СРЕДСТВО ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ РИККЕТСИОЗА, ВЫЗЫВАЕМОГО RICKETTSIA SIBIRICA SUBSP. SIBIRICA Российский патент 2020 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 A61K39/02 

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой оригинальный штамм риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки "Баево - 107/87". Штамм "Баево - 107/87" является представителем вида Rickettsia sibirica, изолированным на территории РФ. На основании изучения фенотипических и генотипических признаков штамм отнесен к порядку Rickettsiales семейству Rickettsiaceae роду Rickettsia виду Rickettsia sibirica, subsp. sibirica.

Сибирский клещевой тиф (клещевой сыпной тиф Северной Азии, клещевой риккетсиоз Северной Азии, клещевой сыпной тиф) - наиболее распространенный риккетсиоз, возбудитель которого передается иксодовыми клещами. Очаги этой инфекции распространены преимущественно в Азиатской части России и сопредельных с ней государствах (Казахстан, Монголия, Китай). Сибирский клещевой тиф (СКТ) наряду с клещевым энцефалитом (КЭ) и иксодовыми клещевыми боррелиозами (ИКБ) входит в тройку наиболее распространенных в России трансмиссивных инфекций, передаваемых иксодовыми клещами. Сибирский клещевой тиф -классическая облигатно-трансмиссивная природно-очаговая инфекция, этиологическим агентом которой является Rickettsia sibirica subsp.sibirica.

Диагноз СКТ в настоящее время в России ставится, преимущественно, на основании клинико-эпидемиологических данных, поскольку диагностические препараты для серологической верификации данного риккетсиоза в РФ не выпускаются.

Известен штамм «Нецветаев», который ранее использовался для производства серийно выпускаемого диагностического препарата «Диагностикум риккетсий Сибирика сухой для РСК». Преимуществом заявленного штамма по сравнению с прототипом является более высокая продуктивность при культивировании в 5-6 дневных куриных эмбрионах: штамм "Баево - 107/87" дает больший выход риккетсий (до 75-100 микробных тел в поле зрения по данным микроскопии) и в больших разведениях (до 1:100 к весу желточного мешка), в отличии от штамма «Нецветаев», который дает меньшее накопление (20-50 микробных тел в поле зрения) при более низких разведениях (1:20-1:50 к весу желточного мешка).

Штамм вида Rickettsia sibirica subsp. sibirica "Баево - 107/87" выделен из имаго иксодовых клещей Dermacentor marginatus, собранных в Баевском районе Алтайского края в 1987 году.

Штамм "Баево - 107/87" культивируется в культуре клеток Vero, куриных эмбрионах, морских свинках.

По результатам изучения и сравнения нуклеотидных последовательностей фрагментов генов gltA и оmpА имеет 100% гомологии с типовым штаммом 246 Rickettsia sibirica subsp. sibirica.

Штамм вида Rickettsia sibirica subsp. sibirica " Баево - 107/87" депонирован в Государственную коллекцию бактерий П-Ш групп патогенности Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации 26 января 1989 г.

Технический результат - использование штамма вида Rickettsia sibirica subsp. sibirica "Баево - 107/87", в качестве производственного штамма для обеспечения возможности изготовления и наработки препаратов для диагностики риккетсиоза, вызываемого видом Rickettsia sibirica subsp.

sibirica. Заявляемый штамм обладает способностью активно размножаться в различных биологических системах (морские свинки, развивающиеся куриные эмбрионы, культура клеток Vero) и накапливать производственную биомассу в процессе культивирования, что позволяет использовать его для серийного (коммерческого) выпуска диагностических препаратов (наборов реагентов). Использование штамма "Баево - 107/87" вида Rickettsia sibirica subsp.sibirica, в качестве продуцента диагностических препаратов позволяет оптимизировать лабораторную диагностику риккетсиозов и мониторинг сочетанных природных очагов риккетсиозов группы клещевой пятнистой лихорадки (КПЛ) в России.

