СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ МЕТАСТАЗИРОВАНИЯ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ НА ОСНОВЕ МАРКЕРОВ ВАХ И KI-67 Российский патент 2004 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии и предназначено для прогнозирования метастазирования увеальной меланомы (УМ) с целью своевременного и адекватного лечения больных с этим заболеванием и увеличения продолжительности их жизни.

УМ является чрезвычайно злокачественной опухолью органа зрения, представляющей угрозу не только зрительным функциям, но и жизни пациента. Заболеваемость УМ по данным различных авторов колеблется от 2, 3 до 7 человек на 1 млн. населения, а частота метастазирования после энуклеации достигает 80% при 10-летнем сроке наблюдения [Opthalmic Pathology and Intraocular Tumors.-1996-1997. - p.l86-190 - American Academy of Ophthalmology. San-Francisco]. Непредсказуемость этой опухоли позволяет отнести ее к разряду самых загадочных биологических феноменов. Между тем исследования последних лет показали, что существенную помощь в прогнозировании могут оказать молекулярно-биологические маркеры, регулирующие основные биологические процессы в клетке, например апоптоз.

Известно, что биологическое поведение опухоли определяется балансом двух диаметрально противоположных по смыслу процессов - пролиферации и апоптоза.

Апоптоз - генетически программированный клеточный суицид, обеспечивающий количественный гомеостаз конкретной клеточной популяции или физиологический механизм регуляции клеточного гомеостаза тканей и органов. Нарушения апоптоза на уровне регуляции обусловливают развитие многих патологических процессов, в том числе злокачественных опухолей. В запуске апоптоза участвуют биохимические. морфологические, иммунологические и функциональные сигналы-индукторы. Их комбинации варьируют в различных клетках, органах и тканях в разных физиологических и патологических условиях.

Физиологический апоптоз, то есть протекающий в нормальных клетках, имеет принципиальные отличия от апоптоза опухолевых клеток. В последнем случае меняются не только его функции, но и механизмы регуляции. Если физиологический апоптоз - это механизм поддержания гомеостаза (объема органа, ткани и т.д.), а также генетического постоянства, то апоптоз в опухоли - один из способов иммортализации (закрепления) и усиления злокачественного фенотипа опухолевой клетки, его агрессивности, метастатического потенциала, а также - регулятор скорости прогрессирования.

На широком спектре опухолей человека доказано, что интенсивность апоптоза прямо ассоциируется с прогрессированием, снижением степени зрелости и повышением агрессивности [Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю). Гибель клетки. -М.: Медицина. - 2001, с.189]. Многие авторы пришли к выводу, что интенсивность апоптоза является надежным прогностическим маркером. Чем он выше, тем выше злокачественный потенциал и хуже прогноз.

Для оценки апоптоза и основных механизмов, ответственных за его развитие, в практическом плане широко используются маркеры ключевых точек генетической программы клеточной смерти: протеинов р53, Вс1-2, Вах, Fas (APO-1/CD-95). Из этого числа можно исследовать отдельные показатели, некоторые их сочетания или весь комплекс в зависимости от поставленных задач.

Маркером пролиферации является ядерный пептид пролиферирующих клеток - Ki-67.

В мире существует немного публикаций об экспрессии Вах в опухолях вообще и меланоме, причем литературные данные противоречивы. Одни авторы указывают, что в первичной и метастатической меланоме кожи, как и в невусах, имеет место гиперэкспрессия Вах. Другие исследователи находят гиперэкспрессию Вах только в первичных меланомах [Tang L, Tron VA, Reed JC, Mah K.I. Krajewska M, Li G, Zhou X, Ho VC, Trotter MJ. Expression of apoptosis regulators in cutaneous malignant melanoma. Clin Cancer Res 1998; 4(8): 1865-71]. Не установлено связи экспрессии Вах с прогнозом кожных меланом. В то же время доказано для больных раком молочной железы, толстой кишки, поджелудочной железы, что экспрессия Вах является благоприятным прогностическим признаком. Ранее мы предположили, что Вах - индуктор апоптоза - позволит нам прогнозировать метастазирование УМ.

