Данный патент описывает широкую область лекарственных средств и методов подавления некоторых болезненных состояний, связанных с большой медицинской областью человеческой и ветеринарной фармакологии, где активизация проводящих путей липоксигеназы способствует патологическому состоянию.
Вещества, которые подавляют или модулируют проводящие пути 5-липоксигеназы и 12-липоксигеназы, известны в медицине. Эти вещества мало или вовсе нетоксичны, подавляют соматические или дерматологические воспаления, являются полезными для лечебных целей.
Данный патент также имеет отношение к пигментирующим веществам, пригодным к применению в промышленности морепродуктов, где пигментирующие ингредиенты должны быть включены в состав водного корма для придания цвета телу, коже или оболочке животного.
В частности, настоящее изобретение касается новых липидов, получаемых из класса Холофуридия (Holothuridia или морского огурца, и особенно из его разновидности Кукумария фрондоза (Cucumaria frondosa), обнаруженной в штате Мэн (США) и Северной Атлантике. Частей некоторых видов морского огурца будет достаточно для сырья, из которого выделяют соединения настоящего изобретения. Масла некоторых видов таких морских огурцов могут быть использованы для пигментации морских видов животных путем включения в состав пищи, а также для лечения болезней и облегчения течения болезней, при которых продукты активности фермента липоксигеназы или реакция лейкотриенов ухудшают патологическое состояние.
Таким образом, новые липиды, извлекаемые из некоторых классов или видов морского огурца, подавляют ферменты липоксигеназы и/или связывают рецепторы лейкотриена. Ферменты липоксигеназы хорошо известны в каскаде арахидоновой кислоты. Эти масла, так называемые Красное Масло (Red Oil и Золотое Масло (Gold Oil), могут быть использованы в целях иммуноподавления, а также для обеспечения сырьем, из которого извлекаются ингредиенты иммуноподавляющих медикаментов, способствующих улучшению иммунных реакций, обусловленных трансплантированным органом, или автоиммунной реакцией при таких болезнях как туберкулез кожи или ревматический полиартрит.
Эти масла или соединения из них после молекулярной перегонки могут быть использованы для ослабления, подавления, торможения или предотвращения непривычных иммунных реакций у людей или животных, нуждающихся в иммуноподавлении.
Примеры таких ситуаций включают, в частности, лечение или предотвращение автоиммунных болезней, таких как диабет, туберкулез кожи и ревматический полиартрит. Иммуноподавление также часто необходимо при трансплантации органов. Иммуноподавляющие вещества могут также быть использованы, когда человек или животное имели или, может быть. подвергались действию суперагентов или других факторов, известных как вызывающие сверхстимуляцию иммунной системы. Соединения данного изобретения также используются как образцы для оценки активности других предполагаемых иммуноподавляющих веществ.
Предмет изобретения, кроме того, имеет отношение к фармацевтическим составам, содержащим эти соединения. Эти масла так же, как показало настоящее изобретение, подавляют ангиогенезис, что продемонстрировано в хориоаллатоническом мембранном анализе цыпленка (Книгхтон и др., 1977). Пигментное масло, названное для целей этого патента Красным Маслом, обнаружило содержание неожиданно большого количества карогиноидов. кантаксантина и астаксантина и пригодно для добавления в промышленную пищу для рыб и морских животных для окраски их тушек или оболочек, если это необходимо.
Настоящее изобретение имеет отношение к соединениям, фармацевтическим составам и способам их применения для лечения болезней, в которых активность 5-и 12-линоксигеназы способствует патологическому состоянию. Данное изобретение также касается продуктов, извлекаемых из ликидных фракций тканей морского огурца, которые облегчают иммунные реакции и которые могут также использоваться в аквадиетах с целью придания цвета тушке или оболочке рыб и креветок. Хотя из литературы известно об использовании морских липидов из некоторых рыб для лечения разных артритных заболеваний, однако лнпиды морского огурца не исследовались, нет также свидетельств, что механизмы, задерживающие воспаление, известные у позвоночных рыб, являются уместными в организмах млекопитающих животных (Де Лука и др., 1995).
Также известно, что некоторые морские губки и асцидии обладают иммуноизменяющей или иммуноподавляющей активностью, но нет свидетельств в области морской фармакологии, что липиды морского огурца обладают такой подавляющей активностью и она используется в медицинских целях (Кониг и Райт, 1995).
В частности, соединения, определяемые ниже, подавляют проводящие пути 5- и 12-липоксигеназы у млекопитающих. Вещества проводящих путей липоксигеназы, такие как лейкотриены В4, С4, D4 и Е4, 5-гидроксиэйкозатетраэноидная кислота, 5-гидропероксиэйкозатетраэноидная кислота относятся к вышеописанным состояниям. Специфические условия для применения представленных новых липоксигеназоподавляющих соединений, их фармацевтических композиций и нового метода использования в соответствии с данным изобретением включают аллергию, астму, артриты, кожные заболевания, включая псориаз, атопический дерматит и угри; воспаления, включая воспалительные процессы в кишечнике или родовые схватки; различные раки, включая рак предстательной железы, рак легких и рак кожи; сердечно-сосудистые заболевания, включая миокардическую ишемию, инфаркт и аритмию; ангину, паралич, мигрени и атеросклерозы.
Соединения данного изобретения извлекаются из липидных фракций некоторых видов или подвидов морского огурца, из депигментированной фракции упомянутой липидной фракции, из фаз молекулярной перегонки, как известно специалистам, или из разделения этого в хромотографической колонке; из эпидермических, кожных, передних и задних или кишечных частей, включая дыхательные органы, яичники, полости, трубочки и пузырьки морского огурца.
Морские огурцы различных видов являются источником медицински активных фракций, используемых в лечебных целях. Патент №5519010 показывает, что деполимезированный полисахарид используется в качестве антикоагулянта. Патент №5770205 Коллина показывает, что ткани морского огурца, извлеченные различными способами и обладающие антивоспалительным действием, используются для лечения человека и животных. Глюкозиды из органов морского огурца показали содержание антираковых ферментов (Миямото и др., 1990). Никто из вышеперечисленных авторов не описал липиды из морского огурца, которые подавляют проводящие пути липоксигеназы, воспаления, не описывали пользу таких ферментов, извлекаемых из морского огурца, которые подавляют патологические болезненные состояния, в которых продукты липоксигеназы, изомеры или метаболиты способствуют подобным состояниям. Ни один из вышеперечисленных патентов не дает представления о цели, где подобные липиды обеспечивают иммуноизменяющую активность у млекопитающих.
Данное изобретение показывает, что оба богатые пигментами липидные материалы и депигментировапные липидные материалы, и Легкие Фазы, извлеченные с помощью молекулярной дистилляции некоторых пигментированных и депигментированных липидных материалов морского огурца, способны подавлять активность энзима 5-липоксигеназы в человеческих нейтрофилах и энзима 12-липоксигеназы в человеческих тромбоцитах.
Существует много патентов, описывающих ферменты, которые имеют целью подавление лейкотриенов и проводящих путей 5- 12-липоксигеназы у млекопитающих. Некоторые из этих соединений эффективны, а некоторые имеют токсичные побочные эффекты или не могут быть произведены с эффективными затратами.
Объектом настоящего изобретения является производство масел и их производных из морского огурца, которые могут быть включены в мази, суппозитории и использованы в оральных лекарствах, или в инъекциях, или в других доступных по цене лекарственных средствах, которые будут изменять проводящие пути лейкотриена у млекопитающих и, таким образом, будут способствовать терапевтическому лечению таких болезней, как рак, псориаз, атонический дерматит, и других, в которых лейкотриены, LТВ4, 5-HЕТЕ и 12-НEТЕ способствуют патологическому состоянию.
Терапевтическое применение новых соединений и составов, содержащих их, может рассматриваться завершенным с помощью подходящего терапевтического метода и способа, теперь или в перспективе известных специалистам. В дальнейшем соединения этого изобретения могут быть использованы как исходные или промежуточные материалы для приготовления других полезных соединений и составов, проявляющих более сильную активность.
Объектом этого изобретения является обеспечение фармацевтического производства соединениями, включающими в качестве активных ингредиентов эффективное количество одного или более новых соединений, здесь описываемых. Объектом этого изобретения также является обеспечение производства новыми соединениями, которые являются иммуноизменяющими ферментами, благодаря их подавляющей активности проводящих путей липоксигеназы у млекопитающих и благодаря их подавляющей активности проводящих путей лимфоцитной полиферации иммунной системы млекопитающего, а также ингредиентами, которые являются полезными в аквадиетах для пигментации морских животных. Фракции молекулярной дистилляции или другой сепараторной технологии, включающие так называемые Легкие Фазы извлеченных натуральных масел морского огурца из тканей морского огурца, показали способность подавлять проводящие пути липоксигеназы. Тяжелые Фазы этих масел из молекулярного дистиллятора также обнаруживают подобную активность. Выделение в чистом виде более активных составляющих этих проводящих путей может быть произведено, например, в хромотографической колонне, или другими методами, известными специалистам в области линидной биохимии. Кроме того, объектом этого изобретения является обеспечение сырьем и активным промежуточным сырьем для таких выделений, которые требуются для более сильнодействующих и специфических фракций.
Соединения данного изобретения подавляют активность 5- и 12-липоксигеназы у млекопитающих, для которых подавляющая активность связывается с антиаллергической, антивоспалительной и антигиперпролиферированной активностью. Соединения изобретения полезны для лечения аллергических заболеваний, воспалительных заболеваний эпителия, состояний, вызванных высокой температурой, рака и гиперпролиферированных кожных заболеваний. Они также обнаруживают способность к подавлению пролиферации лимфоцитов в человеческой крови.
Воспалительные заболевания, которые могут излечиваться, включают артрит, бурсит, тендинит, подагру и воспаление кишечника.
"Гиперпролиферированные кожные заболевания" - это такие состояния, симптомы которых характеризуются ускоренным ростом кожных клеток, шелушением, чешуйчатыми или пузырьковыми поражениями. Примерами гиперпролиферированных кожных заболеваний являются псориаз, лишайная экзема, перхоть и подобные. Соединения изобретения могут назначаться в некотором количестве обычных дозировочных форм, таких как местные, оральные, парентальные, ректальные, накожные, ингаляции и подобные. Оральные или ректальные дозировочные формы включают капсулы, таблетки, пилюли, порошки, облатки и суппозитории. Жидкие оральные дозировочные формы включают микстуры и суспензии. Парентальные препараты включают стерильные растворы и суспензии.
Назначение ингаляций может быть в форме носовых или оральных спреев, или путем вдувании. Местными дозировочными формами могут быть кремы, мази, лосьоны, накожные приспособления (такие как подходящие пластырного или матричного типа) и подобные, и это предназначается для лечения гиперпролиферированных кожных заболеваний.
Составы и фармацевтические смеси рассмотренных выше дозировочных форм могут быть приготовлены с помощью традиционных фармацевтически допустимых инертных наполнителей и добавок, используя обычные методы. Такие фармацевтически допустимые инертные наполнители и добавки предназначены для содержания в носителях, связующих веществах, ароматизаторах, прокладках, уплотнителях, красящих ферментах, стабилизирующих ферментах, эмульсирующих ферментах, рассеивающих ферментах, замедляющих ферментах, отдушках, защитных покрытиях, смазках и т.д.
Подходящие фармацевтически допустимые носители заявленного сухого вещества соединений это магния карбонат, магния стеарат, тальк, сахар, лактоза, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлоза, натрия карбоксиметилцеллюлоза, низкоплавкий воск, масло какао и подобные. Капсулы могут быть изготовлены там, где активные соединения вставляются в фармацевтически допустимые капсулы-носители. Активные соединения изобретения могут быть смешаны с фармацевтически допустимыми инертными наполнителями или могут использоваться в порошковых формах высокой очистки, отделенных от инертных наполнителей для включения в капсулы. Подобным образом в облатке содержатся также липосомы.
Жидкие формы препаратов включают растворы, суспензии и эмульсии. Например, водные или растворы водопропиленгликоля для парентальных инъекций. Жидкие формы препаратов могут также быть в виде растворов в полиэтиленгликоле и /или пропиленгликоле, которые могут содержать воду. Водные растворы, предназначенные для орального применения, могут быть приготовлены путем добавления активного компонента в воду, или добавления подходящих красителей, ароматизаторов, стабилизирующих, опресняющих, солюбилизирующих и сгущающих ферментов по необходимости. Водные суспензии, предназначенные для орального использования, могут быть приготовлены путем рассеивания активного компонента в масляной форме внутри эмульгатора типа ТВИН-80, известного специалистам по масловодяным эмульсиям.
