ШТАММ РИККЕТСИЙ ГЕНОТИПА "CANDIDATUS RICKETTSIA TARASEVICHIAE" - КАНДИДАТ В НОВЫЙ ВИД, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ РИККЕТСИЙ И ПОЛУЧЕНИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/20 A61K39/395 

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм «Усть-Тарка-38/2003» является первым представителем риккетсий генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae». На основании изучения фенотипических и генотипических признаков штамм отнесен к порядку Rickettsiales семейству Rickettsiaceae роду Rickettsia генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae». По результатам изучения и сравнения нуклеотидных последовательностей генов цитрат синтетазы и 16S рРНК отнесен к группе риккетсий-предшественников, так как имеет наиболее близкую позицию с Rickettsia canadensis (ареал - Северная Америка), степень гомологии 96 и 98% соответственно.

Штамм «Усть-Тарка-38/2003» выделен в 2003 году из имаго клещей Ixodes persulcatus, собранных с растительности в окрестностях населенного пункта Усть-Тарка Усть-Таркского района Новосибирской области.

Штамм риккетсий нового генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» «Усть-Тарка-38/2003» хранится во Всероссийском музее риккетсиозных культур ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН под инвентарным №141 от 19 мая 2005 г.

По антигенным свойствам выделены две группы риккетсий: группа сыпного тифа (СТ) и группа клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) (Здродовский, Голиневич, 1972). Выделенный нами штамм генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» «Усть-Тарка-38/2003» реагирует с группоспецифическими сыворотками как против антигенов риккетсий группы КПЛ, так и СТ.

Задача изобретения - оригинальный штамм «Усть-Тарка-3 8/2003» риккетсий нового генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae».

Технический результат - использование штамма риккетсий нового генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», отнесенного по филогенетическим критериям к группе риккетсий-предшественников, меняет представление о популяции риккетсий, циркулирующих в Евразии. Rickettsia canadensis, выделенная от иксодовых клещей в Северной Америке (McKiel et al., 1967), отнесена к группе риккетсий-предшественников и занимает позицию между группой КПЛ и СТ (Stothard and Fuerst, 1995) и считается патогенной для человека (Bozeman et al., 1970).

Изученный штамм «Усть-Тарка-38/2003» реагирует с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий групп КПЛ и СТ в методе флюоресцирующих антител (МФА), что позволяет оценивать данный штамм как кандидат для разработки диагностических препаратов.

Это обусловливает необходимость изменения методических подходов к мониторингу риккетсий групп КПЛ и СТ.

Выделенный штамм «Усть-Тарка-38/2003» нового генотипа характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Типичны для риккетсий, но чаще других встречаются кокковидные и палочковидные формы (типы а и b по классификации П.Ф.Здродовского). Грамотрицательны.

Культуральные свойства. Успешно пассируются в культуре клеток Vero с накоплением от умеренного до 1-2 крестов в поле зрения.

Пассажная характеристика. Культура штамма «Усть-Тарка-38/2003 генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» - лиофильно высушена на 4 пассаже на культуре клеток Vero.

Антигенные свойства. Антигенные детерминанты выявляются методом флюоресцирующих антител как с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы КПЛ, так и с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы СТ люминесцирующими, сухими (НПО «Биомед»).

Вирулентные свойства. Вызывают цитопатическое действие в культуре клеток Vero.

Генотипические характеристики. Определена последовательность нуклеотидов гена цитрат синтетазы длиной 1234 п.о. «Усть-Тарка-3 8/2003 генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae», которая имела наибольшую степень гомологии (96%) с депонированной в GenBank нуклеотидной последовательностью Rickettsia canadensis (U59713).

Последовательность нуклеотидов гена цитрат синтетазы длиной 1234 п.о. штамма «Усть-Тарка-38/2003 генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae»:

На основании морфологических, антигенных и генетических признаков изолированный штамм относят к роду Rickettsia генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae».

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Идентификация на основании генотипических признаков.

Экстракция ДНК.

Экстракцию риккетсиальной ДНК из пробы культур клеток осуществляют, применяя QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) и протеиназу К в концентрации 2,0 мг/мл (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) в соответствии с протоколом QIAamp Tissue Kit.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенс-реакция. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенс-реакцию выполняют, применяя праймеры, специфичные для Rickettsiae, амплифицирующие gltA ген, кодирующий цитрат-синтетазу: применяют две пары праймеров CSld (5-ATGACTAATGGCAATAATAA-3) и CS535r (5-GAATATTTATAAGACATTGC-3), CS409d (5-CCTATGGCTATTATGCTTGC-3) и RP1258n (5-ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA-3), которые амплифицируют ген цитрат-синтетазы 1234 п.о. (Roux, V., et al., 1997).

ПЦР выполняют в термоциклере Peltier модель РТС-200 (Mj Research, Inc, Watertown, MA). Реакционная смесь для каждой пробы содержит 10 pmol каждого праймера, 0,5 единиц полимеразы (Elongase, GibcoBRL), 20 mM каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,8 mM MgCl₂ и 7,5 мкл ДНК от каждой пробы, финальный объем составляет 25 мкл. Амплификацию выполняют по следующей программе: 3 мин инициальной денатурации при 94°С, в последующих 44 циклах 30 сек денатурации при 94°С, 30 сек отжиг праймеров при температуре 55°С, 90 сек элонгации при 68°С и 7 мин финальная элонгация при температуре 68°С. Каждая постановка ПЦР включает отрицательный контроль (дистиллированная вода) и положительный контроль (ДНК R. montanensis).

Пурификацию ПЦР-продукта проводят, применяя QIAquick PCR Purification Kit (Germany) в соответствии с протоколом.

