СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОССТАНОВИТЕЛЬНОЙ ЕМКОСТИ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ АНТИОКСИДАНТОВ IN VITRO Российский патент 2004 года по МПК G01N33/52 G01N31/22 

Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности и может быть использовано в оценке качества лекарственных средств и биологически активных добавок к пище (БАД), обладающих антиоксидантными свойствами. Способ позволяет использовать результат как критерий оценки в выборе оптимальных технологических режимов при выделении природных жирорастворимых антиоксидантов, а также осуществлять экспресс-тестирование при поиске эффективной системы антиоксидантов-синергистов.

Активизация свободно-радикальных процессов окисления на фоне истощения системы антиоксидантной защиты (САЗ) организма лежит в основе многих неинфекционных болезней: атеросклероза и его тромбонекротических осложнений (инфаркта миокарда, инсульта), сахарного диабета, гипертонии, катаракты, онкологических заболеваний и др. Это определяет необходимость применения антиоксидантов, в том числе и профилактического назначения, для поддержания функциональной активности данной системы. Особенностью САЗ является распределение ее компонентов между гидрофильной и гидрофобной фазами клеточных структур. При этом ключевую роль в обеспечении наиболее важной функции САЗ - защите клеточных мембран - играют жирорастворимые антиоксиданты, проникающие в гидрофобную зону фосфолипидного бислоя. Это объясняет появление на потребительском рынке огромного количества продуктов фармацевтического и пищевого назначения, в которых активными компонентами выступают жирорастворимые антиоксиданты. Вместе с тем, накоплена разноречивая информация о степени проявления антиоксидантных свойств даже тех веществ, традиционно считаемых антиоксидантами (β-каротин, α-токоферол и др.), а также о проявлении синергизма или антагонизма при их совместном применении. Возможно, эта противоречивость обусловлена не реальным, а декларируемым содержанием действующих веществ (концентраций) в тестируемых лекарственных средствах и биологически активных добавках к пище и/или состоянием активных центров (фармакофоров) данных веществ. В связи с этим, необходимы эффективные и простые способы определения и контроля активности жирорастворимых антиоксидантов.

Нами выявлен единственный источник информации, предусматривающий определение восстановительных свойств (емкости) антиоксидантов (Дадали Ю.В., Дадали В.А., Макаров В.Г. Квантово-химический подход к анализу антиоксидантной активности некоторых природных антиоксидантов// Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: Материалы IV междунар. съезда (Великий Новгород, 29 июня - 1 июля 2000 г.) - СПб, 2000. - С. 135-143). Способ предусматривает, оценку антиоксидантной активности с точки зрения термодинамической выгодности процесса переноса электрона и восстановления молекул субстрата окисления. С этой целью проводят квантово-химические расчеты структуры антиоксидантов и субстратов окисления, использую полуэмпирическую параметризацию на основе метода МО ЛКАО (метод линейных комбинаций атомных орбиталей) самосогласованного поля Хартри-Фока с учетом всех валентных электронов и пренебрежением нулевым дифференциальным перекрыванием.

Недостатки: способ непригоден для практического применения при определении восстановительных свойств сложных композиций природных жирорастворимых антиоксидантов и использования в оценке конкретных лекарственных средств и биологически активных добавок к пище, обладающих антиоксидантными свойствами.

Задачей изобретения является разработка легко воспроизводимого и эффективного теста определения восстановительных свойств жирорастворимых антиоксидантов и их содержащих препаратов в модельной системе in vitro.

Техническим результатом является модель определения восстановительной емкости, которая в качестве субстрата восстановления содержит ион железа (III). Моделируется перенос электронов, аналогичный переносу в антиоксидантной системе организма. Рассчитываемый показатель характеризует восстановительную активность единицы концентрации испытуемого вещества и позволит предварительно оценивать качество лекарственного препарата, БАД: количественное содержание действующего вещества, степень сохранности активного центра (степень разрушения, окисленности), отвечающего за антиоксидантные и антигипоксантные свойства.

Определение восстановительных свойств (восстановительной емкости) позволит оценить прямое андиоксидантное действие веществ лишь в первом приближении, поскольку не учитываются: возможные множественные взаимодействия с ферментными системами организма и мембранными структурами и стабильность образовавшихся продуктов реакции окисления. Восстановительные свойства определяются только энергетической выгодностью переноса электрона, а степень участия вещества в суммарном антиоксидантном эффекте в случае комбинирования с другими антиоксидантами будет определяться величиной восстановительной емкости и эффектом синергизма или антагонизма.