Составы для местного применения в лечении гиперпролиферированных кожных заболеваний могут включать вышеописанные жидкие формы, а также кремы, аэрозоли, спреи, пудры, где масло смешивается с подходящим носителем; лосьоны и мази, которые приготавливаются соединением активного ингредиента, соответствующего этому изобретению, с обычными, фармацевтически допустимыми растворителями и носителями. Мази и кремы могут, например, быть произведены на водной или масляной основе с добавлением подходящих сгущающих и /или желирующих ферментов. Такие основы могут, например, включать воду и /или масло, такое как жидкий парафин, пчелиный воск, растительное масло, такое как масло арахиса и касторовое масло. Сгущающие ферменты, которые могут быть использованы в соответствие с природной основой, включают мягкий воск, стеарат алюминия, цетостеариловый спирт, пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, волокнистый жир, гидрогенизированный ланолин и другие.
Лосьоны могут быть произведены на водной или масляной основе и включать один или более фармацевтически допустимые стабилизирующие ферменты, красящие ферменты, сгущающие ферменты, эмульгирующие ферменты, рассеивающие ферменты, замедляющие ферменты, отдушки и другие.
Местные фармацевтические смеси могут также включать один или более консервантов или ферментов остановки роста микроорганизмов, таких как метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, хлорокрезол, бензалькониума хлориды и другие.
Местные фармацевтические смеси могут также включать активные соединения этого изобретения в комбинации с другими активными ингредиентами, такими как антимикробные средства, особенно антибиотики, анестезирующие средства, анальгетики и успокаивающие средства, такие как циритион цинка.
Соединения данного изобретения могут также быть введены через кожу для соматического распространения. Накожные смеси могут иметь форму кремов, лосьонов и /или эмульсий, и быть включены в накожный пластырь, по необходимости матричного или резервуарного типа.
Соединения данного изобретения могут назначаться подходящим способом приема в эффективных количествах для антиаллергических, антивоспалительных и антигиперпролиферированных целей для реализации способов их применения. Дозировки могут варьироваться в зависимости от необходимости для пациента по решению лечащих врачей, тяжести заболевания и особенностей применяемого соединения. Установление правильной дозы в каждой ситуации есть вопрос квалифицированного специалиста. Лечение может быть начато с малых доз, меньших, чем оптимальные дозы соединений. После этой дозы они могут быть увеличены путем небольших добавлений до достижения оптимального эффекта. Для удобства общая ежедневная доза может быть разделена и назначена по желанию порциями в течение дня.
Так, в зависимости от назначения, могут быть назначены дозы от около 0,1 до около 500 мг/кг веса тела в день. Например, когда назначение оральное, соединения проявляют антиаллергическую активность в дозах от около 0,5 до около 200 мг/кг веса тела, предпочтительнее от около 50 до около 100 мг/кг веса тела; когда назначение путем ингаляции, соединения проявляют антиаллергическую активность в дозах от около 0,1 до 5 мгс на впрыск, и один или четыре впрыска могут быть сделаны каждые 4 часа.
Соединения данного изобретения могут назначаться каким-нибудь подходящим способом для достижения антивоспалительного эффекта путем назначения эффективного количества соединения. Соединения данного изобретения, как антивоспалительный фермент, могут назначаться в дозах от около 0,1 до около 500 мг/кг веса тела в день, предпочтительнее от около 5 до около 200 мг/кг веса тела в день. Предпочтительно, если общая ежедневная доза может быть разделена на 2-4 отдельные дозы в день. Например, оральная доза может колебаться от около 5 до около 50 мг/кг веса тела в день в раздельных дозах, принимаемых примерно через 4-х часовой интервал.
Когда для лечения гиперпролиферированных кожных заболеваний соединения данного изобретения могут назначаться местно, орально, ректально или парентерально, предпочтительнее местно. При местном назначении соединения его количество широко варьируется в зависимости от величины излечиваемого кожного участка, а также от концентрации активного ингредиента, приложенного к пораженному участку. Предпочтительно, чтобы местные смеси содержали от около 0,10 до около 10% по весу активного ингредиента и наносились по необходимости согласно мнению лечащего врача. Когда назначенные орально соединения Красного Масла и Золотого Масла эффективны для лечения гиперпролиферированных кожных заболеваний, ежедневные дозы колеблются от около 0,1 до около 500 мг/кг веса тела в день, предпочтительнее от около 5 до около 100 мг/кг веса тела в день, которые могут быть назначены в раздельных дозах. Ежедневные дозы назначенных ректально соединений данного изобретения колеблются от около 0,1 до 1 мг/кг веса тела.
В результате назначения соединений данного изобретения у большинства пациентов с псориазом ослабляются симптомы заболевания: шелушение, эритема, размер бляшек, возбуждение и другие. Дозы медикамента и длительность времени, требуемого для успешного лечения каждого индивидуального пациента с псориазом, могут изменяться, но так, что специалист в области медицины будет способен узнавать эти изменения и регулировать курс терапии соответственно.
Арахидоновая кислота является биологическим предшественником семейства физиологически активных эйкозаноидов. Они включают продукты, производные от циклооксигеназы, такие как класс соединений простагландин-E и -F, тромбоксаны, простациклин и продукты, производные от энзимов липоксигеназы, такие как гидрокси- и гидропероксиэйкозатераэноидные кислоты и лейкотриены.
Эти продукты липоксигеназы обнаруживают очень сильные стереоспецифические индукторы миграции полиморфоядерного лейкоцита или хемотаксиса, освобождение фермента лизосомы и дегрануляцию. Дополнительно эти продукты индуцируют сжатие гладкой мускулатуры, такой как сосудистая и легочная ткань, и вызывают генерацию дополнительных возбудителей воспаления, таких как тромбоксаны А2 и простациклин. Продукты липоксигеназы также взаимодействуют с вазодилаторными простаноидами и другими посредниками, приводящими к усилению или расширению воспалительной реакции.
Лейкотриены и гидрокси- и гидропероксиэйкозатераэноидные кислоты играют важную роль в патогенезисе многих болезненных состояний. Эти соединения обосновывают синовиальную жидкость суставов, пораженных ревматизмом, кожные поражения пациентов с псориазом, воспаление толстокишечной ткани и повышенные уровни в ишемической миокардической ткани. Они также являются посредниками аллергических и астматических состояний.
Роль 5-НЕТЕ в стимуляции роста числа различных типов опухолей недавно была продемонстрирована в группе публикаций. Например, добавление арахидоновой кислоты в культивированные человеческие клетки рака простаты имело результатом значительное увеличение клеточного роста и увеличение биосинтеза 5-гидроксиэйкозатетраэноидной кислоты (5-НЕТЕ) (Гош и Миерс, 1997). Увеличенный рост был блокирован с помощью 5-липоксигеназы (5-LO) ингибиторами АА681 и МК886, но не с помощью 12-LO ингибиторов, байкалеина и N-бензил-N-гидрокси-5-фенилпентанамида (ВНРР), не с помощью циклооксигеназы (СОХ) ингибиторов. Кроме того, добавление в клетки 5-НЕТЕ, но не других продуктов 5-LO проводящего пути, таких как лейкотриен В4, не только стимулировало клеточный рост, но и аннулировало эффект МК886.
Подобные выводы также можно сделать и в отношении раков другого типа, как "in vitro", так и "in vivo". Например, в клеточном ряду грудного рака (HS578T) человека, LO ингибиторы нордигидрогвайаретовой кислоты (NDGA) и эскулетина подавляли клеточный рост, но СОХ ингибитор пироксикам не имел эффекта. (Нофманова и др., 1996). В клеточном ряду (МАХ) мышиной аденокарциномы и у мыши с трансплантированными МАС клетками, 5-LO ингибиторы ВWA4С (в ацетогидроксамовой кислоте с главной формулой R-СОNHОN) и ВWВ70C (в ацетогидроксамовой кислоте деривате) задерживали рост опухолевой клетки и производство 5-НЕТЕ, (Хасси и Тисдал, 1996). Кроме того, в исследованиях "in vivo" у А/J мышей с аденомой, введенной с помощью уретана, назначение NDGА значительно уменьшало количество клеток аденомы легкого (Моуди и др., 1998) и в мышиной аденокарциноме ВWА4С и ВWВ70С также показали уменьшение МАС26 и МАС16 клеточного роста путем воздействия на выработку 5- и 12-HЕТЕ (Хасси и Тисдал, 1996).
Есть основания считать, что 12-НЕТЕ, генерируемая тромбоцитами и опухолевыми клетками, является крестообразной молекулой для продвижения опухолевых метастаз. Увеличение опухолевой клетки, вызванное скоплением тромбоцитов и сцеплением опухолевых клеток в субэндофелиальную матрицу путем увеличения поверхностных ингегринов, вызывает эндофелиальное клеточное стягивание и увеличивает подвижность опухолевой клетки, все это является важными этапами в метастазах опухолевой клетки (Хонн и др., 1994). Лабораторные исследования показали, что 12-LO ингибитор ВНРР уничтожает эффекты, описанные выше, т.е. обоих эдогенно и экзогенно добавленных 12-НЕТЕ (Хонн и др., 1992; Чен и др., 1994). Было продемонстрировано, что выделение 12-НETЕ является хорошим индикатором потенциала метастаз опухолевой клетки. Например, уровни mRNА 12-НЕТЕ повышаются в раковых клетках простатита в сравнении с нормальными клетками, и увеличение уровня mRNА устанавливает соотношение с продвижением вперед стадий и с видоизменением раковых клеток (Гао и др., 1995). В дальнейших опытах обнаружилось, что крысиные Walker карциномы (W 256) и мышиные меланомы (В16a) клетки совершают обмен арахидоновой кислоты в 5 и 12-НЕТЕ и, что в экспериментальных метастастазах использование ВНРР уменьшает образование колонии в легком (Чен и др., 1994, Лиу и др., 1994).
Соединения и фармацевтические смеси в соответствии с настоящим изобретением подавляют липоксигеназу, биосинтез или биохимическое действие лейкотриенов и являются полезными для лечения или облегчения ряда заболеваний, в которых патогенезис вызывает производство лейкотриенов и других производных липоксигеназы, таких как 5 и 12-НЕТЕ и лейкотриена В4 (LТВ4). Эти ингибиторы липоксигеназы способствуют предотвращению воспаления и повреждения ткани, которые являются результатом инфильтрата лейкоцитов, освобождают усвоенные ткани энзимы лизосомы и изменяют проницаемость и состояние сокращения гладкой мускульной ткани.
Специфические условия, в которых подобные липоксигеназоподавляющие и лейкотриенопротиводействующие соединения и фармацевтические смеси в соответствии с изобретением являются полезными, включают аллергию, астму, артриты, кожные заболевания, включая псориаз и угри, воспаления, воспалительные заболевания кишечника, родовые схватки, сердечно-сосудистые заболевания, включая миокардическую ишемию и инфаркты, ангину, аритмию, паралич, атопические дерматиты, атеросклероз и раки различных этиологий, включая рак простаты, легких, кожи и пищевого тракта.
Большой научный интерес представляют поиски ингибиторов ангиогенезиса в связи с тем, что подавление новых кровеносных сосудов ограничит рост новообразований. Нормальная клетка развивается в твердую опухоль, подвергаясь серии изменений. На физиологическом уровне, вопреки иммунитету, происходит рост опухолей, вызывая новососудистые образования. Новососудистые образования или появление ангиогенезиса являются предпосылками опухолевого роста. Экспериментальные твердые опухоли не способны расти больше нескольких миллиметров в толщину без кровяного снабжения. Главная сущность твердых опухолей это выработка ангиогенезисных факторов, которые притягивают новые кровеносные сосуды, от которых они зависят. Таким образом, здесь продолжаются исследовательские усилия, направленные к возможности препятствования сильного распространения капиллярного разрастания, что поддерживает стабильное состояние капиллярных эндофилиальных клеток нормальных тканей.
Дополнительным объектом настоящего изобретения является обеспечение состава вещества и метод подавления ангиогенезиса в теплокровном животном, нуждающемся в подобном лечении, которое включает назначение упомянутому теплокровному животному терепевтически эффективного количества смеси, включающей выделенное Красное Масло, или Золотое Масло, или Легкую или Тяжелую Фазы в процессе молекулярной дистилляции, как описывается в следующих разделах.
