СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2009 года по МПК A61K31/191 A61P37/02 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии, и может быть использовано для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

В настоящее время в терапии заболеваний, обусловленных дисфункцией иммунной системы, используются [Энциклопедия лекарств, 2004]: препараты на основе цитокинов, интерфероны и интерфероногены (например, неовир, тилорон, криданимод), синтетические вещества с иммуностимулирующими свойствами (например, декарис, циклоферон, тимоген, ликопид), препараты растительного происхождения, препараты на основе нуклеиновых кислот (натрия дезоксирибонуклеат, натрия нуклеинат, оксиметилурацил), препараты, содержащие микроорганизмы или их производные (имудон, ИРС 19, рибомунил) и препараты на основе ферментов (вобэ-мугос Е, вобэнзим).

Наиболее близким препаратом (базисным) является ликопид, поскольку в основе механизма его иммуномодулирующего действия лежит активация фагоцитирующих клеток (макрофаги, нейтрофилы) [Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 2003]. Известно, что основным цитокином, активирующим Т-хелперы 1 типа (Th1), является интерлейкин-12, который вырабатывается антиген-презентирующими клетками в раннюю фазу инфекции. Благодаря этому цитокину макрофаги могут направлять дифференцировку Т-хелперов, создавая условия для предпочтительного развития Th1 in vitro и in vivo. Ликопид активирует клетки моноцитарно-макрофагального звена, стимулируя продукцию ими воспалительных цитокинов.

Из литературы известно, что D-глюкуроновая кислота является одним из основных компонентов гликозаминогликанов экстрацеллюлярного матрикса [Laurent Т.С., Fraser J.R.E., 1992]. Эти структуры с высоким содержанием глюкуроновой кислоты участвуют в регуляции ряда процессов: клеточной адгезии, продукции различных цитокинов, хемокинов и экспресии их рецепторов [Camenisch T.D., McDonald J.A., 2000], функций дендритных клеток [Termeer C.C. et al., 2000].

Известно применение D-глюкуроновой кислоты в качестве средства, избирательно стимулирующего грануломоноцитопоэз [Патент № 2020936] и функциональную активность нейтрофильных лейкоцитов [Патент № 2058137]. Кроме того, показано наличие у D-глюкуроновой кислоты противоаллергического действия [Патент №2240801].

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих иммуномодулирующей активностью и действующих на Th1-зависимый иммунный ответ.

Поставленная задача решается путем применения D-глюкуроновой кислоты в качестве иммуномодулятора, стимулирующего Th1-зависимый тип иммунного ответа.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение в качестве иммуномодулирующего средства D-глюкуроновой кислоты.

Новое свойство D-глюкуроновой кислоты было обнаружено в результате экспериментальных исследований. В экспериментах была использована D-глюкуроновая кислота производства «Sigma».

Новое свойство D-глюкуроновой кислоты стимулировать Th1-зависимый тип иммунного ответа явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники и описание его не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. В качестве иммуномодулирующего средства D-глюкуроновую кислоту можно использовать для коррекции нарушений в иммунной системе при патологических состояниях, связанных с недостаточностью Th1-зависимого типа иммунного ответа (хронические, вялотекущие и рецидивирующие инфекционные, а также онкологические заболевания).

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Эксперименты проведены на 92 линейных мышах ВА1b/с массой 20 г (возраст 8 недель), полученных из коллекционного фонда НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН. Животные соответствовали 1 категории (согласно сертификату), содержались в неполной барьерной системе, имели постоянный доступ к воде и пище (кипяченая питьевая вода, подкисленная соляной кислотой до рН 4-4,5, стерилизованный гранулированный корм).

На основании имеющейся литературы и опираясь на данные, полученные в предварительных экспериментах, была использована наиболее оптимальная суточная доза D-глюкуроновой кислоты - 50 мг/кг массы тела.

Для индукции Тh1-зависимого типа иммунного ответа животных иммунизировали эритроцитами барана, которые, как известно, вызывают развитие именно этого типа иммунного ответа. Для изучения влияния D-глюкуроновой кислоты на гуморальный и клеточный иммунный ответ мышам вводили раствор кислоты по 50 мг/кг массы тела ежедневно внутрибрюшинно в течение 10 дней. Через 5 дней от начала введения животных иммунизировали эритроцитами барана (по 5×10⁶ внутрибрюшинно при определении числа АОК и титра антител, по 1×10⁸ при проведении реакции гиперчувствительности замедленного типа).

Влияние D-глюкуроновой кислоты на гуморальное звено иммунитета оценивали по изменению числа антителообразующих клеток (АОК) в селезенке иммунизированных мышей [Хаитов P.M. с соавт., 1999] и по титру антител в сыворотке крови. Для этого животных забивали на 5-й и 7-й день после иммунизации (на пике IgM-AOK и IgG-AOK соответственно), лимфоциты получали гомогенизацией селезенок в стеклянном гомогенизаторе, после чего клеточную взвесь фильтровали через 4-слойный капрон, трижды промывали холодным изотоническим раствором хлорида натрия, ресуспендировали в 4 мл среды 199 и подсчитывали количество жизнеспособных клеток. В пробирки, предварительно нагретые до 49-53°С, вносили 0,9 мл среды культивирования (среда 199, 0,7% агар «Difco»), 0,2 мл 20%-ной взвеси эритроцитов барана, 0,2 мл взвеси спленоцитов и 0,1 мл комплемента. После ресуспендирования данной смесью заполняли камеры Горяева, помещали их во влажную камеру, инкубировали 2 ч при 37°С, затем подсчитывали зоны гемолиза при помощи светового микроскопа. Титр антител в сыворотке крови определяли на 5-й и 7-й день после иммунизации в реакции агглютинации [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого животных забивали цервикальной дислокацией, вскрывали грудную полость и забирали кровь из сердца, после чего клеточные элементы осаждали центрифугированием. Полученную сыворотку раститровывали в 96-луночном планшете с шагом 1/2, добавляли эритроциты барана, инкубировали при 37°С 2 часа и учитывали реакцию. За титр принимали то последнее разведение исследуемой сыворотки, при котором еще наблюдается агглютинация.

