СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТАДИЙ КАНЦЕРОГЕНЕЗА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/96 G01N33/48 

Изобретение относится к области медицины, а именно, к способам гистологической дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза (озлокачествления эпителиальных тканей) и степени дедифференцировки (снижения зрелости клеток) карцином.

Проблемы ранней и точной диагностики доброкачественных гиперпластических состояний, неинвазивных (не прорастающих окружающие структуры), пограничных и инвазивных (прорастающих ткани) стадий озлокачествления эпителиальных образований и степеней дедифференцировки карцином, возникающих в различных органах, весьма актуальны для современной онкологии, т.к. раковые опухоли составляют основную часть онкологических заболеваний.

Важное значение для диагностики опухолей приобретает не только распознавание гистологического строения новообразования, но и уточнение стадий канцерогенеза, а также степень дедифференцировки клеток в карциномах, т.к. эти сведения определяют тактику лечения, характер и объем лечебных вмешательств. В связи с этим сохраняется необходимость дальнейшей разработки высокоинформативных и объективных методов гистологической диагностики стадий развития новообразований.

Известны различные гистологические и гистохимические методы диагностики стадий озлокачествления эпителиальных тканей, получаемые на основе данных светооптического микроскопического исследования срезов тканей, включающие в себя подробное описание изменений морфологического строения ядер, цитоплазмы клеток, структуры ткани или интенсивности гистохимических реакций, которые наблюдаются при опухолевой трансформации разных типов эпителия. Эти данные оцениваются патогистологом и с использованием руководств, атласов и других пособий дают основание для отнесения их к той или иной форме новообразования с уточнением стадии канцерогенеза, а и при наличии карцином, особенностей дедифференцировки их клеточных элементов (Патологоанатомическая диагностика опухолей человека. М.: 1982; Дж. Вуд (ред.) Введение в количественную цитохимию. М: Мир. - 1969 и др.).

Недостатками указанного способа является его субъективность, большая зависимость от опыта врача, а также невозможность, в ряде случаев, проведения точного разграничения доброкачественных и злокачественных изменений эпителиальной ткани, а также осуществление однотипной диагностики степеней дедифференцировки карцином.

Число разночтений одних и тех же гистологических препаратов разными специалистами продолжает оставаться достаточно высоким (Головин Д.И. Ошибки и трудности гистологической диагностики опухолей. Л.: 1982; European Commission Working group on Breast Screening pathology Consistency achieved by 23 European pathologists from 12 countries in diagnosing breast disease and reporting prognostic features of carcinomas //Virchows Archiv. - 1999. - Bd. – 434 - S -. 3-10 и др.).

Для уточнения гистологической диагностики в последние десятилетия успешно используют достижения молекулярной генетики, иммуногистохимии и электронной микроскопии (Райхлин Н.Е. и др. Ультраструктура опухолей человека. М.: - 1981. С.В.Петров, Райхлин Н.Т.(ред.) Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека. Казань. - 2000; Упоров А.В. и др. //Арх. патол. 2000. - в.2. - С.26-30; Kearsley I. et al. // Brit. J.Cancer. - 1990, - v.61. - P.821-827; Kuropkat at al. // Virchows Archiv. 1994. - v.143. - P.590-595.). Однако все новые гистологические методы исследования опухолей требуют использования большого количества дорогостоящих расходных материалов, а распространенный метод проточной флюорометрии не дифференцирует стадии канцерогенеза и степени дедифференцировки клеток в различных карциномах, т.к. исследуется вся взвесь ядер клеток опухоли с клетками стромы и сосудов, без учета их структурной принадлежности.

В качестве ближайшего аналога принят способ гистологической диагностики новообразований эпителиальной природы с учетом данных об изменениях ядер опухолевых клеток, содержащих в хромосомах дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК), которая определяет их плоидность, заключающийся в том, что гистологические срезы тканей новообразований подвергаются микроспектрфотометрическому исследованию с целью определения содержания ДНК в ядрах клеток (Steibeck R.G. Mitotic failure and genome stability in begin, premalignant and malignant human tissues. - Stockholm, 1998).

