УСТРОЙСТВО ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ ВОЗДУШНОЙ И ВОДНОЙ СРЕДЫ Российский патент 2004 года по МПК G01N21/64 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при разработке систем контроля окружающей среды, в частности систем микробиологического контроля воздушной и водной среды.

Для решения проблем, связанных с биотерроризмом и охраной здоровья человека, актуальной задачей является создание систем быстрого обнаружения малых концентраций биологических агентов в воздушной и водной среде. С этой целью создаются новые и совершенствуются старые системы и методы отбора проб, методы исследования проб, системы инструментальной обработки результатов исследований. При этом особое внимание уделяется упрощению и удешевлению устройств, уменьшению доли ручного труда. Эффективными методами при обнаружении малых концентраций биологических объектов в образце являются твердофазные иммунофлуоресцентные методы анализа с использованием длительно люминесцирующих меток и регистрации сигналов с временным разрешением. При этом большое внимание уделяется созданию чувствительных оптических систем для возбуждения люминесценции и измерения слабых сигналов эмиссии люминесценции исследуемого образца.

Известно устройство для фотолюминесцентного картографирования полупроводниковых пластин (патент России №2172946, класс МКИ G 01 N 21/64). Устройство содержит предметный столик для размещения на нем полупроводниковой пластины, лазерный источник излучения, формирующий луч с практически плоским волновым фронтом, который распространяется вдоль оптической оси и фокусируется на верхней поверхности полупроводниковой пластины, расширитель лазерного пучка с объективом для получения минимального диаметра светового пучка на пластине, систему сканирования, содержащую два стола линейного перемещения и поворотный стол, выполненный с возможностью вращения расположенного на нем предметного столика, при этом полупроводниковая пластина фиксируется на предметном столике посредством вакуумного присоса; датчик фотолюминесценции, который содержит расположенный на оптической оси объектив для фокусировки лазерного пучка на поверхности полупроводниковой пластины, расположенное над объективом плоское наклонное зеркало с отверстием для прохождения лазерного пучка и конденсор, расположенный под плоским наклонным зеркалом, причем фокус объектива сопряжен с фотоприемником через плоское наклонное зеркало. Конденсор выполнен в виде линзы или системы линз, по крайней мере, одна из которых имеет осесимметричное отверстие для похождения лазерного луча без преломления и расположена коаксиально с объективом.

Центральные части линз конденсора без отверстий участвуют вместе с объективом в формировании светового пучка на поверхности образца, а периферийные области линз конденсора собирают фотолюминесценцию, которая далее направляется плоским наклонным зеркалом на фотоприемник. Объектив выполнен в виде ахроматической склеенной линзы с числовой апертурой 0,25 и создает световой поток с диаметром пятна 5 мкм. Вся мощность лазерного пучка доходит до поверхности полупроводниковой пластины, за исключением потерь на поверхностях объектива, при этом относительные потери фотолюминесценции на коаксиальных отверстиях конденсора составляют примерно 12% по отношению ко всему потоку, собираемому конденсором. Для устранения отраженного (рассеянного) лазерного излучения перед фотодетектором устанавливают фильтр.

Устройство не может быть использовано для анализа множества образцов, нанесенных на длинную ленту, из-за сложности перемещения ленты по X-Y осям и тем более ее вращения.

Известна система отображения для оптического сканера, используемая для считывания информации с микрорядов ДНК или РНК, биочипов и других биологических образцов (РСТ №00/50878, класс МКИ G 01 N 21/64). Устройство содержит несколько источников излучения на различных длинах волн, зеркало для направления лазерного пучка света на образец, систему затворов для выбора одной или нескольких длин волн возбуждения исследуемого образца; объектив для фокусирования света на образец, который при фокусном расстоянии порядка 6 мм и диаметре лазерного светового потока 0,6 мм создает в плоскости образца диаметр светового пятна порядка 5 мкм. Лазерный луч направляется на исследуемый образец с помощью зеркала, размеры которого выбраны таким образом, что позволяют получить максимально возможный поток эмиссии образца на фотодетектор, в качестве которого используется ФЭУ. Кроме того, зеркало позволяет удалить из канала измерения значительную часть отраженного от образца возбуждающего потока. Для улучшения соотношения сигнал/шум в измерительном канале использованы узкополосные фильтры. Сканер разделяет интересующую область на множество пикселей, причем флуоресценция каждого измеряется отдельно. Для осуществления измерений эмиссии флуоресценции микроплощадок используют конфокальный сканирующий микроскоп. Устройство не может быть использовано для сканирования микрообластей образцов, нанесенных на длинную ленту. Кроме того, значительная часть возбуждающего потока лазерного излучения теряется в элементах оптической системы, фокусирующей световой поток на образец, что ухудшает чувствительность устройства при обнаружении малых объектов в пределах каждой микрообласти (пикселя).

