ШТАММ ВИРУСА НЬЮКАСЛСКОЙ БОЛЕЗНИ ПТИЦ PSEVDOPESTIS AVIUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ Российский патент 2002 года по МПК C12N7/00 A61K39/17 C12N7/00 C12R1/93 

Изобретение относится к области вирусологии, в частности к получению штамма вируса ньюкаслской болезни "М-ВНИИВВиМ" и может быть использован в научно-исследовательских учреждениях и различных отраслях биологической промышленности для производства вирусвакцины против ньюкаслской болезни птиц.

Имеется несколько штаммов для приготовления живых вакцин для специфической профилактики ньюкаслской болезни (НБ), такие как "Ла-Сота", "B1", "Бор-74 ВГНКИ", "Н" (В.И.Сюрин и др., Вирусные болезни животных, 1998, М., ВНИИТИБП, с. 214-232), "ГАМ-61" (В.И.Смоленский, Средства и методы специфической профилактики болезней птиц вирусной этиологии, докт. дисс., 1999 г.). Штаммы "Ла-Сота", "Бор 74". "В 1" в дозе (1-5)•10⁶ЕД₅₀/см³ при интраназальном введении вызывают образование вирусспецифических антител (≥3 log₂) и защищают не менее 80% птицы от заболевания. Однако указанные штаммы размножаются только в куриных эмбрионах и для этой цели используют СПФ-эмбрионы.

Производимая в РФ вакцина из мезогенного штамма "Н" хорошо зарекомендовала себя в условиях эпизоотической нестабильности и неблагополучия, однако ее применение ограничено в связи с остаточной вирулентностью для цыплят младших возрастных групп.

Штамм ГАМ-61 был получен путем аттенуации вирулентного вируса НБ перемежающимися пассажами на первичной культуре клеток почки теленка и куриных эмбрионах и является штаммом максимально "поздней" селекции. Вирус размножался в первичных (куриных, утиных, перепелиных фибробластах, почке эмбрионов, тестикулах КРС) и перевиваемых линиях (Hela, Hер-1, СПЭВ). При этом уровень гемагглютинации находился в диапазоне 2-4 log₂, инфекционный титр составлял 5,0-6,0 lg ТЦД₅₀/см³.

После 3 циклов пассирования увеличение титра вируса не наблюдали. Таким образом первичные и перевиваемые культуры клеток оказались малочувствительными и непригодными для его накопления с целью изготовления вакцин. Поэтому оптимальной системой для репродукции вируса являются куриные эмбрионы, в которых вирус накапливался в титре 8,5-9,5 lg ЭЛД₅₀/см³ с гемагглютинирующим титром 8,0 log₂. Стоимость одного СПФ эмбриона, который затрачивается для изготовления приблизительно 200 доз вакцины, составляет 47 руб. 50 коп.

Целью изобретения является получение нового штамма вируса НБ "поздней" селекции, размножающегося с необходимой для приготовления вакцины инфекционной и гемагглютинирующей активностью в технологичных перевиваемых культурах клеток и сохраняющего иммуногенность.

Штамм вируса ньюкаслской болезни "М-ВНИИВВиМ" получен из эпизоотического вируса, выделенного от бройлерных цыплят в птицеводческом хозяйстве Мурманской области селекцией по признаку максимального накопления в перевиваемой культуре клеток ВНК-21/13. Исходный выделенный штамм не был патогенен для цыплят, но инокуляция 20%-ной суспензии селезенки павших в хозяйстве цыплят в разведении 10^-3 вызывала гибель 50% куриных эмбрионов через 60-84 часа, который был идентифицирован как мезогенный штамм. Инфекционный титр составлял 8,5-9,0 lg ЭЛД₅₀/см³, а гемагглютинирующий титр - 1:256-1:512 (8,0-9,0 log₂).

После первых 4 пассажей выделенного в хозяйстве штамма в клетках ВНК-21/13 наблюдалось четко выраженное цитопатогенное действие вируса, который накапливался в титрах 7,0-7,5 lg ТЦД₅₀/см³ (титрование в культуре клеток) или 8,0-8,5 lg ЭЛД₅₀/см³ (титрование на куриных эмбрионах), а гемагглютинирующий титр возрастал с 1:4 в первом пассаже до 1:32 в 4 пассаже. Начиная с 5 пассажа, накопление вируса в клетках ВНК-21/13 стабилизировалось и составляло 7,0-7,5 lg ТЦД₅₀/см³ или 8,0-8,5 lg ЭЛД₅₀/см³ а гемагглютинирующий титр - 1:256-1:512. Этому штамму вируса НБ, размножающемуся в перевиваемой культуре клеток, было присвоено название штамм "М-ВННИВВиМ" и он был депонирован в Коллекции штаммов ВНИИВВиМ за 2225 от 01.09.00.

При инокуляции 10-дневных эмбрионов штаммом "М-ВНИИВВиМ" в дозе 10^-1 в объеме 0,1 см³/к.э. последний накапливался в эмбрионах до 8,0-8,5 lg ЭЛД₅₀, гемагглютинирующий титр при этом составлял 1:256-1:512 (8,0-9,0 log₂).

