КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ВИРУСВАКЦИНА ПРОТИВ НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ Российский патент 2004 года по МПК A61K39/17 A61P31/12 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к получению культуральной вирусвакцины против ньюкаслской болезни из штамма "М - ВНИИВВиМ".

Профилактику ньюкаслской болезни (НБ) проводят путем вакцинации кур препаратами, изготовленными из лентогенных штаммов - Ла Сота, Бор-74 ВГНКИ (В.Н.Сюрин и др. Вирусные болезни животных, 1998 г. М.: ВНИИТИБП, с.214-232) и мезогенных штаммов парамиксовируса 1 - "Н", ГАМ-61 (В.И.Смоленский. "Средства и методы специфической профилактики болезней птиц вирусной этиологии". Док. дисс. 1999 г.). Эти штаммы при различных способах введения вызывают образование вирусспецифических антител (более 3 log 2) и защищают не менее 80% птицы от заболевания.

Вакцины из лентогенных штаммов обладают хорошей иммуногеностью, не реактогенны, вакцинацию можно проводить различными методами, но формируется иммунитет через 2-3 недели после иммунизации.

Отличительной особенностью вакцин из мезогенных штаммов является то, что они высокоиммуногенны, создают невосприимчивость через 48-220 часов и защищают птицу и течение года, но обладают реактогенностью.

Вирусным сырьем для изготовления вакцин из лентогенных и мезогенных штаммов является экстраэмбриональная жидкость зараженных развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ). Для получения вакцин необходимо использовать только СПФ эмбрионы, которые в несколько раз дороже обычных, а их производство в России не налажено.

Наиболее близким прототипом изобретения является эмбриональная вакцина против ньюкаслской болезни из мезогенного штамма Paramyxovirus "ГАМ-61 ВГНКИ", которую применяют для профилактики однократно интраназально, энтерально, внутримышечно или аэрозольно в эффективных дозах. Сохранность цыплят яичной породы после применения этой вакцины составила в среднем 99,3%, а для цыплят-бройлеров - 83,0%. Сделана попытка адаптации этого штамма на культурах клеток для изготовления культуральной вакцины. Установлено, что штамм "ГАМ-61 ВГНКИ" не вызывает цитопатического действия в первичных и перевиваемых культурах клеток ПТ-80, ФЭК, ФЭУ и не пригоден для накопления с целью изготовления вакцины (П. №2055890 - прототип).

Целью изобретения является культуральная вирусвакцина из мезогенного штамма "М-ВНИИВВиМ" Paramyxovirus 1 серотипа (ньюкаслская болезнь), выращенного на культуре клеток ВНК-21/13, обладающая высокой иммуногенностью.

Используемый штамм не патогенен для цыплят, но инокуляция 20% суспензии селезенки от павших цыплят в разведении 1/1000 вызывала гибель куриных эмбрионов через 60-84 часа. Штамм был идентифицирован как мезогенный. Инфекционный титр его составил 8,5-9,0 lg ЭЛД₅₀/см³, а гемагглютинирующий титр - 1:256-1:512 (8,0-9,0 log₂).

После первых 4 пассажей вируса в клетках ВНК-21/13 наблюдалось четко выраженное цитопатическое действие. Вирус накапливается в титрах 7,0-7,75 lg ТЦД₅₀/см³, а гемагглютинирующий титр увеличился с 1:4 в первом пассаже до 1:32 в четвертом пасаже. Начиная с пятого пассажа, накопление вируса в клетках ВНК-21/13 стабилизировалось и составляло 7,0-7,75 lg ТЦД₅₀/см³, а гемагглютинирующий титр - 1:16-1:32. Культивирование штамма в КК ВНК-21/13 на протяжении 15 пассажей не привело к изменению его характеристик (Патент №2192464).

Для получения вакцинного препарата подобрана питательная и поддерживающая среды и отработан режим роллерного культивирования вируса, определен состав защитной среды и режим лиофильной сушки, определены дозы, способы вакцинации птицы и иммуногенность вакцины.