Известно устройство для детектирования параметров образцов жидкости (патент РСТ №90/10874, класс МКИ G 01 N 35/00). Устройство может быть использовано для исследования реагентных пленок и представляет собой конвейер, посредством которого пленка (лента) сматывается с катушки; на пленку наносится исследуемый образец с помощью средства для отбора и подачи пробы, затем в резервуаре с реагентом данный участок ленты инкубируется заданное время и поступает в зону измерения детектирующего устройства. Отработанная пленка поступает в другой резервуар. В устройстве имеется возможность перемещения пленки в прямом и обратном направлении.

Устройство не предназначено для детектирования малых концентраций различных биологических агентов в образцах, взятых из окружающей среды.

Известно устройство для микроскопических исследований продуктов и биологических жидкостей (патент РСТ №85/05691, класс МКИ G 01 N 35/00). Устройство содержит длинную гибкую ленту, намотанную на барабан, средство для перемещения ленты в аппаратуре, средство для нанесения на ленту определенного количества жидкого образца, содержащего микротела, которые должны быть исследованы; средство для фиксирования образца на ленте; предметный столик микроскопа; средство для размещения ленты с образцом на поверхности предметного столика; средство фокусировки микроскопа на образец на ленте; средство удержания ленты на предметном столике в фокальной плоскости микроскопа; средство для обработки, перед исследованием в микроскопе, зафиксированного на ленте образца реагентной жидкостью, это средство может быть выполнено в виде ванны, наполненной обрабатывающей жидкостью, с роликами, позволяющими перемещать ленту и погружать ее в жидкость. В устройстве может быть также использовано средство для сушки ленты перед исследованием в микроскопе. Для исследования флуоресцирующих искомых микротел под микроскопом используется ФЭУ.

После нанесения на пленку образец может подвергаться одной или нескольким операциям обработки и отмывки/сушки, а аппаратура может содержать несколько блоков для выполнения этих операций; операция сушки может осуществляться потоком теплого воздуха. Устройство может быть использовано для автоматического счета микроорганизмов в исследуемом образце, их формы и размеров, однако оптическая система устройства не предназначена для сканирования отдельных микрозон поверхности исследуемого образца.

Известно устройство для экологического контроля загрязненной водной среды (патент РФ №2034274, класс МКИ G 01 N 21/64). Устройство предназначено для измерения температуры, солености, прозрачности водной среды и содержания в ней планктона. В устройстве имеются средства для отбора проб воды, анализа проб на прозрачность, флуоресцентность и другие физико-химические параметры, документирования результатов измерений, сравнения их с пороговыми значениями и выработки управляющих сигналов или сигналов тревоги. Однако устройство не предназначено для выявления наличия в водной среде биологических агентов, таких как микроорганизмы, вирусы и т.п.

Известно сканирующее устройство для измерения спектрального распределения на субстрате (патент США №5425841, класс НКИ 356-47). Устройство содержит источник возбуждающего излучения (например, лазер), оптическую систему возбуждения, держатель образца, оптическую систему измерения и фотодетектор. Сканирующая система выполнена в виде двух элементов: для перемещения сфокусированного лазерного пучка по оси, перпендикулярной оптической оси, использовано гальванометрическое зеркало, при этом размер пятна (диаметр), освещаемого возбуждающим световым потоком, находится в пределах 5-50 мкм; для сканирования по второй оси, перпендикулярной первой, перемещают держатель с образцом. Однако при сканировании микрозон на поверхности образца, нанесенного на длинную ленту, перемещение ленты по одной из осей не может быть осуществлено с достаточной точностью.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является устройство для оптической дискриминации оснований нуклеиновых кислот (ЕР №0541296, класс МКИ G 01 N 21/64). Устройство содержит барабан с лентой, имеющей зеркальную поверхность; средство для перемещения ленты с постоянной скоростью; средство для нанесения на ленту моноклональных антител (AT) в виде отдельных зон (антитела могут быть нанесены заранее), соответствующих каждому из определяемых оснований; средство для отмывки несвязавшихся антител; средство для нанесения оснований ДНК на зафиксированные зоны моноклональных антител; средство для нанесения на зоны с AT и основаниями люминесцентных антител, специфичных к основаниям; средство отмывки несвязавшихся люминесцентных антител, специфичных к основаниям; средство внесения в зоны люминесцентных реагентов (средство для возбуждения люминесценции) и детектор люминесценции с фотоприемным устройством, в качестве которого используется телевизионная камера или ФЭУ. Лента с образцами для исследования перемещается непрерывно с такой скоростью, что создаются условия для проведения реакции специфического связывания и в поле зрения детектора находится только одно пятно. Поверхность ленты выполнена зеркальной, что позволяет отразить облучающий поток и не допустить его попадания на фотодетектор. Использование различных люминесцентных антител, люминесцирующих на различных длинах волн и связанных, соответственно, с различными основаниями (A, G, С и Т), позволяет дискриминировать одно основание от другого, используя оптические средства. С помощью средства для нанесения на ленту наносятся зоны диаметром примерно 30 мкм, причем диаметр пятна, создаваемого осветительной системой, составляет 1-2 мм. Фотодетектор регистрирует сигналы люминесценции оснований ДНК. Устройство предназначено для дискриминации четырех оснований одиночных фрагментов ДНК путем измерения интегрального значения эмиссии флуоресценции всей детектируемой зоны. Поэтому при исследовании гетерогенных образцов, взятых из окружающей среды (воды, воздуха), данное устройство не сможет обеспечить высокую чувствительность и селективность при определении малых концентраций множества биологических агентов.

