СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ К ВИРУСАМ ОСПЫ ОВЕЦ И ОСПЫ КОЗ МЕТОДОМ ДВУХФАЗНОГО ИНГИБИРОВАНИЯ ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 2003 года по МПК G01N33/577 G01N33/569 C12P21/08 A61K39/275 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и оспы коз путем выявления вирусспецифических антител методом двухфазного ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) на основе моноклональных антител, и может быть использовано в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

В настоящее время наиболее употребляемыми лабораторными методами обнаружения вирусспецифических антител к оспе овец и оспе коз являются: реакция нейтрализации (Davies F.G. Characteristics of a virus causing a pox disease in sheep and goats in Kenya, with observations on the epidemiology and control// J. Hyg. - 1976 - v.76. - p.163-171; Muzichin S.I., Babiker E.H.A. A study of sheep pox in the Sudan// Bull. Anim. Health Prod. Afr. - 1979. - v. 27. - p.105-112), реакция диффузионной преципитации (Bhambani В.D., Krishnamurthi D. An immunodiffusion test for laboratory diagnosis of sheeppox and goatpox// J. Сотр. Path. - 1963. - v.73. - p.349); реакция непрямой иммунной флюоресценции (Davies F.G., Atema С. The antibody response in sheep infected with a Kenyan sheep and goats pox virus// J. Comp. Path. - 1978. - v.88. - p. 205-210; Sarkar P., Singh S.P., Pandey A.K. et al. Application of fluorescent antibody test in the diagnosis of sheep-pox, and study of sheep-pox virus multiplication in cell-culture// Indian J. Anim. Sci. - 1980. - v.50. - p.428-433); иммуноферментный анализ (ИФА) (Sharma S., Negi В.S., Yadav M. R. Применение ELISA для выявления антигена и антител к вирусу оспы коз// Acta Virol. - 1988. - v.32. - р.65-69; Cam V.M., Kitching R.P., Hammond J.M. et al. Use of a recombinant antigen in an indirect ELISA for detecting bovine antibody to capripoxvirus// J. Virol. Meth. - 1994. - v.49. - p.285-294).

Реакция нейтрализации наряду с высокой чувствительностью требует специальных условий проведения и не обладает экспрессностью. Окончательный учет результатов реакции проводят на 9 сутки с момента ее постановки.

Использование реакции диффузионной преципитации для диагностики оспы овец и оспы коз ограничивается недостаточной ее специфичностью из-за возможности перекрестной реакции с антителами к вирусу контагиозного пустулезного дерматита.

Применение реакции непрямой иммунной флюоресценции с использованием поликлональных сывороток затруднено ввиду наличия неспецифического фонового окрашивания при учете результатов.

Наиболее приемлемыми являются методы ИФА. Разработанный Sharma S. et al. (1988 г.) метод ингибирования ТФ ИФА, сочетая в себе чувствительность и производительность, не позволял дифференцировать каприпоксвирусные антитела от антител к вирусу контагиозного пустулезного дерматита.

Эту проблему удалось решить Cam V. М. et al. (1994 г.), которые разработали непрямой ИФА для обнаружения антител к вирусу бугорчатки КРС с использованием рекомбинантного белка Р 32 каприпоксвирусов в качестве специфического антигена и антивидового конъюгата.

Суть метода заключается в следующем. Полистирол, используемый в качестве твердой фазы, сенсибилизируют очищенным рекомбинантным белком Р 32, экспрессированным в плазмидном векторе. Продукт экспрессии является структурным полипептидом, характерным для всех каприпоксвирусов. На следующем этапе реакции антитела исследуемых сывороток крови взаимодействуют с иммобилизированным на твердой фазе антигеном. Выявление образовавшихся комплексов антиген-антитело осуществляют антивидовым (антиовечьим, антикозьим или антибычьим) пероксидазным конъюгатом.

Недостатком описанного метода, являющегося прототипом предлагаемого изобретения, можно считать то, что технология получения иммунореагентов трудоемка, дорогостояща. Методология получения рекомбинантного антигена сложна в исполнении, а возможная замена нескольких нуклеотидов, кодирующих аминокислотную последовательность данного белка, может приводить к потере его функциональной активности.

Целью настоящего изобретения является разработка метода двухфазного ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител, пригодного для обнаружения специфических антител к вирусам оспы овец и оспы коз в сыворотках крови больных и переболевших животных и дифференцирования их от антител к гетерологичным возбудителям болезней мелких жвачных.

Указанная цель достигается тем, что на первом этапе реакции, проходящем в отдельной панели, антитела исследуемых сывороток крови взаимодействуют со специфическим культуральным антигеном вируса оспы овец.

Обнаружение не вступившего в реакцию антигена происходит на втором этапе, где в качестве "захватывающей" основы используются иммобилизированные на твердой фазе моноклональные антитела клона 08.3, обладающие специфичностью к антигенным детерминантам полипептида молекулярной массы 36-40 кД вируса оспы овец штамма "НИСХИ". Выявление комплекса моноклональное антитело - специфический антиген осуществляется пероксидазным конъюгатом поликлональных антител, выделенных из гипериммунной сыворотки животных - реконвалесцентов.