При интраназальном введении интактным бройлерам и цыплятам яичной породы индуцировал у них образование гуморальных антител в среднем титре 4,7 log₂. Штамм защищал 75-100% птицы, вакцинированной в дозе (1-3)•10⁶ ТЦД₅₀ в объеме 0,1-0,5 см³/голову от контрольного заражения вирулентным вирусом НБ (штамм Т-53) в дозе (3-5)•10³ ЭЛД₅₀/голову. Стабильность данного признака: размножение в культуре клеток ВПК-21/13 с сохранением высокой иммуногенности не изменялось на протяжении 15 пассажей (срок наблюдения).

Полученный штамм на уровне 6-15 пассажей может служить живой культуральной вакциной для иммунизации птицы против ньюкаслской болезни в птицеводческих хозяйствах. Цыплят прививают интраназально с 15-дневного возраста в дозе 3•10⁵ТЦД₅₀/гол. в объеме 0,1 см³ однократно. Иммунитет наступает на 14 сутки после вакцинации. Проверка экспериментальных серий вакцины показала, что она ареактогенна, безвредна и иммуногенна. Однократная вакцинация птицы обеспечивает 75-100% защиту от контрольного заражения эпизоотическим вирусом НБ в дозе 3-5 тыс. ЭЛД₅₀/гол.

Штамм "М ВНИИВВиМ" характеризуется следующими признаками:
Таксономия. Штамм М ВНИИВВиМ относится к семейству Paramixovirider род Rubulavirus.

Маркерные характеристики. Штамм оказывает цитопатическое действие на перевиваемые культуры клеток ВНК-21/13, ПСГК и накапливаются в титрах 7,0-7,5 lg ТЦД₅₀/см³ с гемагглютинирующим титром - 1/16-1/32. Культуральный вирус хорошо размножается в 9-10-дневных куриных эмбрионах, зараженных в аллантоисную полость. Биологическая активность через 48-72 часа инкубации при 37^oС достигает титра 8,0-8,5 lg ЭЛД₅₀/см³.

Вирулентные свойства. Индекс интрацеребральной патогенности составляет 1,4. Индекс внутривенной патогенности составляет 0,8. Величина среднего времени гибели куриных эмбрионов, вызванная минимальной летальной дозой, составляет 80-95 часов.

Антигенные свойства. Видовая специфичность штамма "М ВНИИВВиМ" определена в реакции задержки гемагглютинации со специфическими сыворотками к вирусу ньюкаслской болезни, ГП и ССЯ-76 по общепринятой методике и твердофазным иммуноферментным анализом (ТФ ИФЛ) с использованием моноклональных антител (МАт) к рибонуклеопротеиду (РНП) вирусов НБ и ГП. Установлено, что штамм "М ВНИИВВиМ" антигенно родственен парамиксовирусу первой антигенной подгруппы (ПМВ-1). При введении в организм птиц вызывает формирование иммунитета. Антигемагглютинирующие антитела накапливаются в титрах 4,0-5,5 лог₂. Однократно привитые цыплята вакциной из штамма "М ВНИИВВиМ" интраназально и внутримышечно через 7-14 дней были иммунны в 100% случаев.

Иммуногенность. При контрольном заражении вакцинированная птица интраназально в дозе 0,3 млн. ТЦД₅₀/см³ и внутримышечно в дозе 0,15 млн. ТЦД₅₀/см³ была невосприимчива к заболеванию.

Серологические свойства. Штамм "М ВНИИВВиМ" вируса НБ обладает способностью агглютинировать эритроциты птиц, животных и человека. Гемагглютинирующий титр 1/512-1/1024. Элюция вирусов с эритроцитов наступает через 30-40 минут.

Тропизм. Выраженным тропизмом штамм не обладает. Преимущественно вирус размножается в клетках головного мозга, селезенке и трахее.

Безвредность. Штамм "М ВНИИВВиМ" вируса НБ безвреден для цыплят всех возрастных групп при энтеральном и парентеральном введении в 10-100-кратной профилактической дозе.

Стандартные условия выращивания. Вирус выращивают в перевиваемых культурах клеток ВНК-21 или ПСГК (ПСГК-60, ПСГК-С85) стационарным или роллерным способом культивирования в поддерживающей среде Игла (MEM) при 37^o±1^oC. Множественность заражения составляет 0,1-10 ТЦД₅₀/кл. При наступлении 80% ЦПД, инфицированную культуру замораживают и хранят при -40^oС.

Изобретение относится к области вирусологии. Штамм вируса ньюкаслской болезни "М-ВНИИВВиМ" получен из эпизоотического вируса, выделенного от бройлерных цыплят в птицеводческом хозяйстве г. Мурманска, селекцией по признаку максимального накопления в перевиваемой клеточной культуре ВНК-21/13. Полученный штамм на уровне 6-15 пассажей может служить живой культуральной вакциной для иммунизации птицы против ньюкаслской болезни в птицеводческих хозяйствах. Проверка экспериментальных серий вакцины показала, что она ареактогенна, безвредна и иммуногенна. Однократная вакцинация птицы обеспечивает 75-100%-ную защиту от контрольного заражения эпизоотическим вирусом НБ в дозе 3-5 тыс. ЭЛД₅₀/гол. 1 табл.

Штамм вируса ньюкаслской болезни птиц Psevdopestis avium, депонированный в Коллекции штаммов ВНИИВВиМ за 2225 от 01.09.2000, используемый для приготовления ветеринарных биопрепаратов.