Задачей является создание устройства, действующего длительное время в автономном режиме, для автоматического медицинского мониторинга и санитарно-эпидемиологического контроля окружающей среды в отношении носителей опасных инфекционных заболеваний и токсикантов.

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является обнаружение малых концентраций четырех и более аналитов (биологических агентов) на фоне гетерологичных примесей и проведение исследований в реальном масштабе времени.

Технический результат достигается предлагаемым изобретением.

Сущность изобретения заключается в том, что в устройство для биологического контроля воздушной и водной среды, содержащее катушку с лентой для нанесения на нее зон исследуемого образца с искомыми биологическими агентами и функционально связанные средство для перемещения ленты, средство для нанесения на ленту исследуемого образца по группам зон, средство для обработки этих зон конъюгатами меченых люминесцентной меткой специфичных к искомым биологическим агентам антител и средства для возбуждения и детектирования люминесценции исследуемого образца с фотоприемным устройством, введены средство для определения биологических агентов в зонах, средство управления и связи и средство для высушивания зон с исследуемыми образцами, при этом средство для возбуждения люминесценции исследуемого образца содержит оптически связанные источник излучения, объектив для фокусирования возбуждающего светового потока на исследуемой зоне и систему сканирования отдельных микроплощадок в зонах сфокусированным световым потоком, которая выполнена в виде зеркала, неподвижно установленного на валу, связанном с ведущей прямоугольной рамкой, выполненной с возможностью поворота вокруг оптической оси и оси, перпендикулярной к ней, причем вал с закрепленным на нем зеркалом установлен неподвижно в меньшем плече рамки, средство для определения биологических агентов содержит блок памяти люминесценции искомых биологических агентов, блок памяти гетерогенных фонов, блок выделения фонов анализируемой зоны, блок выделения типов люминесценции биологических агентов и блок нормирования измеряемой люминесценции, при этом выходы блока памяти искомых биологических агентов, блока памяти гетерогенных фонов и блока выделения фонов анализируемой зоны связаны с первым, вторым и третьим входами блока выделения типов люминесценции биологических агентов соответственно, четвертый вход которого и вход блока выделения фонов анализируемой зоны связаны с выходом блока нормирования измеряемой люминесценции, вход которого связан с выходом фотоприемного устройства средства для детектирования люминесценции исследуемого образца, а выход блока выделения типов люминесценции биологических агентов связан со входом средства управления и связи, средство для высушивания зон с исследуемым образцом на ленте установлено после средства для отмывки несвязавшихся меченых комплексами Pt копропорфирина антител (биосенсорных реагентов, например авидин-стрептавидин, диоксигенин).

Технический результат достигается также изобретением, конкретизированным в дополнительных пунктах формулы изобретения.

Средство для детектирования люминесценции исследуемого образца содержит оптически связанные входной объектив для сбора люминесценции образца, выходной объектив для фокусирования люминесценции образца на катоде фотоприемного устройства и интерференционные светофильтры, установленные перед выходным объективом.

Входной объектив средства для детектирования люминесценции исследуемого образца выполнен с рабочим отрезком 8...12 мм и апертурой более 1 ср.

Использование входного объектива с такими параметрами и интерференционного светофильтра, установленного в предложенной оптической схеме средства для детектирования люминесценции исследуемого образца, позволяет собрать максимальный световой поток с исследуемой зоны и значительно уменьшить влияние фоновой люминесценции.

Объектив для фокусирования возбуждающего светового потока на исследуемом образце установлен внутри входного объектива средства для детектирования люминесценции исследуемого образца и соосно с ним и выполнен с рабочим отрезком 10...14 мм.

Размещение одного объектива в другом позволяет каналы возбуждения и регистрации люминесценции исследуемого образца разместить со стороны образца, что даст возможность получить максимально возможный световой поток люминесценции, который также возрастает за счет уменьшения вклада фоновой люминесценции элементов оптической системы, возникающий при прохождении возбуждающего светового потока.

Средство для нанесения на ленту исследуемого образца по группам зон выполнено в виде дозирующего насоса для создания потока исследуемой текущей среды через ленту по питательному и сливному трубопроводам с возможностью одновременного нанесения всех зон.

Средство позволяет осаждать на ленте оптимальное количество биологических агентов, что дает возможность улучшить соотношение сигнал/шум и увеличить чувствительность детектирования и селективного выделения биологических агентов.

