали (7 500g) и повторно суспендировали на денатурирующий связывающий буфер (8М мочевины, 20 мМ фосфата натрия, рН 8,0, и 500 мМ NaCl), разрушали ультразвуком на льду в ходе серии импульсов 3×15 с с 30 с интервалами при помощи ультразвукового клеточного дезинтегратора Branson 250 («Branson Ultronics Corporation», Данбери, Коннектикут) с установкой микронаконечника в положении 3, затем центрифугировали при 39000 g в течение 30 мин. при 4°С.
Рекомбинантные белки очищали от надосадочной жидкости путем загрузки на предварительно уравновешенную колонку с Ni-NTA агарозой и дальнейшей промывки денатурирующим промывочным буфером (8М мочевины, 20 мМ фосфата натрия, рН 6,0, и 500 мМ NaCl), при этом десорбировался несвязанный белок. Затем указанную колонку промывали 10 объемами связывающего буфера В, и рекомбинантные белки десорбировали денатурирующим элюирующим буфером (8М мочевины, 20 мМ фосфата натрия, рН 6,0, и 500 мМ NaCl и 0,5 М имидазола). Очищенный белок подвергали диализу против 2М мочевины-ФСБ и хранили при -80°С.
Пробы рекомбинантных белков анализировали посредством SDS-PAGE, и их молекулярные массы определяли при помощи ProtParam on-line (http://au.expasy.org/tools/protparam.html). Концентрацию белка во всех пробах определяли по белковым спектрам Bio-Rad, применяя в качестве стандарта БСА (бычий сывороточный альбумин).
Вакцинация и модель периодонтита у мышей. Эксперименты с периодонтитом у мышей проводили, как описывалось ранее (3), и было одобрено Комиссией по этике экспериментов на животных Мельбурнского университета. Мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель (12 мышей на группу), выдерживаемых в микроизоляторах, вакцинировали подкожно (п/к 100 мкл) либо 50 мкг одного из рекомбинантных белков, либо комплексом RgpA-Kgp, 2×109 убитых формалином клеток Р. gingivalis штамма W50 или ФСБ; каждый антиген эмульгировали в неполном адъюванте Фрейнда (IFA). Через 30 дней мышам вводили бустер-дозу антигена (п/к инъекция, эмульгированный в IFA), и затем забирали кровь из ретробульбарного сплетения через 12 дней. Через четыре дня после второй вакцинации мышам вводили канамицин («Sigma-Aldrich», Новый Южный Уэльс, Австралия) в дозе 1 мг/мл в деионизированной воде с альбумином в течение 7 дней. Через три дня после лечения антибиотиком (через 2 дня после отбора крови), мышам в ротовую полость прививали четыре раза с интервалом 2 дня 1×1010 жизнеспособных клеток Р. gingivalis W50 (25 мкл) в буфере PG (50 мМ трис-HCl, 150 мМ NaCl, 5 мМ CaCl2 и 5 мМ цистеин-HCl, рН 8,0), содержащем 2% (масса/объем) карбоксиметилцеллюлозы (CMC, «Sigma-Aldrich», Новый Южный Уэльс, Австралия), а контрольную группу подвергали ложному инфицированию буфером PG, содержащим только 2% (масса/объем) CMC. Прививочный материал готовили в анаэробной камере и затем непосредственно наносили на десневой край верхних больших коренных зубов. Через две недели мышам вводили еще четыре дозы (с интервалом 2 дня) 1×1010 жизнеспособных клеток Р. gingivalis W50 (25 мкл) в буфере PG, содержащем 2% (масса/объем) CMC. Количество жизнеспособных бактерий в каждой прививке проверяли путем подсчета на кровяном агаре. Мыши получали сухие порошковые корма («Barastock», Австралия) и содержались в клетках, оснащенных поднимающимся проволочным дном, чтобы избежать доступа к подстилке. Через четыре недели после введения последней дозы у мышей отбирали кровь из ретробульбарного сплетения и забивали, верхнюю челюсть изымали и разрезали пополам, после чего одну половину (правую) применяли для измерения резорбции альвеолярной кости, а вторую половину (левую) - для ПЦР в режиме реального времени.
Правую половину верхней челюсти кипятили (1 мин) в деионизированной воде, освобождали от мышц механическим путем и погружали в 2% (масса/объем) гидроксид калия (16 ч, 25°С). Затем верхнюю челюсть промывали (двукратно деионизированной водой) и погружали в 3% (масса/объем) перекись водорода (6 ч, 25°С). После промывки половины верхней челюсти (два раза деионизированной водой), ее окрашивали 0,1 (масса/объем) водным метиленовым синим, и цифровое изображение буккальной стороны каждой половины верхней челюсти получали цифровой камерой Olympus DP12, установленной на препаровальной лупе, при помощи программы OLYSIA BioReport версии 3.2 («Olympus Australia Pty Ltd.», Новый Южный Уэльс, Австралия) для оценки горизонтальной резорбции кости. Под горизонтальной резорбцией кости понимают резорбцию, возникающую в горизонтальной плоскости, перпендикулярной гребню альвеолярной кости (АВС), которая приводит к уменьшению высоты гребня. Каждую половину верхней челюсти выравнивали так, чтобы щечный и язычный бугорок изображения каждого большого коренного зуба был наложен, и изображение захватывали в микрометровой шкале в кадр так, чтобы измерения можно было стандартизировать для каждого изображения. Площадь от эмалево-дентинной границы до АВС для изображения каждого большого коренного зуба измеряли при помощи программы OLYSIA BioReport версии 3.2. Показатели резорбции кости определяли дважды с участием одного исследователя с применением рандомизированного и слепого протокола.
