СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБКОМПОНЕНТА C1Q КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2000 года по МПК G01N33/544 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее наиболее информативной является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Что касается определения функциональной активности компонентов комплемента, то практически единственным является гемолитический метод [1], не отличающийся высокой степенью воспроизводимости и неохотно используемый клиницистами из-за трудностей, связанных с приготовлением гемолитической системы на основе эритроцитов барана.

Нами разработан способ, позволяющий определять функциональную активность субкомпонента Clq первого компонента системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода.

Способ осуществляется следующим образом: проводят последовательную сорбцию в лунках микропанели сначала иммуноглобулинов классов G или M, затем определяемого C1q из растворов, его содержащих. Количество сорбированного субкомпонента C1q определяют по продукту ферментативной реакции с помощью иммуноглобулинов, ковалентно связанных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного субкомпонента C1q специфически связываться с агрегированными иммуноглобулинами классов G и M сыворотки крови человека или животных.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата C1q.

Растворяют иммунохимически чистый IgG в 0,05 М натрий-карбонатным буфере, pH 9,5, в концентрации белка 10 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Три раза отмывают планшет забуференным физиологическим раствором с детергентом (твин), затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего C1q в забуференном физрастворе с детергентом, в виде прогрессивных двукратных разведений. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC, трехкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с иммунохимически чистым IgG в подобранном разведении забуференном физрастворе с детергентом. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и трехкратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 ил цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерения светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C1q рассчитывают по стандартной кривой.

Пример 2. Проведено определение активности Clq в двух образцах сыворотки крови человека согласно методу, описанному в примере 1, и стандартным гемолитическим методом [1]. Получены следующие резульатты: активность C1q в сыворотке N1 - по заявленному способу - 32 ± 10 гем.ед./мл, по гемолитическому методу - 32 ± 16 гем.ед./мл; активность C1q в сыворотке N2 - по заявленному способу - 224 ± 64 гем.ед./мл, по гемолизу - 256 ± 128 гем.ед./мл.

Пример 3. Определение функциональной активности C1q в сыворотке крови проводят аналогично примеру 1, только для сенсибилизации планшета используют иммунохимически чистый IgM, а в качестве конъюгата - конъюгат специфических анти-C1q антител с пероксидазой.

Литература
1. Kolb W.R., Kolb L.M., Podack E.R. Clq: isolation from human serum in high yield by affinity chromatography and development of a highly sensitive hemolytic assay. J. Immunol. 1979. V. 122. N 5. P. 2103 - 2111.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Сенсибилизируют микропанели неспецифическими иммуноглобулинами G и М человека или животных. Затем в лунки микропанели вносят последовательно раствор, содержащий субкомпонент C1q, конъюгат иммуноглобулинов с ферментом и субстрат этого фермента. После этого проводят количественное определение С1q по продукту ферментативной реакции. В частности, качестве конъюгата иммуноглобулинов с ферментом используют конъюгат с неспецифическими иммуноглобулинами G и М человека или животного, а именно конъюгат с иммуноглобулинами - антителами к С1q. Способ позволяет определить функциональную активность первого компонента системы комплемента на основе иммуноферментного анализа, прост, не требует дорогостоящего оборудования. 2 з.п.ф-лы.

1. Способ определения функциональной активности субкомпонента C1q комплемента человека, отличающийся тем, что сенсибилизируют микропанели неспецифическими иммуноглобулинами G и M человека или животных, в лунки микропанелей вносят последовательно раствор, содержащий субкомпонент C1q, конъюгат иммуноглобулинов с ферментом и субстрат этого фермента, после чего проводят количественное определение C1q по продукту ферментативной реакции. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют конъюгат с неспецифическими иммуноглобулинами G и M человека или животного. 3. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют конъюгат с иммуноглобулинами - антителами к C1q.