Лента выполнена в виде полимерного мембранного фильтра с диаметром пор в пределах 2...10 мкм, покрытого слоем блокирующего свободные места связывания на поверхности пленки белка, например бычьего сывороточного альбумина.

Лента может быть выполнена в виде полимерного мембранного фильтра с диаметром пор в пределах 2...10 мкм, на который нанесены в виде групп зон антитела, специфичные к искомым биологическим агентам, при этом на зоны нанесен слой блокирующих белков, например бычьего сывороточного альбумина.

Полимерная лента указанной конструкции позволяет при прокачивании через нее потока жидкости или воздуха с биологическими агентами удалить основную часть гетерогенных примесей (фрагментов клеток микроорганизмов, например), с другой стороны, создает условия для осаждения искомых биологических агентов, связывания их с антителами и удаления промывающей воды. Защитная пленка из блокирующего белка позволяет сохранить реактивные свойства ленты, а все признаки вместе позволяют повысить чувствительность и селективность при детектировании малых количеств различных биологических агентов длительное время без участия оператора.

Авторам не известно техническое решение, имеющее совокупность признаков, подобную заявляемой. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию новизны.

Сканирование отдельных микроплощадок в зоне сфокусированным до размеров микроплощадок пучком света позволяет значительно уменьшить влияние фоновой люминесценции на измеряемый полезный сигнал. Высушивание ленты с образцами перед измерением люминесцентного сигнала исключает тушащее действие воды и кислорода на комплексы Pt копропорфирина, использование которых в качестве меток увеличивает чувствительность измерений как за счет увеличения квантового выхода данных металлокомплексов, так и за счет разнесения полос возбуждения и регистрации люминесценции. Эффект, получаемый при использовании Pt копропорфирина, известен (патент РСТ WO 94/01774, класс МКИ G 01 N 33/543, заявка РФ №2001114151/14, класс МКИ G 01 N 33/76). Однако свойство порфиринов длительное время сохранять реактивность в конъюгатах с антителами позволяет не только повысить чувствительность и селективность измерений, но и сохранять их в процессе работы устройства в автономном режиме.

Вся совокупность признаков позволяет улучшить соотношение сигнал/шум и за счет повышения чувствительности дает возможность длительное время селективно детектировать малые количества различных биологических агентов в присутствии гетерогенных примесей в образцах, взятых из естественных источников при контроле окружающей среды. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию уровня техники.

Возможность надежного выявления биологических агентов в любой момент на протяжении длительного времени в автономном режиме позволяет осуществлять непосредственное управление процессом контроля экологического состояния среды.

Изобретение может быть использовано для контроля биологической безопасности и биологического мониторинга окружающей среды, для разработки новейших технологий биологического микроанализа и для санитарно-эпидемиологического контроля в отношении опасных инфекционных заболеваний, для решения глобальных проблем борьбы с биотерроризмом и охраны здоровья человека. Следовательно, предлагаемое изобретение отвечает критерию промышленной применимости.

На фиг.1 показана структурная схема варианта осуществления предлагаемого устройства; на фиг.2 показаны каналы возбуждения и регистрации люминесценции исследуемого образца со сканирующей системой; на фиг.3 показан участок ленты с нанесенными на нее зонами образцов; на фиг.4 показана картина сканирования зоны световыми пятнами; на фиг.5 показана блок-схема средства для выявления импульсов люминесценции, соответствующих искомым биологическим агентам.

Устройство (фиг.1) содержит катушку с лентой 1 для нанесения исследуемого образца в виде зон 2; средство 3 для нанесения на ленту 2 исследуемого образца по группам зон (например, четыре зоны в каждой группе для определения четырех биологических агентов), средство 3 может содержать дозирующий насос (не показан) для создания потока жидкости или аэрозоля из воздуха через ленту по питательному 4 и сливному 5 трубопроводам; средство для обработки зон 2 с исследуемыми образцами конъюгатами меченых флуоресцентной меткой антител имеет микродозаторы 6 и связанные с ними контейнеры 7 для конъюгатов; средство 8 для отмывки несвязавшихся антител и контейнер 9 для сбора промывающей жидкости; средство 10 для высушивания зон 2 с исследуемыми образцами на ленте 1; фотоприемное устройство 11; блок 12 определения биологических агентов в зонах; средство 13 управления и связи.

Устройство (фиг.2) содержит также предметный столик 14, прижимной столик 15 для фиксирования ленты 1 в положении детектирования люминесценции; зеркало 16 для сканирования, укрепленное жестко на валу 17; ведущую рамку 18 для поворота вала 17 и зеркала 16 вокруг двух взаимно перпендикулярных осей: приводом 19 - вокруг оптической оси, приводом 20 - вокруг оси, перпендикулярной к ней; объектив 21 для фокусирования возбуждающего светового потока на исследуемом образце; лазер 22; входной объектив 23 средства детектирования люминесценции исследуемого образца, внутри которого и соосно с ним установлен объектив 21; интерференционный фильтр 24 и выходной объектив 25 для фокусирования люминесценции образца в зоне 2 на фотокатоде 26 фотоприемного устройства (ФПУ) 11; светоделитель 27; блок измерения энергии возбуждения 28, демпферы 29 для гашения колебаний ведущей рамки 18 при сканировании зоны 2.