Определение подкласса антител посредством ELISA. Для определения подклассов антител, опосредующих ответ сыворотки мышей, трехкратно проводили твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с применением 5 мг/мл раствора клеток Р. gingivalis W50, убитых формалином, в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (0,01 М Na2HPO4, 1,5 мМ KH2PO4, 0,15 М NaCl), pH 7,0, содержащем 0,1% (объем/объем) Твин 20 (ФСБТ) для заполнения лунок поливинилового микропланшета с плоским дном Мак-Лейн, ВА). После удаления раствора для нанесения в лунки добавляли ФСБТ, содержащий 2% (масса/объем) сухого обезжиренного молока, для блокирования непокрытого пластика, и выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре. После шестикратной промывки лунок при помощи ФСБТ, в каждую лунку добавляли последовательные разведения сыворотки мышей в ФСБТ, содержащем 0,5% (масса/объем) сухого обезжиренного молока (ОМ-ФСБТ), и инкубировали в течение 16 ч при комнатной температуре. После шестикратной промывки лунок ФСБТ, в ОМ-ФСБТ добавляли 1/2000 разведение lgG козы с lgM, lgA, lgG1, lgG2a, lgG2b или lgG3 мыши («Sigma-Aldrich», Новый Южный Уэльс, Австралия) и давали связаться в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты шестикратно промывали в ФСБТ, и к каждой лунке добавляли разведение 1/5000 конъюгированного с пероксидазой хрена иммуноглобулина кролика против антител козы («Sigma», Новый Южный Уэльс, Австралия) в ОМ-ФСБТ и инкубировали в течение 1 ч при комнтаной температуре. После шестикратной промывки лунок ФСБТ связанное антитело определяли путем добавления 100 мкл субстрата ABTS [0,9 мМ 2,2’-азино-бис(3-этилбенз-тиазолин-6)-сульфоновой кислоты в 80 мМ лимонной кислоты, содержащей 0,005% (объем/объем) перекиси водорода, pH 4.0] к каждой лунке. Оптическую плотность на 415 нм определяли при помощи микропланшетного ридера (Микропланшетный ридер Bio-Rad, модель 450).
Гель-электрофорез на SDS-PAGE и вестерн-блоттинг. Рекомбинантные белки (10 мкг) анализировали при помощи системы электрофореза «XCell surelock Mini-Cell». Рекомбинантные белки смешивали с 20 мкл восстановительного буфера для разведения проб (10% [масса/объем] SDS, 0,05% [масса/объем] бромфенолового синего, 25% [объем/объем] глицерина и 0,05% [объем/объем] 2-меркаптэтанола). pH подгоняли до pH 8,0 при помощи 1,5 М Трис-HCl, и затем указанный раствор нагревали в течение 5 мин при 100°С. Рекомбинантные белки (10 мкг/дорожку) загружали на заранее залитые Трис-глициновые минигели Novex 12% (масса/объем), и электрофорез проводили под действием тока от 30 до 50 мА, и при разности потенциалов 125 В при помощи системы для электрофореза Novex («Novex», Сан-Диего, Калифорния). Белки визуализировали при помощи 0,25% (массы/объем) Кумасси синего R250.
Анализ эпитопов пептидной последовательности активного сайта протеиназы Kgp (KAS-2). Антитело-связывающие сайты для Lys-специфичного протеиназного активного сайта пептида KAS2 (433-468 SEQ ID №: 28) определяли путем синтеза биотинилированных по N-концу переркрывающихся пептидов из восьми остатков (отклоняющихся по одному, перекрывающихся по семи остаткам) на многоцентровой системе синтеза пептидов («Chiron Technologies», Мельбурн, Автсралия) с применением стандартных протоколов твердофазного пептидного синтеза для химии флуоренилметоксикарбонилов. Биотинилированные пептиды (5 мкг/мл) в 0,1 М ФСБ, рН 7,4 связывали с планшетами, покрытыми стрептавидином, и оставляли на ночь при 4°С («Nunc», Новый Южный Уэльс, Австралия). После четырехкратной промывки лунок ФСБТ картирование эпитопов связанных в планшетах пептидов проводили посредством ELISA в соответствии с инструкцией «Chiron Technologies» с применением сыворотки мыши в разведении 1:1000 в 1% масса/объем обезжиренного сухого молока в 0,1 М ФСБТ, рН 7,4, содержащего 0,1% объем/объем Твин 20 (ОМ-ФСБТ). После шестикратной промывки лунок ФСБТ в ОМ-ФСБТ добавляли разведение 1/2000 lgG козы и IgG мыши («Sigma», Новый Южный Уэльс, Австралия), и давали связаться в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты промывали шестикратно в ФСБТ, в каждую лунку добавляли разведение 1/5000 конъюгированного с пероксидазой хрена иммуноглобулина кролика против lg козы («Sigma», Новый Южный Уэльс, Австралия) в ОМ-ФСБТ и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. После шестикратной промывки лунок ФСБТ связанное антитело определяли путем добавления 100 мкл субстрата ABTS [0,9 мМ 2,2’-азино-бис(3-этилбенз-тиазолин-6)-сульфоновой кислоты в 80 мМ лимонной кислоты, содержащей 0,005% (объем/объем) перекиси водорода, рН 4,0] к каждой лунке. Оптическую плотность на 415 нм определяли при помощи микропланшетного ридера (Микропланшетный ридер Bio-Rad, модель 450).
