СПОСОБ ОДНОВРЕМЕННОЙ ВЕРИФИКАЦИИ И ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ТЕЧЕНИЯ УВЕАЛЬНОЙ МЕЛАНОМЫ Российский патент 2008 года по МПК A61B10/00 G01N33/535 

Изобретение относится к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для одновременной диагностики и прогнозирования метастазирования увеальной меланомы (УМ).

Согласно современным требованиям к диагностике опухолей человека каждая опухоль должна быть подтверждена не только на световом или гистологическом уровне, но и на иммуногистохимическом (ИГХ) уровне. Сегодня в распоряжении гистологов имеется широкий ряд тканедифферентационных маркеров, с помощью которых проводят верификацию опухолей. Под термином «верификация» подразумевают определение ее тканевого происхождения или гистогенез.

Для верификации УМ, как и меланомы кожи, используют несколько стандартных меланомаспецифических маркеров. К ним относятся: S-100, тирозиназа, меланин-А, НМВ-45, MITF [Руководство по иммуногистохимической диагностике опухолей человека, - под редакцией С.В.Петрова и Н.Т.Райхлина. - Казань. - 2000 г. - Стр.287]. Частота выявления этих маркеров в УМ, как и количество позитивных опухолевых клеток к этим маркерам в опухоли, по данным литературы, колеблется значительно. Это означает, что чувствительность различных меланомаспецифических маркеров при верификации меланом различных локализаций существенно варьирует. Другими словами, по данным отдельных авторов, могут возникать ситуации, когда эти маркеры не распознают меланому, при этом реакция с этим маркером будет ложно-отрицательной [Beckenkamp G., Schafer H., von Domarus D. Immunocytochemical parameters in ocular malignant melanoma.// Eur J. Cancer Clin Oncol, 1988, vol.24, p.41-45; Bumier M.N. Jr., McLean I.W., Gamel J.W. Immunohistochemical evaluation of uveal melanocytic tumors.// Cancer, 1991, vol.68, p.809-14; Femando S.S., Johnson S., Bate J. Immunohistochemical analysis of cutaneous malignant melanoma: comparison of S-100 protein, НМВ-45 monoclonal antibody and NKI-C3 monoclonal antibody. // Pathology, 1994, vol.26, p.16-19. Heegard S., Jensen O.A., Prause J.U. Immunohistochemical diagnosis of malignant melanoma of the conjunctiva and uvea: comparison of the novel antibody against melan-A with S 100 protein and HMB-45.// Melanoma Res, 2000, vol.10, p.350-354.]

В связи с чем, для уточнения ситуации, а также с целью повышения качества ИГХ-диагностики, мы попытались найти наиболее надежные и точные маркеры для верификации этих опухолей среди других внутриглазных неоплазм. Для этого мы взяли из архива нашего института парафиновые блоки тканей УМ, полученных от 82 пациентов, прооперированных более 5 лет назад, и провели собственные ИГХ-исследования. Целью этих исследований являлась оценка надежности применения того или иного маркера в диагностике или, иными словами, оценка их чувствительности. Это можно было сделать по количеству ложно отрицательных случаев. Для оценки специфичности маркеров мы также взяли и другие внутриглазные опухоли - лейомиосаркому и лимфому. Специфичность ИГХ-маркеров, как правило, анализируется по выявлению ложно позитивных реакций меланоцитарных маркеров в опухолях немеланоцитарного ряда. Попутно мы проводили ретроспективный анализ результатов ИГХ-исследования в корреляции с клиническими данными по выживаемости пациентов.