Устройство также содержит (фиг.3) контрольный люминесцентный образец 30; отверстия 31 для прохождения возбуждающего светового потока на контрольный образец 30, отверстия расположены на оси, параллельной оси расположения группы 32 зон 2 (А, В, С, D), напротив каждой зоны.

На фиг.4 показаны расположенные на ленте 1 сканируемая площадка 33 в зоне 2 и нахождение световых пятен 34 при сканировании.

Блок 12 для определения биологических агентов (фиг.5) содержит блок 35 памяти люминесценции биологических агентов; блок 36 памяти гетерогенных фонов; блок 37 выделения фонов анализируемой зоны; блок 38 выделения пиков биологических агентов; блок 39 нормирования измеряемой люминесценции.

Для выявления биологических агентов (БА) в исследуемой среде в устройстве используют два типа ленты. В первом случае на рабочую поверхность полимерного мембранного фильтра с диаметром пор 2...10 мкм, который используют в качестве ленты, наносят слой бычьего сывороточного альбумина (БСА), высушивают, ленту сматывают в катушку и сохраняют до использования. Во втором случае на такую же ленту наносят антитела, специфичные к искомым БА, в виде групп 32 зон 2 - зоны А, В, С, D (фиг.3), причем каждая зона содержит антитела, отличные от антител в других зонах. Каждая зона имеет площадь 2-10 мм, зоны разнесены друг от друга на расстояние примерно 1 мм, а группы зон разнесены на расстояние примерно 35 мм. Затем рабочую поверхность ленты покрывают слоем блокирующих белков, например БСА, высушивают, сматывают в катушку и хранят до использования. Лента дополнительно может быть обработана раствором сахаров, что позволяет длительный срок сохранять реактивность биоспецифических компонентов (антител).

Средство 3 (фиг.1) для нанесения исследуемого образца с БА в зоны может быть выполнено в виде проточного модуля для прокачивания воды или аэрозоля из воздуха через мембранный фильтр, при этом производительность прокачивающего модуля определяется временем осаждения БА на фильтре или временем связывания БА с антителами и необходимостью получения представительной пробы. Осаждение исследуемого образца во все зоны осуществляется одновременно. Средство 7 (фиг.1) для нанесения в зоны специфических меченых комплексами Pt копропорфирина антител представляет собой блок емкостей 7 объемом до 30 мл с конъюгатом антител для каждого определяемого БА в рабочем разведении. Объем емкостей достаточен для работы устройства в автономном режиме по крайней мере в течение трех месяцев. Конъюгаты сохраняют специфическую активность при комнатной температуре до трех месяцев и более. С емкостями связаны автоматически управляемые микродозаторы 6, с помощью которых в каждую зону наносят конъюгат в объеме 1-3 мкл.

Для отмывания несвязавшегося с БА конъюгата может быть использовано стандартное средство 8, которое должно обеспечивать гарантийный смыв несвязавшихся антител и фрагментов клеток с реакционных зон для уменьшения мешающей фоновой люминесценции. Вода, используемая для отмывки, собирается в емкости 9.

В качестве средства 10 для высушивания зон перед детектированием БА может быть использовано устройство, обеспечивающее высушивание методом обдува ленты струей теплого сухого воздуха.

Оптический канал возбуждения (фиг.2) содержит импульсный синхронный лазер 22 с длиной волны излучения 532 нм, объектив 21 для фокусирования лазерного излучения в плоскости образца и сканирующую систему для перемещения пучка света по зоне - сканирования микроплощадок. Объектив 21 выполнен т.о., что при длине оптического хода от выходного окна лазера до объектива 150-200 мм и диаметре пучка света на выходе лазера 0,5-0,7 мм обеспечивает в плоскости исследуемого образца диаметр сканирующего пятна света, равный 20...40 мкм, что примерно равно диаметру сканируемой микроплощадки в зоне.

Рамка 18 сканирующей системы выполнена с возможностью поворота вокруг каждой из двух взаимно перпендикулярных осей на ± 2°. Размеры сканируемой площадки находятся в пределах 2х2 мм. При большом соотношении плеч сканирования, например 1:5, и указанных размерах сканируемой площадки и углах поворота рамки нелинейность сканирования относительно невелика, что позволяет смягчить требования к точности приводов и изготовить надежные, длительно работающие приводы.

Чтобы надежно просканировать всю площадь исследуемой зоны, шаг сканирования выбирают меньше размера микроплощадки. Например, при диаметре микроплощадки, равном 40 мкм, шаг сканирования выбирают равным 30 мкм. Перекрытие пятен сканирования показано на фиг.4.