Статистический анализ. Данные о резорбции кости подвергали статистическому анализу с применением однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) и Т3-критерия Даннета (SPSS для Windows, версия 12). Титры подклассов антител lgA, lgM и IgG подвергали статистическому анализу с применением критерия Стьюдента, при помощи программы SPSS (SPSS для Windows, версия 12).
Пример 2
Описание свойств и очистка рекомбинантных белков (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1). Чтобы охарактеризовать способность фрагментов Kgp с доменом адгезина A1 и химерных фрагментов протеиназы Kgp и домена адгезина А1 Kgp защищать от инфекции Р. gingivalis, мы экспрессировали и очистили рекомбинантные белки: KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1. Рекомбинантные белки (KsA1 и KLA1) и рекомбинантные химерные белки (KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1) очищали от телец включения при помощи никель-хелатной аффинной хроматографии, и очищенные белки анализировали посредством SDS-PAGE (Фиг.1). Каждый из очищенных рекомбинантных белков состоял из одной основной полосы белков с молекулярными массами 40, 36, 31 и 32 кДа, соответствующими KAS2-KLA1, KLA1, KsA1 и KAS1-KsA1, и указанные массы соответствовали расчетным молекулярным массам рекомбинантных белков с гистидиновой меткой, полученных при помощи ProtParam. Чтобы охарактеризовать иммуногенность, рекомбинантные белки KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1 применяли для иммунизации мышей, а сыворотку указанных мышей применяли для зондирования покрытых пептидом KAS2 планшетов и покрытых убитыми формалином клетками Р. gingivalis W50 (Фиг.2). Было показано, что антисыворотка с рекомбинантными химерными белками KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1, распознает пептид KAS2 (Фиг.2A) при уровне, аналогичном уровню KAS2-специфичной антисыворотки (конъюгат KAS2-дифтepийный анатоксин), а также убитые формалином клетки Р. gingivalis W50 (Фиг.2B). Однако антисыворотка на рекомбинантный белок KLA1 распознает только убитые Р. gingivalis W50 (Фиг.2B).
Пример 3
Действие иммунизации рекомбинантными белками (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1) на индуцируемую Р. gingivalis резорбцию альвеолярной кости в модели периодонтита у мышей. Для определения и сравнения защиты против индуцируемой Р. gingivalis резорбции альвеолярной кости с применением модифицированной модели резорбции периодонтальной кислот у мышей, о которой сообщали Baker et a/ (4), применяли рекомбинантные белки KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1, убитые формалином клетки Р. gingivalis W50 и комплекс RgpA-Kgp. Мышей вакцинировали (дни 0 и 30) лио рекомбинантными белками KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 или KAS2-KLA1, RgpA-Kgp комплексом или убитым формалином штаммом Р. gingivalis W50 (FK-W50), или одним только адъювантом в ФСБ, и затем ротовую полость инфицировали Р. gingivalis W50. Вакцинация всеми рекомбинантными антигенами, комплексом RgpA-Kgp и клетками FK-W50 давали защиту мышей BALB/c от Р. gingivalis-индуцированной резорбции альвеолярной кости, поскольку у указанных животных имела место значительно сниженная резорбция кости (p<0,001) по сравнению с группой, вакцинированной ФСБ (Фигура 3). Однако у мышей, вакцинированных KAS2-KLA1, резорбция кости была значительно ниже, чем у мышей, вакцинированных KLA1 (p<0,01); KsA1 (p<0,001), комплексом RgpA-Kgp (p<0,001), клетками FK-W50 (p<0,001) и у неинфицированных мышей (p<0,001). Значимых различий в резорбции кости между мышами, вакцинированными KAS2-KLA1 и KAS1-KsA1, не было. Кроме того, у мышей, вакцинированных KAS1-KsA1, резорбция кости была значительно ниже, чем у неинфицированных мышей (p<0,01) и у мышей, вакцинированных комплексом RgpA-Kgp (p<0,05), но не отличалась значимо от резорбции у мышей, вакцинированных KsA1, KLA1, и FK-W50. Значимых различий в резорбции кости между мышами, вакцинированными KsA1, KLA1, комплексом RgpA-Kgp и клетками FK-W50.