Оказалось, что практически все маркеры в подавляющем большинстве случаев (94,9-100%) дают позитивную реакцию с S-100, тирозиназой, меланином-А, HMB-45 и MITF. Однако чувствительность различных меланомаспецифических маркеров действительно различается. Справедливости ради, заметим, что эта разница оказалась намного ниже, чем описывали упомянутые авторы (см. табл.1). Результаты проведенных исследований показали, что с помощью одного S-100 нельзя с абсолютной убежденностью утверждать, что S-100-позитивная опухоль - меланома. К этому маркеру давали позитивную реакцию и опухоли миогенного ряда - лейомиосаркома. То есть идет речь о том, что этот маркер не является высокоспецифичным, как например, маркеры меланоцитарного ряда тирозиназа, меланин-А, HMB-45, MITF. Именно последние являются высоко специфичными маркерами и не дают ложно позитивных результатов. Следовательно, их присутствие необходимо для верификации меланом. Вместе с тем они дают ложно негативные результаты. Так, из 82 меланом в 1 случае реакция с тирозиназой оказалась негативной. На практике это означает, что использование только одной тирозиназы в ИГХ-диагностике привело бы к диагностической ошибке. Аналогичная ситуация сложилась бы и при использовании только одного MITF. Этот маркер также давал ложно негативную реакцию с меланомами. Идеальными меланомаспецифическими маркерами оказались НМВ-45 и меланин-А (см. табл).

Как показали собственные исследования, применение двух маркеров (S-100 и одного из меланомаспецифических маркеров: меланина-А или НМВ-45) повышает степень надежности ИГХ-диагностики. Преимуществом меланина-А перед НМВ-45 является тот факт, что меланин-А окрашивает премеланосомы, в то время как НМВ-45 - зрелые меланосомы, и не окрашивает опухоли другого генеза. То есть эти два маркера отвечают за 2 различные стадии созревания меланосом. И поскольку различные популяции опухолевых клеток, как правило, находятся на разной стадии зрелости и, следовательно, на разных стадиях меланогенеза, то в УМ обязательно обнаружатся меланин-А-позитивные опухолевые клетки. Что, собственно, и получили мы эмпирическим путем.

Наш ретроспективный анализ также показал, что существует прямая тесная связь между экспрессией S-100 и выживаемостью пациентов. Этот факт по каким-то причинам не нашел отражения в литературе или просто не был замечен другими авторами. Оказалось, что чем меньше в опухоли выявляется S-100-позитивных клеток, тем хуже прогноз. Статистический ретроспективный анализ показал, что критичное количество S-100-позитивных клеток для прогноза - 50. То есть, говоря иными словами, при выявлении в опухоли менее 50 S-100-позитивных клеток вероятность развития метастазов становилась высокой и достигала 82,2%. В качестве доказательства приводим график выживаемости пациентов с двумя диаметрально противоположными показателями в опухоли. Так, согласно этому графику (см. чертеж), среди 28 пациентов, с менее 50 S-100-позитивными клетками в опухоли (страта А), метастазы развились в 9 случаях (32% случаев), а частота их 5-летней выживаемости составила 68%, соответственно. Среди 29 пациентов с ≥50 S-100-позитивных клеток в опухоли (страта В) метастазирование наступило у 5 человек (17,8% случаев), а показатель выживаемости достиг 82,2%. Разница в показателях выживаемости достоверна. Это подтверждено 3 различными тестами контроля качества проведения исследования.

В связи с чем в последующей нашей работе мы стали использовать эти два маркера в целях верификации увеальной меланомы, а количественный анализ S-100-позитивных клеток в опухоли служил нам в качестве маркера для прогнозирования метастазирования.

Задачей предлагаемого изобретения является разработка такого способа, который позволял бы одновременно не только верифицировать увеальную меланому, но и прогнозировать вероятность развития ее метастазов.

Техническим результатом является решение одновременно двух задач (верификация опухоли и прогнозирование вероятности ее метастазирования) с помощью только двух маркеров (S-100 и меланина-А) и одноэтапного иммуногистохимического исследования, что обеспечивает упрощение способа с позитивным экономическим эффектом.

Технический результат достигается за счет использования двух тканедифферентационных маркеров S-100 и меланина-А, отвечающих за принадлежность опухоли к неоплазмам меланоцитарного ряда.

Предлагаемый нами способ прогнозирования осуществляют следующим образом.

1. После энуклеации глаза с увеальной меланомой готовят парафиновые срезы толщиной 3-5 микрон по стандарной методике, депарафинируют в ксилоле и регидратируют в батарее спиртов.

2. Иммуногистохимическое исследование проводят по стандартной методике. Для открытия антигенных детерминант проводят обработку срезов в цитратном буфере [рН 6,0] в течение 30 минут при 95°С на водяной бане.