Секвенс-реакцию с ПЦР-продуктами выполняют, применяя d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosistems, Warrington, UK). Секвенирование выполняют на ABI 3100 PRISM (Applied Biosystems) автоматическом секвенаторе. Последовательности ДНК, полученные в секвенс-реакции, идентифицируют в GenBank.

Таким образом, полученную с применением молекулярно-биологических методов нуклеотидную последовательность для идентификации сравнивают с последовательностью нуклеотидов гена цитрат-синтетазы штамма «Усть-Тарка-38/2003 генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» и при 100% степени гомологии относят к генотипу «Candidatus Rickettsia tarasevichiae».

Пример 2. Идентификация на основании фенотипических (культуральных и антигенных) свойств.

Культивирование риккетсий.

Версенизация и выращивание клеточных культур.

Для работы культуры клеток Vero и Нер-2 подвергают версенизации по стандартной методике Соловьева, Бектемирова, 1972 г., в матрац добавляют 0,25% раствора версена и 0,25% раствора трипсина от объема матраца. На флакон с культуральной поверхностью 25 см² достаточно 0,5 мл раствора. Его равномерно распределяют по слою клеток покачиванием флакона; выдерживают флакон при 36°С до тех пор, пока все клетки не отделятся от ростовой поверхности (проверяют под микроскопом), энергично постукивают по стенке флакона; ресуспендируют клетки в ростовой среде (4,5 мл на флакон с ростовой поверхностью 25 см²), которая останавливает действие трипсина. Суспензию всасывают несколько раз через тонкую пастеровскую пипетку, чтобы раздробить агрегаты клеток; разводят суспензию клеток ростовой средой Игла MEM с двойным набором аминокислот до нужной концентрации, основываясь на подсчете клеток, 150 тыс. на 1 мл. К общему объему добавляют до 10% эмбриональной сыворотки. Рассевают полученную клеточную суспензию в культуральные флаконы или пробирки, плотно закрывают и помещают в термостат при 36°С. Когда монослой почти сформирован (1-2 дня), заменяют ростовую среду поддерживающей средой. Культуры обычно перевивают каждые 5-7 дней.

Заражение культур клеток.

Клеточную культуру во флаконе заражают 50% суспензией, полученной из высушенных штаммов, в дозе 0,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками центрифугируют при 800 об/мин при температуре 22°С в течение 30 мин, после центрифугирования во все флаконы добавляют среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1% эмбриональной сыворотки) в объеме 1,5 мл на флакон (Raouit D., 2000). Флаконы с зараженными клетками культивируют в углекислотном термостате при температуре 35,6°С в течение 8 суток. После завершения инкубации все флаконы подвергают замораживанию в низкотемпературном холодильнике при -20°С, затем размораживают для разрушения клеток и максимального выхода из них микроорганизмов. После разморозки материал центрифугируют 10 минут при 3000 об/мин, супернатант в объеме 0,5 мл берут на следующий пассаж, а из 0,2 мл делают мазки, остатки супернатанта хранят в криопробирках в низкотемпературном холодильнике. Инфицированность и стерильность культуры клеток определяют в мазках, окрашивая их по Романовскому-Гимза.

Полученные образцы исследуют методом флюоресцирующих антител по стандартной методике, используют иммуноглобулины диагностические для выявления риккетсий группы КПП, антитела люминесцирующие сухие (НПО «Биомед). Изучение морфологических и тинкториальных свойств проводят по методу Здродовского (Здродовский, Голиневич, 1972).

Приготовление корпускулярного антигена.

После завершения культивирования культуру зараженных клеток замораживают в низкотемпературном холодильнике при - 20С°, а потом размораживают для разрушения клеток и максимального выхода из них риккетсий. Материал центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Супернатант используют для нанесения корпускулярного антигена на стекла и проведения реакции непрямой иммунофлюоресценции для исследования сывороток больных клещевыми инфекциями.

Изучение антигенных свойств.

а) Антигенные детерминанты «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» в клещах и на культуре клеток выявляют методом флюоресцирующих антител как с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы КПЛ, так и с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы СТ люминесцирующими, сухими (НПО «Биомед»).

б) С целью лабораторной диагностики сыворотки крови больных клещевыми инфекциями исследуют в реакции непрямой флюоресценции с корпускулярными антигенами известных видов риккетсий и полученным на культуре клеток корпускулярным антигеном «Candidatus Rickettsia tarasevichiae».

Таким образом, на основании приведенных выше примеров показана возможность применения штамма «Усть-Тарка-38/2003 риккетсий генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» для идентификации риккетсий на основании генотипических (пример 1) и фенотипических (пример 2) признаков и получения диагностичеких антигенных препаратов.

Штамм «Усть-Тарка-38/2003» - первый представитель риккетсий генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae». На основании изучения фенотипических и генотипических признаков штамм отнесен к порядку Rickettsiales семейству Rickettsiaceae роду Rickettsia генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae». Штамм генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» «Усть-Тарка-38/2003» депонирован под №141 во Всероссийском музее риккетсиозных культур ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. Штамм реагирует с группоспецифическими сыворотками как к риккетсиям группы клещевой пятнистой лихорадки, так и сыпного тифа. Нуклеотидная последовательность может быть идентифицирована как генотип «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» при 100% степени гомологии с определенной нами нуклеотидной последовательностью штамма «Усть-Тарка-38/2003». Штамм риккетсий генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» может быть использован для идентификации риккетсий и получения диагностичеких антигенных препаратов.

Штамм «Усть-Тарка-38/2003» рода Rickettsia генотипа «Candidatus Rickettsia tarasevichiae» - кандидат в новый вид (депонирован во Всероссийский музей риккетсиозных культур ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН под №141 от 19 мая 2005 г.), используемый для идентификации риккетсий и получения диагностических препаратов.