Каротиноиды из морского огурца упоминаются в научных журнальных статьях, так Матсуно и другие (1995) сообщали о нахождении астаксантина, как главного каротиноида, бетакаротина, эхиненона, кантаксантина и зеаксантина в яичниках морских огурцов Holothuria leucospilota и Stichopus japonicus. С другой стороны, астаксантин и сложные эфиры, кантаксантин, фоеникоксантин и эхиненон были выделены Баллоком и Даусоном (1970) из стенок красного тела Psolus fabrichil. Тсушима и другие (1996) сообщали о новых морских ди-Z каратиноидах, кукумариаксантинах А, В и С из морского огурца Cucumaria japonica. Финдлай и другие (1983) сообщали о кантаксантине из разновидностей Cucumaria frandosa. Ни одно из этих сообщений не описывало использования подобных каротиноидов в аквакультуре, или в медицине, или в индустрии здоровой пищи, и не описывало методы сгущения подобных пигментированных липидных фракций.
Американский патент №4692280 Спинелли. Стоута и Нилсона описывает способ получения очищенных рыбных масел (после первоначальной экстракции из рыбной ткани), используя сверхкритический диоксид углерода, и включается сюда для целей, описывающих упомянутый способ. Этот патент не раскрывает средства получения липидных фракций морского огурца, очищенных посредством комплекса суперкритических очищающих методологий.
Также не известны способы эффективного и широкомасштабного удаления липидных фракций и получения годных к употреблению каротиноидных и безкаротиноидных липидных фракций тканей морского огурца.
Объектом настоящего изобретения является обеспечение средств для извлечения годных к употреблению пигментированных липидных фракций и депигментированных липидных фракций из внутреннего кишечного материала и/или стенок сосудов морского огурца, особенно из разновидностей Cucumaria frandosa.
Объектом настоящего изобретения является определение смеси веществ, которая состоит из пигментированных липидных фракций и депигментированных липидных фракций, полученных в результате подобных средств извлечения. Пигментированная липидная фракция, полученная путем экстракции ацетоном или спиртовым раствором на промышленном оборудовании для экстракции, таком как Экстрактор Краун 2 (Краун Айрон Вокс, Чикаго, Иллинойс), который используется для экстракции масел соевых бобов, и обеспечивает пигментированным материалом, содержащим кантаксантин в количестве приблизительно 4.500 частей на миллион и используемым в добыче и переработке морепродуктов как пищевой ингредиент. После экстракции липидов, высушивания безлипидная ткань может использоваться как высокопротеиновая мука или жмых, или гидролизат с неожиданно высоким уровнем эфирных аминокислот.
Данное изобретение определяет передовые способы и смеси веществ для промышленной экстракции новых пигментированных липидных соединений из внутренней ткани или тканей стенок туловища морского огурца во влажном или сухом состоянии сырья. Соединения этого изобретения можно использовать в качестве пигментирующих добавок в аквадиеты или как медикотерапевтические препараты для млекопитающих и производить путем технологии молекулярной дистилляции, технологий экстракции раствором в промышленных масштабах, технологий колоночной хромотографии и посредством технологии предварительной жидкостной хромотографии высокого давления, которые описываются здесь.
Соединения этого изобретения показывают антивоспалительную активность, которая становится очевидной, когда эти соединения применялись местно в мышиных моделях воспаления, характеризовавшихся невысоким процентом увеличения веса уха у мышей, а также, когда эти соединения применялись для подавления вспомогательного вещества, вызывающего воспаление в задних лапах крыс, так же, как в примечательных сообщениях о субъективной пользе для людей.
Соединения этого изобретения.
Красное Масло и Золотое Масло и фракции молекулярной дистилляции можно использовать для лечения аллергий у млекопитающих (в том числе у человека и собаки) и предпочтительно использовать для лечения аллергических воспалений кожи таких млекопитающих, и с подходящими накожными переносчиками этих соединений, такими как ингибиторы артритических воспалительных состояний, где масла этого изобретения переносятся локально через кожу в места липоксигеназной активности. Дополнительно их можно использовать при лечении заболевания хронической закупорки легкого. Хроническая закупорка легкого - такое болезненное состояние, при котором прохождение воздуха в и из легких затруднено или недостаточно так же, как в случае астмы, аллергических и хронических ринитах и/или бронхитах и подобных. Лечение псориазов, угрей, артрита или рака может выполняться при использовании соединения настоящего изобретения, назначаемого как местно, так и орально.
Поэтому дополнительный объект этого изобретения имеет отношение к иммуноподавляющему применению Красного Масла и Золотого Масла, извлеченных из тканей морского огурца, и различных производных и аналогов этих соединений. Эти соединения могут быть использованы для ослабления, сдерживания, подавления или предотвращения необычных иммунных реакций. К тому же, это иммуноподавление может быть достигнуто без цитотоксичности. Поэтому эти соединения используются для лечения людей и животных, нуждающихся в иммуноподавлении. Примеры таких ситуаций включают, но не ограничиваются автоиммунные заболевания, такие как диабет, волчанка, ревматоидный артрит. Иммуноподавление также часто необходимо в связи с трансплантацией органов. Иммуноподавляющие ферменты могут также быть использованы, когда человек или животное было или может быть подвергнуто действию суперантигенов или другим факторам, известным как сверхстимуляция иммунной системы. Соединения субъекта изобретения также полезны как стандарты для оценки активности других предполагаемых иммуноподавляющих ферментов. Субъект изобретения имеет отношение к фармацевтическим смесям, содержащим эти компоненты.
Как пигментные добавки, различные пигментированные масла могут быть добавлены в пищу рыб и креветок в различных долях содержания, зависящих от содержания каротиноидов в масле, или необходимости достижения определенной интенсивности цвета в особых водяных видах животных, которых кормят пигментированной диетой.
Фиг. 1 показывает влияние Легких Фаз Золотого Масла на синтез LTB4 по сравнению с контрольным;
фиг. 2 показывает зависимость подавления синтеза метаболита нейтрофил 5-липоксигеназы от степени разбавления Золотого Масла;
фиг. 3 показывает влияние Красного Масла на синтез метаболита нейтрофил 5-липоксигеназы при степени разбавления масла 1: 10.000;
фиг. 4 показывает влияние Красного Масла и Золотого Масла на синтез 12-НЕТЕ по сравнению с контрольным влиянием метанола;
фиг. 5 показывает газовую хромотографию Золотого Масла;
фиг. 6 показывает абсорбционный спектр Красного Масла;
фиг. 7 показывает влияние 5% -ного Золотого Масла на уши подопытных мышей, подвергшихся обработке кретоновым маслом, в сравнении с контрольным влиянием ацетона;
фиг. 8 показывает влияние Красного Масла на уши подопытных мышей, подвергшихся обработке кротоновым маслом, в сравнении с контрольным влиянием ацетона;
фиг. 9 показывает влияние Легких Фаз Золотого Масла на синтез 12-НЕТЕ по сравнению с контрольным влиянием метанола.
Различные фракции извлекаются из морского огурца и используются терапевтически или как часть морской пищи. Кратко, способ приготовления этих фракций включает экстракцию высушенных внутренностей морского огурца или оболочки тушки с помощью раствора для приготовления пигментированного масла, названного Красным Маслом. Пигменты могут быть удалены из Красного Масла для производства более или менее депигментированного масла, названного Золотым Маслом, при этом вторая фракция является красным пигментированным липидным концентратом. Красное Масло и Золотое Масло, каждое, могут быть дистиллированы для получения различных фракций, включая те, что названы Легкими Фазами и Тяжелыми Фазами. Другим подходом является использование сырой ткани морского огурца, что предпочтительнее.
При использовании ацетона или спирта первая экстракция растворителем производит продукт, упоминаемый как Красный Жир. Второй метод производства Золотого Масла также описывается. Этот альтернативный метод описывает вторую экстракцию раствором ткани морского огурца, которая высушивается подходящими средствами после первой экстракции, и удаляет весь или большинство красного цвета. В конце концов обрабатывают делипидизированные ткани морского огурца и получают еще одну фракцию, используемую для производства богатого протеином гидролизата. Этот гидролизат полезен в качестве пищевых добавок или может быть переработан в продукты питания. Способы производства и использования каждой из фракций излагаются ниже. Они не являются единственными способами производства каждого из соединений этого изобретения, таких как Золотое Масло и Красное Масло, других соединений этого изобретения или продуктов, включающих их. Существуют другие методы производства продуктов, равноценных описанным здесь, с подобным действием и также используемых.
Кишечная масса из 460 кг морского огурца Cucumaria frondosa была получена в процессе обработки отходов промышленности морского огурца. Кишечная масса (352 фунта) высушивалась в подходящей сушке низкого нагрева для морской пищи (Сауфвинд, Нова Скотия, Канада) на укрытых стеллажах 3 дня, в результате давая 105 фунтов высушенного материала. Высушенная кишечная масса будет экстрагирована введением в гексан, как известно при производстве масла соевых бобов посредством соответствующих методов (Краун Экстрактор модель 2, Краун Айрон Векс, Чикаго, Иллинойс) для производства приблизительно 42 фунтов красного липидного материала, названного Красным Маслом. Липидный материал был после этого дегуммирован путем добавления 1% воды в масло, затем гидратирован в течение 30 мин, и центрифугирован при 8000 об/мин 150°F. Впоследствии Красный депигментированный липидный материал предварительно очищался 0,5% силикагелем, нагретым до 180° F (градусов по Фаренгейту), и затем фильтровался с использованием 6-микронной фильтровальной бумаги. Удаление пигмента производилось добавлением 5% отбеленной глины в предварительно очищенное масло. Масло нагревалось до 220°F в течение 20 мин при вакууме 28 дюймов ртутного столба. Получившееся масло (34 фунта) было светло-желтого цвета и большинство пигментов адсорбировалось в отбеленной глине. Кишечный липид, свободный от пигментов, называется Золотое Масло и является одной из липидных фракций, в дальнейшем используемой для подавления активности липоксигеназы и в целях противовоспалительного действия.
Полученная глина затем подвергалась экстракции ацетоном в весовом соотношении глины к растворителю 1:2 и промывалась дважды. Полученный растворитель затем выпаривался в испарителе Лува при 90°С и вакууме в 29 дюймов ртутного столба, и получалось 8 фунтов концентрата красной липидной фракции.
Альтернативный метод приготовления Золотого Масла это пропуск Красного Масла через колонну силиконовой кислоты, уравновешенной хлороформом, колонна промывается хлороформом. При этом хлороформ вымывает Золотое Масло. Концентрированное Красное Масло может также вымываться из колонны прохождением через нее смеси хлороформа с метанолом (приблизительно 60%:40%). В результате около 70% оригинального материала, содержащегося в жидкой фазе колонны, было получено как Золотое Масло и 30% было получено как концентрированное Красное Масло.
Не содержащее пигментов Золотое Масло и пигментированное Красное Масло, оба подвергаются воздействию молекулярной дистилляции для отделения испаряемых фракций. Три прохождения были сделаны через прибор для молекулярной перегонки при 200°С и 0.005 торр. Три фракции в каждое прохождение были получены. Легкая фаза (Легкая Фаза 1) собиралась с помощью холодильника с температурой около 30°С и удерживалась. Летучая фракция собиралась уловителем спирт/сухой лед и отбраковывалась. Тяжелой фазой (Тяжелая Фаза 1) была га порция, которая вымывалась на дно перегонного аппарата, не испарявшаяся в процессе производства. Тяжелая Фаза 1 была впоследствии вновь введена в прибор для молекулярной перегонки и произвела Легкую Фазу 2 и Тяжелую Фазу 2. Тяжелая Фаза 2, которая вымылась на дно перегонного аппарата, была затем вновь введена в перегонный аппарат и получились Легкая Фаза 3 и Тяжелая Фаза 3. В общем, были произведены Легкие Фазы 1, 2, 3; Тяжелые Фазы 1, 2, 3 и дополнительная летучая фаза, которая была забракована. Легкие Фазы были впоследствии испытаны на их активность в подавлении проводящих путей липоксигеназы. Фиг. 1 показывает подавление активности 5-липоксигеназы Легкими Фазами.
