ШТАММ ВИРУСА ПАРАГРИППА-3 КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИННЫХ И ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2006 года по МПК C12N7/00 A61K39/155 C12R1/93 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии и может быть использовано для изготовления средств специфической профилактики и диагностики парагриппа-3 (ПГ-3) крупного рогатого скота (КРС).

ПГ-3 (транспортная лихорадка КРС, параинфлюэнца-3) - остро протекающая контагиозная вирусная болезнь, главным образом телят, характеризующаяся поражением органов дыхания, но наиболее характерной является латентная форма парагриппозной инфекции. Часто осложняет течение других болезней, в сочетании с пастереллами обуславливает тяжелые формы респираторных инфекций у телят ПГ-3 распространен повсеместно, практически во всех странах мира. Указанная инфекция возникает у КРС в виде моноинфекции, смешанных инфекций, которые наносят значительный экономический ущерб из-за гибели и выбраковки животных, снижения продуктивности и нарушения функции воспроизводства.

Для специфической профилактики ПГ-3 применяют живые и инактивированные вакцины (1). Живые вакцины против ПГ-3 используют как монопрепараты или в составе ассоциированных вакцин, а инактивированные не нашли широкого применения из-за их низкой иммуногенности.

В связи с этим актуальной остается проблема новых штаммов вируса ПГ-3, сохраняющих свои нативные биологические свойства и после инактивации, для производства высокочувствительных и специфичных средств диагностики и высокоиммуногенных, безвредных средств профилактики заболевания.

Известен аттенуированный штамм УК-АТИ-739 вируса ПГ-3, используемый для изготовления живой вакцины против ПГ-3 (2). Его недостатком является низкая иммуногенная активность и нестабильность при инактивации.

Известен штамм paramyxovirus "ПТК-45/86" вируса ПГ-3 КРС, используемый для изготовления ассоциированной вирусвакцины против ИРТ, ПГ-3 и вирусной диареи КРС (3). Его недостатком является низкая иммуногенная активность и высокая реактогенность для телят 1-3-месячного возраста.

Известен аттенуированный штамм 1-а ВА 77 №14 вируса ПГ-3, используемый для изготовления вирусвакцины против ПГ-3 КРС (4). Недостатки данного штамма состоят в его низкой биологической, антигенной и иммуногенной активности и нестабильности при инактивации.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является штамм " ВГНКИ-4" вируса ПГ-3, (прототип) используемый для изготовления инактивированной вакцины против парагриппа-3 крупного рогатого скота (5). Недостатками данного штамма являются его низкая биологическая, иммуногенная активность и нестабильность при инактивации.

Целью настоящего изобретения являлось получение нового производственного вируса ПГ-3, обладающего высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью в нативном виде и после инактивации и обеспечивающего изготовление эффективных диагностических и вакцинных препаратов, гомологичных по протективному антигену эпизоотическому вирусу, циркулирующему на территориии Российской Федерации.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении производственного штамма вируса ПГ-3, обладающего высокой биологической, антигенной активностью и стабильностью при инактивации и пригодного для изготовления средств диагностики и специфической профилактики заболевания.

Указанный технический результат достигнут получением штамма ПГ/К-2002 вируса ПГ-3. Штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 является новым, ранее неизвестным. Исходный вирус для получения штамма ПГ/К-2002 выделен из легких 1-2-месячных телят с респираторной патологией во время вспышки заболевания в комплексе "Славянское" Орловской области в 1999 году.

Вакцинный штамм получен во ВНИИВВиМ путем культивирования в перевиваемых культурах клеток MDBK и ПС.

Полученный штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Всероссийского государственного научно-исследовательского института контроля стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) 23.08.2003 г. под регистрационным наименованием ПГ/К-2002 ДЕП.

По сравнению с прототипом штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 обладает белее высокой биологической, антигенной и иммуногеннной активностью в нативном виде.

Экспериментально подтверждена возможность его использования для изготовления средств диагностики и специфической профилактики ПГ-3 КРС. Штамм ПГ/К-2002 обеспечивает проведение серологической диагностики ПГ-3 и производство эффективных живых и инактивированных вакцин, создающих защиту восприимчивых животных от указанного возбудителя заболевания.

Штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 характеризуется следующими признаками и свойствами (Табл.1):

Таблица 1
Маркерные характеристики штамма ПГ/К-2002 вируса ПГ-3№ п/пНаименование свойствХарактеристика свойств1231Морфологические признаки (свойства)Штамм обладает морфологическими признаками, характерными для семейства парамиксовирусов. Размер от 150 до 250 нм. Вирион состоит из оболочки и внутреннего компонента,123  который представлен рибонуклеопротеидной спиралью. Коэффициент седиментации - 1000 S в градиенте сахарозы. Вирус ПГ-3 штамм ПГ/К-2002 имеет 7 структурных белков:  1. Фосфопротеины (р, мол.м. 83 кД);  2. ГА-нейроминидазный гликопротеин (HN мол. м. 69 к.Д);  3. Главный нуклеокапсидный протеин (Np, мол.м. 66 к.Д);  4. Гликопротеин (F, мол.м. 55 кД);  5. Матричный белок(М. мол.м. 38 кД);  6. Белок L-полимераза (мол.м. 180 кД);  7. Клеточный активный белок А (мол.м. 43 кД)2Адаптационные свойства и контагиозностьВирус репродуцируется в культуре перевиваемой линии клеток почки сайги (ПС) при оптимальной температуре (37±0,5°С), значений рН-7,0-7,4 до уровня титров инфекционности 8,0-8,5 lg ТЦД₅₀/мл. Штамм не контагиозен для КРС.3Патогенные свойстваВирус после аттенуации не проявляет патогенность для лабораторных и восприимчивых животных при внутримышечном и подкожном способах введения.4Свойства полезного вещества, продуцируемые вирусом (антигенные свойства)Вирус вызывает образование вируснейтрализующих протективных и гемагглютинирующих антител. Штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 агглютинирует эритроциты морской свинки, кролика, свиньи, коровы, мыши, овцы, козы, человека, белой мыши. После инактивации индуцирует иммунитет у КРС против эпизоотических вариантов возбудителя ПГ-3, циркулирующих в настоящее время на территории Российской Федерации.5Терморезистентность (Т-56 признак)Полностью утрачивает инфекционную и ГА-активность в течение 90 минут.

1236ИнгибиторочувствительностьПод воздействием хлороформа, эфира и других растворителей полностью утрачивает инфекционную активность. Вирус инакивируют растворы формальдегида, сернокислой меди, теотропина, димер этиленимина.7Стабильность генетических и иммунобиологических признаковСтабильность генетических и иммунобиологических признаков сохранялись при его пассировании в культуре клеток чувствительных к вирусу ПГ-3 в течение не менее 18 пассажей (срок наблюдения).8Контаминация бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусамиНе контаминирован бактериями, грибами, микоплазмами и посторонними вирусами.9Биотехнологические характеристикиШтамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность как в нативном виде, так и после инактивации, и по перечисленным признакам соответствует полевым изолятам. Штамм ПГ/К-2002 предназначен для использования в качестве сырья для приготовления живых и инактивированных вакцин против ПГ-3 КРС. Этот вирус размножается в культурах ПЭК, ПТ, ВНК-21, ПС, MDBK и накапливается в титрах 5,0-8,5 lg ТЦД₅₀/мл.10Сохраняемость и условия храненияШтамм ПГ/К-2002 стабилизируют обезжиренным молоком или другими стабилизаторами и хранят в лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 60°С. Вирус освежают пасссированием в культуре клеток ПС один раз в 3 года.11Оригинальность и патентоспособностьШтамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 по показателям инфекционности, антигенности и иммуногенности является оригинальным, в таксономическом отношении, новым ранее неизвестным вариантом вируса ПГ-3.

Примеры, поясняющие сущность предлагаемого изобретения.

Пример 1.

Для получения инактивированной вакцины против ПГ-3 КРС из штамма ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 используют перевиваемую монослойную культуру клеток ПС, к которой адаптирован предложенный штамм вируса ПГ-3. В качестве поддерживающей используют среду Игла MEM без сыворотки с добавлением антибиотиков при рН 7,4-7,6. Культуру клеток заражают вирусом из расчета 1:100-1:1000 (доза инфицирования - 0,1-0,01 ТЦД₅₀/клетку). Культивирование вируса ведут при температуре 36-37°С в течение 48-96 часов до разрушения монослоя на 80-90%. После этого вируссодержащую суспензию сливают в емкость и отбирают пробы для контроля стерильности и биологической активности вируссодержащего материала. Для составления серии вакцины используют только стерильные вируссодержащие жидкости, прошедшие контроль на МПА, МПБ и тиогликолевой среде. Одновременно берут пробы (2-3 мл) для определения инфекционного титра вируса (в каждой емкости) перед инактивацией вирусного сырья. Инфекционную активность определяют по общепринятой методике. Титр вируссодержащего сырья должен быть не ниже 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³. В полученный вируссодержащий материал вносят в качестве инактиванта теотропин в конечной концентрации 0,1% (дробно), для коррекции рН до величины не выше 7,3±1,0 вносят двухзамещенный фосфорнокислый калий, содержимое сосудов тщательно перемешивают и выдерживают при 36-37°С в течение 6-7 суток периодически перемешивая.

Приготовленный таким образом полуфабрикат вакцины проверяют на стерильность и полноту инактивации. Проверку на отсутствие контаминации проводят по ГОСТу 28085-89, полноту инактивации вируса проверяют путем 3-кратного пассирования в культуре клеток ПС.

Для нейтрализации теотропина после окончания процесса инактивации в антигенсодержащую суспензию добавляют раствор тиосульфата натрия из расчета 80% к объему использованного теотропина.

