СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2004 года по МПК A61K31/7012 A61P37/08 A61P37/06 

Изобретение относится к медицине, конкретно - к клинической иммунологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции нарушений в иммунной системе, наблюдающихся при аллергических заболеваниях.

В настоящее время для лечения аллергических заболеваний широко применяются препараты с антигистаминным действием, которые либо блокируют H₁-рецепторы (димедрол, фенкарол, пипольфен и т.д.), либо тормозят высвобождение и активность гистамина, а так же других медиаторов аллергии (кромолин-натрий, незокромил-натрий, кетотифен, оксатомид) [1].

Большинство указанных препаратов обладает выраженным в различной степени седативным эффектом, что ограничивает их назначение в амбулаторной практике. Имеются у них и другие побочные действия - тошнота, рвота, головокружение [1]. Кроме того, данные лекарственные средства применяются в основном для снятия острых явлений аллергии. Наиболее близким препаратом сравнения (прототипом) можно считать тавегил - антигистаминный препарат, обладающий всеми характерными для данной группы препаратов побочными эффектами.

Следует подчеркнуть, что действие антигистаминных препаратов осуществляется на стадии патохимических изменений, когда уже произошло образование комплексов антиген-антитело и развилась аллергическая реакция, обусловленная воздействием биологически активных веществ (в том числе гистамина). В этой связи изучение средств, которые могли бы купировать развитие аллергических реакций на более ранних этапах (до образования комплекса антиген-антитело), представляет интерес и является актуальным.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих противоаллергической активностью и действующих на наиболее ранние этапы формирования аллергических реакций, связанные с выработкой иммуноглобулинов Е.

Поставленная задача решается путем выявления нового, не изученного до сих пор свойства глюкуроновой кислоты, - ее противоаллергической активности.

Известно применение глюкуроновой кислоты в качестве средства, избирательно стимулирующего грануломоноцитопоэз [3] и функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов [4].

Применение глюкуроновой кислоты по новому назначению стало возможным благодаря выявленным нами новым свойствам. Впервые показано, что глюкуроновая кислота подавляет развитие анафилактического шока, снижает содержание иммуноглобулинов Е и G1 (IgE и IgGl), подавляет местную реакцию на аллерген.

Глюкуроновая кислота является одним из основных компонентов гликозаминогликанов экстрацеллюлярного матрикса [4]. Эти структуры с высоким содержанием глюкуроновой кислоты участвуют в регуляции ряда процессов: клеточной адгезии [5], продукции различных цитокинов, хемокинов и экспресии их рецепторов [6], функций дендритных клеток [7], Т- и В-лимфоцитов [8; 9; 10], что определяет качество и интенсивность иммунного ответа (IR).

Новым является то, что глюкуроновая кислота используется в качестве средства, обладающего противоаллергической активностью. Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - “новизна”, “изобретательский уровень” и “промышленно применимо”.

Новые свойства доказаны экспериментально. Эксперименты проведены на мышах и крысах. Глюкуроновую кислоту (ГК) вводили мышам в дозе 50 мг/кг массы тела внутрибрюшинно в физиологическом растворе хлорида натрия (ФР) по 0,2 мл на мышь (рН доводили до 7,4-7,6), контрольной группе вводили то же количество ФР в/бр. Животные двух- или трехкратно получали сенсибилизирующие инъекции овальбумина (OVA) с гидроокисью алюминия (А1) (оба “Sigma”) под кожу бедра: овальбумина по 100 мкг/мышь, гидроокиси алюминия по 5 мг/мышь в ФР в объеме 0,1 мл с интервалом 2 недели между иммунизациями. Животным контрольной группы вводили по 0,1 мл ФР в те же сроки также подкожно.