Технической новизной является то, что в модельную систему, состоящую из спиртовых растворов хлорида железа (III) и о-фенантролина, вводят хлороформные растворы антиоксидантов, и при условии изменения окраски после 10 мин выдержки определяют величину восстановительных свойств спектрофотометрической регистрацией оптической плотности образовавшегося окрашенного комплекса Fe (II) с о-фенантролином при длине волны 510 нм с последующим расчетом восстановительной емкости единицы концентрации испытуемого вещества по формуле

Х=D/C,

где С - массовая доля антиоксиданта, %; D - величина оптической плотности комплекса Fe (II) с о-фенантролином.

Шкала оценки восстановительных свойств антиоксидантов в относительных единицах позволяет сравнить восстановительную способность различных антиоксидантов, независимо от механизма действия и природы антиоксиданта, так как значение оптической плотности во всех случаях будет определяться концентрацией ионов Fe (II) в растворе и образующимся комплексом Fe (II) с о-фенантролином (красное окрашивание).

В свою очередь, величина оптической плотности будет зависеть от того, насколько испытуемое вещество способно восстановить Fe (III) в Fe (II). Оптическая плотность раствора комплекса Fe (II) с о-фенантролином находится в прямой зависимости от концентрации последнего, калибровочный график проходит через начало координат, таким образом, наблюдается подчинение закону Бугера -Ламберта -Бера.

Способ осуществляют следующим образом.

К 1 мл 0,5% спиртового раствора о-фенантролина и 1 мл 0,2% спиртового раствора хлорида железа (III) прибавляют 3 мл хлороформного раствора испытуемого вещества. Точно через 10 мин после прибавления раствора испытуемого вещества измеряют оптическую плотность раствора красно-оранжевого цвета на спектрофотометре (СФ-56 или аналогичном) при длине волны 510 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 1 мл 0,5% спиртового раствора о-фенантролина, 1 мл 0,2% спиртового раствора хлорида железа (III) и 3 мл хлороформа. Величину восстановительной емкости (X) в относительных единицах вычисляют по формуле

X=D/C.

Определения проводили неоднократно для различных концентраций антиоксидантов, затем рассчитывали среднеарифметическую величину восстановительной емкости (Хср), которая является характеристикой восстановительных свойств конкретного жирорастворимого антиоксиданта.

Сравнительный анализ полученных индивидуальных показателей (X) позволяет оценить восстановительную емкость и, соответственно, степень проявления антиоксидантных свойств в ряду исследуемых веществ. С этой же целью можно использовать, приняв за 100% или 1,0, восстановительную емкость аскорбилпальмитата, как наиболее ярко выраженного антиоксиданта прямого действия, и дополнительно - стандартизовать качество жирорастворимых антиоксидантов и продуктов на их основе в условных относительных единицах.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Анализировали субстанцию с содержанием β-каротина 99,2%. Готовили хлороформный раствор с массовой долей β-каротина - 0,001%, 0,00075%, 0,0005%, 0,00025%, 0,0001%. Далее к 1 мл 0,5% спиртового раствора о-фенантролина и 1 мл 0,2% спиртового раствора хлорида железа (III) прибавляли 3 мл 0,001% хлороформного раствора β-каротина. Точно через 10 мин после прибавления измеряли оптическую плотность раствора красно-оранжевого цвета на спектрофотометре СФ-56 при длине волны 510 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения использовали 1 мл 0,5% спиртового раствора о-фенантролина, 1 мл 0,2% спиртового раствора хлорида железа (III) и 3 мл хлороформа. Величину восстановительной емкости (X) в относительных единицах вычисляют по формуле

X=D/C.

Определения повторяли для растворов с массовой долей β-каротина - 0,00075%, 0,0005%, 0,00025%, 0,0001%. Затем рассчитывали среднюю величину восстановительной емкости (Хср), которая является характеристикой восстановительных свойств конкретного жирорастворимого антиоксиданта. Результаты определения представлены в таблице 1.

Средняя величина восстановительной емкости (Хср) в относительных единицах для β-каротина (99,2%) составляет

Хср=(1071+1073+1079+1069+1063)/5=1071.