Фиг.2 показывает подавление активности 5-липоксигеназы недистиллированным Золотым Маслом. Фиг.3 показывает подавление активности 5-липоксигеназы Красным Маслом до его депигментизации. Фиг.4 показывает действие Золотого и Красного Масел на активность проводящих путей 12-липоксигеназы и генерацию 12-НЕТЕ. Фиг. 9 показывает эффект от действия Легких Фаз Золотого Масла при разбавлении 1:1000 на синтез 12-НЕTЕ по сравнению с контрольным метанолом.
Второй способ производства полезных фракций
Объекты настоящего изобретения, которые включают использование предмета рассмотрения - масляных фракций из тканей внутренностей и оболочки морского огурца как пигментообеспечивающих соединений для пигментации рыбы или креветок, получаются вследствие процессов, которые включают следующие шаги.
a) Отделение внутренней ткани обрабатываемого морского огурца вручную или с помощью машины. Ручное отделение предполагает разрезание животного ножом и ручную выемку кишок. Машинное разрезание предполагает механизацию, где автоматизированные разделочные машины способны разрезать разложенное животное, после чего кишки становятся доступными для извлечения.
b) Протеиносодержащий и липидный материал внутренностей предварительно обрабатывается после извлечения из животного достаточным количеством кислоты, чтобы рН уровень кислотности ткани находился в пределах от около 4 до около 5,5, предпочтительно в пределах от около 4,3 до около 4,7, чтобы подавить микробное разложение, деминерализацию массы и для общего улучшения красных каротиноидных пигментов, извлекаемых в течение последующей экстракции растворителем или комбинацией растворителей.
с) В этом способе протеиносодержащий липидный материал внутренностей смешивается с ацетоном, спиртом или подобным растворителем в пропорции 3:1 растворитель к материалу и затем взбалтывается 24 часа или до того, как достаточное количество пигмента высвободится из материала внутренностей в растворитель.
d) Ацетон или другой растворитель декантируется от оставшегося материала внутренностей, и затем материал внутренностей промывается 4 часа или более моющим растворителем для удаления оставшихся каротиноидосодержащих липидов.
e) Оставшийся материал внутренностей центрифугируется, чтобы очистить оставшийся растворитель, или нагревается в закрытом резервуаре, и растворитель регенирируется способами, использующими извлекатели растворителя, известные в этой области.
f) Содержащий пигмент ацетон или растворитель закачивается в пленочный испаритель, известный специалистам в химии масел, пигменты удерживаются и изолируются, а растворитель регенерируется.
g) Полученная в результате липидная пигментная фракция является смешанным каротиноидосодержащим материалом, включающим кантаксантин и астаксантин и называющимся здесь Красный Жир. В примере с Cucumaria frondosa основным каротиноидом является кантаксантин.
h) Полученная в результате пигментированная линидная фракция может быть стабилизирована с помощью известных специалистам в этой области антиоксидантов.
i) Оставшийся материал внутренностей высушивается и экстрагируется гексаном, бутаном, сверхкритической углекислотой или подобным растворителем для выделения, по существу, свободного от пигментов золотистого по цвету масла. Это золотистое масло, практически не содержащее каротиноидов, называется Золотым Маслом. Получившийся в результате в остатке сухой протеиносодержащий материал, не содержащий липидов, богат протеином и полисахаридами и используется для включения в пищевые наполнители для человека и животных, которым необходимы эти важные аминокислоты. Протеиносодержащая депигментированная мука является уникальной в морской рыбно-мучной промышленности, поскольку она депигментирована, делипидизирована, и может расворяться в воде способами, описаннными ниже; эта мука содержит высокий процент протеина и важных аминокислот и практически лишена ненужных пахучих примесей. Она легко перерабатывается в порошок или гидролизат известными специалистам способами, которые описываются здесь.
В других, описанных в этом изобретении, процессах извлеченные внутренности морского огурца также высушиваются после подкисления, как это описано в предыдущем способе. Материал внутренностей также может быть нагрет в воде до температуры между 150°F и точкой кипения на протяжении различных промежутков времени от 10 до 30 минут, до безвредного для основных процессов изобретения подкисления.
Процесс высушивания может проводиться как при невысокой температуре (от 60 до 80°F), так и при высокой температуре (от 150 до 200°F), не влияя на заданные липидные фракции или каротиноиды. Процессы, описанные в изобретении, включающие высушивание внутреннего или тканевого материала, включают следующие шаги.
a) Высушенный внутренний или тканевый материал, имеющий влажность менее приблизительно 10%, подвергается стандартной "маслоизвлекающей операции" с гексаном или любым другим подходящим растворителем, известным специалистам в этой области, где сухая ткань или материал внутренностей смешиваются в пропорции 1:1 при 130°F в течение 5 минут и затем высушиваются. Экстрагированный продукт затем промывается на протяжении 3-х часов в другом растворителе. Раствор, содержащий каротиноиды, подвергается удалению растворителя в пленочном испарителе (Лува и Поуп) при 95°С и вакууме в 28 дюймов ртутного столба.
b) Изоляция фазы растворитель/липид в резервуарах, предназначенных для подобных целей, и высвобождение упомянутого растворителя из каротиноидомасляной/растворитель фазы путем стандартных технологий "паром для отпарки и десорбции" или "пленочным" способом.
с) Обработка таким способом масляной фазы с антиоксидантами, известны-ми специалистам в этой области, такими как 6-этокси-1.2-дигидро-2,2,4-триметил-хинолин (Этоксиквин. Монсанто) от 300 до 600 частей па миллион или приблизительно 1% витамином Е.
d) Полученное красное пигментированное масло подвергается рафинированию добавлением 1% воды в масло, затем гидратируется 30 минут, после этого центрифугируется при 8000 об/мин при 150°F. Это масло называется Красным Маслом.
с) Извлечение концентрированного пигмента следующим способом.
Дегуммированное масло, во-первых обрабатывается 0,5% силикагелем (Тризил 600, Грэйс Ко), нагревается до 180°F затем фильтруется через 6-микронную фильтровальную бумагу. Удаление цвета проводится добавлением 5-процентной отбеленной (активированной) глины (Энглехард 105) в предварительно приготовленное масло, затем масло нагревается до 220°F в течение 20 минут при вакууме в 28 дюймов ртутного столба. Получается масло светло-желтого цвета, при этом большая часть пигмента адсорбируется в отбеленной глине. Это масло называется Золотым Маслом. Полученная в результате глина подвергается экстракции посредством ацетона в весовой пропорции 1:2 глина к растворителю и дважды промывается. Полученный в результате растворитель удаляется в испарителе (Ротовап) при 90°С и вакууме в 29 дюймов ртутного столба.
f) Определение каротиноидного содержания извлеченного концентрата стандартными методами (НРLС), известными специалистам.
Концентрированный пигмент, извлеченный в соответствии с этим изобретением, пригоден для включения в аквадиеты и содержит кантаксантин от 2.000 и 5.000 частей на миллион каротиноидов, в зависимости от содержания каротиноидов в исходном материале.
g) Стабилизация депигментированных липидов, полученных в процессе экстракции каротиноидов (Золотое Масло) путем добавления витамина Е или других подходящих антиоксидантов, известных специалистам, в количестве от 1 до 5% от веса.
h) Инкапсулирование депигментированной липидной фракции (Золотого Масла) или пигментированного масла (Красного Масла), полученного из каротиноидосодержащего масла экстракцией кишечных масс морского огурца, в мягкие желеобразные капсулы по 500-1000 мг, или упаковка в подходящие контейнеры для орального или местного назначения млекопитающим.
Местно назначенные вещества могут быть получены путем комбинации смягчающих средств с непигментированной липидной фракцией, в зависимости от ожидаемого эффекта в конкретных ситуациях.
i) Включение упомянутой пигментированной липидной фракции, в зависимости от содержания каротиноидов, в аквадиеты в процентном отношении к подобной пище в количестве, достаточном чтобы произвести каротиноидный осадок в теле или коже.
Дополнительные способы производства полезных фракций
Дополнительным объектом настоящего изобретения является раскрытие смеси вещества, содержащей липидную фракцию внутренностей морского огурца, практически свободную от каротиноидов. Она практически лишена запаха, содержит значительное количество омега-3 жирной кислоты, ЕРА (эйкозапентановая кислота) и содержит витамин Е.
Газовая хроматография/масс спектрометрия выполнялась с депигментированной липидной фракцией. Данные газовой хроматографии показаны на фиг. 5. Фиг. 5 является спектром депигментированной липидной фракции после экстракции каротиноидов посредством передачи активированной глине и выполнялось с помощью модели Хавлетт-Паккарда 5890 Газовый Хроматограф, и 5971 Селективный Детектор масс (Спектрометр масс). Колонна, использовавшаяся в анализах, была HP Ультра-1 Капиллярная GC колонна длиной 25 мм. Депигментированная липидная фракция была сначала омылена тремя жирными кислотами, включая метилат натрия, как стандарт в липидных аналитических целях, затем подкислена, и после этого превращена в метил сложных эфиров. Являющиеся результатом и таким образом произведенные синтетические метил сложные эфиры были сравнены со стандартными профилями жирных кислот из известных справочных библиотек.
Табл.1 дает сравнение процента сходства жирных кислот из депигментированных липидных фракций морского огурца и известными профилями жирных кислот.
Дополнительным объектом настоящего изобретения является раскрытие состава вещества, включающего материал внутренностей морского огурца, который был депигментизирован описанными здесь способами. Этот материал является уникальным, поскольку он, по существу, лишен запаха, обладает высоким содержанием протеина и легко производится в виде удобного порошка. Вот два примера, которые непосредственно иллюстрируют типичные фракции, из числа фракций, полученных с использованием различных технологий и растворителей.
Ткань оболочки тушки морского огурца содержит меньше липидов, чем внутренние кишечные массы, то есть липидов, экстрагированных путем некоторых описанных способов из внутренностей морского огурца. Содержание липидной фракции в тканях оболочки тушки много меньше, чем в материале внутренностей, и составляет около 1-2% от общего сухого веса ткани оболочки тушки.
Пигментированная липидная фракция морского огурца, так называемый Красный Жир, подмешивается в аквадиеты подобно пище (в зависимости от количества частей на миллион каротиноидов) в процентном количестве, достаточном, чтобы произвести осадок в мясе или коже.
Объектом настоящего изобретения является раскрытие смеси вещества, содержащего каротиноидную липидную фракцию, полученную из внутренностей или ткани тушки морского огурца, которая содержит различный процент и количество частей на миллион астаксантина и кантаксантина, в зависимости от факторов окружающей среды. В одной из каротиноидных липидных фракций, раскрытой как Красный Жир, путем спектрофотометрического анализа было установлено содержание 4.706.52 частей на миллион кантаксантина. Спектр поглощения этого анализа показан на фиг. 6 и получен на хроматографе Бекмана DU-800 из экстракции ацетоном каротиноидной липидной фракции свежего материала внутренностей морского огурца, подсчитано ррm 4,706.52 содержания каротиноидов. 23 мг ацетона экстрагировали каротиноидную липидную фракцию, разжиженную 10 мл нефтяного эфира с каротиноидным материалом, имевшим коэффициент поглощения E=2400 и показания 467 nm для каптасантина.
Свежий материал внутренностей морского огурца, так же как и ткани тела, может быть источником липидных соединений и может быть экстрагирован горячим пищевым маслом подобно методу Мейерса и Чена (1982). Патент №4505963 (на который здесь ссылались), также Мейерса и Чена описывает промышленные средства, посредством которых каротиноидные пигменты лангуста экстрагируются горячим маслом в процессе утилизации отходов.
Хотя применение данного промышленного способа отличается от метода горячего масла, возможно использование свежего материала внутренностей морского огурца как основного источника, оба процесса по существу подобны, поскольку основаны на миграции каротиноидосодержащих липидов в горячее пищевое масло.
Свежий материал внутренностей морского огурца Сucumaria frondosa (1 кг) был положен в бак с 5 кг масла соевых бобов, нагретого до 170°F, и оставлено стоять в течение 20 минут. Ткань была подвержена фильтрации через сетчатый нержавеющий фильтр 200 меш и бумагу, известную как "кофейный фильтр", и остаток масла был легко отжат и возвращен в кухонный бак. Следующий 1 кг внутренностей был помещен в бак и процедура была повторена с новой партией материала. После 5 новых партий материала внутренностей, обработанных этим способом, масло в кухонном баке меняет цвет на темно-красный вследствие миграции липидов внутренностей в масляную смесь.