Однако описанный способ, в основном, носит только описательный характер и не имеет градаций диагностических критериев для проведения дифференциальной диагностики отдельных стадий канцерогенеза и степеней дедифференцировки карцином, возникших из различных эпителиальных структур.

Таким образом, применяемые в патологоанатомической практике способы гистологической диагностики нуждаются в простых и доступных для повседневного применения методах.

Таким образом, применяемые в патологоанатомической практике способы гистологической диагностики нуждаются в простых и доступных для повседневного применения методах светооптического исследования препаратов, которые должны осуществляться одновременно с рутинными способами диагностики, при которых, в ряде случаев, возникают затруднения при диагностике начальных форм озлокачествления ткани, переходных состояний от доброкачественных к злокачественным стадиям процесса и оценке степени дедифференцировки клеток злокачественной опухоли.

Задачей изобретения является создание объективного и более точного способа дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза в различных органах, а при наличии карцином - степеней их дедифференцировки.

Сущность изобретения состоит в том, что в способе дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза, включающем исследование гистологических срезов тканей новообразования, срезы исследуют на компьютерном анализаторе, на полученном изображении выделяют ядра малых лимфоцитов, определяют их плоидность, принимают ее за стандарт, с использованием которого проводят компьютерное определение средней плоидности ядер клеток ростковых зон новообразования, и при значении этого показателя 1,5 с - 2,9 с диагностируют нормальную эпителиальную ткань и ее гиперплазию, 3 с - 3,4 с - доброкачественную стадию канцерогенеза - низкую степень внутриэпителиальной неоплазии, 3,5 с - 4,4 с - пограничную стадию - высокую степень внутриэпителиальной неоплазии, а при значении показателей выше 4,5 с - злокачественную стадию канцерогенеза - карциому, при диагностике которой дополнительно определяют степень дедифференцировки клеток, и при значениях показателя средней плоидности ядер клеток: 4,5 с - 5,4 с диагностируют первую, высокодифференцированную степень, 5,5 с - 6,4 с - вторую, умеренно дифференцированную, 6,5 с - 7,4 с - третью, низкодифференцированную, а при значениях показателя 7,5 с и выше - недифференцированную карциному.

Использование изобретения позволяет получить следующий технический результат.

Плоидометрический способ диагностики стадий развития эпителиальных опухолей по сравнению с используемыми в настоящее время методиками обладает более высокой точностью и объективностью, а также не требует дорогостоящих расходных материалов.

Способ дает возможность патологоанатому и онкоморфологу объективизировать процесс гистологической диагностики новообразований с учетом результатов измерения плоидности ядер в их клетках, принимать обоснованные диагностические решения при определении доброкачественного, пограничного и злокачественного характера опухоли, не прибегая к многочисленным консультациям, которые также страдают большим субъективизмом.

Предлагаемый подход, использующий плоидометрические данные, также способствует унификации представлений о степени дедифференцировки злокачественных эпителиальных рационального и адекватного лечения онкологического больного. Способ впервые позволяет проводить дифференциальную диагностику стадий канцерогенеза и степени дедифференцировки карцином, уточнять патогистологический диагноз в спорных случаях. Этот подход способствует унификации представлений о степени дедифференцировки новообразований эпителиального происхождения, что имеет большое значение для организации рационального и адекватного лечения больного.

Технический результат достигается за счет использования высокоинформативного диагностического критерия - плоидности ядер клеток росткового слоя опухоли, отражающей генетический профиль клеточных популяций, их пролиферативную активность (способность к размножению) и изменение их генома в процессе канцерогенеза (возникновение онкогенов, изменения в промоторе, патология митозов, появление анеуплоидных и полиплоидиых ядер), ведущей к опухолевой трансформации эпителиальной ткани и появлению карцином с метастазами и без метастазов.