Пример 1. Для получения вакцины в качестве посевного вируса ньюкаслской болезни используют мезогенный штамм "М-ВНИИВВиМ", полученный на уровне 5-15 пассажей с инфекционным титром - 7,0-7,75 lg ТЦД₅₀/см³, гемагглютинирующим титром - 1:16-1:32.

Культуру клеток ВНК-21/13 выращивают в матрасах или роллерным методом культивирования с использованием ростовой среды Игла (MEM) при 36-38°С. Ростовая среда содержала 10% сыворотки КРС, а поддерживающая - 1%. Множественность заражения составляет 0,1-10 ТЦД₅₀/кл. При наступлении 80% ЦПД инфицированную культуру в матрасах замораживают и хранят при -40°С. Роллерное культивирование продолжается в течение 3-4 суток.

В качестве стабилизирующей среды используют защитную среду на основе пептона, которую готовили согласно технологическому регламенту "Среда защитная (СПЛФ - жидкая)", утв. ГУВ Госагропрома СССР 10.11.88 г и контролируют согласно ТУ 10-19.45-88 "Среда защитная для вирусных вакцин (СПЛФ - жидкая)".

Вируссодержащий препарат смешивают с защитной средой в соотношении 1:1, разливают в ампулы по 1 см³ и проводят сушку на сублимационном аппарате ТГ-50,5, предварительно заморозив смесь до температуры минус 50°С. Температурный режим сушки изменяется во времени, а вакуум остается в пределах 80-100 мм рт. столба. Общее время сушки составляет 34-37 часов, а влажность готового продукта 2-3%.

Контроль стерильности культуральной вакцины проводили на бактериальных средах: МПА, МПБ, Сабуро и тиогликолевом агаре. Рост бактериальной и грибковой микрофлоры в течение 10 дней не выявлен.

Проверку безвредности культуральной вакцины против ньюкаслской болезни проводили путем вакцинации 10 цыплят интраназально в обьеме 0,1 см исходной вируссодержащей жидкости. Клинических признаков заболевания в течение 10 дней наблюдения не отмечено.

Лиофилизированый препарат применяют для вакцинации цыплят. Способы вакцинации - внутримышечный - однократно в объеме 0,5 см³ в разведении 1:500 или интраназальный - однократно в объеме 0,1 см³ в разведении 1:100 по общепринятой методике. Прирост титра антигемагглютининов составляет не менее 3,0 log₂ на 7 день после вакцинации.

Иммуногенные свойства культуральной вакцины против НБ из штамма “М-ВНИИВВ и М” приведены в таблице.

В опытах использованы цыплята яичного и мясного направления.

Из представленных результатов видно, что вакцина из штамма М-ВНИИВВиМ обеспечивает защиту цыплят к заражению вирулентным штаммом "Т-53" вируса ньюкаслской болезни в 93,3-100% случаев, а эмбриональная вакцина из мезогенного штамма ГАМ-61 ВГНКИ при аналогичных иммунизирующих дозах обеспечивает защиту цыплят - в 83,3-100% случаев.

Проверена сохранность лиофилизированной культуральной вакцины против ньюкаслской болезни. Хранение вакцины в течение 18 месяцев практически не снизило ее активность. Внутримышечная вакцинация цыплят дала положительный результат.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Вакцина содержит суспензию мезогенного штамма “М-ВНИИВВиМ” вируса ньюкаслской болезни, выращенного в перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13, а его титр достигает 7,0-7,75 lg ТЦД_50/мл и защитную среду при соотношении 1:1. Вакцина безвредна, обладает высокой иммуногенностью. 1 табл.

Культуральная вирусвакцина против ньюкаслской болезни, включающая вируссодержащий материал и защитную среду, отличающаяся тем, что в качестве вируссодержащего материала содержит суспензию мезогенного штамма “М-ВНИИВВиМ” вируса ньюкаслской болезни, выращенного на культуре клеток ВНК-21/13, и защитную среду при соотношении 1:1.