Выделенный штамм вида Rickettsia sibirica subsp.sibirica "Баево -107/87" характеризуется следующими признаками:

Морфологические признаки. Типичны для риккетсий, но чаще других встречаются палочковидные формы (тип b по классификации Здродовского, Голиневич, 1972). Грамотрицательны.

Культуральные свойства. Успешно пассируется в культуре клеток Vero, с максимальным накоплением риккетсий до 25-50 и более в поле зрения.

При культивировании на 5-6 дневных куриных эмбрионах, начиная со второго пассажа дает накопление 50 и более риккетсий в поле зрения.

Пассажная характеристика. Штамм выделен в 1987 г. в биопробе на морских свинках-самцах и после двух пассажей на морских свинках переведен на куриные эмбрионы. Культура штамма вида Rickettsia sibirica subsp.sibirica "Баево - 107/87" лиофильно высушена на 7-м пассаже на куриных эмбрионах.

Антигенные свойства. Антигенные детерминанты вида Rickettsia sibirica subsp. sibirica выявляются методом флюоресцирующих антител с иммуноглобулинами диагностическими для выявления риккетсий группы КПЛ.

Иммуногенные свойства. В реакции связывания комплемента (РСК) с антигеном R. sibirica и сыворотками морских свинок, зараженных штаммом вида Rickettsia sibirica subsp. sibirica "Баево - 107/87, отмечается сероконверсия в титрах 1:160-1:320. При исследовании методом ИФА сывороток крови лихорадящих больных, проживающих на эндемичной по СКТ территории Алтайского края и имевших в анамнезе присасывание клещей, с антигеном вида Rickettsia sibirica subsp. sibirica, приготовленным из штамма "Баево - 107/87", антитела класса IgM к данному виду риккетсий выявлены в 81,5±4,8%, антитела класса IgG - в 69,2±5,7%.

Вирулентные свойства. Внутрибрюшинное заражение самцов морских свинок 1 мл яичной культуры штамма в разведении до 10^-4 вызывает лихорадочную реакцию продолжительностью от двух до шести суток с выраженным периорхитом у части животных. При вскрытии у животных наблюдается характерная для СКТ патологоанатомическая картина.

Генотипические характеристики. Определена нуклеотидная последовательность гена цитрат синтазы (gltA) длиной 1234 пар оснований штамма "Баево - 107/87", которая имела 100% гомологии с последовательностью гена цитрат синтазы типового штамма R. sibirica subsp.sibirica 246, депонированной в GenBank под номером U59734:

Последовательность нуклеотидов гена белка наружной мембраны риккетсий (OmpA) длиной 590 пар оснований имеет 100% гомологии с депонентом GenBank под номером U43807 Rickettsia sibirica subsp. sibirica 246.

На основании культуральных, морфологических, антигенных и генетических признаков изолированный штамм относят к роду Rickettsia виду Rickettsia sibirica subsp. sibirica.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Идентификация на основании генотипических признаков. Экстракция ДНК.

Экстракцию риккетсиальной ДНК из пробы культур клеток осуществляют, применяя QIAamp Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) и протеиназу К в концентрации 2,0 мг/мл (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) в соответствии с протоколом QIAamp Tissue Kit.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и секвенс-реакция.

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) и секвенс-реакцию выполняют, применяя праймеры, специфичные для Rickettsiae, используют две пары праймеров, амплифицирующие git А ген, кодирующий цитрат синтетазу:CSld(5-ATGACTAATGGCAATAATAA-3) и CS535r (5-GAATATTTATAAGACAT-TGC-3), CS409d (5-CCTATGGCTATTATGCTTGC-3) и RP1258n (5-ATTGCAAAAAGTACAGTGAACA-3), а также праймеры 190.70 (ATGGCGAATATTTCTCCAAAA), 190.180 (GCAGCGATAATGCTGAGTA) и 190.701 (GTTCCGTTAATGGCAGCATCT), амплифицирующие ompA ген, кодирующий белок наружной мембраны (Roux, V., et al., 1997; Fournier, P-E., et al., 1998).