Микроспектрофотометрический способ определения плоидности ядер клеток в цитологических препаратах (мазках, соскобах) основан на изучении содержания ДНК по их оптической плотности или интегральной яркости в целых ядрах. При изучении гистологических срезов исследуются как целые ядра, так и их фрагменты, соотношение которых зависит от толщины среза и компановки клеток (Floderus P.Acta path. microbiol. scand.1944 Suppl.53..P.3; Abercrombie A. Anat. rec. 1946. Vol. 94. - 2 - P.239). Поэтому рекомендуется выполнять требования сравнительной микроспектрофотометрии, при которой стандартизируют толщину и окраску срезов, условия проведения измерений и др. (Автандилов Г.Г. Морфометрия в патологии. М.: Медицина. - 1973).

Предлагаемый подход определения плоидности ядер в диагностических целях на гистологических срезах существенно отличает изобретения от аналогов (Mellen et al. Zbl.Pathol.l994. - 140: 273 - 187; Steinbeck. Proc.Nat.Sci. USA. 1996. - 93: 479-484; Acta oncologica. 1997. - 36. - 1.-: 3-12; Eur. J. Histochem. 1997. - 41: 243-254; Haroske et al. Acta stereologica. - 1998-17/3: 357-382.), связанных с определением содержания ДНК в ядрах клеток, в которых не приводятся конкретные дифференциальные диагностические критерии стадий канцерогенеза и признаков снижения дифференцировки опухолевых клеток для практического применения.

Сравнительная плоидометрическая диагностики стадий канцерогенеза в эпителиальных тканях и степеней дедифференцировки карцином с использованием компьютерного анализатора изображений для получения градаций развития процесса до настоящего времени не применялась.

Способ осуществляется следующим образом.

Гистологические срезы толщиной 8 мкм окрашивают по методу Фельгена, без докраски фона (Меркулов Г.И. Курс патологогистологической техники. Л.: 1969. Haroske et al.// Acta stereologica. - 1998. 17/3, 357-382).

Проводят исследование гистологического среза с помощью компьютерного анализатора изображений “Имаджер -ЦГ” с компьютерной программой плоидометрии “Автан-Сан” (Инструментальный программный комплекс для автоматизированного анализа биомедицинских изображений “Имаджер БИОМЕД”. Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ №2001610674 Росспатент 2001, ВНИИстандарт №200/ 033660 от 26.06.2001). Рекомендация к применению в медицинской практике - Протокол №2 от 07 декабря 2000 г. Комитета по новой медицинской технике Минздрава РФ.

При стандартизованной окраске ядер по методу Фельгена содержание ДНК в ядрах клеток точно соответствует количеству энергии проходящего через ядро монохроматического луча света (570 нм), поглощаемого красителем, связавшимся с молекулами ДНК (Дж.Вид. Введение в количественную цитохимию. М.: 1969). Проведение сравнительной микроспектрофотометрии (Автандилов Г.Г. Морфометрия в патологии. М.: 1973) позволяет выражать содержание ДНК в ядрах в единицах плоидности.

Гистологические срезы исследуют на компьютерном анализаторе, на полученном изображении выделяют ядра малых лимфоцитов, определяют их плоидность, принимают ее за стандарт, с использованием которого проводят компьютерное определение средней плоидности ядер клеток ростковых зон новообразования, при значениях этого показателя 1,5 с - 2,9 с диагностируют нормальную эпителиальную ткань и ее гиперплазию, 3 с - 3,4 с - доброкачественную стадию канцерогенеза - низкую степень внутриэпителиальной неоплазии, 3,5 с - 4,4 с - пограничную стадию - высокую степень внутриэпителиальной неоплазии, а при значении показателей выше 4,5 с - злокачественную стадию канцерогенеза - карциному, при диагностике которой дополнительно определяют степень дедифференцировки клеток, и при значениях показателя средней плоидности ядер клеток: 4,5 с - 5,4 с - диагностируют первую, высокодифференцированную степень, 5,5 с - 6,4 с - вторую, умеренно дифференцированную, 6,5 с - 7,4 с - третью, низкодифференцированную, а при значениях показателя 7,5 с и выше - недифференцированную карциному.