Пример 4
Ответы подклассов антител, индуцируемые при иммунизации рекомбинантными белками (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1) в модели периодонтита у мышей. Перед прививкой клеток Р. gingivalis в ротовую полость и после указанной прививки у мышей отбирали кровь, и сыворотку отделяли посредством центрифугирования. На Фиг.4 показана реактивность подклассов антител на убитые формалином клетки Р. gingivalis W50 для каждого из иммуногенов (KsA1, KLA1, KAS1-KsA1 или KAS2-KLA1, или убитые формалином клетки Р. gingivalis штамма W50 (FK-W50)) в модели периодонтита у мышей. Все из защитных иммуногенов вызывали высокий титр антител lgG на FK-W50. Кроме того, преобладающим подклассом антител для каждого защитного иммуногена был lgG1, а FK-W50-специфичные антитела подклассов lgG2a, lgG2b и lgG3 проявляли лишь слабую иммунореактивность (Фиг.4). Преобладающим подклассом антител, индуцируемым каждым иммуногеном до (Фиг.4A) и после прививки (Фиг.4 В) был lgG1.
Пример 5
Картирование эпитопов KAS2 (433-468). Синтезировали биотинилированные переркрывающиеся пептиды из восьми остатков (отклоняющиеся по одному, перекрывающиеся по семи остаткам) для KAS2 (433-468), и применяли их для нанесения в покрытые стрептавидином планшеты. Затем антитело-связывающие эпитопы идентифицировали при помощи антисыворотки от мышей, вакцинированных конъюгатом KAS1-KsA1, KAS2-KLA1 и KAS2 с дифтерийным анатоксином (Фиг.5). Двукратное превышение оптической плотности (415 нм) по сравнению с фоновым сигналом рассматривали как положительный антительный ответ (пороговая OD). Указанная антисыворотка распознавала следующие последовательности пептидов, полученных из SEQ ID №: 28 viz. KAS1-KsA1 распознавала пептиды 435-442, 436-443, 445-452, 446-453 и 447-454 (пороговая OD=0.07, Фиг.5A), а KAS2-KLA1 распознавала пептиды 435-442, 447-454 и 448-455 (пороговая OD=0.07, Фиг.5A). Это указывает на распознавание нескольких минимальных эпитопов viz. пептида 436-442 (VSFANYT и его варианта VGFANYT), пептида 447-452 (ETAWAD и его варианта ETSWAD), и пептида 448-453 (TAWADP и его варианта TSWADP). Пептиды, которые включают пептидный эпитоп 436-442, включают GVSFANYT, GVGFANYT, VSFANYTA и VGFANYTA. Пептиды, которые включают пептидные эпитопы 447-452 и/или 448-453, включают SETAWAD, SETSWAD, ETAWADP, ETSWADP, TAWADPL и TSWADPL, более конкретно GSETAWAD, GSETSWAD, SETAWADP, SETSWADP, ETAWADPL, ETSWADPL, TAWADPLL и TSWADPLL.
Пример 6
Синтез пептидов KAS и RAS для конъюгации с белком.
Пептиды синтезировали вручную или с применением микроволнового синтезатора пептидов СЕМ. На протяжении всех экспериментов применяли стандартные протоколы твердофазного пептидного синтеза для химии флуоренилметоксикарбонилов. Белки собирали в форме карбоксиамидов с применением линкера Ринка, полученного из смолы AM-sure («AAPPTEC», Кентукки, США). Соединение осуществляли посредством активации HBTU/HOBt с применением 4 эквивалентнов флуоренилметоксикарбониловой аминокислоты и 4 эквивалентов диизопропилэтиламина. Флуоренилметоксикарбонильную группу удаляли 20% пиперидином в 1 М HOBt/DMF.
Смолы, содержащие пептиды KAS или RA, набухали в диметилформамиде (DMF), а N-концевую Флуоренилметоксикарбонильную группу удаляли 2% (объем/объем) диазобицикло-(5.4.0)-ундек-7-ене в диметилформамиде, содержащем 2% (объем/объем) пиперидина. Затем N-концевую аминогруппу превращали в производное при помощи 8-ацетилмеркаптоуксусной кислоты (SAMA), применяя 5 эквивалентов SAMA-Opfp и 5 эквивалентов HOBt. Реакцию отслеживали при помощи теста с тринитробензен-сульфоновой кислотой (TNBSA). Когда вновь появлялся отрицательный результат TNBSA-теста, смолу промывали (5×DMF, 3×DCM и 3 × диэтилового эфира). Затем смолу высушивали под вакуумом. Отщепление белков от полимерной подложки проводили при помощи расщепляющей смеси трифторукусуной кислоты : фенола : ТIРS : ЕОТ : воды (92:2:2:2:2) в течение 2,5 часов или 4 часов в зависимости от содержания аргинина в указанном пептиде. После расщепления смолу удаляли путем фильтрации, а фильтрат концентрировали приблизительно до 1 мл в парах азота. После осаждения пептидных продуктов в холодном эфире, их центрифугировали и трижды промывали. Осадки белка растворяли в 5-10 мл воды, содержащей 0,1% (объем/объем) трифторукусуной кислоты, а нерастворимый осадок удаляли путем центрифугирования. Пептиды очищали путем ОФ-ВЭЖХ.
