СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТОВ Clrs ПЕРВОГО КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2004 года по МПК G01N33/573 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Субкомпоненты С1r и C1s, синтезируемые в организме в равных количествах и представляющие собой зимогены протеиназ, образуют прочный Са-зависимый тетрамерный комплекс Clr₂s₂, связанный с субкомпонентом C1q также Са-зависимым образом и формирующий с ним компонент С1. При связывании С1 с иммунным комплексом происходит активация протеиназ С1r и C1s. Активация этих ферментов - существенный этап инициации каскада активации комплемента по классическому пути, поэтому их функциональный дефицит может быть причиной различного рода патологических состояний организма.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее, наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. На уровне техники не известны источники информации, касающиеся определения функциональной активности комплекса С1r₂s₂ субкомпонентов комплемента, пригодные для клинической практики до настоящего времени не известны.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность комплекса С1r₂s₂ системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета иммуноглобулина G, затем внесения в лунки микропланшета сыворотки морской свинки в присутствии этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) для связывания ионов кальция и сорбции на иммуноглобулине субкомпонента C1q. После освобождения лунок микропланшета от жидкости и их промывки в лунки вносят буферный раствор с ионами кальция, анализируемые пробы, содержащие комплекс С1r₂s₂ с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при рН 5,5) в качестве источника компонента С4. При проведении инкубации для активации комплемента происходит ковалентное связывание С4b на сорбированном иммуноглобулине в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого комплекса C1r₂s₂. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С4 -фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного комплекса C1r₂s₂ активировать С4 с образованием С4b, количество которого определяется по его количеству, связавшемуся в лунках. Тем самым достигается определение функциональной активности С1r₂s₂ иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности комплекса Clr₂s₂ комплемента человека, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов.

Пример. Определение функциональной активности препарата С1r₂s₂

Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, рН 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4 (VBSE), содержащим 0,15 М NaCl, 50 мМ динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора VBSE и 15 мкл сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С и отмывки вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺), в лунки планшета вносят по 100 мкл раствора VBS²⁺, содержащего 15 мкл псевдоглобулиновой фракции сыворотки человека (супернатант после осаждения эуглобулинов сыворотки диализом против дистиллированной воды при рН 5,5) и анализируемую пробу, содержащую комплекс C1r₂s₂ с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъютата пероксидазы с антителами против компонента С4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерения светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата комплекса С1r₂s₂ рассчитывают по стандартной кривой. Этим методом проведено определение активности комплекса С1r₂s₂ в 6 образцах. Полученные результаты приведены в таблице.

Изобретение относится к области медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности факторов комплемента в сыворотке крови человека, и может быть использовано при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сущность изобретения состоит в том, что сорбируют неспецифический иммуноглобулин G, вносят раствор, содержащий сыворотку морской свинки и этилендиаминтетраацетат натрия, после инкубации и осушения планшета вносят анализируемую пробу, содержащую комплекс С1r₂s₂ комплемента человека с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки крови человека, буферный раствор, содержащий ионы кальция и магния, проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности комплекса С1r₂s₂ по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Техническим результатом является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность комплекса С1r₂s₂ комплемента человека. 1 табл.

Способ определения функциональной активности комплекса Сlr₂s₂ комплемента человека, характеризующийся тем, что в лунках микропланшета сорбируют неспецифический иммуноглобулин G, затем вносят раствор, содержащий сыворотку морской свинки и этилендиаминтетраацетат натрия, после инкубации и осушения планшета вносят анализируемую пробу, содержащую комплекс Сlr₂s₂ комплемента человека с неизвестной активностью, и псевдоглобулиновую фракцию сыворотки крови человека, получаемую диализом против дистиллированной воды, а также буферный раствор, содержащий ионы кальция и магния, проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности комплекса Сlr₂s₂ по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.