Экспрессия Вах выявлена нами в 35% тестируемых опухолей. Не обнаружено корреляций между экспрессией Вах и традиционными клинико-патологическими характеристиками опухоли. Вместе с тем было обнаружено, что низкая общая выживаемость наблюдалась у больных, положительных по Вах, по сравнению с Вах-отрицательной группой (р=0,022; фиг.1б). При анализе все пациенты были распределены на две группы А и В. Группу А образовали 61 пациент с Вах-негативными больными, из которых за время наблюдения (209,6±3,3 месяца) умерло от генерализации 10 человек. Группу В составили 33 пациента с Вах-позитивными УМ, из которых умерло 13 человек от метастазов при средних сроках наблюдения 89,8±9,3 месяца. Таким образом. выживаемость в группе А при 10-летнем сроке наблюдения составила 80%, а в группе В при тех же сроках наблюдения - в два раза меньше (40%, р<0,01). Медиана продолжительности жизни с момента оперативного вмешательства до смерти от метастазов составила 81 месяц. При оценке безрецидивной выживаемости выявлена сильная тенденция к более частому развитию метастазов у Вах-положительных больных по сравнению с Вах-отрицательными больными (р=0,061; фиг.1а). Медиана времени до появления метастазов в группе Вах-позитивных больных составила 72 мес.

Полученные результаты позволяют предположить, что этот белок играет важную роль в прогрессировании УМ, поскольку безрецидивная и общая выживаемость у Вах-отрицательных больных значительно выше, а разница в показателях выживаемости в обеих анализируемых группах - высоко достоверна (р=0,02).

Таким образом, результаты проведенных нами исследовании позволили прийти к заключению, что количественное определение экспрессии Вах в УМ может служить достоверным и информативным маркером прогнозирования клинического течения УМ. Вместе с тем выявление только позитивности или негативности экспрессии маркера в тестируемой опухоли дает низкую эффективность и достоверность прогнозирования - частота совпадения прогноза не более 70-80%. В связи с чем мы также предположили, что недостаточно высокая информативность и достоверность связаны с тем, что Вах жизненно характеризует только один важный аспект жизнедеятельности опухоли апоптоз, между тем в исследованиях не нашел отражение другой, не менее важный, а главное диаметрально противоположный, по сути, биологический процесс пролиферация. В связи с чем мы продолжили наши исследования и изучили экспрессию маркера-регулятора пролиферации - Ki-67. Ретроспективный анализ совместной экспрессии этих маркеров (соэкспрессии) во взаимосвязи с исходом опухолевого процесса показал, что мы находимся на верном пути.

В качестве самостоятельного показателя этот пептид дал малоинформативен. Так, согласно полученным данным, у больных УМ Ki-67 выявлен в 62,8% случаев (n=97), из них только в четырех случаях процент иммунопозитивных клеток в поле зрения был ≥10%, у остальных он не превышал этот уровень.

Продукция Ki-67 слабо коррелировала с диаметром опухоли (коэффициент корреляции k=0,17888, р=0,08), по-видимому, пептид регулирует pocт опухоли не в высоту, а по протяженности. Обнаружена официальная высоко коррелятивная связь (р=0,03) между продолжительностью жизни пациента с момента диагностирования метастазов УМ до его смерти, и продукцией Ki-67 (коэффициент корреляции: k=-0.3995, p=0,031): чем выше продукция Ki-67, тем быстрее идет инвазия в тканях, следовательно, выше скорость диссеминации. Между тем, мы не выявили достоверной связи между экспрессией Ki-67 и частотой метастазирования. Но анализ соэкспрессии Ki-67 и Вах показал тесную, высоко коррелятивную связь с прогнозом (фиг.2).

Результаты позволяли сказать, что несмотря на то, что высокие уровни Ki-67 при поздних и генерализованных УМ ассоциируются с быстрым метастазированием и короткой продолжительностью жизни с момента манифестации метастазов до смерти, в качестве самостоятельного маркера Ki-67 для протезирования метастазирования УМ не годится. Ранее нами было показано, что Вах является неблагоприятным прогностическим маркером для безрецидивной (р=0,055) и общей выживаемости (р=0,02) больных УМ (B.Г.Лихванцева. Роль цитокинов в патогенезе, прогнозе и лечении увеальной меланомы. /Диссертация на соискание ученой степени д.м.н. - М., 2001). Поздние исследования показали, что определение совместной экспрессии Ki-67 и Вах давало более точную прогностическою информацию для определения прогноза течения болезни и отбора групп повышенною риска метастазирования.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка способа прогнозирования клинического течения увеальной меланомы, в частности вероятность развития метастазов у каждого конкретного больного.

За ближайший аналог изобретения мы взяли способ прогнозирования клинического течения увеальной меланомы на основе иммуногистохимического анализа экспрессии маркера апоптоза - Вах (В.Г.Лихванцева. Роль цитокинов в патогенезе, прогнозе и лечении УМ. /Диссертация на соискание ученой степени д.м.н. - М., 2001). Способ надежен, эффективен, однако вероятность совпадения прогноза достигает не более 80%, что заставило нас искать пути повышения достоверности и надежности прогноза.