В одном примере этой процедуры в начальный объем 5 кг масла соевых бобов были помещены и удержаны каждый из 5 кг влажного материала внутренностей и через приблизительно 20 мин удалены. Общий каротиноидный процент в одной такой подобно произведенной пробе полученного масла был установлен с помощью стандартных методов в 540 частей на миллион.
Производство делипидизированного гидролизата, богатого протеином
Триста граммов ткани материала внутренностей морского огурца было получено описанным здесь способом, высушено и делипидизировано путем экстракции гексаном. Полученная в результате мука морского огурца была десольвенизирована (извлечен растворитель) посредством нагревания и продувания воздухом, полученная мука была собрана. После этого мука была помещена в раствор с 1 л дистиллированной воды. Используя концентрированный гидрооксид натрия, рН была поднята до 12, и этот раствор был перемешан в течение 30 мин. В конце этих 30 мин уровень pH был отрегулирован с помощью HCl до значения рН 8,5. По достижении этого уровня рН раствор был нагрет до 80°С на 1 мин. Затем раствор был остужен до 25°С и затем центрифугирован при 10.000 об/мин в течение 20 мин и твердые частицы были удалены как лишние, и надосадочная жидкость была доведена до рН, равной 3.0. Протеины были осаждены в растворе, а также получены из раствора центрифугированием и фильтрацией. Протеины были затем растворены в минимальном количестве воды, и рН было приведено к 7,2, и затем это было высушено с использованием сублимационной сушки. Было определено, что жидкий гидролизат является подходящим для стандартной распылительной сушки, известной специалистам в этой области. Эффективность экстракции в предварительных экспериментах равнялась 73% отдачи от начального материала.
Вышеописанный способ был определен подходящим для большого производства в крупнотоннажном конвертере с механизированным оборудованием, которое является общепринятым в пищевой промышленности и производстве гидролизата протеина. Таким образом, полученный высушенный гидролизат растворим в воде, а профиль аминокислоты этого материала следующий, %:
Триптофан 0,82
Аспарагиновая кислота 8,14
Треонин 3,01
Серин 2,62
Глутаминовая кислота 8,67
Пролин 2,67
Глицин 4,21
Аланин 4,39
Цисгеин 0,21
Валин 4,31
Метионин 1,00
Изолейцин 4,03
Лейцин 3,38
Фенилаланин 4,39
Лизин 5,31
Гистидин 1,88
Аргинин 5,93
Вышеописанный гидролизат морского огурца годен для включения как протеин или как довываренное соединение аминокислоты в жидкие напитки, инкапсулированные пищевые добавки, салатные приправы, молочные заменители для детского питания, протеиновые бруски, косметику, пресные напитки, пасту и входить в формулу питания людей, испытывающих недостаток питательных веществ. Нет необходимости включать сюда вариации, в которых сухие или разведенные порошки, богатые аминокислотами, могут добавляться в различных процентах в пищу, поскольку эти типы составов хорошо известны специалистам в науке о питании.
Способы использования фракций морского огурца
Примеры включения пигментированных липидов или каротиноидолипидных продуктов в водные диеты
(А) Сто фунтов свежего внутреннего материала морского огурца было смешано с приблизительно 55 галлонами ацетона и взбалтывалось при комнатной температуре в течение 3 час в 300 галлоновом закрытом резервуаре. Ацетон был слит из смеси в защитный резервуар, и материал внутренностей был промыт новым ацетоном, пока не был достигнут слабый пигментный цвет. Ацетон был прокачан через пленочный испаритель (Поуп Стил), в ацетоновую смесь была добавлена вода, ацетон был выделен из пигментированной липидной фракции и утилизирован. Ацетон был использован как отход производства, а водная фаза была отброшена.
Полученная в результате липидная фракция (63 фунта) имела вид вязкой консистентной смазки и включала 4700 частей на миллион каротиноида кантаксантина. Антиоксидант 6-этокси-1,2-дигидро-2,2,4-триметилхинолин (Этоксиквин, Монсанто) был добавлен в липидную фазу и перемешан в количестве 1% от веса.
Вязкая липидная фракция, содержащая каротиноидный материал (Красный Жир) (было установлено содержание 4.700 частей на миллион кантаксантина путем НРLС анализов) была подмешана в стандартный декоративный рыбный корм, который имел исключенный из производства промышленный каротиноидный материал. Водная диета - рыбный корм был составлен производителем так, что в конечном итоге содержал 80 частей на миллион кантаксантина, полученного из морского огурца. Рыбу-клоуна кормили 2 месяца пищей экспериментальной водной диеты и оценили с помощью комиссии из 5 экспертов, давших среднее число очков 8,5 (по шкале от 1 до 10, где "10" было наиболее приемлемым цветовым осадком) отложениям подходящего цвета в коже рыбы-клоуна.
(B) Морской огурец (1000) вида Cucumaria frondosa был выпотрошен вручную и материал внутренностей был высушен с помощью слабонагретой сушки для морской пищи при 70°F в течение 4 дней (Сауфвинд, Нова Скотиа). Перед сушкой в свежий влажный материал внутренностей морского огурца была добавлена пропионовая кислота в количестве 7,2% от веса. Полученный в результате высушенный материал (105 фунтов) содержал 10% влаги и 41% липидов. Сухой материал внутренностей затем был подвергнут экстрагированию гексаном для выделения липидной фракции, согласно производственным стандартам в 200 галонном закрытом резервуаре, по существу такой же процесс используется при производстве масла соевых бобов, таким образом была произведена красная липидная фракция (42 фунта) (здесь названная Красным Маслом), содержавшая 924,5 частей на миллион каротиноидов, определенных как кантаксантин, и 8,8% эйкозапентаноидных жирных кислот. Эта липидная фракция также содержала 35 IU-альфа-токоферола на 100 гр. Красная липидная фракция (Красное Масло) было затем дегуммировано путем добавления 1% воды в масло, а затем подвержена гидратации в течение 30 мин, после центрифугировано при 8000 об/мин при 150°F. Дегуммированный материал также включает в себя Красное Масло.
Дегуммированное масло (липидная фракция внутреннего материала морского огурца) было сначала предварительно обработано 0,5%-ным силикагелем, нагретым до 180°F, и затем профильтровано с помощью 6-микронной фильтровальной бумаги. Извлечение цвета было произведено путем добавления 5% отбеливающей глины в предварительно подготовленное масло. Масло было нагрето до 220°F в течение 20 мин при вакууме 28 дюймов ртутного столба. Полученное в результате масло (34 фунта) было светло-желтого цвета, и большинство ферментов адсорбировалось в отбеливающей глине. Эта фракция называлась Золотое Масло. Полученная в результате отбеливающая глина была затем подвержена экстракции ацетоном в пропорции 1:2 глина к растворителю и дважды промыта. Полученный в результате раствор был затем десольвенизирован (извлечен растворитель) в испарителе Лува при 90°С и вакууме 29 дюймов ртутного столба, и было получено 8 фунтов концентрата красной липидной фракции.
В результате процесса получилось 3 вида материала: желтое/золотистое масло (Золотое Масло); концентрированная каротиноидосодержащая липидная фракция; и сухой протеиновый порошок без липидов. Желтая липидная фракция (Золотое Масло) было примешано в местно используемую косметику и в водную диету - оральный питательный - морской тест-продукт "Омега 3 липид" для экспериментального использования.
Красная концентрированная липидная фракция подмешивалась в декоративную водную диету для рыб в течение 1 месяца для эффективного осаждения каротиноидосодержащих липидов и достижения желаемого цвета этой рыбы.
Подавление ангиогенезиса в эмбрионах цыпленка с помощью Красного Масла
По 1 мг Красного Масла было помещено микропипеткой на каждый из 6 дисков из метилцеллюлозы диаметром в 1/4 дюйма и высушено. Диски были помещены на шесть десятидневного возраста цыплячьих эмбриохориоаллантонических мембран; другие шесть дисков, пропитанных гидрокортизоном/гепарином, были размещены на контрольные мембраны других шести яиц, как описано у Книгхтона и др. (1977'). Мембраны, обработанные Красным Маслом, обнаружили почти полное подавление сосудистого роста и были более эффективны в подавлении новососудистых образований, чем "позитивные контрольные" мембраны, использовавшие гепарин и гидрокортизон. Испытания проводились "in vivo" и показали клиническое использование соединений, подавляющих опухолевый рост путем подавления кровяного снабжения опухолей (Книгхтон и др., 1977).
Красное масло, как вспомогательное средство, воздействующее на артрит в опытах на крысах
Красное масло, произведенное из тканей кишечника и оболочки тела морского огурца Cucumaria frondosa путем экстрагирования гексаном из высушенного материала вышеописанным способом, а также гидрокортизон и фенилбутазон были применены в качестве вспомогательных средств воздействия на модель артрита у крыс для изучения противовоспалительного эффекта этих соединений (Винтер и Насс., 1966; Гленн, 1966; Лангфорд и др., 1972).
Вспомогательное средство воздействия на модель артрита, примененное на крысах, показало полезность отобранных соединений для лечения ревматоидных артритов у человека.
Вспомогательное средство вызвало артритические отзывы как в стероидах, так и в нестероидах. Величина воспаления могла быть оценена с помощью одного из двух измерений - увеличения веса и /или объема лапы.
Способы
Крысы, весящие от 160 до 180 г, были приобретены в Б энд К Юниверсал, Инк., Кент, ВА, 98032. Это были самцы Спрэгюэ-Давлэй. Животные содержались индивидуально в клетках из нержавеющей стали со свободным доступом еды и воды. Световой цикл поддерживался - 12 часов свет и 12 часов темнота. Температура поддерживалась около 22°С с отклонением не более чем в 3° и относительной влажностью от 40 до 70%. Пищей была диета Харлан Теклан Родент Диет.
Предметы теста
Материалы теста были подвешены в деионизированной воде в дозах, указанных ниже. Все объемы принудительного скармливания были 2 мл.
Схема эксперимента
Самцы крысы Спрэгюэ-Давлэй (160-180 г) были сенсибилизированы инъекцией Фроундз Комплот Аджювапт (0,5% суспензия убивающего микобактерии туберкулеза (Н37RА, Difco в минеральном масле)). 0.05 мл было введено подкожно в области подошвы правой задней лапы каждой крысе.
Материалы теста давались орально (принудительным скармливанием) в 0,5% метилцеллюлозе один раз в день в течение 7 дней. Назначение было начато на следующий день после сенсибилизации.
Веса лап каждой группы на каждом участке теста выводились в среднем. Воздействие было подсчитано следующим образом: средний вес лап контрольных животных - средний вес лап тестируемых животных/средний вес лап тестируемых животных ×100=% антивоспалительная реакция.
Результаты и выводы
Результаты антивоспалительной реакции представлены в табл.2.
Антивоспалительная реакция была различной в среднем весе лапы крысы, подверженной действию инъекции Фроундз Комплот Аджювант в сравнении с неподверженной действию этой инъекции лапой.
В этом исследовании контрольный гидрокортизон давал антивоспалитель-ную реакцию 59,0%, фенилбутазон давал антивоспалительную реакцию 155,3%. Эти два соединения являются положительными контрольными. Красное масло давало антивоспалительную реакцию 158,6% в этом испытании.
Золотое Масло впоследствии было испытано для определения активности подавления воспаления отека мышиного уха.
Модель отека мышиного уха
Кротоновое масло, которое содержит разнообразные форболовые сложные эфиры и арахидоновую кислоту (АА), является стандартным стимулятором воспаления в мышиных ушах при местном применении. Многократное местное применение арахидоновой кислоты вызывает на мышиных ушах воспаление и пролифиративные изменения (Дохерти и др., 1988). Форболовые сложные эфиры, особенно форбол миристил ацетат (РМА), активизирует один или несколько изозимов убихитозы мембраны рецептора, протеина киназы С (РКС), которые приводят к началу нескольких каскадов обмена веществ, вызывающих воспаление (Кастагна и др., 1982).
АА является основой для одного из этих каскадов, приводящего к выделению простогландина и лейкотриена, оба они являются воспалительными. Подавление такого воспаления с помощью предполагаемого биоактивного вещества считается важным показателем потенциальной фармакологической активности. Детеныши самцы Балб/С мышей были приобретены в Б эпд К Юниверсал, Кент, ВА и содержались в лаборатории в течение одного дня до начала эксперимента. При времени t=0 передняя сторона обоих ушей каждой мыши была обработана местно 10 мл 10% кротонового масла в ацетоне (n=12 ушей) или 5% Золотым Маслом, растворенным в ацетоне (n=8 ушей). Животные были умерщвлены шейным вывихом при t=24 часа, уши удалены, взята биопсия из каждого уха путем 8 мм пункции. Биопсия была немедленно взвешена на 4-х чашечных весах. Результаты приведены на фиг. 7. Золотое Масло производило 52% снижение (p<0,05. Вилкоксин Ранк Сам тест) набухания по сравнению с ушами, обработанными только ацетоном, и 50% - по сравнению с необработанными ушами.