3. Инкубацию с первичными антителами проводят в течение ночи при 4°С. Для визуализации реакции антиген-антитело используют стрептавидинбиотиновую тест-систему LSAB+kit [DAKO Corp] согласно инструкции. В качестве хромогена используют ДАБ+[DAKO Corp]. В качестве первичных антител используют кроличьи поликлональные антитела к S-100 (разведение 1:500, DAKO Corp) и меланина-А (разведение 1:80, DAKO Corp).

4. Затем срезы докрашивают гематоксилином Майера и заключают в канадский бальзам.

5. Реакцию оценивают с применением светового микроскопа (увеличение ×400) по следующим критериям. Отрицательной считали реакцию при отсутствии специфического окрашивания опухолевых клеток на всей площади опухолевой ткани. Положительную реакцию расценивали при окрашивании опухолевых клеток. При позитивной реакции опухолевых клеток с двумя маркерами опухоль верифицируют как увеальную меланому.

6. Количественную оценку экспрессии маркера S-100 по срезу определяют как число иммунопозитивных клеток в поле зрения микроскопа при увеличении × 400. В случае, где число S-100-позитивных клеток не достигает 50, определяют высокий риск развития метастазов. Если число S-100 позитивных клеток в опухоли более или равно 50, то считают, что риск развития метастазов для пациента невысок.

Пример 1. Пациент 54 года. Диагноз: УМ в стадии Т₃NoMo на правом глазу. Проведено органосохранное лечение в объеме иридоциклхориоидэктомии. Иммуногистохимические исследования парафинового среза опухоли по указанному способу выявили S-100-позитивную и меланин-А-позитивную опухоль, которую верифицировали как меланому. Подсчитали количество S-100-позитивных клеток на срезе УМ при увеличении × 400: их оказалось 17. Больной отнесен в группу высокого риска развития метастазов. Назначены укороченные интервалы между визитами врача. По истечении 8 месяцев наблюдения после проведенной операции у больного выявлены метастазы в печени. Проведена иммунотерапия с целью замедления скорости метастазирования.

Пример 2. Пациентка 72 лет. Перенесла энуклеацию левого глаза по поводу УМ в стадии T4NoMo. Иммуногистохимически выявили S-100-позитивную и меланин-А-позитивную опухоль, которую верифицировали как увеальную меланому. Подсчитали количество S-100-позитивных клеток. На срезе УМ при увеличении × 400 их оказалось 87. Пациент отнесен к группе низкого риска развития метастазов. Продолжительное наблюдение за пациентом в течение 3-х лет показало благоприятное течение заболевание и отсутствие метастазов.

Таким образом, предложенный способ с высокой степенью вероятности позволяет одновременно проводить как верификацию увеальной меланомы, так и оценивать прогноз ее течения, что позволяет осуществлять отбор пациентов в группу риска развития метастазов и обосновывает тактику ведения больных с данной патологией. При этом использование всего двух маркеров позволяет сократить продолжительность исследования и экономические затраты на их проведение.

Изобретение относится к области медицины, в частности к офтальмологии, а именно к офтальмоонкологии, и предназначено для одновременной верификации увеальной меланомы и прогнозирования вероятности развития ее метастазов. Способ обеспечивает упрощение исследования при высокой специфичности и чувствительности одновременной верификации увеальной меланомы и прогнозирования ее метастазирования. Проводят иммуногистохимический анализ экспрессии белка S-100 и меланина-А в опухолевых клетках с одновременным подсчетом количества S-100-позитивных клеток в поле зрения. Увеальную меланому верифицируют при положительной реакции S-100 и меланина-А с прогнозированием высокой вероятности метастазирования опухоли при наличии в ней менее 50 S-100-позитивных клеток. 1 табл., 1 ил.

Способ одновременной верификации увеальной меланомы и прогнозирования ее метастазирования, включающий проведение иммуногистохимического анализа экспрессии белка S-100 и меланина-А с одновременным подсчетом количества S-100-позитивных опухолевых клеток в поле зрения, и верификацию увеальной меланомы при положительной реакции S-100 и меланина-А с прогнозированием высокой вероятности метастазирования опухоли при наличии в ней менее 50 S-100-позитивных клеток.