Влияние ГК на протекание анафилактической реакции исследовали с использованием 58 самцов мышей линии BALB/c. Ответ на сенсибилизирующие введения OVA (см. выше) оценивали по тяжести анафилактической реакции, развивающейся после инъекции разрешающей дозы овальбумина. Разрешающую дозу вводили внутривенно (по 10 мкг в 0,1 мл ФР в ретроорбитальный синус) на 7-ой день после последней иммунизации. Глюкуроновую кислоту вводили по двум схемам: 1 - на протяжении 21 дня (при 2-кратной иммунизации), начиная одновременно с первой сенсибилизирующей инъекцией OVA; 2 - на протяжении 10 дней (при 3-кратной иммунизации), начиная за 10 дней до введения разрешающей дозы OVA. Результаты анафилактической реакции учитывались по следующим критериям:

- - нет реакции;

+ - цианоз, незначительные судороги, угнетенное состояние;

++ - цианоз, клонические судороги, угнетенное состояние, ярко выраженные параличи, положение "лягушки";

+++ - летальный исход.

Влияние глюкуроновой кислоты на местную реакцию на аллерген (овальбумин) оценивали методом гиперчувствительности замедленного типа с использованием 30 самцов мышей линии BALB/c следующим образом. Животных сенсибилизировали двухкратной инъекцией OVA, как описано выше. На 7-й день после последней инъекции в подушечку задней лапы вводили 20 мкг OVA в 0,05 мл ФР (“опытная лапа”), в контрлатеральную лапу вводил 0,05 мл ФР (“контрольная лапа”). Местную воспалительную реакцию оценивали через 4 часа по разнице массы опытной (Мо) и контрольной (Мк) лап. Обе лапки отрезали сразу же после забоя животных по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой костей и выше пяточного сустава. Способ и доза введения глюкуроновой кислоты описана выше, длительность введения -10 дней, за 10 дней до индукции местной реакции. Индекс реакции (ИР) для каждой мыши вычисляли по формуле:

Влияние глюкуроновой кислоты на продукцию IgE- и IgGl-специфических антител в сыворотке определяли методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА). Сыворотку получали от 18 мышей линии BALB/c, иммунизированных OVA, как описано выше, на 7-й день после второй иммунизации. Способ и доза введения ГК описана выше, длительность введения - 10 дней, за 10 дней до забивки животных.

Титры IgGl антител, специфических к OVA, определялись на 12 нелинейных мышах-самцах. Сыворотку крови иммунизированных мышей в различных разведениях вводили в объеме 30 мкл внутрикожно в область спины. Разрешающую дозу OVA (0,5 мг в 0,2 мл 0,5% раствора синего Эванса в ФР) вводили мышам в ретроорбитальный синус через 2 часа после внутрикожного введения сыворотки. Интенсивность ПКА оценивали через 30 мин по прокрашиванию участков кожи, для чего животных забивали, кожу отсепаровывали, выраженность реакции определяли по площади прокрашенного учаска, измеряемой на внутренней поверхности кожи.

Титры IgE антител, специфических к OVA, определяли на 12 беспородных крысах-самцах. Животным внутрикожно в область живота вводили сыворотку крови иммунизированных мышей в различных разведениях в объеме 30 мкл. Разрешающую инъекцию OVA делали крысам в хвостовую вену через 24 часа после пассивной иммунизации (100 мкг OVA на 100 г массы тела в 1 мл 0,5% раствора синего Эванса на ФР). Интенсивность ПКА оценивали через 30 мин по прокрашиванию участков кожи, аналогично описанной выше ПКА на мышах.

Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при р<0,05.

Экспериментально установлено, что введение ГК снижает летальность от анафилактической реакции (табл.1). При длительности курса введения ГК в 21 день при двухкратной иммунизации летальность снижалась в 2 раза: из 9 мышей контрольной группы погибло 8, в опытной группе из 9 животных погибло 4. При длительности курса введения ГК в 10 дней при трехкратной иммунизации в контрольной группе из 10 животных погибло 9, а в опытной из 10 погибло 5. Таким образом, вне зависимости от тяжести анафилактического шока глюкуроновая кислота снижает летальность.

