СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2005 года по МПК G01N33/573 

Описание патента на изобретение RU2253117C1

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Компонент С4 после его активации и активации компонента С2 образует прочный Mg-зависимый комплекс С4b2а, связанный с поверхностью, на которой происходит активация. Этот комплекс является ферментом - С3 конвертазой, которая активирует компонент С3, после чего последний необратимо связывается на той же поверхности в количествах, пропорциональных количеству активного С4 при избытке остальных компонентов комплемента (C1, C2 и С3). Имеющийся на сегодняшний день способ определения функциональной активности компонента С4 (изотип С4В) комплемента человека [1, 2] решает задачу определения активности С4 путем измерения количества связавшегося активированного С4 с помощью специфических антител против С4, ковалентно связанных с ферментом. Недостатком указанного способа являются трудности получения высококачественных антител к С4 и, вследствие этого, их конъюгаты с ферментом в тест-системе имеют высокие фоновые значения. В результате приходится определять активность С4 в тестируемых образцах, используя несколько точек с двукратными прогрессивными разведениями образцов и измерением тангенсов угла наклона соответствующих графиков раститровок.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа, позволяющего определять функциональную активность компонента С4 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода в одном разведении с использованием линейного калибровочного графика.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения, который предусматривает сорбцию в лунках микропланшета липополисахарида, затем определяемого С4 из растворов, его содержащих, в присутствии реагента R4, т.е. сыворотки крови человека, лишенной активности С4. Количество ковалентно связавшегося компонента С3 зависит от концентрации функционально активного определяемого компонента С4. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента С3 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С3 - фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Моноспецифические поликлональные антитела к С3 легко приготовляются и коммерчески доступны. Способ основан на способности функционально активного комплекса С4b2а активировать С3 с образованием С3b, количество которого определяется по его количеству, связавшемуся в лунках. Тем самым достигается определение функциональной активности С4 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека в одном разведении, обладающего хорошей воспроизводимостью результатов.

Пример. Определение функциональной активности препарата С4. Смешивают препарат липополисахарида - аптечный препарат пирогенал с 0,05 М натрий-карбонатным буфером, рН 9,5, с конечными концентрациями липополисахарида 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са2+ и 0,5 мМ Mg2+ (VBS++), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета вносят по 100 мкл раствора, содержащего тестируемый С4 в VBS++, и 5 мкл сыворотки крови человека, лишенной активности С4 (реагент R4 - продажный препарат Кировского НИИ гематологии и переливания крови). После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С3 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки тем же буфером и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл раствора 33′, 5,5′-тетраметилбензидина (ТМБ) в субстратном буфере. После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливали внесением в каждую лунку 50 мкл 4% серной кислоты. Результаты реакции учитывали с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата С4 рассчитывали по стандартной кривой. Результаты определения активности С4 приведены на чертеже.

Литература

1. Козлов Л.В., Скороходова Т.Г., Баталова Т.Н., Лахтин В.М., Матвеевская Н.С., Гузова В.А., Дьяков В.Л. Способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека. Патент РФ 2162601. Бюл. №3. 27.01.2001.

2. Козлов Л.В., Лахтин В.М., Скороходова Т.Г., Баталова Т.Н., Шойбонов Б.Б., Дьяков В.Л., Гузова В.А., Матвеевская Н.С. Изотипирование компонента С4 комплемента человека с использованием различий в функциональной активности// Биоорган. химия. 2000. Т. 26. №7. С. 539-547.

Похожие патенты RU2253117C1

название год авторы номер документа
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 2003
  • Козлов Л.В.
  • Лахтин М.В.
  • Лахтин В.М.
  • Дьяков В.Л.
RU2253118C1
СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 2008
  • Козлов Леонид Васильевич
  • Бичучер Анна Мироновна
  • Гора Наталья Вадимовна
RU2376606C1
СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С2 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 2009
  • Козлов Леонид Васильевич
  • Бичучер Анна Мироновна
  • Гора Наталья Вадимовна
RU2405042C1
СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 2012
  • Козлов Леонид Васильевич
  • Андина Светлана Семеновна
  • Ромащенко Инна Андреевна
RU2495432C1
СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С3 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА ПО АЛЬТЕРНАТИВНОМУ ПУТИ АКТИВАЦИИ 2008
  • Гора Наталья Вадимовна
  • Козлов Леонид Васильевич
RU2380707C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕФИЦИТОВ ИЗОТИПОВ С4А И С4В КОМПОНЕНТА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 1999
  • Козлов Л.В.
  • Скороходова Т.Г.
  • Баталова Т.Н.
  • Лахтин В.М.
  • Матвеевская Н.С.
  • Гузова В.А.
  • Дьяков В.Л.
RU2162604C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 1999
  • Козлов Л.В.
  • Скороходова Т.Г.
  • Баталова Т.Н.
  • Лахтин В.М.
  • Матвеевская Н.С.
  • Гузова В.А.
  • Дьяков В.Л.
RU2162601C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С3 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА ПО АЛЬТЕРНАТИВНОМУ ПУТИ АКТИВАЦИИ 2003
  • Козлов Л.В.
  • Романов С.В.
  • Дьяков В.Л.
  • Лахтин В.М.
RU2232992C1
СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ФАКТОРА В КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 2008
  • Гора Наталья Вадимовна
  • Козлов Леонид Васильевич
RU2374650C1
СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С3 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 2009
  • Козлов Леонид Васильевич
  • Бичучер Анна Мироновна
  • Гора Наталья Вадимовна
RU2417375C2

Реферат патента 2005 года СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к области медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Проводят сорбцию липополисахарида в лунках микропанели. Затем в лунки вносят анализируемую пробу, содержащую компонент С4 комплемента человека с неизвестной активностью, и реагент R4, т.е. сыворотку крови человека, лишенную активности С4, а также буферный раствор, содержащий ионы кальция и магния. Проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента. Проводят расчет активности компонента С4 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Способ позволяет провести определение функциональной активности компонента С4 комплемента человека в одном разведении и повысить точность ее определения. 1 ил.

Формула изобретения RU 2 253 117 C1

Способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, характеризующийся тем, что в лунках микропанели сорбируют липополисахарид, в лунки затем вносят анализируемую пробу, содержащую компонент С4 комплемента человека с неизвестной активностью, и реагент R4, т.е. сыворотку крови человека, лишенную активности С4, а также буферный раствор, содержащий ионы кальция и магния, проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С3 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет активности компонента С4 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2005 года RU2253117C1

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C4 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 1999
  • Козлов Л.В.
  • Скороходова Т.Г.
  • Баталова Т.Н.
  • Лахтин В.М.
  • Матвеевская Н.С.
  • Гузова В.А.
  • Дьяков В.Л.
RU2162601C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА C2 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА 2001
  • Козлов Л.В.
  • Романов С.В.
  • Дьяков В.Л.
  • Баталова Т.Н.
  • Лахтин В.М.
  • Гузова В.А.
RU2195670C1
СКОРОХОДОВА Т.Г
Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды 1921
  • Богач Б.И.
SU4A1
М., 1999, с.7
КОЗЛОВ Л.В
Регуляция системы комплемента человека и пути воздействия на систему: Автореф…докт.биол.наук
М., 1992, с.4-24
КОЗЛОВ Л.В
и др

RU 2 253 117 C1

Авторы

Козлов Л.В.

Лахтин М.В.

Лахтин В.М.

Дьяков В.Л.

Даты

2005-05-27Публикация

2003-12-09Подача