Для получения производных пептидов для конъюгации с белками можно применять несколько разных химических частиц, которые позволяют ввести такие группы как: галогениды (бром, хлор и йод), малеимидо-группы, сукцинимидил-, гидразинил-, оксим-, тиоловые группы, которые затем можно применять для конъюгации модифицированного пептида с белком, таким как KgpA1, через их природные остатки цистеина, или можно получать производные с комплементарными активными группами, которые создают возможность сшивки с образованием конъюгата пептид-белок.
Конъюгация SAMA-пептидов с KA1. К раствору, содержащему 10 мг/мл рекомбинантного KA1 или другого домена адгезина комплекса RgpA-Kgp в фосфатно-солевом буфере (0,1 М фосфата натрия, 0,9% NaCl, pH 7,4) добавляли 0,1 М 1% (масса/объем) раствора m-малеимидо-бензоил-N-гидроксисукцинимидного эфира (МБС) в DMF. Через 30 мин непрореагировавший МБС удаляли, а МБС-модифицированный KA1 отбирали посредством гель-фильтрации с применением колонки PD10 («Pharmacia», Новый Южный Уэльс, Австралия), уравновешенной буфером для конъюгации (0,1 М фосфата натрия, 5 мМ EDTA; pH 6,0). Очищенный SAMA-пептид (1,3 мкмоль) растворяли в 200 мкл 6 М гуанидина гидрохлорида, содержащего 0,5 М Трис; 2 мМ EDTA, pH 6,0 и разведенного 800 мкл воды MilliQ, и снимали защитную группу in-situ путем добавления 25 мкл 2 М NH2OH (40 эквивалентов), растворенного в воде MilliQ. Отобранный MBS-KA1 сразу же реагировал с SAMA-пепетидом без защитных групп, и смесь перемешивали в течение одного часа при комнатной температуре. Конъюгат пептил-KA1 отделяли от непрореагировавшего пептида посредством гель-фильтрации фильтрации с применением колонки PDIO, уравновешенной ФСБ pH 7,4, и лиофилизировали. Реакцию отслеживали методом Элмана.
Пример 7
Приготовление антител. Поликлональную сыворотку на рекомбинантные белки получали у мышей путем подкожной иммунизации указанными белками. Мышей вакцинировали в день 0, вводя 25 мкг белка в неполном адъюванте Фрейнда, а также в день 30, вводя 25 мкг белка в неполном адъюванте Фрейнда. Вакцинацию проводили при помощи стандартных способов. Получали поликлональную антисыворотку с высоким титром против указанных белков. При желании при помощи стандартных способов получают моноклональные антитела, направленные специфично против рекомбинантных белков.
Пример 8
Вакцинация с целью генерирования антител. Мышей BALB/c или CD1 (швейцарские аутбредные мыши) в возрасте 6-8 недель (10 мышей на группу) вакцинировали подкожно (п/к 100 мкл) 50 мкг химеры KAS2-LA1 и антигена, эмульгированных в неполном адъюванте Фрейнда (IFA). Через 30 дней указанные мыши получали бустерную дозу антигена (п/к инъекция, эмульгированный в IFA), и через 12 дней мышей забивали и отбирали кровь из сердца.
Определение подкласса антител посредством ELISA. Для определения подклассов антител, опосредующих ответ сыворотки мышей, трехкратно проводили твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) с применением 5 мг/мл раствора химеры KAS2-LA1 клеток Р. gingivalis W50, убитых формалином, в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (0,01 М Na2HP04, 1,5 мМ KH2PO4, 0,15 М NaCl), рН 7,0, содержащем 0,1% (объем/объем) Твин 20 (ФСБТ) для заполнения лунок поливинилового микропланшета с плоским дном Мак-Лейн, ВА). После удаления раствора для нанесения в лунки добавляли ФСБТ, содержащий 2% (масса/объем) сухого обезжиренного молока, для блокирования непокрытого пластика, и выдерживали в течение 1 ч при комнатной температуре. После четырехкратной промывки лунок при помощи ФСБТ, в каждую лунку добавляли последовательные разведения сыворотки мышей в ФСБТ, содержащем 0,5% (масса/объем) сухого обезжиренного молока (ОМ-ФСБТ), и инкубировали в течение 16 ч при комнатной температуре. После шестикратной промывки лунок ФСБТ, в ОМ-ФСБТ добавляли 1/2000 разведение IgG козы с lgM, lgA, lgG1, lgG2a, lgG2b или lgG3 мыши («Sigma-Aldrich», Новый Южный Уэльс, Австралия) и давали связаться в течение 2 ч при комнатной температуре. Планшеты шестикратно промывали в ФСБТ, к каждой лунке добавляли разведение 1/5000 конъюгированного с пероксидазой хрена иммуноглобулина кролика против lg козы («Sigma», Новый Южный Уэльс, Австралия) в ОМ-ФСБТ и инкубировали в течение 1 ч при комнтаной температуре. После шестикратной промывки лунок ФСБТ связанное антитело определяли путем добавления 100 мкл субстрата ABTS [0,9 мМ 2,2’-азино-бис(3-этилбенз-тиазолин-6)-сульфоновой кислоты в 80 мМ лимонной кислоты, содержащей 0,005% (объем/объем) перекиси водорода, рН 4.0] к каждой лунке. Оптическую плотность на 415 нм определяли при помощи микропланшетного ридера (Микропланшетный ридер Bio-Rad, модель 450).