ПЦР выполняют в термоциклере Peltier модель РТС-200 (Mj Research, Inc, Watertown, MA). Реакционная смесь для каждой пробы содержит 10 pmol каждого праймера, 0,5 единиц полимеразы (Elongase, GibcoBRL), 20 mM каждого дезоксинуклеозидтрифосфата, 1,8 mM MgCl₂ и 7,5 мкл ДНК от каждой пробы, финальный объем составляет 25 мкл. Амплификацию выполняют по следующей программе: 3 мин инициальной денатурации при 94°С, в последующих 44 циклах 30 сек денатурации при 94°С, 30 сек отжиг праймеров при температуре 55°С, 90 сек элонгации при 68°С и 7 мин финальная элонгация при температуре 68°С. Каждая постановка ПЦР включает отрицательный контроль (дистиллированная вода) и положительный контроль (ДНК R. montanensis).

Пурификацию ПЦР-продукта проводят, применяя QIAquick PCR Purification Kit (Germany) в соответствии с протоколом.

Секвенс-реакцию с ПЦР-продуктами выполняют, применяя d-Rhodamine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit (Applied Biosistems, Warrington, UK). Секвенирование выполняют на ABI 3100 PRISM (Applied Biosystems) автоматическом секвенаторе. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей для сравнения степени гомологии с последовательностями базы данных GenBank проводят с помощью программы BLAST в режиме прямого доступа.

Пример 2. Культивирование риккетсий и идентификация на основании фенотипических (культуральных и антигенных) свойств.

2.1. Культивирование риккетсий с использованием перевиваемых культур клеток.

Версенизация и выращивание клеточных культур.

Для работы культуры клеток Vero и Нер-2 подвергают версенизации по стандартной методике Соловьева В.Д., Бектемирова Т.А. (1972 г.), в культуральный флакон добавляют раствор Версена до конечной концентрации 0,25% и раствор трипсина также до концентрации 0,25%. На флакон с культуральной поверхностью 25 см достаточно 0,5 мл раствора.

Его равномерно распределяют по слою клеток покачиванием флакона, выдерживают при 37°С до тех пор, пока все клетки не отделятся от ростовой поверхности (проверяют под инвертированным микроскопом), энергично постукивают по стенке флакона; отделившиеся клетки ресуспендируют в ростовой среде (4,5 мл на флакон с ростовой поверхностью 25 см²), которая останавливает действие трипсина. Суспензию пипетируют, чтобы раздробить агрегаты клеток, разводят суспензию клеток ростовой средой Игла MEM с двойным набором аминокислот до нужной концентрации, основываясь на подсчете клеток: 150 тыс. в 1 мл. К общему объему добавляют эмбриональную сыворотку до концентрации 5%. Рассевают полученную клеточную суспензию в культуральные флаконы или пробирки, плотно закрывают и помещают в термостат при 37°С. Когда монослой почти сформирован (1-2 дня) заменяют ростовую среду поддерживающей средой. Культуры клеток обычно перевивают каждые 5-7 дней.

Заражение культур клеток.

Клеточную культуру во флаконе заражают 50%-ой суспензией, приготовленной из лиофильно высушенных штаммов, в объеме 0,5 мл на флакон. Флаконы с зараженными клетками центрифугируют при 800 об/мин при температуре 22°С в течение 30 мин, после центрифугирования во все флаконы добавляют среду поддержки (Игла MEM с добавлением 1% эмбриональной сыворотки) в объеме 1,5 мл на флакон (Raoult D., 2000). Флаконы с зараженными клетками инкубируют в углекислотном термостате при температуре 37°С в течение 8-14 суток, в зависимости от культуры клеток. После чего флаконы подвергают замораживанию при температуре минус 20°С, затем размораживают при комнатной температуре, для разрушения клеток и максимального выхода из них микроорганизмов. После размораживания, материал в объеме 0,5 мл берут для следующего пассажа, а из 0,2 мл делают мазки, остатки супернатанта хранят в криопробирках в низкотемпературном холодильнике при температуре минус 20°С. Степень накопления риккетсий и отсутствие посторонней микрофлоры определяют в мазках, окрашивая их по Романовскому - Гимза.