Пример 2. Анализировали субстанцию с содержанием α-токоферола - 98,3%. Готовили хлороформный раствор с массовой долей α-токоферола - 0,01%, 0,0075%, 0,005%, 0,0025%, 0,001%. Далее поступали аналогично примеру 1. Результаты определения представлены в таблице 2.

Средняя величина восстановительной емкости в относительных единицах для α-токоферола составляет

Хср=327.

Пример 3. Анализировали препарат - ретинола ацетата 3,44% раствор в масле. Готовили хлороформный раствор с массовой долей ретинола ацетата - 0,015%, 0,0125%, 0,001%, 0,0075%, 0,005%. Далее поступали аналогично примеру 1. Результаты определения представлены в таблице 3.

Средняя величина восстановительной емкости в относительных единицах для ретинола ацетата составляет

Хср=79.

Пример 4. Анализировали субстанцию L-6-О аскорбилпальмитата с содержанием аскорбилпальмитата - 98,0%. Готовили хлороформный раствор с массовой долей аскорбилпальмитата - 0,001%, 0,00075%, 0,0005%, 0,00025%, 0,0001%. Далее поступали аналогично примеру 1. Результаты определения представлены в таблице 4.

Средняя величина восстановительной емкости в относительных единицах для аскорбилпальмитата составляет

Хср=2269.

Восстановительная активность, выраженная в условных “аскорбиновых” единицах, для β-каротина по приведенным в таблицах данным будет равна 0,47·(1071:2269×1,0), для α-токоферола - 0,14, а для ретинола ацетата - 0,035.

Наконец, возможно использование полученных показателей для подбора оптимального сочетания антиоксидантов, так как определение величины восстановительной емкости композиции и сравнение ее с расчетной теоретической (т.е. суммой показателей отдельных компонентов композиции с учетом их концентрации) позволит определить либо отсутствие, либо наличие и величину проявления эффекта синергизма или антагонизма.

Например, значение оптической плотности продукта реакции иона железа (II) с о-фенантролином композиции α-токоферола и β-каротина с содержанием их в анализируемой пробе соответственно 0,00005% и 0,0005% составляет 0,603, а теоретическая плотность будет равна:

D_{теорет.}=327×0,00005+1071×0,0005=0,0164+0,536=0,552.

Так как D_{теорет.} < D_факт, то можно сделать заключение об отсутствии проявления эффекта антагонизма для выбранного соотношения и концентрации анализируемых антиоксидантов и незначительном превышении величины восстановительных свойств композиции над теоретически ожидаемой.

Технический результат: предложен экспресс-способ выявления антиоксидантов-синергистов, позволяющий оптимально сочетать их в одной лекарственной форме, БАД к пище и оценивать качество данных препаратов.

Изобретение относится к пищевой и фармацевтической промышленности и может быть использовано: в оценке качества лекарственных средств и биологически активных добавок к пище, обладающих антиоксидантными свойствами; в выборе оптимальных технологических режимов при выделении природных жирорастворимых антиоксидантов; в поиске эффективной системы антиоксидантов-синергистов. В модельную систему, состоящую из спиртовых растворов хлорида железа (III) и о-фенантролина вводят хлороформные растворы антиоксидантов, и при условии изменения окраски после 10 мин выдержки определяют величину восстановительных свойств, спектрофотометрической регистрацией оптической плотности образовавшегося окрашенного комплекса Fe (II) с о-фенантролином при длине волны 510 нм с последующим расчетом восстановительной емкости единицы концентрации испытуемого вещества по формуле X=D/C, где С - массовая доля антиоксиданта, %; D - величина оптической плотности комплекса Fe (II) с о-фенантролином. Достигается повышение воспроизводимости и эффективности определения. 4 табл.

Способ определения восстановительной емкости жирорастворимых антиоксидантов in vitro, отличающийся тем, что в модельную систему, состоящую из спиртовых растворов хлорида железа (III) и о-фенантролина, вводят хлороформные растворы антиоксидантов, и, при условии изменения окраски, после 10 мин выдержки определяют величину восстановительных свойств спектрофотометрической регистрацией оптической плотности образовавшегося окрашенного комплекса Fe (II) с о-фенантролином при длине волны 510 нм с последующим расчетом восстановительной емкости единицы концентрации испытуемого вещества

Х = D/C,

где С - массовая доля антиоксиданта,%;

D - величина оптической плотности комплекса Fe (II) с о-фенантролином.