Красное Масло испытывалось для определения активности в подавлении воспаления отека мышиного уха, вызванного кротоновым маслом. В некоторых дозах местно Красное Масло производило 85% подавление набухания в сравнении с ушами, обработанными только ацетоном. Результаты показаны на фиг. 8.
Испытание 5-липоксигеназы
5-липоксигеназа (5-LO) является ключевым энзимом в метаболизме арахидоновой кислоты (АА) в лейкотриен В4(LТВ4) и гидрокси/эйкозатетраэноидную кислоту (5-НЕТЕ). В широком разнообразии клеток, включая полиморфоядерные (РМN) лейкоциты (Хендерсон, 1994) и недавно это было связано с раком простаты и другими видами рака (Гош и Миерс, 1977),. LTB4 является хемотаксиса сигнальным веществом,. вызывающим миграцию РМN из кровяного потока в места с поврежденной тканью, которая является отличительным признаком воспалительной реакции. Человеческие РМN изолируются обычными процедурами из нормального добровольца, предварительно нагретые до t=37°С, и при времени t=0 10 мл тестируемых соединений, подвешенных в метаноле с помощью обработки ультразвуком, или один метанол, были добавлены к 1 мл суспензии РМN. Во время t=10 мин 5 мл 2 мМ АА были добавлены в каждую суспензию как 5-LO основа. При t=14 мин кальциевый ионофор А23187 (5 мл; 1 мМ) был добавлен для активации энзима.
Реакция завершилась при t=19 мин добавлением 100 мл 100 мМ лимонной кислоты, сохраняя pH 3.0. Простагландин В2 и 15-НЕТЕ были добавлены как качественные стандарты для высокого давления жидкостной хромотографической (НРLC) квантификации LТВ4 и 5-НЕТЕ соответственно.
Метаболиты и стандарты экстрагированы из суспензии, используя смесь хлороформ /метанол (7:3). Фаза хлороформа была испарена, влагосодержание в подвижной фазе элюирования HРLС восстановлено. Метаболиты были обнаружены с помощью ультрафиолетового света и подсчитаны па стандартной кривой.
Из данных, представленных на фиг. 2, очевидно снижение выработки РМN (полиморфными лейкоцитами) LТВ4, двух его изомеров и 5-НЕТЕ в зависимости от дозы Золотого Масла. Что эти результаты соответствовали иным факторам, чем клеточная токсичность, выяснялось путем наблюдения, что клетки, подверженные воздействию разбавленного 1:100 и 1:1000 Золотого Масла, в течение 10 мин вырабатывали 85% и 94% клеточной жизнеспособности соответственно. Жизнеспособность определялась методом исключения голубого трипана, как известно специалистам в этой области.
HPLC фракции Красного Масла
Красное Масло было разделено с помощью жидкостной хромотографии высокого давления на 18 отдельных фракций в колонне Е. Мерк Си 60, 5 мm, 250×4,6 мм с линейным градиентом, в течение 30 минут от 100% гексана до 30% изопропанола. Поток был 2.0 мл/мин. Никакие фракции не были собраны в первые две минуты. Впоследствии фракции были собраны с двухминутными интервалами. Все изолированные фракции были направлены на испытания, чтобы определить активность в подавлении проводящих путей 5-липоксигеназы в человеческих нейтрофилах, как описано в предыдущих разделах. Было обнаружено, что 7-я и 8-я фракции, которые были собраны в интервале между 14-й и 18-й минутами, были активны в подавлении лейкотриена B4, 6-транс-лейкотриена B4 и 6-транс-12-эпилейкотриена B4 и 5-НЕТЕ (5(S)-гидрокси-(Е,Z,Z,Z)-6,8.11,14-эйкозатетраэноидная кислота).
Исследование 12-НЕТЕ
Красное Масло и Золотое Масло были исследованы с помощью метода, подобного исследованию 5-липоксигеназы, используя человеческие тромбоциты. Полиморфоядерные лейкоциты были смешаны, проверены на иммунность с помощью A23187, и производство 12-НЕТЕ измерено с помощью жидкостной хромотографии высокого давления (НРLC).
Добавление Красного Масла, разбавленного 1:10,000, в реакции выдавало значение 12-НЕТЕ уровней, которые составляли 65% контрольного метанола, тогда как 1:1000 Золотое Масло давало значение уровней, которые составляли 46% контрольного.
Дегрануляция тучных клеток
Детеныш самец Балб/С мыши был обработан Золотым Маслом, растворенным в гексане за 24 часа. 12 часов и 5 минут до вызова поражения. Уши были обработаны 20 мл 10% кротонового масла в ацетоне, нанесенного на обе стороны ушной раковины (8-миллиметровая пункция биопсии была взята из каждого уха 6 часов спустя после вызова поражения), взвешены и законсервированы в формалине для гистологических анализов. Три 5-микронных слоя были удалены в первом - третьем интервалах через внедренную в парафин биопсию и окрашивались голубым толуидином, который является особенностью гранул, содержащих гистамин. Средняя секция так же, как и те, что показали дегрануляцию, была подсчитана. Результаты приведены в табл.3.
Уши были обработаны для профилактики за 24 часа плюс дважды после обработки для вызова поражения, как описано. Данные даются как средний (+/-стандартная ошибка усреднения; n=4 уха) процент дегрануляции тучных клеток.
Исследование пролиферации лимфоцитов
Влияние Золотого Масла и Красного Масла на пролиферацию лимфацитов оценивалось с помощью исследования поглощения тритированного (3H)-тимидина. Периферийная кровь была взята венепункцией от некоего добровольного донора человека или от овцы, и одноядерные клетки периферийной крови (РВМNС) были выделены из красных кровяных клеток и гранулоцитов путем центрифугирования в градиенте плотности Фиколла. После центрифугирования РВМNС были аспирированы, промыты в РМS и вновь подвешены в среде RРМI, содержащей 10% эмбриональной сыворотки теленка (FCS) и 2 мМ глутамина). PBMNC были приведены к плотности 2×106/мл, и 100 мл кратности (2×105 клеток) были накапаны из пипетки в резервуары из 96 резервуарных круглодонных тарелок. Каждая экспериментальная группа состояла из 5 одинаковых резервуаров. Клетки выращивались в течение 24 часов в присутствии Золотого Масла или Красного Масла в диапазоне разбавлений.
Разбавление масел было произведено следующим образом: суспензия мицелла масел была сделана в чистом этиловом спирте с концентрацией 5% по объему. Этот 5% раствор масла в дальнейшем был разбавлен в RРМI среде, содержащей 10% FСS, чтобы создать диапазон разбавлений (0.0062, 0.0125, 0.025, 0.05, 0.1% по объему). Каждая ступень разбавления была сильно перемешана для поддержания масла в суспензии.
В контрольных резервуарах клетки выращивались без масла. После 24 часов выращивания 1 mКu 3H-тимидина было добавлено в каждый резервуар, содержащий лимфоциты, и выращивались далее 18 часов, чтобы произошло внедрение 3Н-тимидина в повторную DNА лимфоцитов. Клетки были собраны из 96 резервуарных тарелок на стекловолоконный фильтр, который улавливает радиоактивно помеченные DNА. Содержащиеся в фильтре собранные клетки были затем подсчитаны для определения 3Н с помощью сцинтилляционного счетчика, как в стандартных процедурах, известных специалистам в этой области.
Кроме того, митоген Конканавалин А (Соn А) был добавлен к лимфоцитам в концентрации 10 мg/mL. Влияние масел на митогенную стимуляцию было оценено с помощью совместного содержания масел и Соn А. Конканавалин А является лектином, полученным от Canavalia ensiformis (Джек Биэн), который имеет родство с альфа-D-маннозила и альфа-D-глюкозила остатками. Соn А проявляет митогенную активность, которая зависит и нуждается в ионах кальция и/ или магния.
Результаты и выводы
Необработанный PВМNС препарат показал низкую базисную линию внедрения 3H-тимидина.
Затем PBMNC были стимулированы Соn А, и эти клетки демонстрировали увеличенную пролиферацию, как показало увеличение поглощения 3H-тимидина по сравнению со значением их базовой линии. Затем каждое из двух. Золотое Масло или Красное Масло содержалось вместе с Сon А - это была соблюдаемая дозируемая реакция подавления пролиферации, как показало снижение включений 3H-тимидина в PBMNC. Пролиферация (Cоn А стимулированных человеческих РВМNC была подавлена от 71 до 12% Золотым Маслом в диапазоне разбавлений от 0,1 до 0,025%, и пролиферация РВМNС овцы была подавлена от 100 до 57% в этом диапазоне разбавлении. Эффект подавления при использовании Красного Масла был подобен наблюдаемому при использовании Золотого Масла. Красное Масло производило подавление 85% при разбавлении 0.1% в человеческих РВМNС, и в РВМNС овцы показало подавление 95% при 0.1% разбавлении, и 56% подавления при 0.05% разбавлении.
Смешанная реакция лимфоцитов с Красным Маслом
Смешанная реакция лимфоцитов (МLК) является лабораторным исследованием пролиферации лимфоцитов, вызванной аллореактивностью лимфоцитов от двух несвязанных индивидуумов. Эта пролиферативная реакция измеряется поглощением тритированного тимидина. По существу, в МLК. имеющие антиген клетки (АРС) от первого индивидуума отдают аллопептиды через МНС молекулы рецепторам Т-клеток в Т-клетки второго индивидуума. Эта реакция называется Сигнал 1. После Сигнала 1 совместное возбуждение вызывалось (Сигнал 2) взаимодействием клеточного сцепления молекул между Т-клеткой и АРС {например, СD28-В7), которое приводит к T-клеточной активности и пролиферации.
МLR является лабораторным изображением аллореактивности, которая получается в результате болезни отторжения пересаженной ткани (неприятие трансплантации костного мозга) и болезни неприятия пересаженных тканей (отторжение трансплантированного органа). Эти исследования широко используются клинически для предсказания аллореактивности, а также экспериментального отбора потенциально иммуноподавляющих веществ. Красное Масло сравнивалось с Циклоспорином А, который теперь используется повсеместно как иммуноподавляющее вещество.
Методика проведения МLR с Красным Маслом
МLR, использующая клетки от двух несвязанных доноров, может быть изучена на основе того, что две клеточные популяции реагируют одновременно друг на друга (то есть два способа MLR).
Периферийная кровь была взята венепункцией от двух независимых добровольцев (людей), и одноядерные клетки (РВМNC) периферийной крови были выделены из красных кровяных клеток и гранулоцитов с помощью центрифугирования в градиенте плотности Фиколла. После центрифугирования, PBMNC были аспирированы, промыты в РВS и вновь подвешены в RРМI, содержащей 10% человеческих АВ сывороток и 2 mM глутамина. Три МLR были проведены с РВМNC, полученными от трех пар независимых индивидуумов, и было обнаружено, что они статистически подобны друг другу.
Типичный эксперимент: РВМNC от двух независимых индивидуумов были приведены к плотности 2×106 клеток/ml, и 50 mL кратности (то есть 1×105 клеток) каждого были смешаны в резервуарах из 96 резервуарных круглодонных тарелок. Каждая экспериментальная группа состояла из 5 одинаковых резервуаров. Клетки содержались в присутствии одного из двух: Циклоспорина A или Красного Масла в диапазоне разбавлений. Разбавления были приготовлены следующим образом: суспензия мицелла Красного Масла была сделана в чистом этиловом спирте с концентрацией 5% по объему. Этот 5% раствор масла в дальнейшем был разбавлен в RРМI среде, содержащей 10% человеческой АВ сыворотки, чтобы создать диапазон разбавлений (0.0062, 0.0125, 0.025, 0.05. 0.01% по объему). Каждая ступень разбавления была сильно перемешана для поддержания масла в суспензии.