Фокусирующий объектив 21 и входной объектив 23 канала детектирования имеют примерно равные рабочие отрезки. Это дает возможность разместить объектив 21 внутри объектива 23, что позволяет в значительной степени уменьшить паразитное влияние фоновой люминесценции оптических элементов на полезный сигнал, т.е. улучшить соотношение сигнал/шум и, в конечном счете, повысить чувствительность устройства при измерении малых концентраций БА.

Устройство работает следующим образом.

Устройство подготавливают к работе и включают. Рабочий цикл выявления БА в пробе включает пять стадий и занимает 15 минут от момента контактирования исследуемой среды с лентой до выдачи результата анализа в управляющую сеть (или в блок 13).

На первой стадии анализируемая среда с помощью средства 3 по питательному 4 и сливному 5 трубопроводам прокачивается через ленту 1 со скоростью, достаточной для адсорбирования БА на поверхности ленты и/или биоспецифического связывания их с антителами, если они нанесены на зоны 2. Проба с биологическими агентами наносится в виде пятен площадью 2-10 мм² сразу на несколько зон, например четыре зоны (фиг.3). Несвязавшиеся с антителами или неадсорбировавшиеся БА и гетерогенные примеси проходят через поры в сливной трубопровод 5. При этом время концентрирования (скорость прокачивания) выбирают таким, чтобы в зонах A...D адсорбировалось количество БА, достаточное для достоверного анализа.

На второй стадии исполнительный лентопротяжный механизм (не показан) перемещает ленту в зону действия средства 6, 7 (фиг.1) для обработки зон 2 конъюгатами специфичных к различным БА антител с люминесцентной меткой, в качестве которой используют комплексы Pt копропорфирина. Использование данных меток позволяет повысить чувствительность измерений как за счет высокого квантового выхода этих порфиринов, так и за счет того, что измерение эмиссии люминесценции осуществляется в диапазоне длин волн 640-670 нм, что дает возможность уменьшить отрицательное влияние фона коротковолновой флуоресценции элементов измерительной системы на соотношение сигнал/шум. Кроме того, использование комплексов Pt копропорфирина позволяет проводить измерения в режиме счета фотонов с временным разрешением сигнала. Объем вносимого в зону конъюгата составляет 3-5 мкл, при этом связывание конъюгатов в зонах с БА происходит в течение 2-2,5 минут.

На третьей стадии исполнительный лентопротяжный механизм перемещает ленту в зону действия средства 8 для отмывки несвязавшихся конъюгатов меченых антител.

На четвертой стадии исполнительный лентопротяжный механизм перемещает ленту в зону действия средства 10 для высушивания реакционных зон на ленте. Операция высушивания необходима для того, чтобы исключить влияние свободной воды на результаты измерения длительной люминесценции Pt копропорфиринов, на которую вода оказывает тушащее действие. Подсушивание можно осуществлять воздуходувкой с направленной струей теплого воздуха в течение одной минуты.

На пятой стадии исполнительный лентопротяжный механизм перемещает по стрелке А (фиг.3) первую реактивную зону А в измерительный объем, где осуществляется возбуждение и регистрация сигнала длительной люминесценции Pt копропорфирина, связанного с комплексом “первый искомый БА - специфичное к нему антитело”. Как только зона А остановится напротив окна в предметном столике 14 (фиг.2), лента зафиксируется в этом положении прижимным столиком 15. Сканирование зоны А по микрообластям 33 (фиг.4) осуществляют перемещением сфокусированного объективом 21 (фиг.2) пучка света в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Сканирование осуществляется следующим образом. Последовательность световых импульсов возбуждения с выхода лазера 22 (фиг.2) поступает на зеркало 16, отражается от него и поступает на объектив 21 канала возбуждения люминесценции, который фокусирует световой пучок возбуждения на сканируемой площади 33 зоны А, диаметр сканирующего светового пятна находится в пределах 40 мкм. Световой поток эмиссии люминесценции от первой микроплощадки собирается входным объективом 23 (фиг.2) и направляется на интерференционный фильтр высокого контраста 24. Выделенный по спектру световой поток люминесценции фокусируется на фотокатоде 26 фотоприемного устройства 11, в котором преобразуется в пропорциональное количество электрических импульсов на выходе. Регистрация эмиссии длительной люминесценции осуществляется в режиме счета фотонов с временным разрешением.

