СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ ГИСТОХИМИЧЕСКИМ ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ АНАЛИЗОМ НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 2004 года по МПК G01N33/577 C12P21/08 A61K39/275 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и оспы коз путем выявления специфических антигенов вышеуказанных возбудителей в цитоплазме инфицированных культур клеток гистохимическим иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Одним из условий постановки достоверного диагноза при различных инфекционных вирусных болезнях, в том числе и при оспе овец и оспе коз, является выделение возбудителя с использованием чувствительных биологических систем - восприимчивых животных или пермиссивных линии первичных и перевиваемых культур клеток с последующей идентификацией вирусспецифических антигенов в различных серологических реакциях.

Принимая во внимание тот факт, что при выделении вирусов идет постепенная адаптация возбудителей к используемой биологической системе, вследствие чего на первых пассажах отмечается минимальное накопление вируса, для ранней диагностики требуется использование более чувствительных методов. Такими методами, позволяющими обнаруживать антигены вирусов оспы овец и оспы коз в цитоплазме инфицированных клеток и используемыми при диагностике оспы овец и оспы коз, являются реакция прямой иммунофлюоресценции, реакция непрямой иммунофлюоресценции и иммуногистохимический метод иммуноферментного анализа.

Реакция как прямой, так и непрямой иммунофлюорерценции (Sarkar Р., Singh S.P., Pandey A.K., Kathuria В.К., Kumar S. Application of fluorescent antibody test in the diagnosis of sheep-pox, and study of sheep-pox virus multiplication in cell-culture. // Indian. J. Anim. Sci. - 1980. - V. 50 - №5. - P.428-433; OIE Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. - 1996. - P.119-127) предусматривает использование тест-препаратов, представляющих собой фиксированные ацетоном мазки-отпечатки из отечной жидкости оспин. Для детекции антигенов вирусов оспы овец используют иммуноглобулины, выделенные из гипериммунной сыворотки, либо конъюгированные с флюорисцин-изотиоцианатом для реакции прямой иммунофлюорисценции, либо выделенные иммуноглобулины из гипериммунной сыворотки с последующим обнаружением иммунных комплексов с помощью антивидового (анти-овечьего) флюорисцин-изотиоцианатного конъюгата в случае реакции непрямой иммунофлюорисценции.

Недостатками данных методов является необходимость использования люминесцентного микроскопа для учета результатов реакции и недостаточная специфичность вследствие использования специфических иммуноглобулинов, выделенных из поликлональных гипериммуиных сывороток, для детекции иммунных комплексов.

Принципиально иной метод - метод иммуногистохимического иммуноферментного анализа - для диагностики оспы овец был предложен Gulbahara M.Y. et al. (Gulbahara M.Y., Calabar M., Gul Y., Icen H. Immunohistochemical detection of antigen in lamb tissues naturally infected with sheep-pox virus // J. Vet. Med. B. - 2000. - V. 47. - №3. - P.173-181).

Суть метода состоит в том, что обнаружение антигенов вирусов оспы овец, находящихся в цитоплазме клеток органов и тканей овец, пораженных оспой, проводят непосредственно в отобранных образцах. Для этого пораженные оспой органы и ткани овец фиксируют формалином и готовят парафиновые блоки. После приготовления срезов из тканей и органов и их депарафинизации проводят детекцию антигенов. С этой целью вначале на поверхность среза наносятся специфические к антигенам вируса оспы овец иммуноглобулины, выделенные из гипериммунной сыворотки кролика. Затем для усиления положительного сигнала на поверхность среза наносятся биотинилированные анти-кроличьи антитела. Детекцию образовавшегося комплекса антиген - специфическое антитело - биотинилированные анти-кроличьи антитела проводят стрептавидиновым пероксидазным конъюгатом.

Данный метод наряду с положительными сторонами - экспрессность и относительная простота постановки реакции - имеет и ряд недостатков. К ним относятся применение поликлональных иммуноглобулинов, выделенных из гипериммунных сывороток, которые вступают в перекрестные реакции с антигенами вируса контагиозного пустулезного дерматита овец и коз и могут быть причинами фонового неспецифического окрашивания, вследствие применения низкоочищенных антигенов при получении гипериммунных сывороток. Данные причины приводят к снижению диагностической ценности метода, однако устранить их возможно, используя моноклональные антитела, обладающие специфичностью к антигенным детерминантам вирусов оспы овец и коз. Способ получения пригодных для этих целей моноклональных антител и их характеристика описаны ранее (Машнин А.В., , Стрижаков А.А., Стрижакова О.М., Новикова М.Б., Середа А.Д. Разработка средств диагностики оспы овец на основе моноклональных антител // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропонозными болезнями животных. Сб. статей Междунар. научно-практич. конфер. – Покров. - 2000. - С.141-143).

Целью настоящего изобретения является разработка способа диагностики оспы овец и оспы коз гистохимическим иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител.