В контрольных (необработанных) резервуарах клетки выращивались без каких-либо веществ. После 96 часов инкубации при 1 mКu 3H-тимидина было добавлено в каждый резервуар, содержащий смешанные лимфоциты, и выращивались далее 18 часов, чтобы произошло проникновение 3H-тимидина в повторную DNА лимфоцитов. Клетки были собраны из 96 резервуарных тарелок на стекловолоконный фильтр, который улавливает радиоактивно помеченные DNА. Содержащиеся в фильтре собранные клетки были затем подсчитаны для определения 3Н с помощью сцинтилляционного счетчика.
Результаты МLR с Красным Маслом
Необработанный препарат МLR показал высокую базовую линию внедрения 3H-тимидина, указывающую на аллореактивность между двумя независимыми популяциями лимфоцитов.
В присутствии Циклоспорина А в обеих концентрациях 10 нанограмм на mL и 500 нанограмм на mL уменьшалась пролиферация, как показало пониженное внедрение 3H-гимидина. Величина подавления выражалась в процентах необработанной МLR. Подавление Циклоспорином А MLR находилось в диапазоне 37-75% при концентрации 100 ng/mL и 81-90% при концентрации 50 ng/mL. Это согласуется с известными иммуноподавляющими свойствами Циклоспорина А. Циклоспорин Л взаимодействует с иммунофилинами и предотвращает ядерное перемещение копирующего фактора NF-AТ, который является важным для перемещения интерлейки-на-2 (IL-2. фактора роста T-клетки).
Красное Масло также показало подавление МLR в зависимости от доз, как показало понижение внедрения 3H-тимидина. При разбавлении 0,025% подавление МLR находилось в диапазоне 40-52% в трех выполненных исследованиях, и при разбавлении 0,05% подавление было 82-98%. Определение клеточной жизнеспособности с помощью исключения голубого трипана, известного специалистам, показало, что разбавление в диапазоне между 0,025% и 0,05% имело клеточную жизнеспособность между 70-99%, и показало потенциальное отсутствие токсичности Красного Масла в этих разбавлениях. Разбавление Красного Масла 0,1% показало уменьшение клеточной жизнеспособности.
Вещества, проявившие иммуноподавляющие свойства, как показали эти исследования, используются в терапевтических целях. Объектом настоящего изобретения является то, что Красное Масло и Золотое Масло включаются в косметические соединения, имеющие иммуномодулирующие свойства. Иммуномодулирующие соединения могут быть иммуностимуляторами для укрепления иммунитета, или быть лекарствами для лечения определенных заболеваний и расстройств. И наоборот, иммуностимуляторы могут сдерживать или подавлять иммунитет для предотвращения нежелательных иммунореакций тела на инородные материалы, предотвращать или улучшать автоиммунные реакции и заболевания.
Иммуномодуляторы, как обнаружено, полезны для использования при лечении соматических автоиммунных заболеваний, таких как эритематозная волчанка и диабеты, а также при иммунодефиците. В дальнейшем иммуномодуляторы могут быть полезны для иммунотерапии рака или для предотвращения отторжения чужих органов или других тканей при трансплантации, например, почки, легкого, сердца или костного мозга (Гровер и др., 1977).
Были открыты различные иммуномодулирующие соединения, включая FK506, производные мурамиловой кислоты дипептида, левамизол, ниридазол, оксизуран, флагил и другие из группы интерферонов, интерлейкинов, лейкотриенов, кортикостероидов и циклоспоринов. Многие из этих соединений имеют нежелательные побочные эффекты и /или высоко токсичны. Поэтому новые иммуномодулирующие соединения нужны, чтобы обеспечить более широкий диапазон иммуномодулирующих функций для специфических областей с минимальными нежелательными побочными эффектами (Ишида и др., 1997).
Таким образом, иммуномодуляция является очень важной для человека; ее измерению, необходимым дополнительным методам и составам иммуномодуляции были посвящены большие научные исследования.
Настоящее изобретение имеет объектом использование масла из морских огурцов как источника материалов и добавок, получаемых посредством специальных способов производства по мере их освоения.
Настоящее изобретение вносит дополнение во множество иммуномодулирующих соединений, открывая новые полезные иммуномодуляторы, включая соединения, выделенные из экстрактов морского огурца некоторых видов.
Кроме того, дополнительный объект этого изобретения имеет отношение к иммуноподавляющему использованию Красного Масла и Золотого Масла, выделенных из тканей морского огурца, и различным производным и аналогам этих соединений. Эти соединения могут быть использованы для уменьшения, подавления или предотвращения невидимых иммунных реакций. Очень важно, что это иммуноподавление может быть достигнуто без цитотоксичности. Кроме того, эти соединения полезны при лечении людей или животных, нуждающихся в иммуноподавлении. Примеры подобных ситуаций включают, но не ограничиваются, лечение или предотвращение автоиммунных заболеваний, таких как диабеты, волчанка, ревматоидные артриты. Иммуноподавление часто необходимо в сочетании с трансплантацией органа.
Иммуноподавляющие вещества могут также быть использованы, когда человек или животное были или могут быть подвержены действию суперагентов или другим факторам, приводящим к сверхстимуляции иммунной системы. Соединения настоящего изобретения также полезны как стандарты для определения активности других предполагаемых иммуноподавляющих веществ. Объект изобретения в дальнейшем имеет отношение к фармацевтическим смесям, содержащим эти соединения.
Возникновение иммунных реакций (in vivo/in vitro) требует модуляции путем воздействия на активность T-клеток. Один аспект субъекта изобретения имеет отношение к человеческому in vivo пресечению реакции T-клеток, в том числе трансплантации и автоиммунной реакции. Поскольку циклоспорин повсеместно использовался в медицинских целях для подавления псориазов, объектом настоящего изобретения является включение Красного Масла или Золотого Масла в мази для местного применения с целью модуляции иммунных реакций в коже пациентов, больных псориазом. Важные сведения, полученные в данном изобретении, будут полезны пациентам, больным псориазом, как описано в других разделах этого изобретения, а также могут быть эффективны в локализованном дерматическом иммуноподавлении T-клеток и /или B-клеток у пациентов.
Дозы назначения будут зависеть от желаемой реакции иммуномодулирования, от типа носителя болезни, его возраста, веса. сопутствующих заболеваний и тому подобное, частоты лечения, терапевтических соотношений и подобных соображений. Таким образом, уровни назначенных ежедневных доз активных ингридиентов могут быть, например: кожные - от 1 до примерно 500 мг/кг: оральные - от 0,01 до 200 мг/кг; в нос - от 0,01 до примерно 100 мг/кг; и аэрозоли - от 0,01 до примерно 50 мг/кг веса тела человека или млекопитающего.
Выраженный в терминах концентрации активный ингредиент изобретения может быть включен в новые смеси для локализованного использования через кожу, в носу, в бронхах, внутримышечно, внутривенно, внутривагинально или орально в концентрации от примерно 0.01 до примерно 50% w/w смеси и особенно от около 0,1 до примерно 30% w/w смеси.
Полезные соединения, согласно предмету изобретения, могут извлекаться с помощью различных технологий, описанных в изобретении. Для специалиста в данной области несомненно, что примеры используемых материалов и реактивов являются коммерчески доступными из известных источников, например на предприятиях с запасами химических веществ. Здесь представлены достаточно полные сведения о включении упомянутых масел в различные капсулы, мази, лосьоны, мыла и шампуни.
Возможные изменения
Рамки данного изобретения не ограничиваются специфическими примерами и предлагаемыми процедурами и использованием, поскольку возможны изменения, которые могут быть произведены специалистами внутри границ данного изобретения, базирующиеся на основной информации, обеспеченной данным описанием.
Оральное назначение
Красное и Золотое Масла, описанные здесь, могут производиться в виде мягких желеобразных капсул, аналоги которых хорошо известны в пищевой промышленности. Масла настоящего изобретения стабилизируются с помощью известных в промышленности смешанных токоферолов. Золотое Масло, произведенное посредством сухой экстракции гексаном из стабилизированного материала внутренностей морского огурца Cucumaria frondosa, было дегуммировано известными специалистам способами и затем стабилизировано добавлением 1% смешанных токоферолов (COVI-OX-T70 из Хенкель Корпорэйшн, Пенсильвания, США) для предотвращения окисления. Было произведено приблизительно 1000 штук 500 мг мягких желеобразных капсул Красного Масла. Золотое Масло, выделенное как здесь описано из Красного Масла, было также произведено в виде мягких желеобразных капсул для экспериментального применения.
Золотое Масло и Красное Масло также было подмешано в апельсиновый сок 1:5 (v/v) с добавлением лецитина для повышения растворимости липидов в водяных фазах апельсинового сока.
Местное назначение
Золотое Масло и Красное Масло настоящего изобретения формируются в следующие формы, которые служат примером некоторых форм, в которых могут быть использованы антипсориазные вещества.
Пример А
Ингредиент мг
Активное соединение 1-20
Бензиновый спирт, NF 20,0
Миндальное или другое масло 30,0
Медицинский вазелин, USP Довести вес ингредиентов до 1.0 г в итоге
Способ производства: Масляные ингредиенты медленно, помешивая или взбалтывая соединить со спиртовыми ингредиентами при 140°F.
Пример В
Крем
Ингредиент мг
Активный компонент 1,0-20,0
Стеариновая кислота, USP 60,0
Глицерин Моностеарат 100,0
Пропилен гликоль, USP 50,0
Полиэтилен Сорбитан
Монопальмитат 50,0
Сорбита раствор, USP 30,0
Бензиловый спирт, NF 10,0
Очищенная вода Довести вес
ингредиентов до
1,0 г в итоге.
Способ производства: нагреть стеариновую кислоту, глицерин моностеарат и полиэтилен сорбитан монопальмитат до 70°С. В отдельном резервуаре растворить раствор сорбита, бензиловый спирт, воду и половину количества пропилен гликоля и нагреть до 70°С. При высокой скорости помешивания добавить водяную фазу в масляную фазу.
Растворить активный компонент в оставшемся количестве пропилен гликоля и добавить к упомянутой эмульсии, когда температура эмульсии станет 37-40°C. Смешать до однородного состояния и охладить до комнатной температуры.
Пример С
Ингалянт для носа
При назначении ингаляций в рот или нос в качестве растворителя могут быть использованы известные инертные жидкости, такие как пропилен гликоль. Ингаляции также могут быть назначены из аэрозольного ингалятора с известными газами-вытеснителями, такими как трихлорофлюрометан и дихлородифлюорометан, с оптимальным нанесением рассеиваемых веществ, как известно специалистам в этой области.
Пример D
Гель
Ингредиент мг
Активное соединение 1,0-20,0
Пропилен гликоль, USP 300,0
Бутилированный гидрокситолиен 5,0
Карбомер 940 5,0
Гидроксид натрия (добавленный как 1%
по весу раствора в пропилен гликоль) 0,7
Полиэтиленгликоль 400, USP Довести вес
ингредиентов до
1,0 г в итоге.
Способ приготовления: сделать 1% раствор гидроксида натрия в пропилен гликоле. Добавить приблизительно половину требуемого пропилен гликоля и полиэтилен гликоля 400 в подходящий сосуд и смешать. Растворить бутилированный гидрокситолиен в этой смеси. Рассеять карбомер 940 в упомянутой смеси, при этом сильно взбалтывая ее. Добавить раствор гидроксида натрия путем высокоскоростного взбалтывания, для приведения рН к значению 7 и перемешивать до тех пор, пока не примет вид густого геля. Растворить активное соединение в оставшемся пропилен гликоле и добавить медленно в гель, который непрерывно перемешивается.
Пример Е
Лосьон
Ингредиент мг
Активное соединение 1,0-20,0
Карбомер 940 3,0
Гидроксид натрия
(используемый как 4% по
весу водный раствор) 0,05
Изопропиловый спирт 40,0
Очищенная вода Довести вес
Ингредиентов
до 1,0 г в итоге
Способ приготовления: сделать 4% раствор гидроксида натрия в воде. Нагреть очищенную воду до 60°С. Добавить карбомер 940 и смешать с большой скоростью до рассеивания. Остудить упомянутую выше микстуру до комнатной температуры и медленно добавить раствор гидроксида натрия до однородного состояния. Добавить 80% изопропилового спирта в упомянутое с перемешиванием. Растворить активное соединение в оставшемся изопропиловом спирте. Добавить это в микстуру при перемешивании. Если необходимо, довести pH до 5,0-5,5 гидроксидом натрия.
