ШТАММ РИККЕТСИЙ ГРУППЫ КЛЕЩЕВОЙ ПЯТНИСТОЙ ЛИХОРАДКИ ВИДА RICKETTSIA HEILONGJIANGENSIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РИККЕТСИЙ И ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2016 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм риккетсий "Приморье - 25/81" является представителем вида Rickettsia heilongjiangensis, впервые изолированным на территории РФ. На основании изучения фенотипических и генотипических признаков штамм отнесен к порядку Rickettsiales семейству Rickettsiaceae роду Rickettsia виду Rickettsia heilongjiangensis. По результатам изучения и сравнения нуклеотидных последовательностей фрагментов генов gltA и ompA имеет 100% гомологии с типовым штаммом Rickettsia heilongjiangensis 054. Штамм "Приморье - 25/81" культивируется в культуре клеток Vero.

В результате изучения штаммов риккетсий, изолированных в Омском НИИ природно-очаговых инфекций, молекулярно-биологическими методами (ПЦР - секвенирование) в 2003 году три штамма, выделенные в 1966 и 1981 годах из клещей Н. concinna на территориях Алтайского и Приморского краев, были идентифицированы как представители нового вида - Rickettsia heilongjiangensis.

Как новый вид R. heilongjiangensis формально описан в 2003 г. (Fournier Р.-Е. et al., 2003). Циркуляция этого возбудителя установлена на ряде удаленных друг от друга территорий Сибири и Дальнего Востока (Алтайский, Красноярский, Хабаровский и Приморский края), основным вектором являются клещи Haemaphisalis concinna (Шпынов и др., 2003; Mediannikov et al., 2004; Shpynov et al., 2004). Случаи клещевого риккетсиоза, вызванные R. heilongjiangensis, выявлены ретроспективно в Хабаровском крае (Mediannikov et al., 2004).

Штамм "Приморье - 25/81" выделен в 1981 году в биопробе на морских свинках из имаго иксодовых клещей Haemaphysalis concinna, собранных с растительности в Дальнереченском районе Приморского края.

Штамм R. heilongjiangensis "Приморье - 25/81" хранится во Всероссийском музее риккетсиозных культур ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи под инвентарным номером 159 от 14 февраля 2012 г.

Задача изобретения - оригинальный штамм Rickettsia heilongjiangensis "Приморье - 25/81".

Технический результат - использование выделенного в России штамма Rickettsia heilongjiangensis позволяет осуществлять лабораторную диагностику заболеваний, вызываемых R. heilongjiangensis, и мониторинг сочетанных природных очагов риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) в России.

Выделенный штамм R. heilongjiangensis "Приморье - 25/81" характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Типичны для риккетсий, но чаще других встречаются кокковидные и палочковидные формы (типы а и b по классификации П.Ф.Здродовского). Грамотрицательны.

Культуральные свойства. Успешно пассируются в культуре клеток Vero с накоплением до 3 крестов в поле зрения, с локализацией как в цитоплазме, так и в ядрах клеток.

Пассажная характеристика. Штамм выделен в 1981 г. в биопробе на морских свинках и высушен на 2 пассаже. Культура штамма R. heilongjiangensis "Приморье - 25/81" рекультивирована в культуре клеток Vero и повторно лиофильно высушена на 5 пассаже в 2011 г.

Антигенные свойства. Антигенные детерминанты R. heilongjiangensis выявляются методом флюоресцирующих антител с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы КПЛ.

Титры комплементфиксирующих антител в сыворотках морских свинок с антигеном R. sibirica составили 1:10 - 1:160. В РНГА с иммуноглобулиновым диагностикумом для выявления риккетсий группы КПЛ выявлен специфический антиген в разведении 1:10+++.

При исследовании методом ИФА с антигеном R. heilongjiangensis, приготовленным из штамма "Приморье - 25/81" сывороток крови лихорадящих больных, имевших контакт с клещами, антитела к данному виду риккетсий выявлены в 6,9%, что позволяет оценивать данный штамм как кандидат для разработки диагностических препаратов.

