АПАТОГЕННЫЙ ШТАММ РИККЕТСИЙ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ПАТОГЕННЫХ И АПАТОГЕННЫХ РИККЕТСИЙ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/00 

Изобретение относится к микробиологии и касается штамма нового генотипа риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ).

Штамм риккетсий группы КПЛ “7/98-Караганда” хранится во Всероссийском музее риккетсиозных культур НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН под №7/98 - Караганда (справка о депонировании 67/01-09-159 от 12 августа 1999 г.).

Единственным известным апатогенным видом риккетсий группы КПЛ на территории России ранее считался вид R.slovaca. Однако в настоящее время доказана его способность вызывать синдром Tibola (Lacos, 1997).

Задача изобретения - оригинальный штамм “7/98-Караганда” рикетсий группы КПЛ “7/98- Караганда” нового генотипа RpA4.

Технический результат - использование штамма риккетсий группы КПЛ, представляющего риккетсий нового генотипа RpA4, характеризующего апатогенные риккетсий клещевого биотипа в Евразии, меняет представление о популяции риккетсий, циркулирующих в Евразии, и обусловливает необходимость изменения методических подходов к мониторингу природных очагов с различным уровнем заболеваемости клещевым риккетсиозом. Штамм “7/98-Караганда” в организме иксодовых клещей не вытесняется вирулентными штаммами R.sibirica, что доказывает возможность интерференции между патогенными и апатогенными вариантами риккетсий группы КПЛ, а также позволяет оценивать данный штамм как кандидата в вакцинные штаммы.

Штамм “7/98-Караганда” генотипа RpA4 (справка о депонировании 67/01-09-159 от 12 августа 1999 г.) выделен из иксодовых клещей D.marginatus (1998 г.), собранных в Карагандинской области республики Казахстан, и характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Типичны для риккетсий группы КПЛ, но чаще других встречаются кокковидные и палочковидные формы (типы а и в по классификации П.Ф.Здродовского). Грамотрицательны.

Культуральные свойства. Успешно пассируется в организме иксодовых клещей рода Dermacentor, характеризуется высоким уровнем вертикальной передачи: уровень трансовариальной передачи 99+0,9%, уровень трансфазовой передачи 100%. Средний уровень накопления риккетсий в голодных личинках 7, после кровепитания на сосунках белых мышей 49 риккетсий в поле зрения (тотальные мазки исследованы в МФА с поликлональными антителами к риккетсиям группы КПЛ). Средний уровень накопления риккетсий в голодных нимфах 46, после кровепитания нимф - 53 риккетсий в поле зрения.

Антигенные свойства. Антигенные детерминанты выявляются методом флюоресцирующих антител (МФА) с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы КПЛ, люминесцирующими, сухими (НПО “Биомед”) и в реакции непрямой иммунофлюоресценции с моноклональными антителами к группоспецифическому липополисахариду риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки.

Вирулентные свойства. Авирулентен. При внутрибрюшинном заражении суспензией из имаго D.marginatus, зараженных данным штаммом, у животных клиническая картина клещевого риккетсиоза не наблюдалась (повышение температуры и скротальный феномен отсутствовали).

Иммуногенные свойства. Не вызывает иммунного ответа у морских свинок, зараженных данным штаммом. В реакции связывания комплемента с коммерческим антигеном R.sibirica и сыворотки крови морских свинок, зараженных штаммом “7/98-Караганда” положительных результатов не получено.

Генотипические характеристики. Получена последовательность нуклеотидов длиной 452 п.о.:

AATAATGCAGCATTTAATGATCTTGCTGTTGCCAATAATTGGAATGAGAT AACGGCTAGAGGGGTAGCTAATGGTACTCCTGCTGGTGGTCCTCAAGACA ATGGGGCATTTACTTACGGTGGTGATCATACTATCACTGCAGATGAAGCA GGTCGTATTATTACGGCTATAAATGTTGCGGGTACTACTCCCGTAGGTCTA AATATTACTCAAAATACCGTAGTTGGTTCGATTGTGACGGGAGGTAACTT GTTGCCTGTTACTATTACTGCTGGCAAAAGCTTAACTTTAAACGGTACTAA TGCTGTTGCTGCAAATCATGGTTTTGATGCTCCTGCCGATAATTATACAGG TTTAGGAAATATAACTTTAGGGGGAGCGAATGCTGCACTAATTATACAAT CTGTAACCCCGGCAAAGATAACACTTGCAGGAAATATAGATGGAGGAGG

При идентификации в Genbank данная последовательность нуклеотидов имела 100% гомологии с Rickettsia RpA4.

На основании морфологических, антигенных и генетических признаков изолированный штамм относят к роду Rickettsia группы КПЛ, генотипу RpA4.

Изобретение иллюстрируется следуюцими примерами.

Пример 1.

Культивирование и изучение уровня трансовариальной и трансфазовой передачи проводят с использованием клещевой экспериментальной модели (Тагильцев и др., “Изучение членистоногих убежищного комплекса в природных очагах трансмиссивных вирусных инфекций: Руководство по работе в полевых и лаборатоных условиях, - Томск, 1990) в сочетании с методами выявления и изучения риккетсий. Кормление пары естественно инфицированных клещей (самка и самец) проводят на взрослых лабораторных животных. Появившееся потомство содержат в серийных кормлениях-линьках “личинка-нимфа-имаго”. Для определения наличия риккетсий в потомстве образцы появившихся личинок и нимф исследуют в МФА с поликлональными антителами индивидуально как в голодном состоянии, так и после напитывания.

Пример 2.

Эстракцию риккетсиальной ДНК из клещей осуществляют, применяя QIAamp Tissue Kit (Qiagen, Courtabringer, France) и протеиназу К в концентрации 2,0 мг/мл (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) в соответствии с протоколом QIAamp Tissue Kit.

Полимеразную цепную реакцию и sequence-анализ выполняют, применяя праймеры, специфичные для Rickettsiae: Rrl90.70p и Rrl90.701n, которые амплифицируют фрагмент 629-632 п.о. отmА гена кодирующего 190-kD белок (Regnery et al., 1991; Foumier et al., 1998).

Пурификацию ПЦР-продукта проводят, применяя QIAquick PCR Purification Kit (Germany) в соответствии с протоколом.

Sequence-анализ выполняют, используя ABI Prism dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit с AmpliTaq Polymerase FS (PE Applied Biosistems, Warrington WA1 4SR, UK) в соответствии с протоколом на ABI Prism 310 Genetic Analyser (PE Applied Biosistems).

Таким образом, штамм “7/98- Караганда” является первым изолированным штаммом нового генотипа RpA4, первым апатогенным представителем риккетсий группы КПЛ на территории СНГ, может использоваться для мониторинга циркулирующих риккетсий клещевого биотипа и конструирования диагностических и вакцинных препаратов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Rickettsia species "7/98-Караганда" генотипа RpA4 группы клещевой пятнистой лихорадки (депонирован в коллекции НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) выделен из клещей D.marginatus в Карагандинской области республики Казахстан. Штамм "7-98-Караганда" является первым представителем апатогенных риккетсий на территории СНГ. Штамм "7/98-Караганда" в организме иксодовых клещей не вытесняется вирулентными штаммами R.sibirica, что доказывает возможность дифференциации патогенных и апатогенных риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки.

Апатогенный штамм Rickettsia species "7-98 Караганда" генотипа RpA4, коллекция НИИЭМ им.^{Н.Ф.Гамалеи РАМН, используемый для дифференциации патогенных и апатогенных риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки.}