Техническим результатом является объективизация и повышение точности прогнозирования.

Технический результат достигается за счет использования дополнительного маркера, отвечающего за пролиферацию опухолевых клеток - Ki-67.

Предлагаемый нами способ прогнозирования осуществляют следующим образом.

1. После энуклеации глаза с увеальной меланомой готовят парафиновые срезы толщиной 3-5 микрон по стандарной методике, депарафинируют в ксилоле и регидратируют в батарее спиртов.

2. Иммуногистохимическое исследование проводят по стандартной методике. Для открытия антигенных детерминант проводят oбpaбoтку срезов в цитратном буфере [рН 6,0] в течение 30 минут при 95°C на водяной бане.

3. Инкубацию с первичными антителами проводят в течение ночи при 4^оС. Для визуализации реакции антиген - антитело используют стрептавидин-биотиновую тест-систему LSAB+kit [DAKO Corp] согласно инструкции. В качестве хромогена используют ДАБ+ [DAKO Corp].

4. Затем срезы докрашивают гематоксилином и заключают в бальзам.

В качестве первичных антител используют кроличьи поликлональные антитела к Вах (разведение 1:500, DAKO Corp) и Ki-67 (разведение 1:50).

5. Реакцию оценивают с применением светового микроскопа (увеличение х 40) по следующим критериям. Количество положительных клеток оценивают в зонах, содержащих их максимальное количество. В качестве негативного контроля используют иммуногистохимическую реакцию без добавления первичных антител.

6. Количественную оценку экспрессии маркера Вах по срезу определяют как долю иммунопозитивных клеток от общего числа клеток в поле зрения микроскопа × 40. В случае, где процент позитивных не превышал 20% реакция расценивалась как слабая. Если процент позитивных клеток был больше 20%, реакция считалась выраженной.

Опухоль считают иммунопозитивной, если более 5% клеток УМ в поле зрения экспрессировало Ki-67.

7. При выявлении более 20% Вах-позитивных клеток и менее 5% Ki-67-позитивных клеток в УМ считают прогноз для конкретного пациента с таким показателем в плане клинического течения увеальной меланомы неблагоприятным с короткой продолжительностью жизни и вероятностью метастазирования - 90%. Пациента выделяют в группу риска и проводят профилактическое антиметастатическое лечение.

Пример 1. Пациент 68 лет. Диагноз УМ в стадии Т₃NоМо. Размеры опухоли не позволяли провести органосохранное лечение. Безальтернативным методом являлась энуклеация. Иммуногистохимические исследования парафинового среза опухоли по указанному способу выявили 55% Вах-позитивных клеток и 2% Ki-67-позитивных клеток на срезе УМ при увеличении × 40. Больной отнесен в группу высокого риска развития метастазов. Назначены укороченные интервалы между визитами врача. Незадолго до окончания года наблюдения после энуклеации у больного выявлены метастазы в печени. Проведена иммунотерапия с целью замедления скорости метастазирования.

Пример 2. Пациентка 70 лет. Перенесла энуклеацию по поводу УМ значительных размеров. Размеры, локализация, возраст - являлись факторами высокого риска развития метастазов. Однако проведенные исследования по определению уровня Вах и Ki-67 показали, что белок синтезируется менее чем в 5% опухолевых клеток. Наблюдение на протяжении 8 лeт не выявило вторичных очагов УМ.

Таким образом, определение характеристики двух основных аспектов канцерогенеза УМ позволяет повысить точность прогнозирования метастатазирования УМ.

Изобретение относится к офтальмоонкологии и может быть использовано для прогнозирования метастазирования увеальной меланомы. Сущность способа состоит в том, что с помощью иммуногистохимического анализа в удаленной опухоли выявляют клетки, экспрессирующие Вах, и дополнительно клетки, экспрессирующие Ki-67, и в случаях присутствия в них Вах и отсутствия Ki-67 прогнозируют высокую вероятность метастазирования. Техническим результатом является повышение точности прогноза метастазирования увеальной меланомы. 2 ил.

Способ прогнозирования метастазирования увеальной меланомы, включающий выявление с помощью иммуногистохимического анализа в удаленной опухоли клеток, экспрессирующих Вах, отличающийся тем, что дополнительно определяют наличие клеток, экспрессирующих Ki-67, и в случаях присутствия в них Вах и отсутствия Ki-67 прогнозируют высокую вероятность метастазирования.