Вирулентные свойства. При внутрибрюшинном заражении морских свинок штамм вызывает 2-3-дневную лихорадочную реакцию с выраженным периорхитом у части животных. При вскрытии у животных наблюдается характерная для клещевого риккетсиоза патологоанатомическая картина.

Генотипические характеристики. Определена нуклеотидная последовательность гена цитрат синтазы длиной 1234 п.о. штамма "Приморье - 22/81", которая была депонирована в GenBank под номером AY285776 и имеет 100% гомологии с типовым штаммом Rickettsia heilongjiangensis 054 (СР002912.1):

Последовательность нуклеотидов гена ompA штамма "Приморье - 22/81" Rickettsia heilongjiangensis длиной 590 п.о. имеет 100% гомологии с депонированной в GenBank нуклеотидной последовательностью типового штамма Rickettsia heilongjiangensis 054 (AF179362):

На основании морфологических, антигенных и генетических признаков изолированный штамм относят к роду Rickettsia виду Rickettsia heilongjiangensis.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Идентификация на основании генотипических признаков

Экстракция ДНК

Экстракцию риккетсиальной ДНК из пробы культур клеток осуществляют, применяя QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) и протеиназу К в концентрации 2,0 мг/мл (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) в соответствии с протоколом QIAamp Tissue Kit. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенс-реакция.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенс-реакцию выполняют, применяя праймеры, специфичные для Rickettsiae, используют две пары праймеров, амплифицирующие gltA ген, кодирующий цитрат синтетазу:CS1d (5-ATGACTAATGGCAATAATAA-3) и CS535r (5-GAATATTTATAAGACAT-TGC-3), CS409d (5-CCTATGGCTATTATGCTTGC-3) и RP1258n (5-ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA-3), а также праймеры 190.70 (ATG GCG AAT ATT TCT CCA AAA), 190.180 (GCA GCG ATA ATG CTG AGT А) и 190.701 (GTT CCG TTA ATG GCA GCA TCT), амплифицирующие ompA ген, кодирующий белок наружной мембраны (Roux V. et al., 1997; Fournier P-E. et al., 1998).

ПЦР выполняют в термоциклере Peltier, модель PTC-200 (Mj Research, Inc. Watertown, MA). Реакционная смесь для каждой пробы содержит 10 pmol каждого праймера, 0,5 единиц полимеразы (Elongase, GibcoBRL), 20 mM каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,8 mM MgCl₂ и 7,5 мкл ДНК от каждой пробы, финальный объем составляет 25 мкл. Амплификацию выполняют по следующей программе: 3 мин инициальной денатурации при 94°С, в последующих 44 циклах 30 сек денатурации при 94°С, 30 сек отжиг праймеров при температуре 55°С, 90 сек элонгации при 68°С и 7 мин финальная элонгация при температуре 68°С. Каждая постановка ПЦР включает отрицательный контроль (дистиллированная вода) и положительный контроль (ДНК R. montanensis).

Пурификацию ПЦР-продукта проводят, применяя QIAquick PCR Purification Kit (Germany) в соответствии с протоколом.

Секвенс-реакцию с ПЦР-продуктами выполняют, применяя d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosistems, Warrington, UK). Секвенирование выполняют на ABI 3100 PRISM (Applied Biosystems) автоматическом секвенаторе. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей для сравнения степени гомологии с последовательностями Банка данных GenBank проводят с помощью программы BLAST в режиме прямого доступа.

Пример 2. Идентификация на основании фенотипических (культуральных и антигенных) свойств

Культивирование риккетсий

Клеточные культуры выращивают по стандартной методике Соловьева, Бектемирова 1972 г., в качестве ростовой среды используют Игла MEM с двойным набором аминокислот с добавлением 10% эмбриональной сыворотки. Оптимальная посевная доза 100-150 тыс. клеток на 1 мл. На следующие сутки после образования монослоя клеточную культуру используют для заражения.

