СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОАЛЛЕРГИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ Российский патент 2008 года по МПК A61K36/28 A61K31/715 A61P37/08 

Изобретение относится к медицине, конкретно к клинической иммунологии, и может быть использовано для фармакологической коррекции нарушений в иммунной системе, наблюдающихся при аллергических (иммуноглобулин-Е-зависимых) заболеваниях.

В настоящее время в терапии аллергических состояний, зависимых от иммуноглобулина Е (IgE), используют методы клеточной технологии и фармакологической коррекции.

Лекарственные средства, применяемые для такой коррекции, являются гистаминолитиками и представлены двумя группами препаратов: H₁-антигистаминные средства и стабилизаторы мембран тучных клеток [Энциклопедия лекарств, №11, 2004]. В основе механизма действия H₁-антигистаминных средств (например, фенкарол, кларитин, супрастин, астемизол) лежит блокирование рецепторов к гистамину, в то время как стабилизаторы мембран тучных клеток (например, кетотифен, кромогексал, цетиризин) препятствуют входу кальция в тучные клетки и, как следствие этого, тормозят их дегрануляцию. Выбор таких фармакологических мишеней основан на патогенезе данных заболеваний, представляющих собой реакции гиперчувствительности немедленного типа. Выделяют иммунологическую, патохимическую и патофизиологическую стадии данной реакции. H₁-антигистаминные средства направлены на коррекцию нарушений, возникающих в патофизиологическую стадию, а стабилизаторы мембран тучных клеток - патохимическую.

Фармакологические средства, которые могли бы купировать развитие аллергических реакций на более ранних этапах, пока не созданы, однако активно исследуют возможность применения препаратов, содержащих антитела к иммуноглобулину Е. Следует отметить, что в настоящее время достаточно широко используют метод иммунотерапии, направленный на коррекцию нарушений функционирования иммунной системы именно в ранние этапы патогенеза атопических (IgE-зависимых) заболеваний, суть которого заключается в многократном введении аллергена в возрастающих дозах [Медицинская микробиология, иммунология и вирусология, 1998]. В результате этого повышается продукция антител, относящихся к классам G и М, что позволяет нам предполагать развитие Th1-зависимого иммунного ответа. Существенным недостатком данной иммунотерапии является необходимость точной диагностики аллергена, что возможно далеко не для всех пациентов.

Задачей, решаемой данным изобретением, является расширение арсенала средств, обладающих противоаллергической активностью и действующих на наиболее ранние этапы формирования Тh2-зависимых аллергических реакций, связанных с выработкой иммуноглобулинов Е.

Поставленная задача решается путем применения водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, в качестве средства, обладающего противоаллергической активностью.

Принципиально новым в предлагаемом изобретении является применение водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, в качестве средства, обладающего противоаллергической активностью за счет подавления Тh2-зависимых реакций.

Новое свойство водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, установлено экспериментально.

Новое свойство полисахаридов явным образом не вытекает для специалиста из уровня техники и описание его не обнаружено авторами в патентной и научно-медицинской литературе. В качестве противоаллергического средства водорастворимые полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, можно использовать для профилактики и лечения IgE-зависимых заболеваний, таких как бронхиальная астма, аллергический бронхит, аллергический ринит, поллиноз, атопический дерматит, аллергический конъюнктивит, крапивница.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения, а именно - «новизна», «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Полисахариды получены по стандартной методике [Методы исследования углеводов, 1975]. Сырье листья мать-и-мачехи измельчали и просеивали через сита с размером пор 1 и 3 мм, экстрагировали водой при перемешивании в течение 30-180 мин при нагревании на водяной бане (температура 80-100°С), при соотношении сырье:экстрагент от 1:10 до 1:50. После этого сырье с экстрагентом оставляли на время от 6 до 36 часов в прохладном месте для настаивания. Затем экстрагент отделяли от сырья фильтрованием, экстракцию повторяли вновь в тех же условиях. После фильтрации полученные извлечения объединяли и упаривали до 1/5 объема. Полисахариды осаждали добавлением к полученному раствору двукратного количества 96%-ного этанола. Выпавший осадок центрифугировали, отделяли от раствора, промывали 96% этиловым спиртом и высушивали. Выход водорастворимых полисахаридов составлял 0,7 г (7%). Сумма водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, представляла собой порошок молочно-белого цвета с кремовым оттенком.

Эксперименты проведены на 20 беспородных и 60 линейных мышах (BAlb/с), а также на 12 беспородных крысах. В предварительных экспериментах было выявлено, что оптимальной суточной дозой полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, является 10 мг/кг массы тела.