Сорбирование полученного антигена осуществляют 6%-ным гелем гидроокиси алюминия (ГОА) из расчета 200 см³ на 1000 см³ антигенсодержащего материала. После седиментации ГОА в течение ночи к полученному адсорбенту добавляют 10%-ный раствор сапонина из расчета 10,0 см³ на 1000 см³ суспензии полуфабриката.

Полученная таким образом вакцина представляет собой суспензию розового цвета. При хранении выпадает рыхлый осадок, легко разбивающийся после встряхивания. Полученную вакцину расфасовывают в стеклянные флаконы и подвергают контролю на стерильность по ГОСТу 28085-89. Безвредность вакцины проверяют на 10 мышах. Авирулентную, безвредную и стерильную вакцину проверяют на антигенную активность на кроликах.

Полученная ГОА-сапониновая инактивированная вакцина против ПГ-3 имеет оптимальный количественный состав (%):

Авирулентный штамм ПГ-3/К-2002 вируса ПГ-3 КРС78,0ГОА (6%-ный раствор)20,0Теотропин (10%-ный раствор)1,0Сапонин (10%-ный раствор)1,0

Полученная вакцина предназначена для применения в неблагополучных по ПГ-3 КРС хозяйствах и угрожаемых зонах для профилактики этого заболевания. Вакцинации подлежат клинически здоровые животные. Телят вакцинируют в 1-6 месячном возрасте. Вакцину вводят подкожно в области средней трети шеи двукратно с интервалом 14-28 дней в объеме 2,0 см³. Иммунитет формируется через 2 недели с начала вакцинации, после повторной вакцинации иммунитет сохраняется не менее 12 месяцев (срок наблюдения).

Пример 2.

Проведены испытания предлагаемой инактивированной культуральной вакцины против ПГ-3, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей (%):

Теотропин (10%-ный раствор)1,0Гель ГОА (6%-ный раствор)20,0Сапонин (1%-ный раствор)1,0Авирулентный антигенный материал из штамма ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 с инфекционной активностью 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³78,0

Эффективность инактивированной вакцины против ПГ-3 КРС, содержащей вирус ПГ-3 (шт. ПГ/К-2002), приготовленной так, как описано в примере 1, испытана на телятах 1-3 месячного возраста в ЗАО "Славянское" Орловской области. Вакцину применяли так, как описано в примере 1. Наблюдение за привитыми телятами показали, что испытуемая вакцина является безвредным препаратом, позволяющим ликвидировать респираторные болезни молодняка КРС и снизить до минимума его гибель.

Пример 3.

Проведены испытания предлагаемой инактивированной культуральной вакцины против ПГ-3, изготовленной так, как описано в примере 1, и содержащей (%);

Теотропин1,0Гель ГОА (6%-ный водный раствор)20,0Сапонин (10%-ный раствор)1,0Авирулентный антигенный материал из штамма ПГ/К-2002 вируса ПГ-3 с инфекционной активностью 7,5-8,0 lg ТЦД₅₀/см³78,0

Эффективность инактивированной вакцины против ПГ-3 КРС, содержащей вирус ПГ-3 (штамм ПГ/К-2002), изготовленной так, как описано в примере 1, испытана на телятах на комплексе "Мценский" Орловской области.

Вакцину применяли так, как описано в примере 1. Наблюдения за привитыми телятами показали, что испытуемая вакцина является безвредным препаратом, позволяющим ликвидировать респираторные болезни молодняка КРС и снизить до минимума гибель животных.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении предлагаемого изобретения при следующей совокупности условий:

- инактивированная вакцина против ПГ-3 КРС, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно, в ветеринарной вирусологии и биотехнологии;

- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в формуле изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке средств и методов;

- штамм ПГ/К-2002 вируса ПГ-3, полученный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной и антигенной активностью как в нативном виде, так и после инактивации и пригоден для изготовления вакцинных и диагностических препаратов как из живого так и из инактивированного вируса.

Литература

1. Инфекционные болезни животных. Справочник. Под. ред. Д.Ф.Осидзе, - М.: Агропромиздат, 1987, 19-99.

2. Пат. ФРГ №2323847, А 61 К 39/02, 1976.

3. Пат РФ №2111011, А 61 К 39/295, А 61 К 39/15? 39/265, 20.05.98 г.

4. Сюрин В.Н. и др. Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП, 1998, 242-251.

5. Пат. РФ №2182494. А 61 К 39/155, 20.05.2002 г.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под регистрационным наименованием «ПГ/К-2002»-ДЕП. Штамм имеет высокую инфекционную, антигенную и иммуногенную эффективность и может быть использован для изготовления вакцинных и диагностических препаратов. 1 табл.

Штамм вируса парагриппа-3 крупного рогатого скота, сем. Paramixoviridae, род Parainfluenza, подтип Parainfluenza virus3, коллекция ВГНКИ N «ПГ/К-2002»-ДЕП, для изготовления вакцинных и диагностических препаратов.