При местной реакции на OVA у предварительно иммунизированных этим же веществом животных также получено снижение ее выраженности под влиянием введения ГК (табл. 2). При двухкратной иммунизации и курсе ГК длительностью 10 дней (начало курса за 10 дней до местного введения антигена) выраженность реакции снижалась на 1/4 по сравнению с контрольной группой, не получавшей ГК.

Глюкуроновая кислота, как показали эксперименты, вызывает снижение уровня IgGl антител, специфических к OVA, в сыворотке крови дважды иммунизированных OVA мышей (табл.3). При курсовом введении ГК длительностью 10 дней (начало курса за 10 дней до взятия сыворотки) аллерген-специфические IgGl антитела в ПКА обнаруживались только у 1 животного в титрах 1/4 и 1/8. Две другие мыши не дали реакцию ни в одном из титров исследуемых сывороток.

Введение глюкуроновой кислоты вызывает также снижение уровня IgE антител, специфических к OVA в сыворотке крови дважды иммунизированных OVA мышей (табл.4). При курсовом введении ГК длительностью 10 дней (начало курса за 10 дней до взятия сыворотки) аллерген-специфические IgE антитела в ПКА обнаруживались только у 2 животных в титре 1/4, другие разведения сывороток не вызывали никакой реакции.

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что глюкуроновая кислота обладает антиаллергическим действием. По сравнению с имеющимися антигистаминными противоаллергическими средствами ГК обладает тем преимуществом, что способна тормозить развитие аллергий на самой первой - иммунологической стадии, за счет уменьшения образования иммуноглобулинов классов Е и Gl, а значит, соответственно, высвобождения в последующем и выработки биологически активных веществ, оказывающих повреждающее действие на клетки и ткани.

Литература.

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Пособие для врачей, четырнадцатое издание, переработанное, исправленное и дополненное. М.: Новая волна. - 2002. - Том 1.

2. Патент №2020936.

3. Патент №2058137.

4. Laurent Т.С., Fraser J.R.E. Hyaluronan. FASEB J, 1992, V.6, 2397-2404

5. Knudson С.В., Knudson W. Hyaluronan-binding proteins in development, tissue homeostasis, and disease. // FASEB J. - 1993. - V.7. - P.1233-1241.

6. Camenisch T.D., McDonald J.A. Hyaluronan is bigger better? / 7 Am. J.Respir. Cell Mol. Biol. - 2000. - V. 23. - №4. - Р.431-433.

7. Termeer C.C., Hennies J., Voith U,, Ahrens Т., Weiss J.M, Prehm P., Simon J.C. Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells. // J. Immunol. - 2000. - V.165. - №4. - Р.1863-1870.

8. Rafi B.A., Nagarkatti M., Nagarkatti P.S. Hyaluronate-CD44 interactions can induce murine B-cell activation. // Blood. - 1997. - V.89. - №8. - Р.2901-2908.

9. Seth A., Gote L., Nagarkatti M., Nagarkatti P. T-cell-receptor independent activation of cytolytic activity of cytotoxic Т lymphocytes mediated through CD44 and gp90MEL-14. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1991. - V.88. - P.7877-7881.

10. Hammond D.M., Nagarkatti P.S., Gote L., Seth A., Hassuneh M.R., Nagarkatti M. Double-negative Т cells from MRL-lpr/lpr mice mediate cytolytic activity when triggered through adhesion molecules and constitutively express perform gene. // J.Exp. Med. - 1993. - №178. - P.2225-2230.

Изобретение относится к медицине, конкретно - к фармакологии. Предложено новое средство, обладающее противоаллергическим действием. Средство представляет собой глюкуроновую кислоту и ранее было известно в качестве стимулятора грануломоноцитопоэза. Изобретение расширяет арсенал средств заявленного назначения и действует на наиболее ранние этапы формирования аллергических реакций, связанных с выработкой иммуноглобулинов. 4 табл.

Применение глюкуроновой кислоты в качестве средства, оказывающего противоаллергическое действие.