Заражение культур клеток

Клеточную культуру во флаконе заражают 50% суспензией, полученной из высушенной культуры штамма, в дозе 0,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками центрифугируют при 800 об/мин при температуре 22° в течение 30 мин, после центрифугирования во все флаконы добавляют среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1% эмбриональной сыворотки) в объеме 1,5 мл на флакон (Raoult D., 2000). Флаконы с зараженными клетками культивируют в углекислотном термостате при температуре 37°С в течение 8 суток. После завершения инкубации все флаконы подвергают замораживанию в низкотемпературном холодильнике при -20°С, затем размораживают для разрушения клеток и максимального выхода из них микроорганизмов. После оттаивания материал центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин, супернатант в объеме 0,5 мл берут на следующий пассаж, а из 0,2 мл делают мазки, остатки супернатанта хранят в криопробирках в низкотемпературном холодильнике. Инфицированность и стерильность культуры клеток определяют в мазках, окрашивая их по Романовскому-Гимза.

Полученные образцы исследуют методом флюоресцирующих антител по стандартной методике, используют иммуноглобулины диагностические для выявления риккетсий группы КПЛ, люминесцирующие сухие (ФГУП «НПО «Микроген», г. Пермь). Изучение морфологических и тинкториальных свойств проводят по методу Здродовского и Голиневич (1972).

Пример 3. Приготовление цельнорастворимых антигенов

При отработке параметров постановки ИФА, а также определении рабочих характеристик тест-системы используют цельнорастворимые риккетсиальные антигены, полученные в соответствии с рекомендациями Здродовского П.Ф., Голиневич Е.М. Перед приготовлением антигена зараженные культуры клеток подвергают центрифугированию при 6000 оборотах в минуту в течение 20 минут, далее удаляют супернатант, а из полученной взвеси делают мазки, которые окрашивают по Романовскому-Гимза.

После микроскопического контроля во взвесь зараженных клеток добавляют физиологический раствор и 0,5% фенол. После встряхивания в шейкере пробирки с зараженной клеточной взвесью помещают в рефрижератор на 3-4 дня для осаждения посторонних белковых примесей.

После этого клеточную взвесь подвергают многократной эфирной обработке по Craigie (1945 г.). При первой эфирной обработке к материалу добавляют 1,5-2 объема наркозного эфира и после встряхивания оставляют при комнатной температуре до следующего дня в темном месте. Затем водную фазу отделяют и второй раз обрабатывают эфиром (равный объем эфира в отношении водной фазы), встряхивают и оставляют на 2 часа, затем водную фазу вновь отделяют и в третий раз обрабатывают эфиром (1/2 объема эфира по отношению к объему водной фазы) таким же образом.

После третьей обработки при образовании среднего тканевого слоя делают повторную эфирную обработку. После окончания эфирной обработки производят отгонку эфира под небольшим вакуумом. Пробирки с антигеном оставляют в течение суток в холодильнике для испарения эфира. Полученные серии антигенов испытывают в РСК на антикомплементарность, специфичность, чувствительность и устанавливают титр. Также антигены стандартизуют по уровню аминного азота методом формольного титрования (%) и белка с помощью биуретовой реакции (%). После испытания антигены разливают в ампулы по 1,0 мл и лиофильно высушивают. Высушенный антиген хранят при температуре -20°С.

Таким образом, приведенные выше примеры показывают возможность применения штамма "Приморье - 25/81" для идентификации риккетсий на основании генотипических (пример №1) и фенотипических (пример №2) признаков и получения диагностических препаратов (пример №3).

Изобретение относится к области биотехнологии и касается штамма риккетсий "Приморье - 25/81". Охарактеризованный штамм является представителем вида Rickettsia heilongjiangensis. Изолирован на территории РФ. Штамм является патогеном человека и депонирован во Всероссийском музее риккетсиозных культур ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи под №159. Изобретение может быть использовано для идентификации риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки и получения диагностических препаратов. 3 пр.

Штамм "Приморье - 25/81" - представитель вида Rickettsia heilongjiangensis, изолированный на территории РФ, депонирован во Всероссийский музей риккетсиозных культур ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи под номером 159, используемый для идентификации риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки и получения диагностических препаратов.