Противоаллергические свойства изучены на модели анафилактической реакции, которую вызывали у мышей линии BAlb/с путем двукратной иммунизации овальбумином. Выбор такой модели не случаен: известно, что мыши данной линии (BAlb/с) в ответ на антиген развивают преимущественно Th2 тип иммунного ответа [Hsieh C.S. et al., 1995], а овальбумин с гидроокисью алюминия является стандартным антигеном, вызывающим Тh2-зависимый иммунный ответ [Oshiba A. et al., 1997].

Животным вводили под кожу бедра овальбумин (100 мкг/мышь) с гидроокисью алюминия (5 мг/мышь, оба «Sigma») в качестве адъюванта в 0,1 мл физиологического раствора хлорида натрия (ФР) с интервалом 2 недели между инъекциями. Мышам контрольной группы вводили по 0,1 мл ФР. Влияние водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, на протекание анафилактической реакции исследовали с использованием 40 мышей линии BAlb/с. Водорастворимые полисахариды, выделенные из листьев мать-и-мачехи, вводили по 10 мг/кг массы тела внутрибрюшинно в 0,2 мл ФР, контрольной группе также вводили то же количество ФР. Животные опытной группы получали полисахариды за 5 дней до каждой иммунизации и в течение 4 дней после первой иммунизации (всего 15 введений). Через 7 дней после второй иммунизации у части животных (40 мышей BAlb/с) вызывали анафилактический шок, а у другой части (20 мышей BAlb/с) забирали сыворотку для определения в ней уровня аллерген-специфических иммуноглобулинов классов G1 и Е.

Анафилактическая реакция развивалась после инъекции разрешающей дозы овальбумина, которую вводили внутривенно (по 10 мкг в 0,1 мл ФР в ретроорбитальный синус). Результаты анафилактической реакции учитывались по следующим критериям:

- легкая степень - цианоз, незначительные судороги, угнетенное состояние;

- средняя степень - цианоз, клонические судороги, угнетенное состояние, ярко выраженные параличи, положение «лягушки»;

- тяжелая степень - цианоз, клонические судороги, угнетенное состояние, ярко выраженные параличи, положение «лягушки», летальный исход.

Влияние полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, на продукцию IgE- и IgG1-аллерген-специфических антител в сыворотке иммунизированных овальбумином мышей линии BAlb/с определяли методом пассивной кожной анафилаксии (ПКА) с использованием беспородных крыс и мышей [Хаитов P.M. с соавт., 1999].

Титры IgG1 антител, специфических к овальбумину, определялись на 20 беспородных мышах-самцах. Сыворотку крови иммунизированных мышей в различных разведениях вводили в объеме 30 мкл внутрикожно в область спины. Разрешающую дозу овальбумина (0,5 мг в 0,2 мл 0,5% раствора синего Эванса в ФР) вводили мышам в ретроорбитальный синус через 2 часа после внутрикожного введения сыворотки. Интенсивность ПКА оценивали через 30 мин по площади окрашенных участков кожи, для чего животных забивали, отделяли кожу и на внутренней поверхности кожи замеряли площадь прокрашенного участка.

Титры IgE антител, специфических к овальбумину, определяли на 12 беспородных крысах-самцах. Животным внутрикожно в область живота вводили сыворотку крови иммунизированных мышей в различных разведениях в объеме 30 мкл. Разрешающую инъекцию овальбумина делали крысам в хвостовую вену через 24 часа после пассивной иммунизации (100 мкг овальбумина на 100 г массы тела в 1 мл 0,5% раствора синего Эванса на ФР). Интенсивность ПКА оценивали через 30 мин по площади окрашенных участков кожи, аналогично описанной выше.

Статистическую обработку проводили при помощи t-критерия Стьюдента. Различия показателей считали достоверными при р<0,05.

Курсовое введение полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, привело к снижению тяжести анафилактической реакции (табл.1). В контрольной группе животных, которым вводили внутрибрюшинно физиологический раствор, тяжелая анафилактическая реакция развивалась у большинства животных - 70% и у половины мышей опытной группы. Только у трети мышей контрольной группы наблюдалась реакция средней степени тяжести, а в опытной, получавших полисахариды, у половины. Анафилактический шок пережили 40% животных контрольной и 60% мышей опытной групп. Таким образом, водорастворимые полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, способствовали ослаблению тяжести анафилактической реакции и увеличению выживаемости животных от анафилактического шока.