Пример конкретного выполнения
При постановке метода двухфазного ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа (ТФ ИФА) использовали 96-луночные панели для микрокультивирования.

а) Приготовление тест-панелей
Перед началом постановки метода готовили тест-панели 1 и 2. Для блокирования свободных сайтов сорбции полистирола в лунки панели 1 вносили по 0,4 см³ блокирующего буфера (забуференный фосфатный раствор pH 7,2-7,4 (ЗФР); 0,05% Твин 20; 1% бычий сывороточный альбумин) и инкубировали в течение 30 мин при 37(±0,5)^oС. Содержимое лунок удаляли, лунки двукратно промывали отмывочным буфером (ЗФР; 0,05% Твин 20).

Лунки панели 2 сенсибилизировали моноклональными антителами в рабочем разведении на 0,01М карбонатно-бикарбонатном буфере (pH 9,5) в течение 18 часов при 4 (±0,5)^oС.

б) Постановка реакции
В лунки нижнего ряда панели 1 вносили по 0,15 см³ контрольных (нормальная и специфическая) и исследуемых образцов сыворотки крови и готовили двукратные разведения на блокирующем буфере. После чего в лунки всех рядов вносили специфический антиген вируса оспы овец штамма "НИСХИ" в рабочем разведении на блокирующем буфере в объеме 0,15 см³ и инкубировали 1,5 ч при 37(±0,5)^oС.

После часового инкубирования панели 1 содержимое лунок панели 2 удаляли, лунки трехкратно промывали отмывочным буфером и блокировали свободные сайты сорбции полистирола путем инкубирования в лунках блокирующего буфера в объеме 0,2 см³ при 37(±0,5)^oС. Спустя 30 мин, содержимое лунок удаляли и промывали их двукратно отмывочным буфером. Затем смесь сыворотка-антиген из лунок панели 1 в объеме 0,15 см³ переносили в одноименные лунки панели 2. Через 1 час инкубирования при 37(±0,5)^oС и последующей трехкратной отмывке отмывочным буфером в лунки панели вносили по 0,15 см³ специфического поликлонального пероксидазного конъюгата в рабочем разведении на блокирующем буфере. Содержимое лунок инкубировали в течение 1 ч при 37(±0,5)^oС. Лунки семикратно отмывали отмывочным буфером, однократно ЗФР и вносили по 0,15 см³/лунку хромогенного субстратного раствора ABTS. После 30 мин инкубировния при комнатной температуре проводили учет и оценку результатов реакции.

Фотометрический учет реакции
При фотометрическом учете измеряют оптическую плотность хромогенного субстратного раствора при длине волны 405 нм. Реакцию считают положительной, если оптическая плотность хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали нормальную контрольную сыворотку, в 2 и более раз выше оптической плотности хромогенного субстратного раствора в лунках, в которых предварительно инкубировали исследуемые и специфическую контрольную сыворотки.

В работе по определению чувствительности и специфичности данного метода использовали гомологичные (нормальные и специфические) и гетерологичные специфические сыворотки к вирусам катаральной лихорадки овец, контагиозного пустулезного дерматита, чумы мелких жвачных, лихорадки долины Рифт, болезни Акабане, болезни Найроби. Результаты по определению чувствительности и специфичности данного метода представлены в таблице.

Результаты исследований, представленные в таблице, свидетельствуют о том, что предлагаемый способ ТФ ИФА на основе моноклональных антител позволяет обнаруживать в сыворотке крови антитела, специфичные к антигенам вирусов оспы овец и оспы коз, и дифференцировать таковые от антител, образующихся к возбудителям болезней мелких жвачных, протекающих с клинически сходной картиной. Способ прост в использовании и может быть применен в научно-исследовательских институтах и ветеринарных лабораториях.

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии, в частности к способу диагностики оспы овец и коз. Способ предусматривает на первом этапе взаимодействие исследуемой сыворотки крови с антигеном вируса оспы овец. На втором этапе не вступивший в реакцию антиген взаимодействует с моноклональными антителами клона 08.3. Образовавшийся комплекс моноклональное антитело - антиген выявляется специфическим пероксидазным конъюгатом поликлональных антител. Предлагаемый способ более чувствителен и специфичен, а также позволяет экспрессно проводить исследование сывороток крови животных. 1 табл.

Способ обнаружения специфических антител к вирусам оспы овец и оспы коз методом ингибирования твердофазного иммуноферментного анализа, предусматривающий взаимодействие исследуемой сыворотки крови с антигеном вируса оспы овец и последующую детекцию иммобилизированного на твердой фазе комплекса антитело - специфический антиген поликлональным пероксидазным конъюгатом, отличающийся тем, что на первом этапе реакции происходит взаимодействие исследуемой сыворотки с культуральным антигеном вируса оспы овец, на втором этапе не вступивший в реакцию антиген взаимодействует с иммобилизированными на твердой фазе моноклональными антителами клона 08.3, обладающими специфичностью к антигенной детерминанте полипептида молекулярной массы 36-40 кД вируса оспы овец штамма "НИСХИ", а образовавшийся комплекс моноклональное антитело - антиген выявляют специфическим пероксидазным конъюгатом поликлональных антител, выделенных из гипериммунной сыворотки животных-реконвалесцентов.