Для оценки действия исследуемого вещества на клеточное звено иммунитета использовали реакцию гиперчувствительности замедленного типа [Хаитов P.M. с соавт., 1999]. Для этого на 5-е сутки после иммунизации животным проводили вторую (разрешающую) инъекцию эритроцитов барана в подушечку задней лапы - «опытная лапа» (10⁸ эритроцитов барана в 0,02 мл изотонического раствора хлорида натрия). В контрлатеральную лапу вводили 0,02 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия («контрольная лапа»). Местную воспалительную реакцию оценивали через 24 часа по разнице массы опытной (Мо) и контрольной (Мк) лап. Животных забивали, обе лапки отрезали по выступу кости ниже сочленения мало- и большеберцовой кости и выше пяточного сустава. Индекс реакции (ИР) вычисляли для каждой мыши по формуле

Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при р<0,05.

Пример 1

Экспериментально установлено, что введение D-глюкуроновой кислоты стимулировало гуморальный ответ на эритроциты барана (табл.1).

Таблица 1Влияние курсового введения D-глюкуроновой кислоты на количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенках мышей и продукцию ими антител (Х±m)ПоказательСроки (сутки после иммунизации)Контрольная группа (физ. р-р)Опытная группа (D-глюкуроновая кислота)Число АОК (10³/селезенку)574,8±3,6124,9±16,1*735,0±5,657,8±6,4*Титр антител (log2)55,75±0,387,50±0,50*73,00±0,106,33±0,44*Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Число антителообразующих клеток на 5-е сутки после иммунизации составило 166,9% от контрольных значений, оставаясь практически таким же высоким на 7-е сутки - 165,1% от контрольного уровня. Введение D-глюкуроновой кислоты стимулировало также функциональную активность продуцентов антител, приводя к увеличению их титра как на 5-е, так и на 7-е сутки - до 130,4% и 211,0% от контрольных значений соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что изучаемое вещество обладает способностью стимулировать гуморальный иммунный ответ, повышая количество антителообразующих клеток и их функциональную активность.

Пример 2

Курсовое введение D-глюкуроновой кислоты усиливало эффекторную фазу реакции клеточного ответа на эритроциты барана (табл.2). У животных контрольной группы, которым вводили изотонический раствор хлорида натрия, индекс реакции составил 7,3%. У мышей опытной группы индекс реакции был увеличен в 2,6 раза, составив 19,2%.

Таблица 2
Влияние курсового введения D-глюкуроновой кислоты (ГК) на реакцию гиперчувствительность замедленного типа на 5-е сутки после иммунизации эритроцитами барана (Х±m)ГруппаИндекс реакции (%)Контроль (физ. р-р)
n=107,3±1,4ГК
n=1019,2±4,1*Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Таким образом, экспериментально установлено, что D-глюкуроновая кислота стимулирует Тh1-зависимый иммунный ответ, вызванный эритроцитами барана.

D-глюкуроновая кислота является активатором Тh1-зависимого типа иммунного ответа и может расширить арсенал средств, способных стимулировать иммунный ответ при хронических, вялотекущих и рецидивирующих инфекционно-воспалительных процессах.

Литература

1. Патент № 2020936.

2. Патент № 2058137.

3. Патент № 2240801.

4. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы и некоторые аспекты их клинического применения. // Клиническая медицина. 1996. № 8. С.7-12.

5. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов (методические рекомендации) // Ведомости Фармакологического Комитета. 1999. №1. С.31-36.

6. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммуномодуляторы: механизм действия и клиническое применение. // Иммунология. 2003. № 3. С.199.

7. Энциклопедия лекарств. 2004. № 11. Изд-во ООО «РЛС-2004». С.1081-1082.

8. Laurent Т.С., Fraser J.R.E. Hyaluronan. FASEB J, 1992, V.6, 2397-2404. Knudson С. В., Knudson W. Hyaluronan-binding proteins in development, tissue homeostasis, and disease // FASEB J. 1993. Vol.7. P.1233-1241.

9. Camenisch T.D., McDonald J.A. Hyaluronan is bigger better? // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2000. Vol.23, № 4. P.431-433.

10. Termeer C.C., Hennies J., Voith U. et al. Oligosaccharides of hyaluronan are potent activators of dendritic cells // J. Immunol. 2000. Vol.165, №4. P.1863-1870.

Изобретение относится к лекарственным средствам и касается применения D-глюкуроновой кислоты в качестве средства, обладающего способностью стимулировать Тh1-зависимый тип иммунного ответа. Изобретение позволяет расширить арсенал средств, обладающих иммуностимулирующей активностью и действующих на Тh1 -зависимый иммунный ответ. 2 табл.

Применение D-глюкуроновой кислоты в качестве средства, обладающего способностью стимулировать Тh1-зависимый тип иммунного ответа.