После окончания регистрации люминесценции от первой микроплощадки приводы 19, 20 (фиг.2) переводят зеркало 16 в положение возбуждения второй микроплощадки зоны А. Время регистрации эмиссии люминесценции зависит от величины соотношения сигнал/шум, необходимой для получения нужной чувствительности, и требуемой производительности анализа. Чем меньше сканируемая микроплощадка, тем лучше достигаемое соотношение сигнал/шум, но при этом пропорционально увеличивается время сканирования всей зоны. В предлагаемом варианте устройства сканирование одной микроплощадки осуществляется в течение 40...50 мс, при этом для перехода на вторую анализируемую микроплощадку перемещение зеркала 16 осуществляют приводами 19, 20 за 2...4 мс. Перемещение элементов сканирующей системы за такое время носит ударный характер и может вызвать затухающие колебания ведущей рамки 18 с зеркалом 16 и, соответственно, колебания светового пятна. Для гашения этих колебаний служат демпферы 29 (фиг.2).

Циклы сканирования повторяются до тех пор, пока не будет зарегистрирован сигнал от последней сканируемой микроплощадки анализируемой зоны А.

После этого по сигналу блока 13 (фиг.5) световое пятно возбуждающего излучения зеркалом 16 перемещается в положение отверстия 31 (фиг.3) на ленте 1. Через отверстие 31 световой поток освещает контрольный образец 30 с известными стабильными люминесцентными свойствами, люминесценция которого через объектив 23, фильтр 24, объектив 25 поступает на фотокатод 26 фотоприемного устройства 11. Кроме того, часть светового потока лазера ответвляется зеркалом 27 на блок измерения энергии возбуждения 28. Данные измерений накапливаются и обрабатываются в блоках 12 и 13 (фиг.5).

Наличие БА в пробе определяют при обработке измеряемых сигналов в блоке 12 для определения биологических агентов. Сигналы, пропорциональные величинам измеряемой в микроплощадках емкости люминесценции, с выхода ФПУ 11 через блок 39 нормирования измеряемой люминесценции поступают на вход блока 37 и четвертый вход блока 38. В блоке 37 выделения фонов анализируемой зоны сигналы, пропорциональные интенсивности эмиссии люминесценции в зоне, интегрируют по группам, включающим 9...16 соседних микроплощадок, и определяют среднее значение уровня люминесценции для каждой группы. Количество площадок в группе выбирают исходя из характеристик предполагаемых гетерогенных фонов. При отсутствии в группе микроплощадок пика люминесценции БА отношение среднего значения показаний для группы к среднеквадратичному отклонению показаний в группе будет в 3...4 раза выше отношения сигнал/шум для единичной микроплощадки. При наличии пика люминесценции БА в группе микроплощадок это отношение резко уменьшится. Это отношение сравнивают по группам микроплощадок в анализируемой зоне и выделяют группы, в которых предполагают отсутствие пиков. По средним значениям показаний для этих групп микроплощадок определяют огибающую значений фона в анализируемой зоне.

Полученные значения фона для каждой единичной микроплощадки и ожидаемые значения шумов поступают в блок 38 выделения пиков люминесценции БА и сравниваются с данными для гетерогенных фонов, поступающими из блока 36 памяти гетерогенных фонов, и нормируются по пикам люминесценции, полученным из блока 35 памяти искомых биологических агентов.

Затем в этом же блоке 38 сигнал от каждой единичной микроплощадки, поступивший на его четвертый вход, сравнивают с ожидаемым значением шумов и фона для нее. По результатам сравнения определяют форму и объем предполагаемых пиков полезного сигнала, которые сравнивают с аналогичными нормированными данными, полученными из блока 35 памяти искомых биоагентов. По результатам сравнения определяют количество и объем пиков биологических агентов в анализируемой зоне. Исходя из этих данных, дается оценка наличия и количества определяемого БА в исследуемом образце.

Полученные данные с выхода блока 12 определения биологических агентов поступают в блок 13 управления и связи, который осуществляет управление и координацию работы всех узлов и блоков устройства (связи не показаны) и обмен с внешними объектами.

Часть светового потока лазера ответвляется светоделителем 27 (фиг 2) на фотоприемное устройство блока 28 нормирования измеряемой люминесценции по энергии возбуждения. Это позволяет ослабить влияние на измеряемый сигнал нестабильностей светового потока, вызванных временной и температурной нестабильностью лазера.

Нормирование измеряемых сигналов по контрольному образцу 30 (фиг.3) уменьшает влияние на измеряемый сигнал длительных нестабильностей тракта измерения, в том числе температурных нестабильностей фотоприемника, фильтра и др. элементов оптической схемы.

Цикл измерений повторяется для каждой последующей зоны В, С и D и для всех других групп зон в течение всего периода автономной работы устройства с периодом примерно 15 минут на осаждение образца на ленту, обработку зон и измерение. Частота замеров ограничена только временем нанесения на ленту представительной пробы, обработки ее антителами, отмывки, сушки и временем детектирования в аналитическом устройстве. Длина ленты в катушке, размеры секторов ленты, используемых для одного анализа, объем емкостей с конъюгатами, водой и стабильность конъюгатов во времени позволяют создать устройство, работающее в автономном режиме длительное время.