Пример F
Комбинация травяного отвара с антипсориазным кремом
Ингредиенты Проценты
Активный компонент 1,20
Концентрат зеленого чая 1-5
Boswellia serrata экстракт 1-10
Силимарин 1-10
Фукозилированный хондроитин
сульфат 1-20
Пчелиный воск 1-40
Куркумовое масло 1-10
Occimum sanctum масло 1-10
Экстракт имбирного спирта 1-10
Вода 1-30
DMSO 1-5
Масло Эму 1-30
Масло чайного дерева 1-5
Способ приготовления.
Объектом настоящего изобретения является обеспечение основы формулы, в которой полезные вещества комбинируются так, чтобы взаимно усилить их действие, которое направлено на лечение псориаза. Хорошо известно, что заболевание псориазом вызывается посредниками воспаления. Ангиогенезис является компонентом этого заболевания, наряду с проводящими путями 12, 15- и 5-липоскигеназы. Дополнительная активность является также посредником этого заболевания.
Изобретателями было показано, что целебная мазь, включающая Красное или Золотое Масло как вещества, подавляющие липоксигеназу; фукозилированный хондроитин сульфат, как дополнительный подавляющий ангиогенезис компонент: экстракт Boswellia serrata, как дополнительное подавляющее вещество, и экстракт зеленого чая, как дерматический антиоксидант, и подавляющее вещество орнитина декарбоксилазы в матрице восковых носителей и другие травяные препараты обеспечивают эффективную местную терапию при псориазе. Имбирный экстракт является ингибитором орнитина декарбоксилазы - посредника воспаления при псориазе. Различные проценты этих веществ могут комбинироваться с эмульгирующими и другими веществами, делающими их подходящими для местного применения. Проценты активных веществ могут изменяться в зависимости от особенностей пациента и величины силы различных симптомов. Другими словами, пациент с множеством сосудистых новообразований может нуждаться больше в фукозилированном хондроитин сульфате, чем пациент, чьи псориазные бляшки представляют увеличенную активность проводящих путей липоксигеназы. Думается, что клинически квалифицированный специалист в определении проводящих путей, включающих псориазные бляшки, будет способен составить подходящую комбинацию веществ, перечисленных в примере Е. К примеру, сыворотка от псориазных пациентов может быть исследована для определения активности проводящих путей липоксигеназы в локальных прыщевых очагах и дополнительном каскаде активации С5а и С3а в поражениях прыщами в этой области. Механизм, основанный на целеуказании псориазных симптомов, может быть достигнут квалифицированными в этой области клиницистами и фармацевтами. Здесь дано достаточно полное описание необходимых ингредиентов, а другие вещества - носители, смягчающие вещества и подобные им, не обязательны.
Пример G
Шести псориазным пациентам в возрасте от 34 до 67 лет, имеющим различные формы и проявления заболевания на время назначения, была дана местная мазь примера F и было предложено пользоваться ею самостоятельно в течение месяца, а потом врач давал свою субъективную оценку терапевтическому эффекту мази. Пять из шести пациентов сообщили об огромном улучшении или о полной ремиссии их псориазных симптомов.
Трем собакам неизвестной породы, страдающим атопическими дерматитами и "ожоговыми пятнами" на туловище и спинно-хвостовых областях, их хозяевами неконтролируемым образом ad libidum в течение 6 недель была использована для местного применения мазь примера F. Владельцы всех трех собак доложили о полном устранении симптомов у их животных и прекращении расцарапывания и искусывания областей, подверженных заболеванию.
Десяти мужчинам и женщине в возрасте от 46 до 81 года, страдающим от ревматоидного артрита и обратившимся в клинику, было дано для орального применения Красное Масло приблизительно 2,000 миллиграмм в день на человека в течение 3 месяцев. Восемь человек сообщили о "динамике улучшения" их болезненных симптомов и увеличении диапазона движения их рук и ног. Женщина 81 года сообщила о полном прекращении боли в плечах и запястьях. Три женщины в возрасте от 50 до 56 лет производили самостоятельное лечение местным соединением, включающим Красное Масло 9,5% от веса, ментол, диметил сульфоксид (DMSO), масло эму, масло wintergreen, спирт и оливковое масло для тестированного исследования болеутоляющей возможности Красного Масла как местного растирания при контрольной формуле боли. После четырех дней применения на болезненных плече, пальце или колене два участника рассказывали о впечатляющей пользе, и один мужчина говорил об умеренной пользе.
Четырем мужчинам, обратившимся с остеоартритами, были назначены по 1,500 миллиграмма Золотого Масла два раза в день в растворе апельсинового сока в течение 2 месяцев. Все четверо сообщили о большой пользе от применения средства, и трое из них утверждали о впечатляющем уменьшении болей и увеличении подвижности.
19-летней лошади неизвестной породы, страдающей от связанной с артритом хромоты правой передней ноги, лечили колено гелем, содержащим 20% Красного Масла и подобным по составу здесь описанному примеру D. В течение двух недель делались ежедневные перевязки с нанесением каждый раз геля вокруг ноги. В конце второй недели владелец лошади сообщил об увеличении диапазона подвижности и об уменьшении хромоты лошади.
Собаке с диагностированной ветеринаром волчанкой давали 1.000 миллиграммов Красного Масла в день в течение шести месяцев, подмешивая его в пищу. Во время курса лечения заболевание пошло на убыль и владелец собаки смог увеличить дозу лекарства для животного до 1/10 от прежнего уровня.
Двум пациентам, страдающим от изжоги (воспаление пищевода), было назначено Золотое Масло в эмульсии с лецитином, соком и сахаром орально в количестве 2.000 миллиграмм Золотого Масла в день с соком. Они констатировали уменьшение симптомов в течение двух минут.
Женщина 22 лет, страдающая астмой, подмешивала в пищу 1.000 мг Красного Масла в день в течение 2,5 месяцев. На протяжении этого срока она сообщала об уменьшении потребности в ингаляциях ее обычных медикаментозных средств и других субъективных признаках улучшения состояния.
Трем юношам с различными поражениями в виде вульгарных прыщей на лицах было назначено Красное Масло в количестве 1.000 мг в день, смешанное с апельсиновым соком и лецитином, в течение 1 месяца. Все они докладывали о субъективном улучшении состояния от применения Красного Масла, выразившемся в уменьшении высыпаний.
Антираковые исследования
Красное Масло и Золотое Масло и различные фракции тонкослойной хромотографии были исследованы in vitro на влияние на человеческие раковые клеточные слои. Вещества были сначала растворены в диметил сульфоксиде и затем разбавлены в среде культурной ткани. Кратные 23 мg/mL были затем применены к РС3 (простаты человека), МСF7 (грудная аденокарцинома), НТ29 (аденокарцинома толстой кишки человека) или ВRО (меланома человека) клеточным слоям.
Эти фракции вызывали подавление клеточного роста по сравнению с необработанными контрольными клетками как оценивалось после 72 часов с помощью метода MTT окрашивания жизнеспособных, который обычно использовался специалистами в этой области. Во всех клеточных слоях Красное Масло и различные фракции были способны подавлять клеточный рост в концентрации, зависящей от метода подавления. Подобная фракция, извлеченная из липидной фазы морского огурца методом Финдлая и др. (1983b), пластохроманол 8, рассматривалась перспективной для значений 20-25 мg/mL, определяемых как значения IC50 (как концентрация, подавляющая 50% клеточного роста). Пластохроманол 8 был также изучен в описанных выше исследованиях 5-липоксигеназы и показывал большое подавление 5-липоксигеназы, LTB4 и различных изомеров энзима. Пластохроманол 8 также подавлял проводящие пути 12-липоксигеназы в человеческих тромбоцитах.
Данные о пластохроманоле 8
В исследовании активности лейкотриена, показавшего влияние пластохроманола 8 на синтез лейкотриена в человеческих нейтрофилах, выраженный в процентах от контрольного метанола, с помощью метода Бетта (1997), пластохроманол 8 подавлял активность 5-НЕТЕ приблизительно на 60%, LTB4 приблизительно на 40%, и двух 6-транс изомеров LТВ4 (6-транс-лейкотриен В4 и 6-транс-эпилейкотриен В4) на 75%.
В описанном исследовании влияния пластохроманола 8 на синтез лейкотриена, выраженный как синтез лейкотриена через 106 PMN, пластохроманол 8 подавлял производство 5-НЕТЕ приблизительно на 75%, LTB4 на 50%, и двух транс-6 изомеров LTB4 приблизительно на 80%. В подобных исследованиях с человеческими тромбоцитами пластохроманол 8 подавлял синтез 12-НЕТЕ приблизительно на 80%.
Таким образом, изобретение было раскрыто в этой патентной заявке лицами, дающими детальные рекомендации и подробные воплощения изобретения, также было дано понять, что раскрытие является в некотором смысле ограниченным и преимущественно иллюстративным, и что специалисты в данной области могут легко предложить некие несущественные изменения, подпадающие под это изобретение и его формулу.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ ЭКСТРАКЦИИ ЛИПИДОВ (ВАРИАНТЫ), ЭКСТРАКТ ЛИПИДОВ КРИЛЯ И ПОЛНАЯ ЛИПИДНАЯ ФРАКЦИЯ (ВАРИАНТЫ) | 1999 |
|
RU2236441C2 |
| СПОСОБ МОДУЛИРОВАНИЯ МЕТАБОЛИЗМА ЭЙКОЗАНОИДОВ | 2006 |
|
RU2438684C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРОНДОЗИДА А И СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ МЛЕКОПИТАЮЩИХ | 2005 |
|
RU2339644C2 |
| АНАЛОГИ ХИНОЛОНА | 2005 |
|
RU2349586C2 |
| СПОСОБ ПЕРЕРАБОТКИ ДАЛЬНЕВОСТОЧНОЙ КУКУМАРИИ Cucumaria japonica И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ ПРОДУКТ, ПОЛУЧАЕМЫЙ ЭТИМ СПОСОБОМ | 2009 |
|
RU2426453C1 |
| НОВЫЕ СИНЕРГИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ АРОМАТИЧЕСКИЕ СОЕДИНЕНИЯ И ТЕРПЕНОИДЫ, ПРИСУТСТВУЮЩИЕ В ALPINIA GALANGA | 1999 |
|
RU2252771C2 |
| ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ СРЕДСТВО | 2014 |
|
RU2667644C2 |
| Фармацевтические композиции, содержащие карбамоилоксиарилалканоиларилпиперазиновое соединение | 2011 |
|
RU2630619C2 |
| СМЕСЬ ДЛЯ ДЕТЕЙ ПЕРВЫХ МЕСЯЦЕВ ЖИЗНИ ИЛИ СТАРШЕ | 2004 |
|
RU2346448C2 |
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГАММА-L-ГЛУТАМИЛГИСТАМИНА, ПРИМЕНЕНИЕ ГАММА-L-ГЛУТАМИЛГИСТАМИНА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ | 1997 |
|
RU2141968C1 |
Изобретение описывает широкую область лекарственных средств и методов подавления некоторых болезненных состояний, связанных с большой медицинской областью человеческой и ветеринарной фармакологии, где активизация проводящих путей липоксигеназы способствует патологическому состоянию. Настоящее изобретение касается новых липидов, получаемых из класса Холофуридия (Holothuridia) или морского огурца, и особенно из его разновидности Кукумария фрондоза (Cucumaria frondosa). Новые липиды, извлекаемые из некоторых классов или видов морского огурца, подавляют ферменты липоксигеназы и/или связывают рецепторы лейкотриена. Масла некоторых видов таких морских огурцов могут быть использованы для пигментации морских видов животных путем включения в состав пищи, а также для лечения болезней и облегчения течения болезней, при которых продукты активности фермента липоксигеназы или реакция лейкотриенов ухудшают патологическое состояние. Технический результат: способы применения и композиции веществ обеспечивают лечение воспалительных, автоиммунных и других заболеваний путем назначения липидных фракций из ткани морского огурца. 18 н. и 25 з.п. ф-лы, 9 ил.
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПРОДУКТОВ ИЗ ГОЛОТУРИИ | 1995 |
|
RU2112527C1 |
| SU 1573578 А1, 27.03.1996 | |||
| Способ получения комплекса фосфолипидов | 1983 |
|
SU1175486A1 |
| Устройство для имитации искажений телеграфных сигналов | 1975 |
|
SU567216A1 |
| US 5770205 А, 23.06.1998 | |||
| ТИМИНДИС Е.В | |||
| и др | |||
| Дальневосточные голотурии и асцидии как ценное пищевое сырье | |||
| - Изд | |||
| Дальневосточного университета, 1983. | |||