Полученные образцы кроме того исследуют методом флюоресцирующих антител по стандартной методике, используя иммуноглобулины диагностические для выявления риккетсий группы КПЛ, антитела люминесцирующие сухие (НПО «Биомед). Изучение морфологических и тинкториальных свойств, проводят по методу Здродовского (Здродовский, Голиневич, 1972).

Приготовление цельнорастворимых антигенов

Для приготовления антигена зараженные культуры клеток подвергают центрифугированию при 6000 оборотах в минуту в течение 60 минут, далее удаляют супернатант, а из полученной взвеси делают мазки, которые окрашивают по Романовскому - Гимза.

После микроскопического контроля во взвесь зараженных клеток добавляют 0,5% фенол (к 0,5 мл цельного фенола добавляют 100 мл забуференного физиологического раствора рН 7,0) из расчета 2 мл фенола на 1 мл клеточной взвеси. После встряхивания в шейкере пробирки с зараженной клеточной взвесью помещают в рефрижератор на 3-4 дня для осаждения посторонних белковых примесей.

После этого клеточную взвесь подвергают многократной эфирной обработке по Craigie (1945 г.). При первой эфирной обработке к материалу добавляют 1,5-2 объема наркозного эфира и после встряхивания оставляют при комнатной температуре до следующего дня в темном месте. Затем водную фазу отделяют, и второй раз обрабатывают эфиром (равный объем эфира в отношении водной фазы), встряхивают и оставляют на 2 часа, затем водную фазу вновь отделяют и в третий раз обрабатывают эфиром (1/2 объема эфира по отношению к объему водной фазы) таким же образом.

После третьей обработки при образовании среднего тканевого слоя делают повторную эфирную обработку. После окончания эфирной обработки производят отгонку эфира под небольшим вакуумом. Пробирки с антигеном оставляют в течение суток в холодильнике для испарения эфира. Полученные серии антигенов испытывают в РСК на антикомплементарность, специфичность, чувствительность и устанавливают титр антигена. Также антигены стандартизуют по уровню аминного азота методом формольного титрования (%) и белка с помощью биуретовой реакции (%). После испытания антигены разливают в ампулы по 1,0 мл и лиофильно высушивают. Высушенный антиген хранят при температуре - 20 С.

Приготовление корпускулярного антигена.

После завершения культивирования культуру зараженных клеток замораживают при - 20 С°, а потом оттаивают для разрушения клеток и максимального выхода из них риккетсий. Материал центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Супернатант используют в качестве корпускулярного антигена для нанесения на стекла и проведения реакции непрямой иммунофлюоресценции для исследования сывороток больных клещевыми инфекциями.

Таким образом, штамм "Баево - 107/87" имеет 100% гомологии с типовым штаммом вида Rickettsia sibirica subsp. sibirica 246 по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей гена gltA и гена ompA, активно размножается в культуре клеток Vero и в развивающихся куриных эмбрионах, что позволяет в процессе культивирования накапливать производственную биомассу. С учетом этого, он может быть использован в качестве производственного штамма при разработке и изготовлении препаратов для диагностики сибирского клещевого тифа - риккетсиоза, вызываемого видом Rickettsia sibirica subsp.sibirica.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается применения штамма Rickettsia sibirica subsp. sibirica "Баево-107/87" для получения диагностических препаратов для выявления риккетсиоза. Штамм Rickettsia sibirica subsp. sibirica "Баево-107/87" выделен из имаго иксодовых клещей Dermacentor marginatus. Штамм "Баево-107/87" успешно культивируется на клеточной культуре Vero Е6 и развивающихся куриных эмбрионах. Штамм депонирован в Государственной коллекции бактерий II-III групп патогенности ФГБУ «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Штамм Rickettsia sibirica subsp. sibirica "Баево-107/87" может быть использован для лабораторной диагностики и получения диагностических препаратов для диагностики риккетсиоза, вызываемого Rickettsia sibirica subsp. sibirica. 2 пр.

Применение штамма Rickettsia sibirica subsp. sibirica "Баево-107/87" для получения препаратов для диагностики риккетсиоза, вызываемого Rickettsia sibirica subsp. sibirica.