Ответы подклассов антител, индуцируемые при иммунизации рекомбинантным белком KAS2-KLA1 у аутбредных мышей (CD1, швейцарские). CD1 (швейцарских) мышей вакцинировали химерой KAS2-KLA1, отбирали кровь, и сыворотку отделяли посредством центрифугирования. На Фиг.6 показана реактивность подклассов антител на химеру KAS2-LA1, убитые формалином клетки Р. gingivalis W50 и комплекс RgpA-Kgp.Химера KAS2-LA1 вызывала сильный гуморальный ответ, опосредуемый антителами IgG, преимущественно lgG1, который распознает химеру KAS2-LA1 и демонстрирует сильную перекрестную реактивность с клетками FK P. gingivalis W50 и комплексом KAS2-LA1 (фиг.6). Кроме того, химера KAS2-LA1 вызывает только слабую иммунореактивность антиген-специфичных антител lgG2a, IgG2b и lgG3 (Фиг.6).
Пример 9
Разработка структурной модели Kgp и идентификация доступных последовательностей поверхности активного сайта.
В нашей работе показано, что активный сайт Kgp-протеиназы у пептидов обладает высокой иммуногенностью и индуцирует высокий уровень защиты от Р. gingivalis-индуцированной резорбции кости. В попытке идентифицировать дополнительные пептиды с активным сайтом протеиназы в качестве кандидатов на создаение вакцины была разработана модель каталитического домена Кдр при помощи пакета программ Orchestrar в системе Sybyl7.3 (Фиг.7). Указанная модель основана на структуре, извлеченной из базы данных белковых молекул, 1crv RgpB протеазы из Р. gingivalis - белков, обладающей 23,58% попарной идентичности и z-баллом 25,09 (модель с высокой достоверностью). Сервер прогнозирования взаимодействия белков Мета-Ppisp предсказывает существование двух поверхностей белок-белкового взаимодействия для Kgp: субстрат-связывающая поверхность (как в RgpB), и вторая поверхность, уникальная для Кдр. Оснонвые различия между моделями RgpB и Kgp заключены в петлях, которые формируют вторую поверхность взаимодействия, и в бреши размером 19 остатков (Val526-Phe545), которую не удается смоделировать в Kgp, и которая попадает во вторую поверхность взаимодействия. На Фигуре 7 показана модель Kgp, где более толстые тяжи показывают доступные на поверхности последовательности вокруг активного сайта протеиназы Kgp; было показано, что доступные на поверхности последовательности - это Asp388-Gln394, Leu421-Ala423, Ala443-Glu447 с AIa451, Asn510-Trp513, и Ile570-Gly577 с Tyr580. Из модели (Фиг.6) явствует, что наряду с KAS2 (А) выдаются еще и три другие последовательности KAS4 (Asp388-Val395) (В), KAS5 (Asn510-Asp516) (С) и KAS6 (Ile570-Tyr580) (D), и они обладают достаточной длиной, чтобы быть мишенями для разработки вакцины. Таким образом, можно получить рекомбинантный химерный белок, который будет содержать каждый из указанных пептидов один за другим, и присоединенными к N-концу KLA1 для получения мульти KAS-KLA1, который можно применять для индукции иммунного ответа, и, следовательно, для защиты пот связанных с Р. gingivalis заболеваний или патологических состояний.
Пример 10
Способ моделирования Arg-X-протеиназы для идентификации иммуногенных областей, фланкирующих данный каталитический сайт.
Трехмерную структуру Arg-X-протеиназы определяли согласно способу, описанному у Eichinger A, Beisel HG, Jacob U, Huber R, Medrano FJ, Banbula A, Potempa J, Travis J, Bode W. Crystal structure of gingipain R: an Arg-specific bacterial cysteine proteinase with a caspase-like fold. EMBO J. 1999 Oct 15; 18(20): 5453-62.
Пример 11
Далее следует пример состава зубной пасты, содержащей антитела
Пример 12
Далее следует пример состава зубной пасты
Пример 13
Далее следует пример состава зубной пасты
Пример 14
Далее следует пример состава зубной пасты
Пример 15
Далее следует пример состава жидкой зубной пасты
Пример 16
Далее следует пример состава ополаскивателя для рта
Пример 17
Далее следует пример состава ополаскивателя для рта
Пример 18
Далее следует пример состава пастилок
Пример 19
Далее следует пример состава крема для массажа десен
Моностеарат сахарозы 0,5
Пример 20
Далее следует пример состава жевательной резинки
Пример 21
Далее следует пример состава фармацевтической композиции
Пример 22
Далее следует пример состава периодонтального геля
Пример 23
Далее следует пример состава периодонтального геля
Следует понимать, что хотя настоящее изобретение в настоящей заявке описано подробно, примеры предназначены только для иллюстрации. Другие модификации вариантов реализации настоящего изобретения, которые очевидны специалистам в области молекулярной биологии, стоматологической диагностики и близких дисциплин, должны входить в область настоящего изобретения.