Предлагаемое изобретение пригодно для анализа биологических загрязнений воды природных водных потоков и водоемов или воздушной среды, может быть изготовлено в герметичном корпусе с возможностью частичного или полного погружения. Система анализа дает возможность пользователю предпринимать незамедлительные меры предосторожности, например, при внезапном повышении концентрации биологических агентов в воздушной или водной среде.

Изобретение относится к измерительной технике. Устройство содержит функционально связанные средство для перемещения ленты, средство для нанесения на ленту исследуемого образца по группам зон, средство для обработки этих зон коньюгатами меченых люминесцентной меткой специфичных к искомым биологическим агентам антител, средства для отмывки несвязавшихся антител и высушивания зон с исследуемыми образцами на ленте, средства для возбуждения и детектирования люминесценции исследуемого образца с фотоприемным устройством, с выходом которого связано средство для определения биологических агентов в зонах. Лента выполнена в виде полимерного мембранного фильтра, на который нанесены специфические антитела. Биологические агенты обнаруживают путем сканирования микроплощадок в зонах сфокусированным лазерным пучком. Технический результат – возможность определения малых концентраций аналитов. 7 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Устройство для биологического контроля воздушной и водной сред, содержащее катушку с лентой для нанесения на нее зон исследуемого образца с искомыми биологическими агентами и функционально связанные средство для перемещения ленты, средство для нанесения на ленту исследуемого образца по группам зон, средство для обработки этих зон коньюгатами меченых люминесцентной меткой специфичных к искомым биологическим агентам антител, средство для отмывки несвязавшихся антител для возбуждения и детектирования люминесценции исследуемого образца с фотоприемным устройством, отличающееся тем, что в него введены средство для определения биологических агентов в зонах, средство управления и связи и средство для высушивания зон с исследуемыми образцами на ленте, при этом средство для возбуждения люминесценции исследуемого образца содержит оптически связанные источник излучения, объектив для фокусирования возбуждающего светового потока на исследуемой зоне и систему сканирования отдельных микроплощадок в зонах сфокусированным световым потоком, которая выполнена в виде зеркала, неподвижно закрепленного на валу, связанном с ведущей прямоугольной рамкой, выполненной с возможностью поворота вокруг оптической оси и оси, перпендикулярной к ней, а вал с закрепленным на нем зеркалом установлен неподвижно в меньшем плече рамки, средство для определения биологических агентов содержит блок памяти люминесценции искомых биологических агентов, блок памяти гетерогенных фонов, блок выделения фонов анализируемой зоны, блок выделения пиков люминесценции биологических агентов и блок нормирования измеряемой люминесценции, при этом выходы блока памяти искомых биологических агентов, блока памяти гетерогенных фонов и блока выделения фонов анализируемой зоны связаны с первым, вторым и третьим входами блока выделения пиков люминесценции биологических агентов соответственно, четвертый вход которого и вход блока выделения фонов анализируемой зоны связаны с выходом блока нормирования измеряемой люминесценции, вход которого связан с выходом фотоприемного устройства, а выход блока выделения пиков люминесценции биологических агентов связан со входом средства управления и связи, средство для высушивания зон с исследуемым образцом на ленте установлено после средства для отмывки несвязавшихся меченых комплексами Pt копропорфирина антител.2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что средство для детектирования люминесценции исследуемого образца содержит оптически связанные входной объектив для сбора люминесценции образца, выходной объектив для фокусирования люминесценции образца на катоде фотоприемного устройства и интерференционные светофильтры, установленные перед выходным объективом.3. Устройство по п.1 или 2, отличающееся тем, что входной объектив средства для детектирования люминесценции исследуемого образца выполнен с рабочим отрезком 8-12 мм и апертурой ≥ 1 ср.4. Устройство по п.1, отличающееся тем, что объектив для фокусирования возбуждающего светового потока на исследуемом образце выполнен с рабочим отрезком 10-14 мм, установлен внутри входного объектива средства для детектирования люминесценции и соосно с ним.5. Устройство по п.1, отличающееся тем, что средство для нанесения на ленту исследуемого образца по группам зон выполнено в виде дозирующего насоса для создания потока исследуемой текущей среды через ленту по питательному и сливному трубопроводам с возможностью одновременного нанесения в зоны заданной концентрации образца.6. Устройство по п.1, отличающееся тем, что лента выполнена в виде полимерного мембранного фильтра с диаметром пор в пределах 2-10 мкм, покрытого слоем бычьего сывороточного альбумина.7. Устройство по п.1, отличающееся тем, что лента выполнена в виде полимерного мембранного фильтра с диаметром пор в пределах 2-10 мкм, на который нанесены в виде групп зон антитела, специфичные к искомым биологическим агентам, а поверх зон нанесен слой блокирующих белков.8. Устройство по п.1 или 7, отличающееся тем, что лента выполнена в виде полимерного мембранного фильтра с диаметром пор в пределах 2-10 мкм, на который нанесены в виде групп зон антитела, специфичные к искомым биологическим агентам, а поверх зон нанесен слой бычьего сывороточного альбумина.