Способ впервые позволяет проводить гистологическую дифференциальную диагностику стадий канцерогенеза и степени дедифференцировки карцином с учетом значений плоидности ядер клеток новообразования, которые определяют пролиферативную активность их клеток.

В качестве примеров, подтверждающих диагностическую ценность плоидометрии, изучены стадии канцерогенеза в молочной и в предстательной железах

Пример 1. Больная Б., 45 лет. Клинический диагноз: фиброкистозная болезнь правой молочной железы. В наружном верхнем квадранте молочной железы пальпаторно и на основании УЗИ-исследования обнаружено уплотнение диаметром 2,5 см. Патологогистологический диагноз: дисплазия протокового эпителия на фоне фиброкистозной болезни.

Результаты компьютерного гистологического исследования срезов биоптата, окрашенного по Фельгену - средняя плоидность ядер клеток протокового эпителия 5 с. Компьютерный гистологический диагноз: высокодифференцированная карцинома молочной железы.

Пример 2. Больной Н., 67 лет. Клинический диагноз: подозрение на аденокарциному предстательной железы. Объем новообразования в железе 40 куб.мм. Проведена пункционная биопсия. Патологогистологический диагноз: гиперплазия желез предстательной железы.

Результаты компьютерного плоидометрического исследования срезов биоптата, окрашенного по Фельгену - средняя плоидность ядер клеток наиболее измененного участка железистого эпителия - 4,0 с.

Компьютерный гистологический диагноз: аденома предстательной железы с очагами высокой степени внутриэпителиальной неоплазии.

Изобретение относится к области медицины. Способ включает исследование гистологических срезов ткани новообразования. Гистологические срезы исследуют на компьютерном анализаторе, на полученном изображении выделяют ядра малых лимфоцитов, определяют их плоидность, принимают ее за стандарт, с использованием которого проводят компьютерное определение средней плоидности ядер клеток ростковых зон новообразования, и при значениях этого показателя 1,5 с - 2,9 с диагностируют нормальную эпителиальную ткань и ее гиперплазию, 3 с - 3,4 с - доброкачественную стадию канцерогенеза - низкую степень внутриэпителиальной неоплазии, 3,5 с - 4,4 с - пограничную стадию - высокую степень внутриэпителиальной неоплазии, а при значении показателей выше 4,5 с - злокачественную стадию канцерогенеза - карциному, при диагностике которой дополнительно определяют степень дедифференцировки клеток, и при значениях показателя средней плоидности ядер клеток 4,5 с - 5,4 с - диагностируют первую, высокодифференцированную степень, 5,5 с - 6,4 с - вторую, умеренно дифференцированную, 6,5 с - 7,4 с - третью, низкодифференцированную, а при значениях показателя 7,5 с и выше - недифференцированную карциному. Способ обеспечивает объективность дифференциальной диагностики.

Способ дифференциальной диагностики стадий канцерогенеза, включающий исследование гистологических срезов ткани новообразования, отличающийся тем, что гистологические срезы исследуют на компьютерном анализаторе, на полученном изображении выделяют ядра малых лимфоцитов, определяют их плоидность, принимают ее за стандарт, с использованием которого проводят компьютерное определение средней плоидности ядер клеток ростковых зон новообразования, и при значении этого показателя 1,5-2,9 с диагностируют нормальную эпителиальную ткань и ее гиперплазию, 3-3,4 с - доброкачественную стадию канцерогенеза - низкую степень внутриэпителиальной неоплазии, 3,5-4,4 с - пограничную стадию - высокую степень внутриэпителиальной неоплазии, и при значении показателей выше 4,5 с - злокачественную стадию канцерогенеза - карциному, при диагностике которой дополнительно определяют степень дедифференцировки клеток, и при значениях показателя средней плоидности ядер клеток: 4,5-5,4 с - диагностируют первую, высокодифференцированную степень, 5,5-6,4 с - вторую, умеренно дифференцированную, 6,5-7,4 с - третью, низкодифференцированную, а при значениях показателя 7,5 с и выше - недифференцированную карциному.