Указанная цель достигается тем, что обнаружение, антигенов вирусов оспы овец и оспы коз осуществляется гистохимическим иммуноферментным анализом, предусматривающим использование пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител клона 010.2, обладающих специфичностью к антигенным детерминантам полипептидов молекулярной массы 36-40 кД вирусов оспы овец и оспы коз.

Пример конкретного выполнения

При постановке гистохимического иммуноферментного анализа готовили тест-препараты. Для этого к монослойным первично-трипсинизированной культуре клеток тестикул ягненка (ТЯ) и перевиваемой культуры клеток почки овцы (ПО), выращенным на покровных стеклах в пробирках, после удаления культуральной среды и трехкратного омовения монослоя средой для культивирования без сыворотки добавляли осветленные суспензии двукратных разведении контрольных культуральных (нормального и специфического) и исследуемых органотканевых антигенов. Контакт клеток с исследуемыми материалами осуществляли в течение 1 ч при 37(±1)°С. После чего супернатант удаляли, клетки двукратно омывали средой для культивирования без сыворотки. Дальнейшее культивирование клеток осуществляли с добавлением 2% сыворотки овцы и антибиотиков (100 ЕД/см³ пенициллина, 100 мг/см³ стрептомицина) при 37(±1)°С на протяжении 5-6 сут. Затем клеточный монослой, выращенный на предметных стеклах, фиксировали в течение 10 мин при комнатной температуре 100%-ным ацетоном, охлажденным до минус 20°С. Стекла высушивали на воздухе и в дальнейшем использовали в качестве тест-препаратов.

Перед постановкой реакции тест-препараты, закрепленные в спичках, омывали в течение 5 мин отмывочным буфером (забуференный фосфатный раствор рН 7,2-7,4 (ЗФР); 0,05% Твин 20). После чего на край предметного стекла наносили по капле специфичного к вирусам оспы овец и оспы коз пероксидазного конъюгата на основе монрклональных антител клона 010.2 в рабочем разведение и размещали в них покровные стекла фиксированным монослоем вниз. Конъюгат инкубировали в течение 1 ч при 37(±1)°С в условиях влажной камеры. Непровзаимодействовавший конъюгат двукратно отмывали по 3-5 мин в отмывочном буфере и однократно ЗФР. Затем стекла погружали в хромогенный субстратный раствор и через 30 мин инкубирования при комнатной температуре покровные стекла размещали в капле глицерина, расположенной на предметном стекле, и проводили учет результатов реакции при помощи светового инвертированного микроскопа.

О специфическом взаимодействии пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител клона 010.2 с антигенами вирусов оспы овец и оспы коз в инфицированных клетках судили по наличию характерного темно-коричневого окрашивания клеток в местах локализации вирусспецифических антигенов.

В работе по определению чувствительности и специфичности данного метода использовали тест-препараты, представляющие фиксированные интактные и инфицированные культуры клеток ТЯ и ПО гомологичными вирусами, выделенными из подкожной клетчетки с мест оспенного поражения, хоан и пораженных участков легких инфицированных животных, а также гетерологичными вирусами мелких жвачных (вирусом контагиозного пустулезного дерматита овец и коз, катаральной лихорадки овец, чумы мелких жвачных). Результаты по определению чувствительности и специфичности данного метода представлены в таблице.

Результаты исследований, представленные в таблице, свидетельствуют, что предлагаемый способ иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител позволяет проводить диагностику оспы овец и оспы коз и дифференцировать данное заболевание от других заболеваний мелких жвачных, протекающих с клинически сходной картиной.

Предлагаемый способ обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, по сравнению с существующими методами. Он доступен, прост в использовании и может быть применен в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии. Предложен способ диагностики оспы овец и оспы коз. Предложенный способ предусматривает проведение гистохимического иммуноферментного анализа с использованием пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител клона 010.2. Антитела этого клона обладают специфичностью к антигенным детерминантам полипептидов молекулярной массы 36-40 кД вирусов оспы овец и оспы коз. При этом обнаружение антигенов вирусов оспы овец и коз осуществляется в цитоплазме инфицированных клеток первичной или перевиваемой культур клеток овечьего происхождения. Предложенный способ более прост в осуществлении, чувствителен, специфичен, позволяет достоверно обнаруживать антигены вирусов оспы овец и оспы коз и дифференцировать их от возбудителей болезней, протекающих с клинически схожей картиной. Способ может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях. 1 табл.

Способ диагностики оспы овец и оспы коз, включающий использование гистохимического иммуноферментного анализа для выявления специфических антигенов вирусов оспы овец и оспы коз, отличающийся тем, что обнаружение антигенов вирусов оспы овец и оспы коз осуществляется в цитоплазме инфицированных клеток первичной или перевиваемой культур клеток овечьего происхождения с помощью пероксидазного конъюгата на основе моноклональных антител клона 010.2, обладающих специфичностью к антигенным детерминантам полипептидов молекулярной массы 36-40 кД вирусов оспы овец и оспы коз.