Следует понимать, что настоящее изобретение, раскрываемое и определенное в настоящем описании, распространяется на все альтернативные комбинации двух или более индивидуальных особенностей, упоминаемых или явствующих из текста или рисунков. Все из указанных разных комбинаций составляют разные альтернативные аспекты настоящего изобретения.
Ссылки
1. McKee, A.S., A.S.McDermid, A.Baskerville, А.В.Dowsett, D.С.Ellwood, and Р.D.Marsh. 1986. Effect of hemin on the physiology and virulence of Bacteroides gingivalis W50. Infect. Immun. 52: 349-355.
2. Slots, J. 1982. Importance of black-pigmented Bacteroides in human periodontal disease. Host parasite interactions in periodontal diseases. American Society for Microbiology.
3. O’Brien-Simpson, N.M., R.Pathirana, R.A.Paolini, Y.-Y.Chen, P.D.Veith, T.V., R.N.Pike, N.Alley, and E.C.Reynolds. 2005. An immune response directed to proteinase and adhesin functional epitopes protects against Porphyromonas gingivalis-induced bone loss. Journal of Immunology 175: 3980-3989.
4. Baker, P.J., R.T.Evans, and D.C.Roopenian. 1994. Oral infection with Porphyromonas gingivalis and induced alveolar bone loss in immunocompetent and severe combined immunodeficient mice. Arch Oral Biol 39: 1035-1040.
Следует понимать, что настоящее изобретение, раскрываемое и определенное в настоящем описании, распространяется на все альтернативные комбинации двух или более индивидуальных особенностей, упоминаемых или явствующих из текста или рисунков. Все из указанных разных комбинаций составляют разные альтернативные аспекты настоящего изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПРОФИЛАКТИКА, ЛЕЧЕНИЕ И ДИАГНОСТИКА ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ БАКТЕРИЯМИ P.GINGIVALIS | 2009 |
|
RU2535898C2 |
| ИЗОЛИРОВАННАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК EHRLICHIA CANIS В 30-КИЛОДАЛЬТОН, ВЕКТОР, РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ, КЛЕТКА-ХОЗЯИН, АНТИТЕЛО И СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ИНФЕКЦИИ EHRLICHIA CANIS У СУБЪЕКТА | 2001 |
|
RU2288952C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОЛИГОПЕПТИДОВ | 1994 |
|
RU2136697C1 |
| ИММУНОГЕНЫ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ВИЧ | 2013 |
|
RU2648791C2 |
| ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛОК EHRLICHIA CANIS С МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССОЙ 30 КИЛОДАЛЬТОН, ВЕКТОР, РЕКОМБИНАНТНЫЙ БЕЛОК И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 1999 |
|
RU2237716C2 |
| ВАКЦИНА, НАБОР И СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ПАРОДОНТОЗА У ЖИВОТНЫХ-КОМПАНЬОНОВ | 2005 |
|
RU2364417C2 |
| ИММУНОРЕГУЛЯТОРНАЯ ВАКЦИНА | 2013 |
|
RU2650709C2 |
| МНОГОКОМПОНЕНТНАЯ ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗВАННОГО β-ГЕМОЛИТИЧЕСКИМИ СТРЕПТОКОККАМИ (БГС) | 2009 |
|
RU2478396C2 |
| БЕЛОК NMB1125 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ КОМПОЗИЦИЯХ | 2004 |
|
RU2336900C2 |
| ИММУНОГЕНЫ ДЛЯ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ВИЧ | 2013 |
|
RU2721274C2 |
Группа изобретений относится к медицине, а именно к стоматологии, и касается набора для лечения заболевания или состояния, связанного с присутствием Р. gingivalis в ткани ротовой полости у субъекта, включающий: (i) композицию, содержащую иммуноген, который вызывает иммунный ответ против P. gingivalis; (ii) композицию, содержащую агент, выбранный из противовоспалительного агента для уменьшения воспаления ткани ротовой полости у субъекта и/или противомикробного агента для удаления микроорганизмов или их фрагментов из ткани ротовой полости субъекта, и (iii) инструкции для применения (i) и (ii) при лечении заболевания или состояния, связанного с присутствием P. gingivalis в ткани ротовой полости субъекта, путем введения (ii) перед введением (i). Также предложен способ лечения заболевания или состояния, связанного с присутствием Р. gingivalis в ткани ротовой полости у субъекта. Группа изобретений обеспечивает снижение частоты возникновения или тяжести заболевания, или указанного патологического состояния у субъекта. 2 н. и 18 з.п. ф-лы, 7 ил., 9 табл., 23 пр.