Таблица 1.
Влияние курсового введения водорастворимых полисахаридов (ПС), полученных из листьев мать-и-мачехи, на тяжесть анафилактической реакции иммунизированных овальбумином мышей (Х±m)Курсовое введениеКоличество животных (%) с разной степенью тяжести реакции% летальностилегкаясредняятяжелаяРастворитель (контроль)0307060ПС мать-и-мачехи (опыт)0505040

Полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, вызывали снижение уровня специфических к овальбумину IgG1 антител в сыворотке крови мышей (табл.2). Площадь окрашенных участков кожи при введении сыворотки иммунизированных животных была значительно ниже, чем при введении сыворотки мышей контрольной группы, не получавшей полисахариды. При использовании максимального количества (разведение 1/4) сыворотки наблюдалось снижение окрашенной площади кожи на 60%, при введении сыворотки в разведении 1/8 - на 85%, а при введении сыворотки, разведенной 1/16, площадь окрашенного участка уменьшилась на 90%. Не дали реакцию ПКА в разведении 1/16 20% мышей опытной группы. Таким образом, курсовое введение полисахаридов мать-и-мачехи приводило к снижению концентрации антиген-специфических IgG1 антител.

Таблица 2.
Влияние курсового введения водорастворимых полисахаридов (ПС), полученных из листьев мать-и-мачехи, на титры IgG1 в сыворотке иммунизированных овальбумином мышей (Х±m)Курсовое введениеРеакция ПКА (площадь окрашенного участка, мм²)разведение сыворотки1/41/81/16Растворитель (контроль)451,2±50,1165,8±42,239,35±10,9ПС мать-и-мачехи186,4±66,5*25,1±5,0*4,0±4,9*Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Введение полисахаридов вызывало также снижение уровня IgE антител, специфических к овальбумину, в сыворотке крови дважды иммунизированных мышей (табл.3). Реакция ПКА, вызываемая разведенной 1/4 сывороткой мышей опытной группы, была на 73% ниже, чем реакция, индуцированная сывороткой животных контрольной группы. Сыворотка животных, получавших полисахариды, в разведении 1/8 и 1/16 также вызывала более слабую реакцию, чем сыворотка мышей контрольной группы - на 85% и 76% соответственно. Следовательно, введение полисахаридов травы мать-и-мачехи приводило к уменьшению продукции аллерген-специфических IgE антител.

Таблица 3.
Влияние курсового введения водорастворимых полисахаридов (ПС), полученных из листьев мать-и-мачехи, на титры IgE в сыворотке иммунизированных овальбумином мышей (Х±m)Курсовое введениеРеакция ПКА (площадь окрашенного участка, мм²)разведение сыворотки1/41/81/16Растворитель (контроль)1219,4±134,7743,1±109,659,7±12,6ПС мать-и-мачехи327,8±201,2*113,0±91,7*14,4±11,1*Примечание: * - различия с контролем достоверны, р<0,05.

Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют, что полисахариды, полученные из травы мать-и-мачехи, обладают противоаллергическим действием. По сравнению с имеющимися противоаллергическими средствами исследованное нами вещество способно ингибировать развитие иммуноглобулин-Е-зависимых аллергий на самой первой - иммунологической - стадии их развития, вызывая снижение синтеза иммуноглобулинов классов Е и G1, что приводит к торможению развития дальнейших событий, связанных с выработкой и высвобождением биологически активных веществ, оказывающих повреждающее действие на клетки и ткани.

Литература

1. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология (под. ред. А.И.Коротяева). С.-Петербург: Специальная литература, 1998. С.228.

2. Методы исследования углеводов (пер. с английского В.А.Несмеянова, под. ред. проф. Харлина). М.: Мир, 1975. С.274.

3. Хаитов P.M., Гущин И.С., Пинегин Б.В., Зебрев А.И. Экспериментальное изучение иммунотропной активности фармакологических препаратов (методические рекомендации). // Ведомости Фармакологического комитета. 1999. №1. С.31-36.

4. Энциклопедия лекарств. 2004. №11. М.: Изд-во ООО «РЛС-2004». С.1086-1088.

5. Hsieh C.S., Macatonia S.E., O'Garra A., Murphy K.M. Т cell genetic background determines default Т helper phenotype development in vitro // J. Exp.Med. 1995. Vol.181. P.713-721.

6. Oshiba A., Hamelrnann E., Haczku A. et al. Modulation of antigen-induced В and Т cell responses by antigen-specific IgE antibodies // J. Immunol. 1997. Vol.159. P.4056-4063.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к средству, способному подавлять иммунный ответ, лежащий в основе иммуноглобулин-Е-зависимых аллергических заболеваний. Новым в изобретении является применение водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, в качестве средства, способного подавлять иммунный ответ, лежащий в основе иммуноглобулин-Е-зависимых аллергических заболеваний. Водорастворимые полисахариды, полученные из листьев мать-и-мачехи, эффективно подавляют иммунный ответ, лежащий в основе иммуноглобулин-Е-зависимых аллергических заболеваний. 3 табл.

Применение водорастворимых полисахаридов, полученных из листьев мать-и-мачехи, в качестве средства, способного подавлять иммунный ответ, лежащий в основе иммуноглобулин-Е-зависимых аллергических заболеваний.