1. Набор для лечения заболевания или состояния, связанного с присутствием Р. gingivalis в ткани ротовой полости у субъекта, включающий:
(i) композицию, содержащую иммуноген, который вызывает иммунный ответ против P. gingivalis;
(ii) композицию, содержащую агент, выбранный из противовоспалительного агента для уменьшения воспаления ткани ротовой полости у субъекта и/или противомикробного агента для удаления микроорганизмов или их фрагментов из ткани ротовой полости субъекта, и
(iii) инструкции для применения (i) и (ii) при лечении заболевания или состояния, связанного с присутствием P. gingivalis в ткани ротовой полости субъекта, путем введения (ii) перед введением (i).
2. Набор по п. 1, отличающийся тем, что указанный агент представляет собой противовоспалительный агент.
3. Набор по п. 1, отличающийся тем, что указанный агент представляет собой противомикробный агент.
4. Набор по п. 3, отличающийся тем, что указанный противомикробный агент представляет собой агент, ингибирующий фумарат-редуктазу.
5. Набор по п. 3, отличающийся тем, что указанный противомикробный агент выбран из группы, состоящей из оксантела, морантела и тиабендазола.
6. Набор по п. 1, отличающийся тем, что указанный иммуноген P. gingivalis представляет собой клетку, фрагмент или метаболит P. gingivalis или полученный из них рекомбинантный продукт.
7. Набор по п. 6, отличающийся тем, что указанный рекомбинантный продукт, полученный из P. gingivalis, представляет собой химерный пептид или гибридный белок.
8. Набор по п. 7, отличающийся тем, что указанный химерный пептид или гибридный белок P. gingivalis выбран из группы, состоящей из KAS1-KsA1 и KAS2-KLA1.
9. Набор по п. 1, отличающийся тем, что указанный агент и/или иммуноген вводят системно.
10. Набор по п. 1, отличающийся тем, что указанный агент и/или иммуноген вводят непосредственно в ткань ротовой полости.
11. Набор по п. 10, отличающийся тем, что указанный агент и/или иммуноген вводят непосредственно в слизистую ротовой полости.
12. Набор по п. 1, отличающийся тем, что указанное лечение дополнительно включает стоматологическую процедуру.
13. Набор по п. 12, отличающийся тем, что указанная стоматологическая процедура включает одни или более из санации ротовой полости, удаления зубного камня или сглаживание поверхности корня зуба.
14. Способ лечения заболевания или состояния, которое связано с присутствием Р. gingivalis в ткани ротовой полости у субъекта, включающий:
(i) введение указанному субъекту противовоспалительного агента для уменьшения воспаления ткани ротовой полости указанного субъекта и/или противомикробного агента для удаления микроорганизмов или их фрагментов из ткани ротовой полости указанного субъекта, и
(ii) последующее введение указанному субъекту иммуногена, который вызывает иммунный ответ против P. gingivalis.
15. Способ по п. 14, согласно которому указанный иммуноген вводят через одну-две недели после введения указанного агента.
16. Способ по п. 14, согласно которому указанный иммуноген вводят в то время, когда ткань ротовой полости указанного субъекта не воспалена.
17. Способ по п. 14, согласно которому указанный иммуноген вызывает гуморальный иммунный ответ, который преимущественно является ответом, опосредуемым Th2 клетками.
18. Способ по п. 14, дополнительно включающий проведение стоматологической процедуры у указанного субъекта.
19. Способ по п. 18, согласно которому указанная стоматологическая процедура выбрана из группы, состоящей из санации ротовой полости, удаления зубного камня или сглаживания поверхности корня зуба.
20. Способ по п. 14, согласно которому указанное заболевание или состояние ассоциировано с инфекцией P. gingivalis.
| Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор | 1923 |
|
SU2005A1 |
| Способ обработки целлюлозных материалов, с целью тонкого измельчения или переведения в коллоидальный раствор | 1923 |
|
SU2005A1 |
| АППАРАТ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОГО ПРОИЗВОДСТВА ФОТОГРАФИЧЕСКИХ СНИМКОВ | 1925 |
|
SU12579A1 |
| СПОСОБ КОСТНОЙ ПЛАСТИКИ ПРИ НЕПОСРЕДСТВЕННОЙ ДЕНТАЛЬНОЙ ИМПЛАНТАЦИИ | 2008 |
|
RU2366378C1 |
| T.HOWARD HOWELL et al | |||
| Nonsteroidal Antiinflammatoty Drugs as Inhibitors of Periodontal Disease Progression // Critical Reviews in Oral Biology and Medicine, 1993, 4(2):177-196, реферат, с.186-192 | |||
| P.SUNETHRA RAJAPAKSE et al | |||
| Immunization with the RgpA-Kgp Proteinase-Adhesin Complexes of Porphyromonas gingivalis Protects against Periodontal Bone Loss in the Rat Periodontitis Model | |||
| // Infection and Immunity, May 2002, Vol | |||
| Деревянный торцевой шкив | 1922 |
|
SU70A1 |
| Кипятильник для воды | 1921 |
|
SU5A1 |
